Pomiar zużycia tlenu przez mitochondria wątroby i kinetyki wycieku protonów w celu oszacowania oddychania mitochondrialnego u bydła mlecznego rasy holsztyńskiej

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie energetyki, takie jak zdrowie mitochondriów, efektywność energetyczna i zużycie energii. Główną zaletą tej techniki jest to, że zużycie tlenu w izolowanych mitochondriach jest mierzone bezpośrednio. Wyniki nie muszą być korygowane dla innych wewnątrzkomórkowych procesów metabolicznych.

Po raz pierwszy zdecydowaliśmy się zastosować tę metodę u bydła mlecznego, gdy chcieliśmy zbadać, jak wydajność mitochondriów wpływa na wydajność paszy. Demonstracja wideo tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy izolacji mitochondriów są trudne do nauczenia, ponieważ muszą być spójne i precyzyjne. Tak szybko, jak to możliwe, po pobraniu próbki wątroby od krowy, umyj ją w pożywce do izolacji mitochondriów w celu usunięcia czerwonych krwinek.

Za pomocą nożyczek drobno zmiel tkankę do schłodzonej zlewki, która zawiera wystarczającą ilość podłoża izolacyjnego, aby tkanka była wilgotna. Przenieś zmieloną wątrobę do 30-mililitrowej szklanej fiolki zawierającej pożywkę do izolacji mitochondriów. Dodać tłuczek teflonowy o prześwicie 0,16 milimetra, który był inkubowany w lodzie, i homogenizować próbkę wątroby z prędkością 500 obr./min przez jedną minutę z czterema uderzeniami na minutę.

Następnie przenieś homogenat do probówki zawierającej pożywkę izolacyjną mitochondriów i umieść ją w zlewce wypełnionej lodem. Odwirować homogenat w temperaturze 500 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Odrzucić osad i przenieść supernatant do schłodzonej probówki wirówkowej.

Odwirować otrzymany supernatant w temperaturze 10 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut, aby uzyskać osad mitochondrialny. Ponownie zawiesić i przepłukać osad w 10 mililitrach pożywki do izolacji mitochondriów z BSA bez kwasów tłuszczowych. Następnie odwirować w temperaturze 8, 100 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut.

Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach pożywki izolacyjnej. Umieść to na lodzie, aż będzie gotowe do użycia do testów zużycia tlenu i wycieku protonów. Oznaczyć stężenie białka w zawiesinie granulek za pomocą zestawu kwasu bicinchoninowego zgodnie z instrukcjami producenta, używając BSA jako wzorca.

Najpierw utwórz media zużywające tlen, jak opisano w protokole tekstowym. Inkubować pożywkę zużywającą tlen w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Następnie należy skonfigurować komorę oddechową, pompę i elektrodę tlenową do systemu oksygraficznego zgodnie z instrukcjami producenta.

Następnie umieść jeden mililitr pożywki zużywającej tlen w komorze oddechowej. Następnie dodaj 0,35 miligrama białka mitochondrialnego do komory. Mieszaj energicznie, aby roztwór nasycił się powietrzem i utrzymywał temperaturę 30 stopni Celsjusza.

Rejestruj zużycie tlenu przez około pięć minut. Gdy zużycie tlenu staje się stałe, reprezentowane przez malejącą linię prostą, zapisz to jako podstawowe zużycie tlenu. Dodaj 1,25 mikrolitra czteromilimolowego roztworu rotenonu, aby zahamować złożony, a następnie dodaj pięć mikrolitrów jednego molowego roztworu bursztynianu, aby osiągnąć końcowe stężenie pięciomilimolowego bursztynianu w komorze oddechowej.

Jest to zużycie tlenu w IV stanie. Następnie dodaj jeden mikrolitr 100-milimolowego roztworu ADP, aby osiągnąć końcowe stężenie 100 mikromolów w komorze oddechowej. Zużycie tlenu zmniejszy się przez około pięć minut, a następnie stanie się linią prostą.

Zapisz to zużycie tlenu jako oddech w stanie III. Oblicz współczynnik kontroli oddechowej zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie odessać wszystkie roztwory z komory oddechowej.

Przepłucz komorę kilkakrotnie podwójnie dejonizowaną wodą. Najpierw przygotuj roztwór 80 nanogramów na mililitr nigerycyny w etanolu, ograniczając ilość dodawanego etanolu do mniej niż jednego mikrolitra. Przygotuj również roztwór ośmiu mikrogramów oligomycyny na mililitr w etanolu.

Po dokładnym przepłukaniu komory podwójnie dejonizowaną wodą, umieścić jeden mililitr pożywki zużywającej tlen w komorze oddechowej i energicznie wymieszać mieszadłem magnetycznym. Dodaj 0,35 miligrama białka mitochondrialnego do komory oddechowej. Dodaj elektrodę wrażliwą na metylotrifenylofosfonium do konfiguracji komory, upewniając się, że drugi koniec jest prawidłowo podłączony do pH-metru.

Dodaj 1,25 mikrolitra czteromilimolowego roztworu rotenonu, aby zahamować Complex I. Rejestruj oddech przez dwie do pięciu minut. Zapisz wartość zużycia tlenu, gdy stanie się stała. Następnie dodaj 0,56 mikrolitra roztworu oligomycyny, aby zahamować wykorzystanie ADP.

Nagrywaj oddech przez około dwie do pięciu minut. Zapisz wartość zużycia tlenu, gdy stanie się stała. Następnie dodaj 0,112 mikrolitra 80 nanogramów na mililitr roztworu nigerycyny, aby znieść gradient pH przez wewnętrzną błonę mitochondriów.

Rejestruj oddech przez dwie do pięciu minut i notuj wartość zużycia tlenu, gdy stanie się stała. Dodaj pięć mikrolitrów 10-milimolowego roztworu metylopitrifenylofosfonium do inkubacji mitochondriów, aby rozpocząć przygotowywanie krzywej wzorcowej. Powtórzyć to dodawanie jeszcze cztery razy, aż do uzyskania całkowitego stężenia 2,5.

Dodano mikromolowy. Następnie dodaj pięć mikrolitrów jednego molowego roztworu bursztynianu do komory, aby rozpocząć oddychanie. Rejestrować oddech aż do uzyskania stabilnego śladu.

Następnie dodać malonian, aby miareczkować system zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W tym badaniu RCR i kinetyka wycieku protonów są mierzone w mleku krów mlecznych rasy holsztyńskiej 70 dni po karmieniu krów mlecznych różnymi poziomami miedzi, i manganu przez 28 dni. Oddychanie w stanie IV jest najwyższe u krów ze względu na niski poziom manganu, ale jest najniższe u krów kontrolnych, co wskazuje, że mangan odgrywa ważną rolę w minimalizowaniu oddychania zależnego od wycieku protonów.

Analiza oddychania zależnego od nieszczelności protonów w wątrobie pokazuje, że oddychanie to jest największe u krów leczonych niskim poziomem manganu, a najniższe u krów kontrolnych. Wyniki te potwierdzają, że grupa o niskiej zawartości manganu ma największy stan oddychania IV, podczas gdy grupa kontrolna ma najniższy. Chociaż wykorzystanie paszy jest wyższe u wołów rasy Angus urodzonych od buhajów o niskim RFI niż u buhajów o wysokim RFI, nie znalazło to odzwierciedlenia w mitochondrialnym RCR ani kinetyce wycieku protonów.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wszystkie fiolki i zlewki znajdowały się na lodzie podczas przetwarzania mitochondriów. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się żywieniem bydła mlecznego do zbadania roli wydajności mitochondriów w wydajności paszy i funkcji mitochondriów w wątrobie. Nie zapominaj, że praca z rotenonem może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek, ochrony oczu i odpowiednich środków ochrony osobistej.