Name: Pomiar zużycia tlenu przez mitochondria wątroby i kinetyki wycieku protonów w celu oszacowania oddychania mitochondrialnego u bydła mlecznego rasy holsztyńskiej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-30T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Poznaj metodę pomiaru zużycia tlenu przez mitochondria wątroby u bydła mlecznego rasy holsztyńskiej. Technika ta pozwala ocenić efektywność mitochondrialną i jej wpływ na wykorzystanie paszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez fundusze Alltech i USDA Hatch za pośrednictwem Center for Food Animal Health w UC Davis School of Veterinary Medicine.

Wszystkie opisane tutaj metody, protokoły i badania zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Kalifornijskiego w Davis.
1. Pobranie biopsji wątroby od krowy mlecznej rasy holsztyńskiej
UWAGA: Biopsja wątroby powinna być wykonana przez licencjonowanego lekarza weterynarii. Biopsje wątroby można wykonać w gospodarstwie mlecznym, w którym znajdują się krowy. Krowy mleczne w okresie laktacji mogą być nadal dojone normalnie, a mleko nie musi być pobierane z pożywienia przed lub po zabiegu. Zaleca się, aby do wykonania biopsji wątroby krowy mlecznej potrzebne były co najmniej 4 osoby: weterynarz do wykonania biopsji, opiekun zwierząt stojący przy biodrze krowy w celu ochrony obszaru biopsji i weterynarz, technik laboratoryjny na zewnątrz kojca do przenoszenia narzędzi, materiałów i próbki biopsji do i od lekarza weterynarii oraz utrzymywania czystego obszaru, który może znajdować się z tyłu pojazdu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), a technik pobiera próbkę wątroby i rozpoczyna izolację mitochondriów.
<ol>
	<li>Na miesiąc przed biopsją wątroby należy podać krowom szczepionkę przeciwko Clostridii. Twórz pakiety chirurgiczne, autoklawując ręczniki chirurgiczne, narzędzie do biopsji, uchwyty na skalpele i sprzęt chirurgiczny.</li>
	<li>Na dzień przed biopsją wątroby należy wstrzyknąć krowie chlorowodorek ceftiofuru 0,044 ml/kg masy ciała podskórnie w szyję. Monitoruj temperaturę krów, spożycie i wyniki kału, aby wykorzystać je jako punkt odniesienia dla normalnego funkcjonowania.</li>
	<li>Stworzyć pożywkę do izolacji mitochondriów (MIM) zawierającą 220 mM mannitolu, 70 mM sacharozy, 20 mM HEPES, 1 mM EDTA i 0,1% (w/v) BSA wolnego od kwasów tłuszczowych, pH 7,4 w 4 °C. Potrzebne będzie około 30 ml na próbkę.</li>
	<li>W razie potrzeby należy fizycznie unieruchomić krowę za pomocą zapięcia na głowę z kantarem (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Za pomocą kantara przywiąż jej głowę do lewej strony słupka. W razie potrzeby można zastosować ogranicznik chemiczny (chlorowodorek ksylazyny 100 mg/ml dożylnie przy 0,010-0,015 mg / kg masy ciała).</li>
	<li>Obszar biopsji znajduje się w prawej 10 - 11 przestrzeni międzyżebrowej (<silna klasa="xfig">Ryc. 3). Narysuj linię prostą od prawego koksa bulwy do punktu prawego ramienia. Miejsce biopsji to miejsce, w którym linia ta przecina się z 10-11. przestrzenią międzyżebrową. Wysterylizuj obszar krowy, który ma być poddany biopsji, goląc powierzchnię kwadratową o powierzchni 10 cm (<silna klasa="xfig">Rysunek 4). Umyj obszar 10% peelingiem providone (<silna klasa="xfig">Rysunek 5) okrężnymi ruchami. Spryskaj obszar 70% roztworem etanolu (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 6). Powtórzyć pranie prowidonem i etanolem. 
	UWAGA: Wątroba znajduje się w nieco innym położeniu u bydła mlecznego rasy holsztyńskiej niż u bydła mięsnego.</li>
	<li>Wstrzyknij 2% chlorowodorku lidokainy (10-15 ml) miejscowo w obszar, aby zapewnić znieczulenie skóry i leżących pod nią mięśni oraz tkanki łącznej (<silna klasa = "xfig">Ryc. 7). Powtórz pranie prowidonem i 70% etanolem. 
	UWAGA: Zakończenia nerwowe znajdują się w skórze i mięśniach, ale nie w narządach wewnętrznych, więc potrzebne jest tylko znieczulenie miejscowe. Co najwyżej krowa powinna odczuwać tylko pewien ucisk i brak bólu podczas procedury biopsji.</li>
	<li>Wykonaj 1-2 cm nacięcie kłute przez skórę 10-11 przestrzeni międzyżebrowej (<silna klasa="xfig">Ryc. 8). Przełóż przyrząd do biopsji wątroby bydła Schackelforda-Courtneya przez skórę i skieruj instrument do biopsji w lekkim kierunku czaszki, kontynuując przez przeponę i do wątroby (<silna klasa = "xfig">Rysunek 9, <silna klasa = "xfig">Rysunek 10). Pobrać 1 g próbki wątroby i wyjąć instrument (<silna klasa="xfig">Ryc. 11). Zamknij skórę za pomocą założenia szwu (<silna klasa="xfig">Rysunek 12).</li>
	<li>Umieścić próbkę wątroby w stożkowej probówce z wystarczającą ilością MIM do pokrycia próbki, na lodzie w celu natychmiastowej izolacji mitochondriów</li>
	<li>Sprawdź nacięcie pod kątem zaczerwienienia, obrzęku, ciepła lub bólu w ciągu 24 godzin od biopsji i wstrzyknij krowie chlorowodorek ceftiofuru 0,044 ml/kg masy ciała podskórnie w szyję raz dziennie przez następne 3 dni (<silna klasa = "xfig">Ryc. 13). Monitoruj temperaturę krowy, spożycie i wyniki kału codziennie przez 1 tydzień po biopsji wątroby. Jeśli wystąpi gorączka, kontynuuj antybiotyki według uznania lekarza weterynarii. 
	UWAGA: Jeśli krowa wykazuje oznaki bólu, takie jak kopanie w miejsce nacięcia, leżenie, zaczerwienienie, ciepło lub reakcja na dotyk w ciągu 1 godziny po biopsji wątroby, w celu złagodzenia bólu i stanu zapalnego można zastosować dożylne wstrzyknięcie 1 mg/kg masy ciała megluminy fluniksyny. W razie potrzeby można podać drugie wstrzyknięcie.</li>
	<li>Zdejmij szwy 7 dni po biopsji.</li>
</ol>
2. Izolowanie mitochondriów z wątroby krowy mlecznej
<ol>
	<li>Tak szybko, jak to możliwe po pobraniu próbki wątroby od krowy, umyj próbkę wątroby w MIM (krok 1.3) w celu usunięcia czerwonych krwinek i drobno zmielić próbkę nożyczkami. Wątroba powinna być rozdrobniona w schłodzonej zlewce zawierającej wystarczającą ilość podłoża izolacyjnego, aby utrzymać wilgotność tkanki.</li>
	<li>Umieścić zmieloną wątrobę w szklanej fiolce o pojemności 30 ml z teflonowym tłuczkiem o odstępie 0,16 mm, inkubowanym w lodzie i zawierającym MIM (1:4 w/v).</li>
	<li>Homogenizować próbkę wątroby w teflonowym tłuczku z prędkością 500 obr./min przez minutę z 4 uderzeniami/min. 
	UWAGA: Homogenat wątroby jest przechowywany w zlewce wypełnionej lodem w MIM podczas całego procesu, a wszystkie poniższe etapy wirowania są zakończone w temperaturze 4 °C</li>
	<li>Odwirować homogenat przy 500 x g przez 10 minut, wyrzucić osad, przenieść supernatant do schłodzonej probówki wirówkowej, a następnie odwirować powstały supernatant przy 10 000 x g przez 10 minut, aby uzyskać osad mitochondrialny.</li>
	<li>Zawiesić i przepłukać osad w 10 ml MIM BSA bez kwasów tłuszczowych i odwirować przy 8100 x g przez 10 minut. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić i przemyć osad w 10 ml MIM bez BSA wolnego od kwasów tłuszczowych i odwirować przy 8100 x g przez 10 minut. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w 200 μl pożywki izolacyjnej i umieścić na lodzie do momentu użycia do zużycia tlenu i testów kinetycznych wycieku protonów.</li>
	<li>Oznaczyć stężenie białka w zawiesinie granulek (rozcieńczenie 1/100) za pomocą zestawu kwasu bicunchoninowego (BCA) zgodnie z protokołem producenta z BSA jako standardem. Każde białko jest uważane za białko mitochondrialne.</li>
</ol>
3. Pomiar zużycia tlenu w mitochondriach (stan 3 i stan 4)
<ol>
	<li>Tworzyć pożywki zużywane tlen (OCM) ze 120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes i 1 mM EGTA, pH 7,4 w 30 °C z 0,3% odtłuszczonym BSA. Potrzebne będzie około 3 ml na próbkę. Przygotuj również roztwór 8 μg/ml oligomycyny w etanolu.</li>
	<li>Inkubować OCM w temperaturze 30 °C. Ustawić komorę oddechową, pompę i elektrodę tlenową zgodnie ze wskazówkami producenta (system oksygraficzny). Oprogramowanie oksygraficzne powinno być już zainstalowane na komputerze.</li>
	<li>Umieść 1 ml OCM w komorze oddechowej i energicznie wymieszaj. Pomoże to zapewnić, że roztwór zostanie nasycony powietrzem.</li>
	<li>Dodać 0,35 mg białka mitochondrialnego do komory oddechowej i utrzymywać temperaturę 30 °C.</li>
	<li>Rejestruj zużycie tlenu przez około 5 minut. System oksygraficzny rejestruje stężenie tlenu, dzięki czemu wraz ze wzrostem oddechu stężenie tlenu maleje. Gdy zużycie tlenu stanie się stałe (malejąca linia prosta), zapisz zużycie tlenu (nachylenie linii = stężenie tlenu/czas). Jest to podstawowe zużycie tlenu.</li>
	<li>Dodać 1,25 μl 4 mM roztworu rotenonu w celu zahamowania kompleksu I, a następnie dodać 5 μl 1 M roztworu bursztynianu, aby osiągnąć końcowe stężenie 5 mM bursztynianu w komorze oddechowej. To jest oddech w stanie 4.</li>
	<li>Dodać 1 μl 100 mM roztworu ADP, aby osiągnąć końcowe stężenie w komorze oddechowej 100 μM. Stężenie tlenu zmniejszy się (zwiększone oddychanie), a następnie po około 5 minutach stanie się linią prostą. Zapisuj zużycie tlenu (nachylenie linii = stężenie tlenu/czas). To jest oddychanie w stanie 3.</li>
	<li>Opcjonalnie: Pod koniec cyklu dodaj FCCP (całkowita objętość 0,2 μM), aby wywołać maksymalne oddychanie. Nagrywaj oddech przez około 5 minut (w przybliżeniu). Gdy zużycie tlenu stanie się stałe, zapisz zużycie tlenu. Jest to maksymalne zużycie tlenu.</li>
	<li>Obliczać Współczynnik kontroli oddechu (RCR) za pomocą równania Zużycie tlenu w stanie 3 / Zużycie tlenu w stanie 4.</li>
	<li>Odessać wszystkie roztwory z komory oddechowej. Przepłucz komorę kilkakrotnie podwójnie dejonizowaną wodą.</li>
</ol>
4. Pomiar potencjału błony mitochondrialnej (MMP) i siły napędowej protonów (PMF)
<ol>
	<li>Przygotować roztwór 80 ng/ml nigerycyny w etanolu. 
	UWAGA: Te chemikalia rozpuszczają się w etanolu i należy dołożyć wszelkich starań, aby ograniczyć ilość dodawanego etanolu do mniej niż 1 μl, ponieważ etanol może rozłączyć system transportu elektronów i spowodować dysfunkcję mitchondrium.</li>
	<li>Po dokładnym przepłukaniu komory podwójnie dejonizowaną wodą, umieścić 1 ml OCM w komorze oddechowej i energicznie wymieszać mieszadłem magnetycznym. Pomoże to zapewnić, że roztwór zostanie nasycony powietrzem. Dodać elektrodę wrażliwą na metylo-trifenylofosfonię (TPMP+) do konfiguracji komory. Elektroda TPMP+ powinna być podłączona do pH-metru i wartości są odczytywane z pH-metru.</li>
	<li>Dodać 0,35 mg białka mitochondrialnego do komory oddechowej.</li>
	<li>Dodaj 1,25 μl 4 mM roztworu rotenonu, aby zahamować Kompleks I. Nagrywaj oddychanie przez 2-5 minut (w przybliżeniu). Gdy zużycie tlenu stanie się stałe, zapisz zużycie tlenu.</li>
	<li>Dodać 0,56 μl roztworu oligomycyny o stężeniu 8 μg/ml w celu uzyskania końcowego stężenia 2,8 μg oligomycyny / 0,35 mg białka mitochondrialnego, aby zahamować wykorzystanie ADP. Nagrywaj oddech przez 2-5 minut (w przybliżeniu). Gdy zużycie tlenu stanie się stałe, zapisz zużycie tlenu.</li>
	<li>Dodaj 0,112 μl 80 ng/ml roztworu nigerycyny, aby znieść gradient pH przez wewnętrzną błonę mitochondriów. Nagrywaj oddech przez 2-5 minut (w przybliżeniu). Gdy zużycie tlenu stanie się stałe, zapisz zużycie tlenu. 
	UWAGA: Rotenon i oligomycyna są używane do blokowania łańcucha transportu elektronów odpowiednio w syntazie kompleksu I i ATP. Nigerycyna jest dodawana w celu przekształcenia transbłonowego gradientu H+ na gradient K+, który można zmierzyć za pomocą elektrody.</li>
	<li>Przygotować krzywą wzorcową dla TPMP+, dodając 5 μl 10 mM roztworu TPMP+ do inkubacji mitochondrialnej. Powtórz ten krok jeszcze cztery razy, aż zostanie dodane całkowite stężenie 2,5 μM TPMP+.</li>
	<li>Rozpocznij oddychanie, dodając do komory 5 μl 1M bursztynianu.</li>
	<li>Rejestruj oddech do momentu uzyskania stabilnego śladu, a następnie miareczkować system, dodając malonian. Dodatki malonianu powinny wynosić 0,5 μl, 1 μl, 1,5 μl, 3,0 μl, 6,0 μl, 9,0 μl, a następnie 12,5 μl 0,1 mM roztworu malonianu, aby uzyskać kolejne dodawanie stężeń malonianu w komorze inkubacyjnej 0,1, 0,2, 0,3, 0,6, 1,2, 1,8 i 2,5 mM.</li>
	<li>Zbierz dane z dwóch elektrod (tlenowej i TPMP+). Oprogramowanie do akwizycji danych z systemu oxygraph może być wykorzystywane do zbierania jednoczesnych pomiarów zużycia tlenu w mitochondriach i potencjału błony mitochondrialnej oraz obserwacji zmian zużycia tlenu w czasie rzeczywistym. Rysunek 14 pokazuje, jak system oksygraficzny rejestruje zużycie tlenu w miarę postępu eksperymentu.</li>
	<li>Obliczać MMP w mV na podstawie równania Nernsta: 
	MMP = 61,5 log (dodano [TPMP+] – zewnętrzne [TPMP+]) x korekcja wiązania TPMP+/ (0,001 x mg białka/ml x [TPMP+]) 
	Stosuje się korektę wiązania TPMP+ na poziomie 0,4 μL/mg białka mitochondrialnego-1. 
	Przykładowe obliczenia na podstawie stężeń w protokole: 
	MMP = 61,5 x log (5 μM – 2 μM) x 0,4/ (0,001 x 0,35 mg białka mitochondrialnego/ml x 2 μM) 
	MMP = 198,9 mV</li>
	<li>Oszacuj PMF, wykreślając wykres MMP w stosunku do zużycia tlenu (<silna klasa="xfig">Rysunek 15). PMF jest podawany jako zużycie tlenu przy potencjale membranowym 165 mV. 
	UWAGA: Miareczkowanie łańcucha transportu elektronów malonianem (0,1 do 2,5 mM) pokazuje kinetyczną odpowiedź wycieku protonu na MMP. Następnie wykreślenie MMP w stosunku do zużycia tlenu określa kinetykę wycieku protonów. PMF określa się, obliczając zużycie tlenu przy wspólnym potencjale membranowym (165 mV).</li>
	<li>Na końcu ostatniego cyklu próbki dodać FCCP (0,2 μM objętości całkowitej) w celu wywołania maksymalnego oddychania i uwolnienia TPMP+ w celu skorygowania linii podstawowej.</li>
	<li>Odessać wszystkie roztwory z komory oddechowej. Przepłucz komorę kilkakrotnie podwójnie dejonizowaną wodą. Na koniec dnia komorę należy również kilkakrotnie przepłukać etanolem.</li>
</ol>

<ol><li>Brand, M. D., Divakaruni, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+and+physiology+of+mitochondrial+proton+leak%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">The regulation and physiology of mitochondrial proton leak.</a> Physiology. 26, 192-205 (2011).</li>
<li>Stephenson, E. J., Hawley, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+function+in+metabolic+health%3A+A+genetic+and+environmental+tug+of+war%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840, 1285-1294 (2014).</li>
<li>Bartlett, K., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+B+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial B oxidation.</a> European Journal of Biochemistry. 271, 462-469 (2004).</li>
<li>Acetoze, G., Kurzbard, R., Klasing, K. C., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Oxygen Consumption, Respiratory Control Ratio (RCR) and Mitochondrial Proton Leak of broilers with and without growth enhancing levels of minerals supplementation challenged with Eimeria maxima (Ei). Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 101, e210-e215 (2016).</li>
<li>Wallace, D. C., Fan, W. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1567724909001536">Energetics, epigenetics, mitochondrial genetics.</a> Mitochondrion. 10, 12-31 (2010).</li>
<li>Paradies, G., Petrosillo, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress%2C+mitochondrial+bioenergetics+and+cardiolipin+in+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radicals+in+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress, mitochondrial bioenergetics and cardiolipin in aging.</a> Free Radicals in Biology and Medicine. 48, 1286-1295 (2010).</li>
<li>Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+mitochondrial+oxygen+consumption+and+efficiency+of+milk+production+in+lactating+Holstein+cows+supplemented+with+Copper%2C+Manganese+and+Zinc%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Physiology+Animal+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Liver mitochondrial oxygen consumption and efficiency of milk production in lactating Holstein cows supplemented with Copper, Manganese and Zinc.</a> Journal of Animal Physiology Animal Nutrition. 102, e787-e797 (2017).</li>
<li>Brown, D. R., DeNise, S. K., McDaniel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+metabolism+and+performance+of+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory metabolism and performance of cattle.</a> Journal of Animal Science. 66, 1347-1354 (1988).</li>
<li>Golden, M. S., Keisler, J. W., H, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+mitochondrial+function+and+residual+feed+intake+in+Angus+steers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">The relationship between mitochondrial function and residual feed intake in Angus steers.</a> Journal of Animal Science. 84, 861-865 (2006).</li>
<li>Lancaster, P. A., Carstens, G. E., Michal, J. J., Brennan, K. M., Johnson, K. A., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+between+residual+feed+intake+and+hepatic+mitochondrial+function+in+growing+beef+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Relationships between residual feed intake and hepatic mitochondrial function in growing beef cattle.</a> Journal of Animal Science. 92, 3134-3141 (2014).</li>
<li>Acetoze, G., Weber, K. L., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. <a target="_blank" href="https://www.hindawi.com/archive/2015/194014/abs/">Relationship between liver mitochondrial respiration and proton leak kinetics in low and high RFI steers from two lineages of RFI Angus bulls.</a> ISRN Vet Sci. 2015 (194014), (2015).</li>
<li>Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. Protection against oxidants in biological systems: The superoxide theory of oxygen toxicity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHalliwell%2C+B+%22Free+Radicals+in+Biology+and+Medicine%22">Free Radicals in Biology and Medicine</a>. , Oxford University Press. Oxford. 186-187 (1989).</li>
<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Nutrient+Requirements+of+Dairy+Cattle%22">Nutrient Requirements of Dairy Cattle</a>. , 7th revised edition, National Academy Press. Washington, DC. (2001).</li>
<li>Ramsey, J. J., Harper, M. E., Weindruch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+of+energy+intake%2C+energy+expenditure%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Restriction of energy intake, energy expenditure, and aging.</a> Free Radical Biology and Medicine. 29, 946-968 (2000).</li>
<li>Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+control+of+immunity%3A+beyond+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial control of immunity: beyond ATP.</a> Nature. 17, 608-620 (2017).</li>
<li>Kirby, D. M., Thorburn, D. R., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+assays+of+respiratory+chain+complex+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Biochemical assays of respiratory chain complex activity.</a> Methods in Cell Biology. 80, 93-119 (2007).</li>
<li>Alex, A. P., Collier, J. L., Hadsell, D. L., Collier, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milk+yield+differences+between+1x+and+4x+milking+are+associated+with+changes+in+mammary+mitochondrial+number+and+milk+protein+gene+expression%2C+but+not+mammary+cell+apoptosis+or+SOCS+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Milk yield differences between 1x and 4x milking are associated with changes in mammary mitochondrial number and milk protein gene expression, but not mammary cell apoptosis or SOCS gene expression.</a> Journal of Dairy Science. 98, 4439-4448 (2015).</li>
<li>Lossa, S., Lionetti, L., Mollica, M. P., Crescenzo, R., Botta, M., Barletta, A., Liverini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+high-fat+feeding+on+metabolic+efficiency+and+mitochondrial+oxidative+capacity+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Effect of high-fat feeding on metabolic efficiency and mitochondrial oxidative capacity in adult rats.</a> British Journal of Nutrition. 90, 953-960 (2003).</li>
<li>Boily, G., Seifert, E. L., Bevilacqua, L., He, X. H., Sabourin, G., Estey, C., Moffat, C., Crawford, S., Saliba, S., Jardine, K., Xuan, J., Evans, M., Harper, M. E., McBurney, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SirT1+regulates+energy+metabolism+and+response+to+caloric+restriction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">SirT1 regulates energy metabolism and response to caloric restriction in mice.</a> PloS One. 3 (3), e1759(2008).</li>
<li>Chen, Y., Hagopian, K., Bibus, D., Villaba, J. M., Lopez-Lluch, G., Navas, P., Kim, K., McDonald, R. B., Ramsey, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+dietary+lipid+composition+on+liver+mitochondria+from+mice+following+1+month+of+calorie+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">The influence of dietary lipid composition on liver mitochondria from mice following 1 month of calorie restriction.</a> Bioscience Reports. 33, 83-95 (2013).</li>
<li>Chacko, B. K., Kramer, P. A., Ravi, S., Benavides, G. A., Mitchell, T., Dranka, B. P., Ferrick, D., Singal, A. K., Ballinger, S. W., Bailey, S. M., Hardy, R. W., Zhang, J., Zhi, D., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bioenergetic+health+index%3A+a+new+concept+in+mitochondrial+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science%22%5BJournal%5D)">The bioenergetic health index: a new concept in mitochondrial translational research.</a> Clinical Science. 127, 367-373 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Najbardziej krytycznym punktem protokołu jest uzyskanie reprezentatywnej próbki tkanki wątroby i rozpoczęcie izolacji mitochondriów jak najszybciej po biopsji. Różnice w pomiarach oddechu są niewielkie (tabela 1) ze względu na krótki czas transportu od krowy do laboratorium. Aby skrócić czas transportu, w biurze mleczarni urządzono małe laboratorium, a próbki wątroby były przewożone do laboratorium biurowego podczas pobierania każdej z nich, tak aby mitochondria zostały wyizolowane w ciągu 10 minut od bi...

Mitochondria są bardzo wrażliwe na stres, a ich środowisko komórkowe może przyczyniać się do wielu różnych chorób metabolicznych. Zużycie tlenu i wyciek protonów w mitochondriach są wskaźnikami zdrowia mitochondriów. Metody opisane w tym artykule szacują wydajność energetyczną mitochondriów przy użyciu RCR w oparciu o zużycie tlenu z wyciekiem protonów i bez niego. Wyniki te mogą odpowiadać za 30% energii utraconej podczas wykorzystania składników odżywczych1. Zmiany w zużyciu tlenu i wycieku protonów mogą identyfikować dysfunkcję mitochondriów, która przyczynia się do chorób metabolicznych i skutkuje zmniejszoną wydajnością energetyczną. Metody te można również wykorzystać do zbadania wpływu różnych metod leczenia na oddychanie mitochondrialne. Ogólnym celem pomiaru zużycia tlenu w mitochondriach i kinetyki wycieku protonów jest ocena funkcji mitochondriów i wydajności energetycznej.
Dysfunkcja mitochondriów wątroby jest związana z wieloma chorobami u bydła mlecznego. Na zdolność metabolizmu komórkowego do przełączania się między paliwami węglowodanowymi i lipidowymi w obliczu deficytu energetycznego we wczesnej laktacji ma wpływ liczba i funkcja mitochondriów w komórce2. Defekty zdolności mitochondriów do przystosowania się do zwiększonego zapotrzebowania na energię i zwiększonego β-oksydacji mogą prowadzić do akumulacji wewnątrzkomórkowych lipidów związanych z insulinoopornością i mogą prowadzić do powstania stłuszczenia wątroby u krów mlecznych we wczesnej laktacji. Mitochondria, jako miejsce produkcji i wykorzystania ciał ketonowych, mogą odgrywać kluczową rolę w ketozie u krów mlecznych3. Brak mitochondriów lub dysfunkcja mitochondriów wpłynie na dostępność paliwa na peryferiach i znajdzie odzwierciedlenie w zmianach zużycia tlenu lub RCR.
Zużycie tlenu w mitochondriach zmienia się w odpowiedzi na stan zapalny. Siedmiodniowe brojlery zostały losowo przydzielone do grupy zakażonej Eimeria maxima i grupy kontrolnej4. Brojlery, które nie przeszły prowokacji kokcydiozy, miały niższe zużycie tlenu z powodu wycieku protonów i wyższy RCR, co wskazuje, że mitochondria wątroby reagują na wyzwanie immunologiczne poprzez zwiększenie wycieku protonów. Podczas gdy wyciek protonów i produkcja reaktywnych form tlenu były kiedyś uważane za oznakę dysfunkcji błony mitochondrialnej i szkodliwą dla wydajności energetycznej, teraz wiadomo, że jest to ważne dla importu białek i wapnia do mitochondriów5, oraz dla generowania ciepła1.
Wyciek elektronów z łańcucha oddechowego sprawia, że mitochondria są podatne na produkcję reaktywnych form tlenu i oksydacyjne uszkodzenia białek błony mitochondrialnej, lipidów i mitochondrialnego DNA. Wraz ze starzeniem się mitochondriów uszkodzenia mogą się kumulować, zwłaszcza mtDNA, powodując dalsze dysfunkcje metabolizmu mitochondriów6 i większą podatność krowy na choroby. W praktyce wiele zwierząt gospodarskich jest karmionych dużymi dawkami suplementów, takich jak Cu, Zn i Mn, w celu zwiększenia funkcji przeciwutleniających. Jednak podawanie wysokich poziomów Cu, Zn i Mn zmniejszyło produkcję mleka i zwiększyło zużycie tlenu z powodu wycieku protonów (oddychanie stanu 4)7.
Poprzednie badania nad rolą funkcji mitochondriów w efektywności energetycznej u bydła koncentrowały się na zmianach w mitochondrialnym zużyciu tlenu i wycieku protonów. Opublikowano bardzo niewiele badań dotyczących bydła mlecznego, a większość prac porównuje wydajność produkcji w postaci resztkowego pobrania paszy (RFI) z funkcją mitochondriów u bydła mięsnego. Zmienność szybkości oddychania mitochondrialnego badano, mierząc stan 3, stan 4 i RCR w wątrobach zarówno krów rasy holsztyńskiej w okresie laktacji, jak i krów mięsnych w okresie laktacji (Angus, Brangus i Hereford)8. Naukowcy nie znaleźli żadnej korelacji w oddychaniu mitochondrialnym z cechami wzrostu lub dojenia bydła mięsnego, ale stwierdzili korelację między oddychaniem mitochondrialnym a cechami dojenia u bydła rasy holsztyńskiej. W dwóch badaniach RFI u bydła mięsnego porównano z częstością oddychania mitochondrialnego (stan 3, stan 4 i RCR) w mitochondriach mięśniowych9,10. Tempo oddychania mitochondriów zmieniło się w odpowiedzi na DMI, a niskie wskaźniki były związane z mniej wydajnymi wołami mięsnymi. W innym badaniu RFI wołów z buhajów o wysokim lub niskim RFI porównano z szybkością oddychania mitochondrialnego i kinetyką wycieku protonów między dwiema grupami potomstwa11. Różnice wynikały ze wzmocnienia, co potwierdzało wniosek, że przyrost nie wpływa na oddychanie mitochondrialne u bydła mięsnego.
W tym artykule, eksperyment badający RCR wątroby w odpowiedzi na karmienie karmiącego bydła mlecznego 3 minerałami przeciwutleniającymi ilustruje użycie metod pomiaru zużycia tlenu podczas oddychania w stanie 4 i 3 oraz PMF.

<table><tbody><tr><td>Biopsja wątroby</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schackelford-Courtney Instrument do biopsji wątroby bydlęcej</td><td>Sontec Instruments Englewood CO</td><td>1103-904</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Szew Fisher Scientific</td><td>19-037-516</td><td></td></tr><tr><td>Igły do szycia</td><td></td><td>NA</td><td>NA W zestawie z</td></tr><tr><td>Skalpelami do szwów</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S2896 / S2646</td><td># do rękojeści i ostrzy</td></tr><tr><td>Ręczniki chirurgiczne</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-129-6667</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Falcon 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>Z168750</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-314387</td><td></td></tr><tr><td>Igły iniekcyjne (22, 2 1/2)</td><td>VWR</td><td>MJ8881-200342</td><td></td></tr><tr><td>Kantar dla krów</td><td>Ciągnik Supply Co.</td><td></td><td></td>101966599</tr><tr><td>Wacik bawełniany</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-102</td><td></td></tr><tr><td>kwadraty z gazy bawełnianej (4x4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-246069</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki medyczne</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>Z265969</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coccidiosis Vaccine 0,75 butelki / krowę</td><td></td><td></td><td>Dostarczone przez </td></tr><tr><td>Weterynarz Szczepionka</td><td></td><td></td> Clostridia <td>Dostarczone przez lekarza weterynarii</td></tr><tr><td>Biopsja wątroby Antybiotyki Excenel 2 cc / 100 funtów przez 3 dni</td><td></td><td></td><td>Dostarczone przez lekarza weterynarii</td></tr><tr><td>Providone Scrub</td><td>Aspen Veteterinary Resources</td><td>21260221</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 70%</td> <td>Sigma - Aldrich</td><td>793213</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek ksylazyny 100 mg / ml IV w 0,010-0,015 mg / kg masa</td><td></td><td></td> ciała <td>Dostarczone przez lekarza weterynarii</td></tr><tr><td>2% lidokainy HCl (10-15 ml)</td><td></td><td></td><td>Dostarczone przez lekarza weterynarii</td></tr><tr><td>1 mg / kg IV wstrzyknięcie megluminy</td><td></td><td></td> fluniksyny <td>Dostarczone przez lekarza weterynarii</td></tr><tr><td><silny>Izolacja mitochondriów (wątroba)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiolka Wheaton 30 ml z tłuczkiem teflonowym o prześwicie 0,16 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-911-527</td><td></td></tr><tr><td>Silnik homogenizatora</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-04369-10</td><td></td></tr><tr><td>Sonda homogenizatora</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-04468-22</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta automatyczna (10 ml)</td><td>Cole Parmer</td><td>SK-21600-74</td><td></td></tr><tr><td>Zlewka (500 mL) z lodem</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB100600</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofugi chłodnicze</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-002-441EW3</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrofuge (1,5 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>kwas bicynchoninowy (BCA) zestaw do oznaczania białek (mikropłytki do czytnika płytek)</td><td>abcam</td><td>ab102536</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>EDS-1KG</td><td></td></tr><tr><td>BSA (bez kwasów tłuszczowych)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>M4125-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Woda dejonizowana</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>38796</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Służy do tworzenia pożywek do izolacji mitochondriów: 220 mM mannitol, 70 mM sacharozy, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA i 0,1% (w/v) BSA bez kwasów tłuszczowych,&nbsp; pH 7,4 przy 4 & stopniach; C, wytrzyma 2 dni w lodówce</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< silny> Mitochondrialny Skład Tlenu< / mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>Sprzęt</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfiguracja Oxygraph + elektroda tlenowa typu Clark</td><td>Hansatech (PP Systems)</td><td>Termostatyczna</td> pompa wodna OXY1 <td></td></tr><tr><td></td><td>ADInstruments</td><td>MLE2001</td><td></td></tr><tr><td>Elektroda tlenowa typu Clark</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Autopipeta (1 ml)</td><td>Cole Parmer</td><td>SK-21600-70</td><td>W zestawie z Oxy1</td></tr><tr><td>Małe mieszadło magnetyczne</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-513-95</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipeta (10 &mu; L)</td><td>Cole Parmer</td><td>SK-21600-60</td><td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P9333-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P5655-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>E3889-100G</td><td></td></tr><tr><td>Służy do wytwarzania mitochondrialnych mediów zużywających tlen: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes i 1 mM EGTA,&nbsp; pH 7,4 przy 30 &deg; C z 0,3% odtłuszczonym rotenonem BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(roztwór 4 mM)</td><td>Sigma - Bursztynian</td><td>Aldrich R8875-5G</td><td></td></tr><tr><td>(roztwór 1 M)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S3674-250G</td><td></td></tr><tr><td>ADP (roztwór 100 mM)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A5285-1G</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycyna (roztwór 8 &mu; g / ml w etanolu)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Mitochondrialny potencjał błonowy i siła napędowa protonów</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TPMP electrode</td><td>World Precision Instruments.</td><td>DRIREF-2</td><td></td></tr><tr><td>Roztwory chemiczne nie muszą być świeże, ale muszą być przechowywane w zamrażarce między cyklami</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Malonate (roztwór 0,1 mM)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>M1296</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycyna (8 &mu; g/ml w etanolu), przechowywać w zamrażarce</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin (80 ng/ml w etanolu), przechowywać w zamrażarce</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>N7143</td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C3920</td><td></td></tr><tr><td>TPMP</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>T200</td><td></td></tr><tr><td>TPMP roztwór: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes i 1 mM EGTA,&nbsp; pH 7,4 przy 30 &deg; C z 0,3% odtłuszczonym BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar zużycia tlenu przez mitochondria wątroby i kinetyki wycieku protonów w celu oszacowania oddychania mitochondrialnego u bydła mlecznego rasy holsztyńskiej

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

Zużycie tlenu, siła napędowa protonów (PMF) i wyciek protonów to miary oddychania mitochondrialnego, czyli jak dobrze mitochondria są w stanie przekształcić NADH i FADH w ATP. Ponieważ mitochondria są również głównym miejscem wykorzystania tlenu i utleniania składników odżywczych do dwutlenku węgla i wody, to, jak efektywnie wykorzystują tlen i wytwarzają ATP, bezpośrednio wiąże się z efektywnością metabolizmu składników odżywczych, zapotrzebowaniem zwierzęcia na składniki odżywcze i zdrowiem zwierzęcia. Celem tej metody jest zbadanie oddychania mitochondrialnego, które można wykorzystać do zbadania wpływu różnych leków, diet i wpływu środowiska na metabolizm mitochondriów. Wyniki obejmują zużycie tlenu mierzone jako oddychanie zależne od protonów (stan 3) i oddychanie zależne od wycieku protonów (stan 4). Stosunek oddychania w stanie 3 / stanie 4 jest zdefiniowany jako współczynnik kontroli oddechowej (RCR) i może reprezentować wydajność energetyczną mitochondriów. Wyciek protonów mitochondrialnych to proces, który umożliwia rozproszenie potencjału błony mitochondrialnej (MMP) poprzez odłączenie fosforylacji oksydacyjnej od ADP, zmniejszając wydajność syntezy ATP. Elektrody wrażliwe na tlen i TRMP+ z substratami mitochondrialnymi i inhibitorami łańcucha transportu elektronów są używane do pomiaru oddychania w stanie 3 i 4, PMF błony mitochondrialnej (lub potencjału do wytwarzania ATP) i wycieku protonów. Ograniczenia tej metody polegają na tym, że tkanka wątroby musi być tak świeża, jak to możliwe, a wszystkie biopsje i testy muszą być wykonane w czasie krótszym niż 10 godzin. Ogranicza to liczbę próbek, które mogą być pobrane i przetworzone przez jedną osobę w ciągu doby, do około 5. Jednak potrzeba tylko 1 g tkanki wątroby, więc u dużych zwierząt, takich jak bydło mleczne, ilość potrzebnej próbki jest niewielka w stosunku do wielkości wątroby i czas rekonwalescencji jest niewielki.

Pozytywne wyniki wykazujące kinetykę RCR i przecieku protonów przedstawiono odpowiednio w Tabeli 1 oraz na Rysunku 15. W niniejszym badaniu7 kinetykę RCR i przecieku protonów zmierzono u krów mlecznych rasy Holstein w 70. dniu laktacji, po tym jak krowy otrzymywały jeden z pięciu różnych poziomów Cu, Zn i Mn przez 28 dni. Stan 4, czyli maksymalna respiracja zależna od przecieku protonów, wykazywał tendencję do zmian po...

Tutaj dzielimy się metodami pomiaru zużycia tlenu w mitochondriach, definiującym pojęciem energetyki odżywczej oraz wyciekiem protonów, główną przyczyną nieefektywności w mitochondrialnym wytwarzaniu ATP. Wyniki te mogą odpowiadać za 30% energii utraconej podczas wykorzystania składników odżywczych, aby pomóc w ocenie funkcji mitochondriów.

Pomiar zużycia tlenu przez mitochondria wątroby i kinetyki wycieku protonów w celu oszacowania oddychania mitochondrialnego u bydła mlecznego rasy holsztyńskiej

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie energetyki, takie jak zdrowie mitochondriów, efektywność energetyczna i zużycie energii. Główną zaletą tej techniki jest to, że zużycie tlenu w izolowanych mitochondriach jest mierzone bezpośrednio. Wyniki nie muszą być korygowane dla innych wewnątrzkomórkowych procesów metabolicznych.Po raz pierwszy zdecydowaliśmy się zastosować tę metodę u bydła mlecznego, gdy chcieliśmy zbadać, jak wydajność mitochondriów wpływa na wydajność paszy. Demonstracja wideo tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy izolacji mitochondriów są trudne do nauczenia, ponieważ muszą być spójne i precyzyjne. Tak szybko, jak to możliwe, po pobraniu próbki wątroby od krowy, umyj ją w pożywce do izolacji mitochondriów w celu usunięcia czerwonych krwinek.Za pomocą nożyczek drobno zmiel tkankę do schłodzonej zlewki, która zawiera wystarczającą ilość podłoża izolacyjnego, aby tkanka była wilgotna. Przenieś zmieloną wątrobę do 30-mililitrowej szklanej fiolki zawierającej pożywkę do izolacji mitochondriów. Dodać tłuczek teflonowy o prześwicie 0,16 milimetra, który był inkubowany w lodzie, i homogenizować próbkę wątroby z prędkością 500 obr./min przez jedną minutę z czterema uderzeniami na minutę.Następnie przenieś homogenat do probówki zawierającej pożywkę izolacyjną mitochondriów i umieść ją w zlewce wypełnionej lodem. Odwirować homogenat w temperaturze 500 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Odrzucić osad i przenieść supernatant do schłodzonej probówki wirówkowej.Odwirować otrzymany supernatant w temperaturze 10 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut, aby uzyskać osad mitochondrialny. Ponownie zawiesić i przepłukać osad w 10 mililitrach pożywki do izolacji mitochondriów z BSA bez kwasów tłuszczowych. Następnie odwirować w temperaturze 8, 100 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut.Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach pożywki izolacyjnej. Umieść to na lodzie, aż będzie gotowe do użycia do testów zużycia tlenu i wycieku protonów. Oznaczyć stężenie białka w zawiesinie granulek za pomocą zestawu kwasu bicinchoninowego zgodnie z instrukcjami producenta, używając BSA jako wzorca.Najpierw utwórz media zużywające tlen, jak opisano w protokole tekstowym. Inkubować pożywkę zużywającą tlen w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Następnie należy skonfigurować komorę oddechową, pompę i elektrodę tlenową do systemu oksygraficznego zgodnie z instrukcjami producenta.Następnie umieść jeden mililitr pożywki zużywającej tlen w komorze oddechowej. Następnie dodaj 0,35 miligrama białka mitochondrialnego do komory. Mieszaj energicznie, aby roztwór nasycił się powietrzem i utrzymywał temperaturę 30 stopni Celsjusza.Rejestruj zużycie tlenu przez około pięć minut. Gdy zużycie tlenu staje się stałe, reprezentowane przez malejącą linię prostą, zapisz to jako podstawowe zużycie tlenu. Dodaj 1,25 mikrolitra czteromilimolowego roztworu rotenonu, aby zahamować złożony, a następnie dodaj pięć mikrolitrów jednego molowego roztworu bursztynianu, aby osiągnąć końcowe stężenie pięciomilimolowego bursztynianu w komorze oddechowej.Jest to zużycie tlenu w IV stanie. Następnie dodaj jeden mikrolitr 100-milimolowego roztworu ADP, aby osiągnąć końcowe stężenie 100 mikromolów w komorze oddechowej. Zużycie tlenu zmniejszy się przez około pięć minut, a następnie stanie się linią prostą.Zapisz to zużycie tlenu jako oddech w stanie III. Oblicz współczynnik kontroli oddechowej zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie odessać wszystkie roztwory z komory oddechowej.Przepłucz komorę kilkakrotnie podwójnie dejonizowaną wodą. Najpierw przygotuj roztwór 80 nanogramów na mililitr nigerycyny w etanolu, ograniczając ilość dodawanego etanolu do mniej niż jednego mikrolitra. Przygotuj również roztwór ośmiu mikrogramów oligomycyny na mililitr w etanolu.Po dokładnym przepłukaniu komory podwójnie dejonizowaną wodą, umieścić jeden mililitr pożywki zużywającej tlen w komorze oddechowej i energicznie wymieszać mieszadłem magnetycznym. Dodaj 0,35 miligrama białka mitochondrialnego do komory oddechowej. Dodaj elektrodę wrażliwą na metylotrifenylofosfonium do konfiguracji komory, upewniając się, że drugi koniec jest prawidłowo podłączony do pH-metru.Dodaj 1,25 mikrolitra czteromilimolowego roztworu rotenonu, aby zahamować Complex I. Rejestruj oddech przez dwie do pięciu minut. Zapisz wartość zużycia tlenu, gdy stanie się stała. Następnie dodaj 0,56 mikrolitra roztworu oligomycyny, aby zahamować wykorzystanie ADP.Nagrywaj oddech przez około dwie do pięciu minut. Zapisz wartość zużycia tlenu, gdy stanie się stała. Następnie dodaj 0,112 mikrolitra 80 nanogramów na mililitr roztworu nigerycyny, aby znieść gradient pH przez wewnętrzną błonę mitochondriów.Rejestruj oddech przez dwie do pięciu minut i notuj wartość zużycia tlenu, gdy stanie się stała. Dodaj pięć mikrolitrów 10-milimolowego roztworu metylopitrifenylofosfonium do inkubacji mitochondriów, aby rozpocząć przygotowywanie krzywej wzorcowej. Powtórzyć to dodawanie jeszcze cztery razy, aż do uzyskania całkowitego stężenia 2,5.Dodano mikromolowy. Następnie dodaj pięć mikrolitrów jednego molowego roztworu bursztynianu do komory, aby rozpocząć oddychanie. Rejestrować oddech aż do uzyskania stabilnego śladu.Następnie dodać malonian, aby miareczkować system zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W tym badaniu RCR i kinetyka wycieku protonów są mierzone w mleku krów mlecznych rasy holsztyńskiej 70 dni po karmieniu krów mlecznych różnymi poziomami miedzi, i manganu przez 28 dni. Oddychanie w stanie IV jest najwyższe u krów ze względu na niski poziom manganu, ale jest najniższe u krów kontrolnych, co wskazuje, że mangan odgrywa ważną rolę w minimalizowaniu oddychania zależnego od wycieku protonów.Analiza oddychania zależnego od nieszczelności protonów w wątrobie pokazuje, że oddychanie to jest największe u krów leczonych niskim poziomem manganu, a najniższe u krów kontrolnych. Wyniki te potwierdzają, że grupa o niskiej zawartości manganu ma największy stan oddychania IV, podczas gdy grupa kontrolna ma najniższy. Chociaż wykorzystanie paszy jest wyższe u wołów rasy Angus urodzonych od buhajów o niskim RFI niż u buhajów o wysokim RFI, nie znalazło to odzwierciedlenia w mitochondrialnym RCR ani kinetyce wycieku protonów.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wszystkie fiolki i zlewki znajdowały się na lodzie podczas przetwarzania mitochondriów. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się żywieniem bydła mlecznego do zbadania roli wydajności mitochondriów w wydajności paszy i funkcji mitochondriów w wątrobie. Nie zapominaj, że praca z rotenonem może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek, ochrony oczu i odpowiednich środków ochrony osobistej.

measuring-liver-mitochondrial-oxygen-consumption-proton-leak-kinetics

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Źródło:Elettra Leo1, Luiza H.D. Cardoso1, Sabine Schmitt1, Erich Gnaiger11Instrumenty OroborosTen film wyjaśnia, w jaki sposób strumień tlenu jest wykorzystywany do oceny oddychania mitochondrialnego w żywych i przepuszczalnych komórkach ssaków. Demonstruje sekwencyjne zastosowanie digitoniny, substratów metabolicznych, ADP, rozprzęgacza i inhibitora w celu scharakteryzowania różnych stanów oddechowych. Uzyskany w ten sposób profil strumienia tlenu ujawnia funkcję mitochondriów i wydajność...

Pomiary strumienia tlenu w celu oceny oddychania mitochondrialnego w żywych i przepuszczalnych komórkach

Przedstawione metody dostarczają instrukcji krok po kroku do wykonania zbioru testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach przy użyciu izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy. Testy te są w stanie zmierzyć mechanistyczne zmiany/adaptacje w mitochondrialnym zużyciu tlenu w powszechnie używanym modelu zwierzęcym.

Wykorzystanie izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy do wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Wysokiej rozdzielczości respirometria służy do określania zużycia tlenu w mitochondriach. Jest to prosta technika określania częstości oddechów mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego (I-IV), maksymalnej pojemności mitochondrialnego systemu transportu elektronów i integralności mitochondrialnej błony zewnętrznej.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji mitochondriów w przepuszczalnych i nienaruszonych komórkach

W tym artykule opisana jest metoda pomiaru zużycia tlenu za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości w permeabilizowanych piersiach Drosophila. Technika ta wymaga minimalnej ilości tkanki w porównaniu z klasyczną techniką izolacji mitochondriów, a uzyskane wyniki są bardziej istotne fizjologicznie.

Pomiar mitochondrialnego zużycia tlenu w przepuszczalnych włóknach Drosophila przy użyciu minimalnych ilości tkanki

Zaprojektowaliśmy i zbudowaliśmy mobilne laboratorium do pomiaru tempa oddychania w izolowanych mitochondriach dzikich zwierząt schwytanych w terenie. W tym miejscu opisujemy projekt i wyposażenie mobilnego laboratorium mitochondrialnego oraz związane z nim protokoły laboratoryjne.

Opracowanie mobilnego laboratorium fizjologii mitochondriów do pomiaru energetyki mitochondriów w terenie

Wysokorozdzielcza respirometria sprzężona z czujnikami fluorescencyjnymi określa zużycie tlenu w mitochondriach i generowanie reaktywnych form tlenu (ROS). Niniejszy protokół opisuje technikę oceny częstości oddechów mitochondriów i produkcji ROS w przepuszczalnym nerwie kulszowym.

Ocena funkcji mitochondriów w nerwie kulszowym za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Opisujemy stopniowe protokoły mierzące oddychanie mitochondrialne mysich i ludzkich neutrofili oraz komórek HL60 za pomocą analizatora metabolicznego przepływu zewnątrzkomórkowego.

Pomiar w czasie rzeczywistym mitochondrialnego profilu bioenergetycznego neutrofili

Konie mają wyjątkową zdolność do ćwiczeń aerobowych, co sprawia, że mięśnie szkieletowe koni są ważną tkanką zarówno do badania fizjologii ćwiczeń koni, jak i fizjologii mitochondriów ssaków. W artykule opisano techniki kompleksowej oceny funkcji mitochondriów w mięśniach szkieletowych koni.

Fluororespirometria mięśni szkieletowych koni w wysokiej rozdzielczości

Tutaj prezentujemy kompilację testów do bezpośredniego pomiaru funkcji mitochondriów w komórkach ssaków, niezależnie od ich zdolności do zużywania tlenu cząsteczkowego.

Testy niezależne od tlenu do pomiaru funkcji mitochondriów u ssaków

Tutaj opisujemy kompleksową metodę pomiaru mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej w świeżych, przepuszczalnych włóknach mięśni szkieletowych z mięśni ludzkich lub myszy. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie oddychania mitochondriów w czasie rzeczywistym oraz ocenę preferencji paliwowych i elastyczności metabolicznej przy jednoczesnym zachowaniu istniejących sieci mitochondrialnych i integralności błony.

Pomiar oddychania mitochondrialnego we włóknach mięśni szkieletowych ludzi i myszy za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Poznaj metodę pomiaru zużycia tlenu przez mitochondria wątroby u bydła mlecznego rasy holsztyńskiej. Technika ta pozwala ocenić efektywność mitochondrialną i jej wpływ na wykorzystanie paszy.

Pomiar zużycia tlenu przez mitochondria wątroby i kinetyki wycieku protonów w celu oszacowania oddychania mitochondrialnego u bydła mlecznego rasy holsztyńskiej (Wideo) | JoVE Journal

Pomiar zużycia tlenu przez mitochondria wątroby i kinetyki wycieku protonów w celu oszacowania oddychania mitochondrialnego u bydła mlecznego rasy holsztyńskiej

Przeglądaj więcej filmów