Zautomatyzowany multipleksowy panel immunofluorescencyjny do badań immunoonkologicznych na próbkach tkanek raka utrwalonego formaliną

Protokół ten jest istotny, ponieważ rozwój, optymalizacja i transfer multipleksowych protokołów immunofluorescencyjnych jest złożony i wymagający. Dla wielu laboratoriów nieocenione jest trzymanie się zoptymalizowanego protokołu. Immunofluorescencja wielospektralna pozwala nam ocenić zarówno lokalizację, jak i tożsamość wielu typów komórek w guzie i wokół niego.

Jest to potężna kombinacja informacji zawartych w badaniach immunoonkologicznych. Najbardziej przekonującym zastosowaniem immunofluorescencji multipleksowej jest onkologia immunologiczna. Ale zdolność do badania wielu typów komórek odpornościowych w setu może być wykorzystana we wszystkich terapiach autoimmunologicznych i zapalnych.

Znajomość lokalizacji i fenotypu komórek immunologicznych w komórkach licznych i wokół nich jest zarówno prognostyczną, jak i przewidywalną odpowiedzią na immunoterapię swoistą dla nowotworu. Optymalizacja i walidacja protokołu to kluczowe kroki, z którymi nie należy się spieszyć. Nowi programiści powinni zapoznać się z nowymi rodzajami artefaktów związanych z obrazowaniem wielospektralnym

Aby zlokalizować podstawowy protokół multiplex, należy go wstępnie załadować do automatycznego barwierki. Filtruj dla wszystkich"zamiast preferowanych"na ekranie protokołu. Przed wprowadzeniem zmian zapisz oryginalny protokół i kliknij kartę protokoły, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy Opal 6 Multiplex, aby wybrać opcję kopiuj.

Zmień nazwę na 7 Multiplex Protocol 1'w nowym oknie i wybierz zakładkę powiązaną z właściwym urządzeniem. Dopasuj protokół w tabeli uzupełniającej S1'i kliknij dodaj odczynnik, aby dodać dziesięciominutowy etap hamowania partlenków, wybierając inhibitor peroksydazy jako odczynnik. Upewnij się, że etapy blokowania wykorzystują bufor blokujący inhibitor kinazy białkowej, że każde pierwotne przeciwciało odnosi się do odpowiedniego odczynnika, że drugorzędowe etapy przeciwciał wykorzystują polimer peroksydazy chrzanowej i że wykorzystywane jest widmowe dapi dostarczone z zestawem do automatyzacji wielospektralnej

Upewnij się, że protokół zawiera inhibitor peroksydazy, po którym następuje sześć sekwencyjnych przebiegów barwienia, z których każdy zawiera etap blokowania białka, przeciwciało pierwszorzędowe, przeciwciało wtórne, dno tyramidu, a następnie pobieranie antygenu w celu usunięcia przeciwciał. Aby dodać kontrolki upuszczania, skopiuj nazwę 7 Multiplex Protocol 1 i zmień ją na 7 Multiplex Protocol 1 CD68 Drop. Zmień odczynnik przeciwciała CD68 na Mouse IgG i zapisz protokół.

Następnie utwórz sześć kolejnych nowych protokołów, po jednym dla każdej kontroli kropli i jeden dla pełnej kontroli typu ISO w ten sam sposób. Stwórz protokół kontroli zrzutu dla każdego celu w taki sam sposób, jak ci to tutaj pokazałem. Aby przygotować zestaw do wykrywania badań, napełnij 30-mililitrowy otwarty pojemnik oznaczony na sól fizjologiczną 1X tris-bufferowaną solą fizjologiczną 1X tris-buffered soli fizjologicznej i umieść pojemnik w pozycji najbardziej oddalonej od uchwytu w Multiplex Research Kit 1.

Oznacz dwa 30-mililitrowe otwarte pojemniki wielospektralne blokowe i wielospektralne wtórne, a następnie napełnij pojemnik z blokiem wielospektralnym 30 mililitrami blokującego rozcieńczalnika przeciwciał buforowych z zestawu do barwienia wielospektralnego. Napełnij wielospektralny pojemnik wtórny 30 mililitrami anty-mysiego anty-wściekłego polimeru przeciwciał wtórnych z zestawu do barwienia wielospektralnego i dodaj 600 mikrolitrów rozcieńczalnika przeciwciał do każdego z dziesięciu otwartych pojemników o pojemności 7 mililitrów. Następnie dodać skoncentrowane przeciwciało pierwszorzędowe do odpowiednich probówek w objętościach wskazanych w tabeli i wymieszać przez delikatne pipetowanie.

Dodaj 3 mililitry podwójnie destylowanej wody plus 12 kropli spektralnego dapi do jednego 7-mililitrowego otwartego pojemnika i 3 mililitry bloku peroksydazy do drugiego otwartego pojemnika o pojemności 7 mililitrów. Ponownie zawiesić każdą liatalizowaną podłogę z 75 mikrolitrami dimetylosulfotlenku i wymieszać przez pipetowanie. Następnie przechowuj zapasy podłogowe wzmacniacza sygnału Tyramidu w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aż będą gotowe.

Podczas przygotowywania poszczególnych rozcieńczeń podłogi TSA. Zarejestruj wszystkie odczynniki w automatycznym barwieniu, a następnie umieść każdy pojemnik w stojaku na odczynniki i załaduj wszystkie odczynniki do automatycznego barwienia. Barwnik wykryje obecność i potwierdzi objętość każdego odczynnika.

Po załadowaniu wszystkich odczynników aktywuj protokół, aby działał przez noc. Pod koniec procedury barwienia zamontuj próbki za pomocą szkiełek nakrywkowych i załaduj próbki do skanera platformy obrazowania wielospektralnego w celu skanowania. Gdy wszystkie próbki zostaną zeskanowane, obrazy zostaną sformatowane jako pliki qptiff.

Otwórz odpowiedni program do analizy qptiff i kliknij przycisk załaduj slajd", aby otworzyć skan całego slajdu z pięcioma filtrami interesującego slajdu. Zaloguj się i użyj narzędzia do stemplowania, aby wybrać pięć regionów do obrazowania wielospektralnego. W obszarze Wybierz dla:wybierz Akwizycję'w obszarze Rozmiar w Polach:wybierz 1x1 i w obszarze Rozdzielczość pola'wybierz 0,5 mikrometra 20x.

Na podstawie tego barwienia cytokeratyną wybierz kilka regionów z zarówno cytokeratynową dodatnią tkanką nowotworową, jak i cytokeratyną ujemną tkanką zrębową, które mają być zobrazowane z ogólnego skanu. Po wybraniu wszystkich obrazów wielospektralnych, przełącz się na oprogramowanie Vectra i zmień zadanie ze skanowania na obrazowanie wielospektralne dla każdego slajdu. Następnie kliknij skanowanie, aby wykonać kolekcję obrazowania wielospektralnego.

Po zakończeniu akwizycji obrazu wielospektralnego użyj oprogramowania do usuwania miksowania spektralnego, aby otworzyć pliki w folderze obrazu wielospektralnego. Pod formatem obrazu"wybierz wielospektralny"Pod formatem próbki"wybierz fluorescencję"I pod Źródło biblioteki spektralnej"wybierz wForma"Aby wybrać piętra, wybierz i załaduj wszystkie sześć pięter oraz dapi ze slajdów biblioteki próbek i kliknij przygotuj wszystko. Oprogramowanie do demiksowania spektralnego wykona demiksowanie spektralne na wszystkich otwartych obrazach przy użyciu dostarczonych profili spektralnych.

Zidentyfikuj i opisz autofluorescencyjny profil spektralny. Należy upewnić się, że sprawdziłeś funkcję autofluorescencji, aby upewnić się, że jest ona całkowicie przechwycona w kanale autofluorescencyjnym po wymieszaniu i aby przetestować różne próbki do momentu, aż zostanie usunięta w akceptowalny sposób. Następnie oceń wzór barwienia w porównaniu z chromogennymi pojedynczymi plamami tego samego celu na sekwencyjnych szkiełkach tej samej tkanki z patologiem.

Aby ocenić intensywność fluorescencji każdego kanału, użyj narzędzia do zliczania, aby zbadać otwarte obrazy. Następnie wróć do protokołu barwienia i dostosuj stężenie TSA, aby uwzględnić wszelkie znormalizowane liczby, które przekraczają lub nie osiągają dopuszczalnego zakresu. W tej reprezentatywnej analizie tkanka migdałków wykazała wyraźnie wyraźne zabarwienie cytokeratyną na powierzchni migdałka, nabłonek płaskonabłonkowy bez tła w tkance limfatycznej z cytokeratyną oraz barwienie PDL-1 widoczne w siatkowatym nabłonku krypt.

Pęcherzykowe centra rozrodcze były łatwo rozpoznawalne i bogate w limfocyty Ki-67 dodatnie. Makrofagi obecne w centrach rozrodczych zostały zidentyfikowane na podstawie ich ekspresji CD-68, przy czym niektóre makrofagi obserwowano również poza centrum rozrodczym. Limfocyty barwione CD-8 z dystrybucją komórek T i ekspresją PD-1 silnie wybarwione małe limfocyty skupione na obrzeżach centrum rozrodczego, a także rozproszone w całym obszarze międzypęcherzykowym.

Po potwierdzeniu oczekiwanego wzorca barwienia w kontroli tkanki migdałkowej, to samo barwienie można było następnie ocenić w próbce raka płuc. Należy również ocenić ujemne kontrole izotypu i kontrole upuszczania; Nie tylko do wykrywania tła i autofluorescencji, ale także do efektów parasolowych i spektralnego. Kontrole upuszczania są ważne dla oceny potencjalnych artefaktów w barwieniu spowodowanych metodą immunofluorescencji multi-plex podczas optymalizacji nowego panelu multi-plex.

Każda kontrola kropli powinna wykazywać ten sam wzór barwienia, co pełny panel multipleksowy, z wyjątkiem pojedynczego przeciwciała pierwszorzędowego, które powinno być usunięte z każdej specyficznej kontroli. Profilowanie immunologiczne z immunofluorescencją wielospektralną pozwala na stratyfikację nowotworów i regionów według kryteriów immunologicznych, które można następnie badać za pomocą masowo multipleksowych badań genomicznych, transkryptomicznych i proteomicznych. Użyłem immunofluorescencji multi-plex do zbadania mechanizmów działania w onkologii i zaburzeniach autoimmunologicznych, co pozwala na identyfikację i charakterystykę komórek immunologicznych i patogennych w jednym wycinku w setu.

Należy zachować ogólne środki ostrożności podczas pracy z przeciwciałami przeciwko białkom ludzkim, tyramidem i dapi, ale żaden odczynnik ani materiał w tym protokole nie jest znany jako szczególnie niebezpieczny.