Indywidualne hodowle widłonogów Tigriopus i analiza ilościowa ich zachowań związanych z ochroną partnerów
26 września 2018
Zachowanie związane z ochroną partnera odgrywa ważną rolę w rozmnażaniu widłonogów z rodzaju Tigriopus. Jednak metody badania tego zachowania nie zostały dobrze opisane. Poniżej opisujemy metody: 1) indywidualnej hodowli dziewiczych zwierząt Tigriopus oraz 2) ilościowej analizy ich zachowań związanych z ochroną partnerów.
Główną zaletą tej techniki hodowli jest to, że można uzyskać dziewicze widłonogi, jednocześnie kontrolując ich doświadczenie w parowaniu i śledząc ich rozwój. Poniższa metoda analizy zachowania może pomóc w kontrolowanych i powtarzalnych eksperymentach dotyczących zachowania gołąźników Tigriopus, które są pospolitym zooplanktonem w skalistych basenach pływowych. Chociaż metody te mogą zapewnić wgląd w zachowania reprodukcyjne Tigriopus, można je również wykorzystać do przyjrzenia się, w jaki sposób czynniki genetyczne i środowiskowe wpływają na fizjologię i zachowanie tych widłonogów.
Na początek użyj pipety Pasteura, aby zebrać ciężarne samice niosące przezroczyste pomarańczowe jaja z kultury podstawowej. Opłukać samice czystą pożywką hodowlaną za pomocą delikatnego pipetowania. Następnie umieść każdą samicę w osobnym dołku na sześciodołkowej płytce do hodowli komórkowej z czystą pożywką hodowlaną.
Następnie umieść płytkę w inkubatorze, aby hodować samice, aż uwolnią woreczki jajowe. Po uwolnieniu woreczków jajowych użyj pipety Pasteura, aby usunąć samice z dołków płytki. Gdy tylko zwierzęta w pierwszym stadium kopeodu lub implantu ślimakowego zaczną się pojawiać, użyj mikropipety P-10, aby je pobrać.
Co dwa do trzech dni monitoruj studzienki pod kątem wysięków. Następnie dokonaj płci zwierząt, badając morfologię ich czułków. Aby poprawnie zidentyfikować dorosłe samice, upewnij się, że wyliniały już pięć wysięków w studzienkach hodowlanych, ponieważ różnice w kształcie czułków między dorosłymi samicami a osobnikami młodocianymi nie są widocznie znaczące w niektórych populacjach.
Po wybraniu zwierząt o odpowiednim etapie i płci nakarm wybrane osobniki drobno zmielonym pokarmem dla ryb. Podczas gdy zwierzęta jedzą, przygotuj dwie 48-dołkowe płytki do hodowli komórek z płaskim dnem jako komory testowe. Po upływie 30 minut opłucz każde zwierzę, pipetując je do kolejnych czterech studzienek 24-dołkowej płytki wypełnionej czystą sztuczną wodą morską.
Następnie umieść opłukane osoby w dołkach płytek A i B na podkładce świetlnej LED. Pozwól zwierzętom zaaklimatyzować się przez 30 minut, a następnie użyj pipety Pasteura, aby przenieść cele z płytki B na płytkę A. Pozwól samcowi i celowi na interakcję w każdym dołku przez wyznaczony czas obserwacji przed zatrzymaniem nagrywania wideo. Najpierw sprawdź wideo pod kątem czasu, w którym każdy cel został przeniesiony do studzienki na płycie A. Następnie zdefiniuj zainicjowanie próby obrony przez samca jako kontakt anteny mężczyzny z dowolną częścią ciała celu.
Zdefiniuj zakończenie próby obrony przez samca jako moment, w którym obie anteny samca odłączają się od ciała celu. Następnie zdefiniuj inicjację kopulacji poprzez zgięcie grzbietowe ciała samca, po którym następuje powtarzający się nacisk urosomu na ciało samicy. Najpierw wygeneruj klip wideo przedstawiający interesujący Cię odcinek, przycinając film za pomocą oprogramowania do edycji filmów.
Następnie otwórz ImageJ i zaimportuj klip wideo. Wybierz ukrytą 8-bitową skalę szarości, aby zmniejszyć ilość pamięci wymaganej do przetwarzania obrazu. Następnie wybierz narzędzie do wyboru linii prostej do kalibracji przestrzennej i narysuj linię wyboru wzdłuż średnicy studni.
Otwórz menu ustawiania skali i wprowadź znaną długość w polu znanej odległości oraz jednostkę w polu jednostki długości. Następnie otwórz menu właściwości i wprowadź interwał klatek w polu interwał klatek. Otwórz wtyczkę MTrackJ, wybierając wtyczki i MtrackJ.
Następnie kliknij przycisk śledzenia w oknie dialogowym, aby otworzyć menu konfiguracji śledzenia. Zaznacz opcję zastosuj lokalne przyciąganie kursora podczas ścieżki i wybierz ciemny środek ciężkości jako funkcję przyciągania. Następnie kliknij przycisk dodawania w oknie dialogowym MTrackJ, aby rozpocząć śledzenie.
Ustaw kursor tak, aby zakrył osoby w klipie wideo, które mają być śledzone. Następnie kliknij, aby wykryć ciemny środek ciężkości obiektu w kwadracie. Aby wygenerować tabelę danych, kliknij tabelę miar w oknie dialogowym MTrackJ, a następnie kliknij przycisk filmu, aby wygenerować film ze śledzoną trajektorią narysowaną jako kolorowa linia.
Na koniec kliknij przycisk Zapisz w oknie dialogowym MTrackJ, aby zapisać wyniki, w tym dane w śledzonej trajektorii dwuwymiarowej. W tym eksperymencie zarejestrowano i zaobserwowano zachowanie widłonogów Tigriopus w zakresie ochrony partnera. Analiza wykazała różnicę w średnim czasie trwania prób obronnych między parami samce-samice i parami samce-samce Tigriopus californicus, gdzie samce w parach męsko-męskich wykazywały stosunkowo krótszy czas trwania prób niż te w parach samiec-samica.
Dwuwymiarowe śledzenie przestrzenne nowo powstałych par stróżujących Tigriopus californicus ujawniło, że pary samce-samce wykazywały większą prędkość niż pary samiec-samica w pierwszych trzech sekundach prób obrony. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny etologii, biochemii i genetyki ewolucyjnej do zbadania unikalnego systemu kojarzenia tego typu widłonogóch.
Przegląd
Niniejsza praca przedstawia metody hodowli dziewiczych widłonogów z rodzaju Tigriopus oraz analizy ich zachowań związanych z ochroną partnera. Opisane techniki umożliwiają prowadzenie kontrolowanych eksperymentów, które mogą dostarczyć wiedzy na temat strategii rozrodczych tych organizmów strefy pływów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Ekologia behawioralna
- Biologia morza
- Biologia rozrodu
Wstęp
- Wideowuśce z rodzaju Tigriopus są powszechne w skalnych jeziorkach przypływowych.
- Zrozumienie zachowań związanych z ochroną partnera jest kluczowe dla badania sukcesu rozrodczego tych organizmów.
- Obecne metody badania tych zachowań nie są dobrze opracowane.
- Celem niniejszego badania jest wypełnienie tej luki za pomocą powtarzalnych technik.
Cel badania
- Opracowanie metod indywidualnej hodowli dziewiczych widłonogów z rodzaju Tigriopus.
- Ilościowa analiza zachowań związanych z ochroną partnera w kontrolowanych warunkach.
- Badanie wpływu czynników genetycznych i środowiskowych na zachowanie.
Zastosowane metody
- Pozyskiwanie i indywidualna hodowla zapłodnionych samic.
- Monitorowanie rozwoju i określanie płci widłonogów.
- Przygotowanie komór obserwacyjnych do analizy behawioralnej.
- Wykorzystanie analizy wideo do śledzenia zachowań związanych z ochroną partnera.
Główne wyniki
- Zaobserwowano różnice w czasie trwania prób ochrony między parami samiec-samica a parami samiec-samiec.
- Pary samiec-samiec wykazywały krótszy czas trwania ochrony w porównaniu z parami samiec-samica.
- W parach samiec-samiec odnotowano wyższe prędkości podczas początkowych prób ochrony.
- Opracowane metody mogą pomóc w dalszych badaniach z zakresu etologii i genetyki ewolucyjnej.
Wnioski
- Przedstawione techniki stanowią podstawę do badania zachowania widłonogów.
- Zdobyta wiedza może pogłębić zrozumienie strategii rozrodczych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych metodach w celu zgłębienia różnych zagadnień biologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia kontrolowaną hodowlę oraz ilościową analizę behawioralną modeli zooplanktonu, wspierając mechanistyczną redukcję ryzyka we wczesnej fazie odkrywania poprzez łączenie zmiennych genetycznych i środowiskowych z wynikami fenotypowymi. Podejście to zapewnia powtarzalne i mierzalne odczyty służące do walidacji celów w systemach niemammalnych, zwiększając pewność prognostyczną w badaniu szlaków sygnałowych. Stanowi ono skalowalną platformę do przesiewania punktów końcowych zachowania istotnych dla screeningu związków neuroaktywnych oraz oceny ryzyka ekologicznego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie zachowań rozrodczych jako odczytu fenotypowego w celu przesiewania czynników genetycznych i środowiskowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowany protokół hodowli w celu uzyskania osobników dziewiczych o kontrolowanej historii parowania.
- Wartość strategiczna: Wspiera testowanie hipotez dotyczących punktów końcowych zachowania w celu oceny ryzyka mechanizmów docelowych w modelach bezkręgowców.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe wskaźniki behawioralne, w tym czas trwania prób ochrony oraz prędkość pływania, do analizy zależnej od dawki.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje śledzenie wideo z kalibracją przestrzenną w celu uzyskania powtarzalnych, wysokoprzetwarzalnych danych behawioralnych.
- Wartość strategiczna: Umożliwia standaryzację testu do przesiewowych badań związków neuroaktywnych lub toksycznych wpływających na zachowanie lokomocyjne lub społeczne.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ułatwia ekstrapolację międzygatunkową biomarkerów behawioralnych w zastosowaniach z zakresu genetyki ekologicznej i toksykologii.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podłużne śledzenie rozwoju i zachowania w celu oceny skutków przewlekłej ekspozycji.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje o kontynuowaniu badań w oparciu o analizę ryzyka, dostarczając mechanistycznych wglądów w interakcje między genami a środowiskiem.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w początkowe etapy procesów badawczych, w których fenotypowanie behawioralne służy do walidacji celów oraz opracowywania testów do przesiewania związków neuroaktywnych lub środowiskowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących zachowań rozrodczych jako wskaźnika modulacji szlaków genetycznych.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowane, mierzalne wyniki behawioralne do oceny wpływu związków w formatach wielodobunkowych.
- Analityka: Zapewnia dwuwymiarowe dane o trajektorii i czasie, umożliwiając statystyczne porównanie fenotypów behawioralnych.
- Badania translacyjne: Łączy punkty końcowe behawioralne z istotnością ekologiczną i badaniami nad interakcjami między genami a środowiskiem.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do przesiewania behawioralnego w modelach zooplanktonowych i panelach stresorów środowiskowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez powiązanie czynników genetycznych i środowiskowych z mierzalnymi wynikami behawioralnymi.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanym protokołom hodowli, określania płci oraz śledzenia wideo.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczenie obiektywnych danych behawioralnych w celu minimalizacji ryzyka związanego z celem.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków na podstawie profili efektów behawioralnych w testach na całych organizmach.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Doświadczenie w hodowli zooplanktonu, mikroskopii oraz wideobehawioralnej analizie zachowań.
- Dostęp do inkubatorów, mikropipet, płytek wielodołkowych oraz oprogramowania do śledzenia wideo (np. ImageJ z wtyczką MTrackJ).
- Standaryzacja warunków środowiskowych (temperatura, oświetlenie, pożywka) we wszystkich fazach hodowli i testów.
- Uwzględnienie adaptacji różnych gatunków w zależności od morfologii, tempa rozwoju oraz markerów płciowych anten.
- Ograniczenia obejmują zmienność behawioralną szczepów pochodzących z natury oraz zależność powtarzalności wyników od kontrolowanych warunków środowiskowych.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:47
Preparation of Virgin Animals for Behavioral Observation
2:00
Behavioral Test and Video Recording of Mate-Guarding Behavior
2:53
Manual Analysis of Behavioral Properties
3:31
Two-Dimensional Tracking of Individuals and Pairs
5:17
Results: Male-Male pairs of T. californicus Demonstrate Shorter Duration of Pairing and Higher Velocity Compared to Male-Female Pairs
6:01
Conclusion
