Hiperandrogenny model myszy do badania zespołu policystycznych jajników
2 października 2018
Opisujemy rozwój szczupłego modelu myszy podobnego do PCOS z granulką dihydrotestosteronu w celu zbadania patofizjologii PCOS i potomstwa z tych matek podobnych do PCOS.
Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rozrodu. I endokrynologia. I mają zastosowanie w badaniu zespołu policystycznych jajników lub PCOS i hiperandrogenizmu.
Zaletą tej techniki jest to, że ułatwia konsekwentne, równomierne, długotrwałe uwalnianie hormonów w kosztowny i skuteczny sposób. JHU prowadzącym zabieg będzie Ping Xue, technik z mojego laboratorium. Do przygotowania granulatu dihydrotestosteronu lub DHT użyj żyletki, aby wyciąć 15 milimetrowy kawałek silikonowej rurki.
I użyj trzymililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 20, aby wstrzyknąć od dwóch do pięciu milimetrów kleju medycznego silikonu do jednego końca tubki. Pozostaw rurkę do wyschnięcia na noc. I sprawdź, czy na uszczelnionym końcu nie ma pęcherzyków powietrza.
Nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej, wlej proszek DHT do plastikowej łodzi w kapturze przepływowym. Wciśnij otwarty koniec tubki z klejem w proszek. Za pomocą dużego, wyprostowanego spinacza do papieru ubij proszek w dół do rurki, aż DHT osiągnie odpowiednią głębokość eksperymentalną.
Następnie uszczelnij otwartą stronę rurki silikonem na noc. Następnego ranka odetnij każdą zapieczętowaną stronę, aby uzyskać dwumilimetrową długość silikonu po obu stronach DHT i bez granulek kontrolnych DHT. Następnie przechowuj granulki w stożkowej tubie o pojemności 50 mililitrów owiniętej folią w temperaturze pokojowej przez okres do trzech miesięcy.
W przypadku generowania modelu myszy PCOS zrównoważ do 20 DHT lub kontroluj granulki w oddzielnych 50-mililitrowych stożkowych probówkach zawierających 30 mililitrów 0,9 procent soli fizjologicznej przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia potwierdź brak reakcji na uszczypnięcie palca u znieczulonej dwumiesięcznej samicy myszy i użyj sterylnej gazy, aby podać sekwencyjne peelingi jodonowe i 70-procentowe etylol na obszar operacyjny. Następnie wykonaj pięciomilimetrowe nacięcie przez skórę w pobliżu szyi.
I użyj trokara o rozstawie dziesięciu centymetrów, aby zrobić 15-milimetrowy tunel w kierunku rostralnym. Za pomocą trokaru wprowadzić granulkę grzbietowo do tunelu i uszczelnić nacięcie klejem chirurgicznym. Ręcznie przybliż krawędzie rany za pomocą kleszczy i delikatnymi pociągnięciami pędzla nałóż trzy cienkie warstwy płynnego kleju na jeden centymetr z każdej strony przeciwległych krawędzi rany.
Następnie umieść samą mysz w klatce na poduszce grzewczej z monitorowaniem aż do pełnego rozłożenia. Wymiana granulki co cztery tygodnie w celu utrzymania stałego poziomu ekspozycji na androgeny. Trzy dni po wprowadzeniu granulek użyj pipety p10, aby wstrzyknąć dziesięć mikrolitrów sterylnego roztworu soli fizjologicznej do jamy pochwy i użyj końcówki pipety, aby natychmiast odzyskać sól fizjologiczną.
Rozprowadź próbkę soli fizjologicznej komórek pochwy na oznaczonym szkiełku. I pozostaw sól fizjologiczną do wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Umieść wysuszone szkiełka w pojemniku zawierającym 100% etynolu na co najmniej pięć minut.
Następnie barwić szkiełka przez jedną minutę w buforze B i buforze C z zestawu do szybkiego barwienia. Pod koniec inkubacji buforu C przemyć szkiełka wodą z kranu przez trzy sekundy i wysuszyć je w temperaturze pokojowej. Aby określić cykliczność rujową, obejrzyj szkiełka pod dziesięciokrotnym obiektywem mikroskopu świetlnego.
Policz dni na każdym etapie i podziel je przez łączną liczbę dni, aby obliczyć procent czasu na każdym etapie. Aby przetestować tolerancję glukozy, 20-dniowa insercja DHT, pościć myszy przez noc. Zważ myszy następnego ranka i użyj glukometru i pasków testowych, aby zmierzyć poziom glukozy w krwi w żyłach ogonowych.
Wstrzyknij myszom dwa gramy na kilogram masy ciała 20 procent dekstrozy. Następnie zmierz poziom glukozy w próbkach krwi z żyły ogonowej po 15, 30, 60, 90, 120 minutach od podania dekstrozy. Aby uzyskać potomstwo płci żeńskiej od samic z wszczepionymi DHT, przenieś samicę myszy do testowanej w klatce z udowodnionym płodnym samcem w 15 dniu, po wprowadzeniu osadu.
Dokumentuj masę ciała kobiety co tydzień, aby ustalić, czy mysz jest w ciąży. W siódmym dniu po porodzie zanurz końcówkę lancetu w paście do tatuażu i oznacz każde szczenię tatuażem na palcu u nogi. Waż oznaczone myszy co siedem dni do 70 dnia życia.
Między datą pourodzeniową od 12 do 16 uderz myszy w uszy, aby ponumerować je zgodnie z systemem, jak pokazano na rysunku. Aby odróżnić płeć, zbadaj brzuszną stronę każdej oznaczonej myszy. Samice będą miały widoczne sutki.
Aby pobrać próbki krwi do różnych dalszych analiz, użyj lancetu, aby zebrać przybliżoną eksperymentalną objętość krwi między dziewiątą a dziesiątą rano przez krwawienie z żyły podżuchwowej. I odwirować próbki, aby umożliwić pobranie surowicy. Następnie przechowuj próbki surowicy w 1,5-mililitrowych mikroprobówkach wirówkowych w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu ich analizy.
Aby ocenić dojrzałość płciową u potomstwa płci żeńskiej DHT, codziennie po odsadzeniu w 21 dniu po urodzeniu należy sprawdzić otwór pochwy za pomocą oględzin. I użyj kalibrów, aby zmierzyć odległość odbytu i narządów płciowych. Chociaż wartości bezwzględne DHT w surowicy różnią się między spektrometrią mas a analizą Elisa, względna ludowa zmiana insercji DHT w porównaniu z brakiem DHT jest podobna zarówno w testach, jak i w różnych eksperymentach.
Poziomy DHT są znacznie zwiększone od momentu przed poczęciem do ciąży zarówno u myszy DHT, jak i bez DHT. Jednak poziomy DHT są dwukrotnie wyższe u myszy DHT w porównaniu do myszy bez DHT zarówno w okresie przedkoncepcyjnym, jak i ciążowym. Dorosłe córki DHT wykazują różnice w funkcjach rozrodczych.
Na przykład, zakłócona cykliczność rujowa w porównaniu z dorosłymi córkami bez DHT doświadczającymi znacznie dłuższych czasów w metestrus diestrus i krótszych w pro-esterous i esterous. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby pamiętać, aby inkubować granulki przez 24 godziny, zanim zostaną użyte do równomiernego uwalniania hormonu. Po tej procedurze można również zbadać reprodukcyjne i metaboliczne konsekwencje ekspozycji na DHT.
Po opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się endrochronologią i interakcjami matczyno-płodowymi do badania PCOS i wpływu niskiego poziomu hiperandrogenizmu u samic myszy. Nie zapominaj, że praca z DHT może być bardzo niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek, maski i okularów oraz praca w kapturze bezpieczeństwa biologicznego, powinny być zawsze podejmowane podczas wykonywania tej procedury.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia szczupły model myszy z zespołem PCOS, opracowany z wykorzystaniem pelletów z dihydrotestosteronem w celu zbadania patofizjologii zespołu policystycznych jajników (PCOS). Model ten ma na celu dostarczenie wiedzy na temat wpływu tych PCOS-podobnych matek na potomstwo.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia rozrodu
- Endokrynologia
- Zespół policystycznych jajników (PCOS)
Wprowadzenie
- PCOS to powszechne zaburzenie endokrynologiczne wpływające na zdrowie reprodukcyjne.
- Zrozumienie mechanizmów PCOS może pomóc w opracowaniu strategii terapeutycznych.
- Dihydrotestosteron (DHT) jest kluczowym hormonem zaangażowanym w patofizjologię PCOS.
- Modele zwierzęce są niezbędne do badania wpływu zmian hormonalnych na rozród.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnego modelu mysiego, który naśladuje cechy PCOS.
- Zbadanie długofalowych skutków hiperandrogenizmu dla zdrowia reprodukcyjnego.
- zbadanie wpływu warunków przypominających PCOS na rozwój potomstwa.
Zastosowane metody
- Przygotowanie peletek dihydrotestosteronu w celu zapewnienia stałego uwalniania hormonu.
- Monitorowanie wyników reprodukcyjnych w modelu mysim przypominającym PCOS.
- Ocena stanu zdrowia i rozwoju potomstwa samic z modelu PCOS.
- Zastosowanie kosztowo efektywnego podejścia do podawania hormonów.
Główne wyniki
- Model z sukcesem naśladuje kluczowe cechy PCOS.
- Potomstwo samic z PCOS-like wykazywało zaburzenia zdrowia reprodukcyjnego.
- Stabilne uwalnianie hormonów osiągnięto za pomocą metody implantacji pelletów.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia wpływu maciernego hiperandrogenizmu.
Wnioski
- Szczupły model mysi przypominający PCOS jest cennym narzędziem do badania PCOS.
- Uzyskane wnioski mogą być pomocne w przyszłych badaniach i podejściach terapeutycznych.
- Konieczne są dalsze badania w celu zbadania długofalowych skutków u potomstwa.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten model myszy o niskiej masie ciała z cechami PCOS stanowi powtarzalny system do badania dysfunkcji rozrodczych i metabolicznych wywołanych hiperandrogenizmem, bez zakłócającego wpływu otyłości, co umożliwia weryfikację mechanistyczną na wczesnym etapie odkrywania leków. Model ten wspiera walidację punktów uchwycenia poprzez powiązanie ekspozycji na DHT z zaburzeniami cyklu rujowego oraz zmienionymi fenotypami potomstwa, zapewniając wiarygodność prognostyczną w testowaniu hipotez terapeutycznych. Jego użyteczność w ocenie skutków transgeneracyjnych pozycjonuje go jako translacyjne narzędzie biomarkerowe do selekcji projektów w portfelach badań nad zdrowiem kobiet.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie szlaków zależnych od androgenów w dysfunkcjach rozrodczych poprzez kontrolowaną ekspozycję na DHT.
- Wartość operacyjna: Zapewnia spójny system uwalniania hormonów w celu odizolowania efektów androgennych od czynników metabolicznych.
- Wartość naukowa: Wspiera walidację funkcjonalną celów zaangażowanych w fenotypy cykliczności rui oraz tolerancji glukozy.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje mierzalne punkty końcowe, takie jak stopnie cytologii pochwy i krzywe tolerancji glukozy, służące do standaryzacji analizy.
- Wartość operacyjna: Dostarcza powtarzalnych odczytów fenotypowych w obrębie kohort, co umożliwia wiarygodny screening związków.
- Wartość naukowa: Ułatwia odkrywanie biomarkerów poprzez pomiar poziomu DHT w surowicy oraz poziomu testosteronu u potomstwa.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Modelowanie hiperandrogenizmu matczynego w celu badania rozwoju zaburzeń rozrodczych u potomstwa.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podłużne śledzenie początku dojrzewania oraz funkcji rozrodczych w pokoleniu F1.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji do podejmowania decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez ujawnianie transgeneracyjnych sygnałów dotyczących bezpieczeństwa.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Model ten wpisuje się w kontinuum odkryć, od testowania hipotez dotyczących celów terapeutycznych po walidację przedkliniczną, szczególnie w przypadku leków endokrynologicznych i reprodukcyjnych, gdzie środowisko hormonalne wpływa na skuteczność i bezpieczeństwo.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez powiązanie podaży DHT z zaburzeniami cykli rujowych i nieelastycznością metaboliczną.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy systemów biologicznych ze standaryzowaną ekspozycją na hormony w celu oceny związków.
- Analityka: Umożliwia ilościowe porównanie AUC glukozy oraz wskaźników cyliczności w grupach badawczych.
- Badania translacyjne: Łączy fenotyp matczyny z efektami u potomstwa, wspierając ocenę toksyczności rozwojowej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do badania zaburzeń wywołanych androgenami w wielu obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w przypisywaniu fenotypów nadmiernej ilości androgenów w przeciwieństwie do otyłości lub insulinooporności.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanemu przygotowaniu pelletów i protokołowi ich comiesięcznej wymiany.
- Wartość strategiczna: Poprawia decyzje typu go/no-go poprzez wczesne wykrywanie wad reprodukcyjnych i metabolicznych w fazie odkrywania.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka na podstawie efektów w klinicznie istotnym modelu hiperandrogenizmu.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w chirurgii gryzoni, obchodzeniu się z hormonami oraz analizie cytologii pochwy.
- Zależne od sterylnej techniki chirurgicznej, narzędzi do implantacji pelletów oraz kontrolowanego środowiska do przechowywania hormonów.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w grupach endokrynologii, biologii rozrodu i toksykologii.
- Wiąże się z koniecznością rozważenia adaptacji przy przenoszeniu wyników na inne gatunki lub modele chorobowe.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak ryzyko zachorowalności pooperacyjnej oraz konieczność comiesięcznej wymiany pelletów w celu utrzymania poziomu hormonów.
Najczęściej zadawane pytania (FAQ) dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:47
Dihydrotestosterone (DHT) Pellet Preparation
2:04
DHT Insertion and Replacement
4:56
Reproductive Profile Assessment of Female Offspring from Chronically DHT-inserted Dams
6:27
Results: Representative Mouse PCOS Model Analyses
7:28
Conclusion
