Nanosonda rezonansowa o zwiększonym rezonansie powierzchniowym i nanosonda rozpraszania Ramana do wykrywania mikroskopijnego raka jajnika poprzez celowanie w receptor kwasu foliowego

Metoda ta wykorzystuje miejscowe zastosowanie nanocząstek do obrazowania mikroskopijnych guzów, zwłaszcza w nowotworach złośliwych, które nie mają jeszcze dostępu do naczyń krwionośnych, takich jak przerzuty raka jajnika. Technika ta polega na obrazowaniu nanocząstek ukierunkowanych i niedocelowych w jednym skanie, aby zmniejszyć fałszywe sygnały i ujawnić prawdziwy zakres guza. Nanocząstki te mogą być podawane we wstrzyknięciu dootrzewnowym lub dożylnym w celu precyzyjnego obrazowania raka jajnika i wielu innych typów nowotworów.

W celu syntezy rdzenia złota nanostar umieść stożkową kolbę zawierającą 800 mililitrów świeżo przygotowanego roztworu kwasu askorbinowego na magnetycznej płytce mieszającej w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wywołaj stały wir. Szybko dodaj osiem mililitrów świeżo przygotowanego roztworu kwasu tetrachloroaurowego do wiru. W ciągu kilku sekund uformują się nanogwiazdy, a roztwór przyjmie ciemnoniebieski kolor.

Wlej zawiesinę nanogwiazdy do 50-mililitrowych stożkowych probówek do odwirowania i odessaj wszystkie oprócz ostatnich 200 mikrolitrów supernatantu z każdej probówki na końcu wirowania. Użyj mikropipety, aby ponownie zawiesić nanocząstki w każdej probówce przed zebraniem wszystkich nanocząstek w jednej kasecie do dializy. Następnie dializuj nanocząstki przez co najmniej trzy dni w porównaniu z dwoma litrami wody dejonizowanej, zmieniając wodę codziennie.

Aby utworzyć powłokę krzemionkową, najpierw dodaj 10 mililitrów izopropanolu, 500 mikrolitrów TEOS, 200 mikrolitrów wody dejonizowanej i 60 mikrolitrów barwnika do 50-mililitrowej stożkowej probówki. I dodaj trzy mililitry etanolu i 200 mikrolitrów wodorotlenku amonu do 15-mililitrowej probówki. Następnie poddaj sonikę dializowanym nanogwiazdom, aby rozproszyć wszelkie klastry i dodaj 1,2 mililitra nanogwiazd do probówki.

Umieść 50-mililitrową rurkę na mieszadle wirowym i wywołaj stały wir. Szybko dodaj roztwór nanogwiazdy do 50-mililitrowej probówki po około pięciu sekundach mieszania, a następnie szybko przenieś probówkę do wytrząsarki na 15 minut przy 300 obr./min w temperaturze pokojowej. Obie probówki muszą być połączone szybko i pod ciągłym zerkowaniem, aby zapewnić, że reakcja krzemionki zachodzi na nanogwiazdach i zminimalizować produkcję wolnej krzemionki.

Pod koniec inkubacji napełnij probówkę etanolem, aby wygasić reakcję i zebrać nanogwiazdy przez odwirowanie. Odessać wszystko, z wyjątkiem ostatnich 500 mikrolitrów supernatantu, uważając, aby nie naruszyć osadu i ponownie zawiesić nanocząstki w jednym mililitrze świeżego etanolu. Następnie przenieś roztwór do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej na cztery jednomililitrowe płukania etanolem przez wirowanie, ponownie zawieszając osad za pomocą ultradźwięków na około jedną sekundę między każdym myciem.

Aby wprowadzić tiole na powierzchnię cząstek, po ostatnim praniu ponownie zawieś osad w jednym mililitrze 85% roztworu etanolu, 10% 3-merkaptopropylo-trimetoksysilanu i 5% dejonizowanego roztworu wody na jedną do dwóch godzin inkubacji w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji przemyć nanocząstki funkcjonalizowane tiolem przez odwirowanie, jak wskazano, ponownie zawieszając osad za pomocą ultradźwięków między płukaniami. W przypadku funkcjonalizowanego przeciwciała nanosondy receptora antyfolianowego reagują 200 mikrogramów przeciwciała białkowego wiążącego antyfoliany z dziesięciokrotnym nadmiarem molowym środka sieciującego PEG w 500 mikrolitrach buforu HEPES.

Po 30 minutach zagęścić przeciwciało przez odwirowanie w filtrze odśrodkowym, odzyskując przeciwciało poprzez odwrócenie filtra do nowej probówki w celu dodatkowego odwirowania. Następnie wymieszać funkcjonalizowane tiolem nanocząstki ze skoncentrowanym przeciwciałem i inkubować mieszaninę przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. Aby utworzyć niecelowane nanosondy, dodaj pięć miligramów metlenkowego maleimidu PEG 5000 rozpuszczonego w DMSO do funkcjonalizowanych tiolem nanocząstek w 500 mikrolitrach buforu HEPES na co najmniej 30-minutową inkubację w temperaturze pokojowej.

W celu wstrzyknięcia nanosondy należy odkręcić oba smaki nanosondy i ponownie zawiesić granulki w świeżym buforze MES o stężeniu 600 pikomolarów. Wymieszaj nanocząstki i załaduj jeden mililitr powstałego roztworu do jednej mililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 26 na mysz i dootrzewnowo wstrzyknij całą objętość do brzucha każdej myszy. Następnie delikatnie masuj brzuch, aby rozprowadzić nanocząsteczki w całej jamie otrzewnej.

Po co najmniej 25 minutach zabezpiecz kończyny zwierzęcia, któremu wstrzyknięto eutanazję, na platformie chirurgicznej i użyj ząbkowanych kleszczy i nożyczek preparacyjnych, aby usunąć skórę w celu odsłonięcia otrzewnej. Naciąć otrzewną. Przymocuj płatki otrzewnowe do platformy i umyj wnętrze jamy otrzewnej co najmniej 60 mililitrami PBS.

Następnie przenieś platformę do spektrofotometru Ramana z pionową konfiguracją optyczną i zmotoryzowanym stolikiem i zobrazuj brzuch przy odpowiednich parametrach obrazowania. Ma to kluczowe znaczenie, aby płaszczyzna ogniskowa dla skanu Ramana znajdowała się na powierzchni większości wnętrzności. Jeśli narządy znajdują się poza płaszczyzną, uzyskany sygnał nie będzie użyteczny.

Dla celów kontroli jakości nanocząstki można scharakteryzować przy użyciu różnych metod podczas procesu syntezy, w tym transmisyjnej mikroskopii elektronowej, dynamicznego rozpraszania światła, analizy śledzenia nanocząstek i spektroskopii absorpcyjnej w ultrafiolecie widzialnym. Pomiary ramanowskie ujawniają obecność unikalnych widm każdego smaku nanocząstek w trakcie syntezy. Typowa wydajność i stężenia reakcji zależą w dużym stopniu od techniki pipetowania na etapach mycia.

Widma Ramana można przetworzyć w celu usunięcia fluorescencji i znormalizować do powierzchni jednostkowej w celu skompensowania siły sygnału przed zastosowaniem klasycznej metody najmniejszych kwadratów. Chociaż klasyczne wyniki najmniejszych kwadratów w każdym widmie referencyjnym nanosondy nie wskazują indywidualnie konkretnych lokalizacji guzów, proporcje punktowe ujawniają obecność rozproszonego mikroskopijnego rozprzestrzeniania się. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o walidacji nanocząstek na każdym etapie syntezy, ponieważ jakość nanocząstek ma duży wpływ na wyniki końcowe.

Technika ta demonstruje potencjał naukowców w zakresie wykorzystania nanosond SERRS do wykrywania markerów związanych z nowotworem w modelach zwierzęcych i wyciętych tkankach pacjentów z dużą precyzją mikroskopową.