Name: Zautomatyzowany multipleksowy panel immunofluorescencyjny do badań immunoonkologicznych na próbkach tkanek raka utrwalonego formaliną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Poznaj zautomatyzowany protokół immunofluorescencji wielokrotnej dla badań immunoonkologicznych na tkankach nowotworowych utrwalonych formaliną. Ta metoda umożliwia ocenę wielu typów komórek immunologicznych w mikrośrodowisku guza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie redakcyjne zapewniła Deborah Shuman z MedImmune.

<ol><li>Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoprofiling+as+a+predictor+of+patient%27s+response+to+cancer+therapy-promises+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges.</a> Current Opinion in Immunology. 45, 60-72 (2017).</li>
<li>Taube, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+the+tumor+immune+microenvironment+for+staging+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics.</a> Modern Pathology. 31 (2), 214-234 (2018).</li>
<li>Idikio, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+in+diagnostic+surgical+pathology%3A+contributions+of+protein+life-cycle%2C+use+of+evidence-based+methods+and+data+normalization+on+interpretation+of+immunohistochemical+stains%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry in diagnostic surgical pathology: contributions of protein life-cycle, use of evidence-based methods and data normalization on interpretation of immunohistochemical stains.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 3 (2), 169-176 (2009).</li>
<li>Rebelatto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+programmed+cell+death+ligand-1+immunohistochemical+assay+validated+for+analysis+of+non-small+cell+lung+cancer+and+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Development of a programmed cell death ligand-1 immunohistochemical assay validated for analysis of non-small cell lung cancer and head and neck squamous cell carcinoma.</a> Diagnostic Pathology. 11 (1), 95(2016).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+and+image+analysis-based+study+shows+that+several+immune+checkpoints+are+co-expressed+in+non-small+cell+lung+carcinoma+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical and image analysis-based study shows that several immune checkpoints are co-expressed in non-small cell lung carcinoma tumors.</a> Journal of Thoracic Oncology. 13 (6), 779-791 (2018).</li>
<li>Rehman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+pathologist-read+comparison+of+the+heterogeneity+of+programmed+death-ligand+1+%28PD-L1%29+expression+in+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">Quantitative and pathologist-read comparison of the heterogeneity of programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression in non-small cell lung cancer.</a> Modern Pathology. 30 (3), 340-349 (2017).</li>
<li>Dixon, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+multiplexing+techniques+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).</li>
<li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+immunohistochemistry%2C+imaging%2C+and+quantitation%3A+a+review%2C+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification%2C+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li>
<li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+immune+profiling+in+HPV-+oral+squamous+cell+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer.</a> JCI Insight. 2 (14), (2017).</li>
<li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispectral+imaging+of+formalin-fixed+tissue+predicts+ability+to+generate+tumor-infiltrating+lymphocytes+from+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 47(2015).</li>
<li>Granier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+immunofluorescence+analysis+and+quantification+of+intratumoral+PD-1%2B+Tim-3%2B+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Multiplexed immunofluorescence analysis and quantification of intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e56606(2018).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).</li>
<li>Ribas, A., Wolchok, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunotherapy+using+checkpoint+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer immunotherapy using checkpoint blockade.</a> Science. 359 (6382), 1350-1355 (2018).</li>
<li>Gorris, M. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eight-color+multiplex+immunohistochemistry+for+simultaneous+detection+of+multiple+immune+checkpoint+molecules+within+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment.</a> Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+neoadjuvant+chemotherapy+on+the+immune+microenvironment+in+non-small+cell+lung+carcinomas+as+determined+by+multiplex+immunofluorescence+and+image+analysis+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Effect of neoadjuvant chemotherapy on the immune microenvironment in non-small cell lung carcinomas as determined by multiplex immunofluorescence and image analysis approaches.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 48(2018).</li>
<li>Rimm, D., Schalper, K., Pusztai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unvalidated+antibodies+and+misleading+results%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Unvalidated antibodies and misleading results.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 147 (2), 457-458 (2014).</li>
<li>Baskin, D. G., Hewitt, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+state+of+the+science+of+immunohistochemistry%3A+the+Histochemical+Society%27s+standards+of+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Improving the state of the science of immunohistochemistry: the Histochemical Society's standards of practice.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 691-692 (2014).</li>
<li>Freedman, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+need+for+improved+education+and+training+in+research+antibody+usage+and+validation+practices%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">The need for improved education and training in research antibody usage and validation practices.</a> Biotechniques. 61 (1), Letter to the Editor 16-18 (2016).</li>
<li>Hewitt, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility%3A+it+is+just+good+science%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Reproducibility: it is just good science.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (4), 223(2016).</li>
<li>Uhlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proposal+for+validation+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A proposal for validation of antibodies.</a> Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).</li>
</ol>

Prace te były wspierane przez MedImmune, globalny dział badawczo-rozwojowy firmy AstraZeneca zajmujący się badaniami i rozwojem w dziedzinie leków biologicznych. C.W., K.R. i C.C.H. są pracownikami firmy Perkin Elmer, która produkuje odczynniki (zestaw TSA) i skanery multispektralne, które zostały użyte w tej pracy. M.S., K.D., A.H., W.Z., C. Bagnall, C. Brown, J.C., A.L., K.S., M.R. i J.R.C. są pracownikami MedImmune posiadającymi akcje i/lub udziały w akcjach lub opcje w AstraZeneca.

Trwająca rewolucja w immunoterapii nowotworów otwiera nowe i obiecujące opcje terapeutyczne dla pacjentów z rakiem13. Postępy w dziedzinie immunoonkologii będą wymagały zwiększonej wiedzy na temat mikrośrodowiska guza zapalnego, nie tylko w celu zrozumienia biologii mechanizmów immunologicznych zaangażowanych w kancerogenezę, ale także w celu znalezienia biomarkerów predykcyjnych dla nowych terapii opartych na immunoterapii 1,2. Ze względu...

Analiza immunoprofilowania próbek tkanek nowotworowych FFPE stała się istotnym elementem badań immunoonkologicznych, szczególnie w celu odkrycia i walidacji nowych biomarkerów predykcyjnych dla immunoterapii nowotworów w kontekście badań klinicznych1,2. Chromogenne IHC, wykorzystujące chemiczne chromogeny, takie jak diaminobenzydyna, pozostaje standardową techniką w patologii diagnostycznej do immunoznakowania tkanek biopsyjnych3. Standardowy IHC może być również stosowany do immunoprofilowania tkanek nowotworowych, w tym do ilościowego oznaczania subpopulacji limfocytów związanych z nowotworem oraz oceny poziomów ekspresji immunologicznych punktów kontrolnych, takich jak ligand programowanej śmierci komórki 1 (PD-L1)4,5. Standardowy IHC jest jednak ograniczony, ponieważ tylko jeden antygen może być znakowany na każdy wycinek tkanki. Ponieważ badania immunoprofilowania zazwyczaj wymagają analizy połączonej ekspresji kilku markerów, zastosowanie standardowego IHC wymagałoby barwienia wielu odcinków tkanki, z których każda jest barwiona jednym markerem, a zatem byłoby znacznie ograniczone do analizy małych próbek tkanek, takich jak biopsje gruboigłowe. Standardowe metody IHC są również ograniczone do oceny markerów, które są współwyrażane przez różne populacje komórek, jak to ma miejsce w przypadku markerów immunologicznych punktów kontrolnych, takich jak PD-L1, który ulega ekspresji zarówno przez makrofagi związane z nowotworem, jak i komórki rakowe. Ograniczenie to zostało zgłoszone na przykład w przypadku stosowania przez patologów standardowego monopleksu IHC do analizy ilościowej markera IHC wyrażanego przez różne typy komórek6. Rozwój multipleksowych technik chromogennych IHC wykorzystujących różne kolorowe chromogeny na tym samym wycinku tkanki stanowi postęp w stosunku do standardowej metody monopleksowej IHC, 7, chociaż pozostają one ograniczone przez znakowanie immunologiczne zaledwie kilku markerów, a także stanowią ważne wyzwanie techniczne dla właściwej oceny markerów wyrażonych w tych samych subkomórkowych przedziałach tych samych populacji komórek.
Wyżej wymienione zastrzeżenia dotyczące dostępności tkanek z próbek klinicznych, jak również ograniczenia technik multipleksowych chromogenicznych IHC, spowodowały potrzebę opracowania ulepszonych metod multipleksowych dla badań immunoonkologicznych opartych na znakowaniu fluorescencyjnym w połączeniu z systemami obrazowania, które mogą skutecznie oddzielać sygnały wielu fluoroforów z tego samego szkiełka. Jedna z takich technik opiera się na wzmocnieniu sygnału tyramidu (TSA) w połączeniu z obrazowaniem za pomocą mikroskopii wielospektralnej w celu efektywnej separacji kolorów8. Dostępny na rynku zestaw oparty na TSA wykorzystuje fluorofory zoptymalizowane pod kątem obrazowania wielospektralnego8 (patrz Tabela Materiałów). Krytyczną zaletą tego systemu jest jego kompatybilność z tymi samymi nieznakowanymi przeciwciałami pierwszorzędowymi, które zostały już zwalidowane i zoptymalizowane pod kątem standardowego chromogennego IHC9,10,11. Pozwala to nie tylko na szybszą optymalizację, ale także na elastyczność w optymalizacji i modyfikacjach paneli o nowe cele. Co więcej, metoda TSA immunofluorescencji multipleksowej (mIF) może być zoptymalizowana pod kątem dostępnych na rynku zautomatyzowanych systemów barwienia IHC, co pozwala na proste przejście z monopleksowego chromogenicznego IHC na mIF.
Tutaj prezentujemy protokół dla panelu mIF do badań immunoonkologicznych, który opiera się na automatycznym barwieniu mIF TSA i wykorzystuje skaner wielospektralny do obrazowania. Protokół ten może być dostosowywany i modyfikowany przez każdego użytkownika laboratoryjnego mającego dostęp do opisanego oprzyrządowania i odczynników. Protokół zawiera panel sześciu podstawowych przeciwciał do immunoprofilowania raków: PD-L1, PD-1, CD68 (jako marker panmakrofagów), CD8 (komórki T-cytotoksyczne), Ki-67 i AE1/AE3 (pan-cytokeratyna, stosowana jako marker nabłonkowy do identyfikacji komórek rakowych). Niedawne badanie opisuje optymalizację ręcznego protokołu TSA mIF przy użyciu chromogennego IHC jako standardowego odniesienia do walidacji barwienia multipleksowego12. Przedstawiona tu zaktualizowana metoda została opracowana przy użyciu dostępnego na rynku, siedmiokolorowego zestawu TSA zoptymalizowanego w automatycznym barwieniu, drastycznie skracającego czas barwienia z 3-5 dni do 14 godzin, przy jednoczesnej poprawie konsystencji barwienia. Oprócz przedstawionego tutaj szczegółowego protokołu głównego, sekcja Materiały uzupełniające zawiera metodę "kontroli zrzutu", dodatkowy proces kontroli jakości w celu oceny nowego panelu mIF, a także uwagi techniczne dotyczące optymalizacji, rozwiązywania problemów i opracowywania nowych paneli multipleksowych, aby pomóc użytkownikowi laboratorium w skonfigurowaniu i optymalizacji metody mIF TSA dla niestandardowych paneli mIF.

<table><tbody><tr><td>"InForm 2.4.2" Oprogramowanie do rozmieszania spektralnego i analizy obrazu</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS151066</td><td>Nazywane "oprogramowaniem do rozmieszania spektralnego" w tekście</td></tr> <tr><td>"Phenochart 1.0.9" QPTIFF Oprogramowanie do wyboru MSI i ogólnego przeglądania skanów slajdów</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS151067</td><td>Nazywany "oprogramowaniem QPTIFF" w tekście</td></tr><tr><td>#1.5 Szkiełka nakrywkowe</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2975246</td><td></td></tr><tr><td>200-procentowy etanol</td><td>Koptec</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>20x tris-buforowana sól fizjologiczna</td><td>VWR</td><td>J640-4L</td><td></td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik przeciwciał</td><td>DAKO</td><td>S2203</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD68 Mysz monoklonalna</td><td>DAKO</td><td>M087601-2</td><td>klon PG-M1</td></tr><tr><td>anty-CD8 monoklonalny królik</td><td>Ventana</td><td>M5392</td><td>klon SP239</td></tr><tr><td>Anti-CK mysz monoklonalna</td><td>DAKO</td><td>M351501-2</td><td>Klon AE1 / AE3</td></tr><tr><td>Anti-ki67 Mysz monoklonalna</td><td>DAKO</td><td>M724001-2</td><td>Klon MIB-1</td></tr><tr><td>Anty-PD-1 Sygnalizacja komórek monoklonalnych królika</td><td></td><td>#86163</td><td>Klon D4W2J</td></tr><tr><td>Anti-PD-L1 Monoklonalny królik</td><td>Ventana</td><td>790-4905</td><td>Klon SP263</td></tr><tr><td>Roztwór do dewaxowania Bond</td><td>Leica</td><td>AR9222</td><td>Nazywany "roztworem dewax" w tekście</td></tr><tr><td>Bond Epitope Retrieval Solution 1</td><td>Leica</td><td>AR9961</td><td>Nazwany "ER1" w tekście</td></tr><tr><td>Bond Epitope Retrieval Solution 2</td><td>Leica</td><td>AR9640</td><td>Nazywany "ER2" w tekście</td></tr><tr><td>Otwarte pojemniki Bond, 30 ml</td><td>Leica</td><td>OP309700</td><td>Nazywany "30 ml otwartymi pojemnikami" w tekście</td></tr><tr><td>Otwarte pojemniki Bond, 7 ml</td><td>Leica</td><td>OP79193</td><td>Nazywany "7 ml otwartych pojemników"" w tekście</td></tr><tr><td>Bond Polymer Refine Detection</td><td>Leica</td><td>DS9800</td><td>Nazywany "chromogenicznym zestawem do wykrywania" w tekście</td></tr><tr><td>Zestaw do wykrywania badań nad Bondem</td><td>Leica</td><td>DS9455</td><td>Nazywany "zestawem do wykrywania badań" w tekście</td></tr><tr><td>Zestaw do miareczkowania Bonda</td><td></td><td>OPT9049</td><td>nazywany "zestawem do miareczkowania" w tekście</td></tr><tr><td>Uniwersalna osłona Bond Novocastra</td><td>Leica</td><td>S21.2001</td><td>Nazywany "covertiles" w tekście</td></tr><tr><td>Bond Wash Solution 10X Koncentrat</td><td>Leica</td><td>AR9590</td><td>Nazywany "10x roztwór do mycia" w tekście</td></tr><tr><td>Autostainer BondRX</td><td>Leica</td><td></td><td>Nazywany "automatycznym stainerem" w tekście</td></tr><tr><td>BondRX Software Version 5.2.1.204</td><td>Leica</td><td></td><td>Nazywana "automatycznym oprogramowaniem do barwienia" w tekście</td></tr><tr><td>Opal 7-Color Automation Zestaw IHC</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL801001KT</td><td>Nazywany "zestawem do barwienia multispektralnego" w tekście</td></tr><tr><td>Blok peroksydazy</td><td>Leica</td><td>RE7101</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>Thermo</td><td>P36965</td><td>Nazywany "mocowaniem do slajdów" w tekście</td></tr><tr><td>Starfrost</td><td>Slides Fisher</td><td>15-183-51</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop multispektralny Vectra Polaris z oprogramowaniem "Vectra 3.0.5" do sterowania mikroskopem wielospektralnym</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS143455</td><td>Nazywany "oprogramowaniem do sterowania mikroskopem" w tekście</td></tr></tbody></table>

zautomatyzowany multipleksowy panel immunofluorescencyjny do badań immunoonkologicznych na próbkach tkanek raka utrwalonego formaliną

Automated Multiplex Immunofluorescence Panel for Immuno-oncology Studies on Formalin-fixed Carcinoma Tissue Specimens

Ciągły rozwój immunoonkologii wymaga lepszego zrozumienia mechanizmów immunologii nowotworów. Analiza immunoprofilowa próbek tkanek z biopsji utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE) stała się kluczowym narzędziem do zrozumienia złożoności immunologii nowotworów i odkrycia nowych biomarkerów predykcyjnych dla immunoterapii nowotworów. Analiza immunoprofilowania tkanek wymaga oceny złożonych markerów, w tym subpopulacji komórek zapalnych i immunologicznych punktów kontrolnych, w mikrośrodowisku guza. Pojawienie się nowatorskich metod immunohistochemicznych multipleksowych pozwala na bardziej wydajną analizę wieloparametryczną pojedynczych skrawków tkanek niż w przypadku standardowej immunohistochemii monopleksowej (IHC). Jedna z dostępnych na rynku metod immunofluorescencji multipleksowej (IF) opiera się na wzmocnieniu sygnału tyramidowego i w połączeniu z wielospektralną analizą mikroskopową pozwala na lepszą separację sygnałów różnych markerów w tkance. Metodologia ta jest zgodna z użyciem niesprzężonych przeciwciał pierwszorzędowych, które zostały zoptymalizowane pod kątem standardowego IHC na próbkach tkanek FFPE. W niniejszym artykule szczegółowo opisujemy zautomatyzowany protokół, który umożliwia multipleksowe znakowanie IF próbek tkanek raka za pomocą sześciomarkerowego panelu przeciwciał multipleksowych składającego się z cytokeratyn PD-L1, PD-1, CD68, CD8, Ki-67 i AE1 / AE3 z 4′,6-diamidino-2-fenyloindolem jako barwnikiem przeciwbarwiącym komórkę jądrową. Protokół panelu multipleksowego jest zoptymalizowany w automatycznym barwiarce IHC pod kątem czasu barwienia krótszego niż w przypadku protokołu ręcznego i może być bezpośrednio stosowany i dostosowywany przez dowolnego badacza laboratoryjnego do badań immunoonkologicznych na próbkach tkanek ludzkich FFPE. Opisano również kilka elementów sterujących i narzędzi, w tym metodę kontroli upuszczania do precyzyjnej kontroli jakości nowego panelu IF multipleksu, które są przydatne do optymalizacji i walidacji techniki.

Protokół opisany w niniejszej publikacji pozwoli na uzyskanie wyników podobnych do tych przedstawionych na Rysunku 2. Należy rozpocząć od oceny barwienia w kontroli z migdałka, zaczynając od powierzchniowego nabłonka wielowarstwowego płaskiego. Histologię próbki migdałka można przeanalizować wraz z patologomorfologiem, wykorzystując preparat barwiony H&amp;E jako punkt odniesienia. Jeśli wykonano chromogenne sekcje IHC z tymi samymi markerami na tym samym blo...

Szczegółowy protokół dla sześciomarkerowego multipleksowego panelu immunofluorescencyjnego jest zoptymalizowany i wykonany, przy użyciu automatycznego barwnika dla bardziej spójnych wyników i krótszego czasu zabiegu. Podejście to może być bezpośrednio zaadaptowane przez dowolne laboratorium do badań immunoonkologicznych.

Zautomatyzowany multipleksowy panel immunofluorescencyjny do badań immunoonkologicznych na próbkach tkanek raka utrwalonego formaliną

Continued developments in immuno-oncology require an increased understanding of the mechanisms of cancer immunology. The immunoprofiling analysis of ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ rozwój, optymalizacja i transfer multipleksowych protokołów immunofluorescencyjnych jest złożony i wymagający. Dla wielu laboratoriów nieocenione jest trzymanie się zoptymalizowanego protokołu. Immunofluorescencja wielospektralna pozwala nam ocenić zarówno lokalizację, jak i tożsamość wielu typów komórek w guzie i wokół niego.Jest to potężna kombinacja informacji zawartych w badaniach immunoonkologicznych. Najbardziej przekonującym zastosowaniem immunofluorescencji multipleksowej jest onkologia immunologiczna. Ale zdolność do badania wielu typów komórek odpornościowych w setu może być wykorzystana we wszystkich terapiach autoimmunologicznych i zapalnych.Znajomość lokalizacji i fenotypu komórek immunologicznych w komórkach licznych i wokół nich jest zarówno prognostyczną, jak i przewidywalną odpowiedzią na immunoterapię swoistą dla nowotworu. Optymalizacja i walidacja protokołu to kluczowe kroki, z którymi nie należy się spieszyć. Nowi programiści powinni zapoznać się z nowymi rodzajami artefaktów związanych z obrazowaniem wielospektralnym.Aby zlokalizować podstawowy protokół multiplex, należy go wstępnie załadować do automatycznego barwierki. Filtruj dla wszystkich"zamiast preferowanych"na ekranie protokołu. Przed wprowadzeniem zmian zapisz oryginalny protokół i kliknij kartę protokoły, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy Opal 6 Multiplex, aby wybrać opcję kopiuj.Zmień nazwę na 7 Multiplex Protocol 1'w nowym oknie i wybierz zakładkę powiązaną z właściwym urządzeniem. Dopasuj protokół w tabeli uzupełniającej S1'i kliknij dodaj odczynnik, aby dodać dziesięciominutowy etap hamowania partlenków, wybierając inhibitor peroksydazy jako odczynnik. Upewnij się, że etapy blokowania wykorzystują bufor blokujący inhibitor kinazy białkowej, że każde pierwotne przeciwciało odnosi się do odpowiedniego odczynnika, że drugorzędowe etapy przeciwciał wykorzystują polimer peroksydazy chrzanowej i że wykorzystywane jest widmowe dapi dostarczone z zestawem do automatyzacji wielospektralnej.Upewnij się, że protokół zawiera inhibitor peroksydazy, po którym następuje sześć sekwencyjnych przebiegów barwienia, z których każdy zawiera etap blokowania białka, przeciwciało pierwszorzędowe, przeciwciało wtórne, dno tyramidu, a następnie pobieranie antygenu w celu usunięcia przeciwciał. Aby dodać kontrolki upuszczania, skopiuj nazwę 7 Multiplex Protocol 1 i zmień ją na 7 Multiplex Protocol 1 CD68 Drop. Zmień odczynnik przeciwciała CD68 na Mouse IgG i zapisz protokół.Następnie utwórz sześć kolejnych nowych protokołów, po jednym dla każdej kontroli kropli i jeden dla pełnej kontroli typu ISO w ten sam sposób. Stwórz protokół kontroli zrzutu dla każdego celu w taki sam sposób, jak ci to tutaj pokazałem. Aby przygotować zestaw do wykrywania badań, napełnij 30-mililitrowy otwarty pojemnik oznaczony na sól fizjologiczną 1X tris-bufferowaną solą fizjologiczną 1X tris-buffered soli fizjologicznej i umieść pojemnik w pozycji najbardziej oddalonej od uchwytu w Multiplex Research Kit 1.Oznacz dwa 30-mililitrowe otwarte pojemniki wielospektralne blokowe i wielospektralne wtórne, a następnie napełnij pojemnik z blokiem wielospektralnym 30 mililitrami blokującego rozcieńczalnika przeciwciał buforowych z zestawu do barwienia wielospektralnego. Napełnij wielospektralny pojemnik wtórny 30 mililitrami anty-mysiego anty-wściekłego polimeru przeciwciał wtórnych z zestawu do barwienia wielospektralnego i dodaj 600 mikrolitrów rozcieńczalnika przeciwciał do każdego z dziesięciu otwartych pojemników o pojemności 7 mililitrów. Następnie dodać skoncentrowane przeciwciało pierwszorzędowe do odpowiednich probówek w objętościach wskazanych w tabeli i wymieszać przez delikatne pipetowanie.Dodaj 3 mililitry podwójnie destylowanej wody plus 12 kropli spektralnego dapi do jednego 7-mililitrowego otwartego pojemnika i 3 mililitry bloku peroksydazy do drugiego otwartego pojemnika o pojemności 7 mililitrów. Ponownie zawiesić każdą liatalizowaną podłogę z 75 mikrolitrami dimetylosulfotlenku i wymieszać przez pipetowanie. Następnie przechowuj zapasy podłogowe wzmacniacza sygnału Tyramidu w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aż będą gotowe.Podczas przygotowywania poszczególnych rozcieńczeń podłogi TSA. Zarejestruj wszystkie odczynniki w automatycznym barwieniu, a następnie umieść każdy pojemnik w stojaku na odczynniki i załaduj wszystkie odczynniki do automatycznego barwienia. Barwnik wykryje obecność i potwierdzi objętość każdego odczynnika.Po załadowaniu wszystkich odczynników aktywuj protokół, aby działał przez noc. Pod koniec procedury barwienia zamontuj próbki za pomocą szkiełek nakrywkowych i załaduj próbki do skanera platformy obrazowania wielospektralnego w celu skanowania. Gdy wszystkie próbki zostaną zeskanowane, obrazy zostaną sformatowane jako pliki qptiff.Otwórz odpowiedni program do analizy qptiff i kliknij przycisk załaduj slajd", aby otworzyć skan całego slajdu z pięcioma filtrami interesującego slajdu. Zaloguj się i użyj narzędzia do stemplowania, aby wybrać pięć regionów do obrazowania wielospektralnego. W obszarze Wybierz dla:wybierz Akwizycję'w obszarze Rozmiar w Polach:wybierz 1x1 i w obszarze Rozdzielczość pola'wybierz 0,5 mikrometra 20x.Na podstawie tego barwienia cytokeratyną wybierz kilka regionów z zarówno cytokeratynową dodatnią tkanką nowotworową, jak i cytokeratyną ujemną tkanką zrębową, które mają być zobrazowane z ogólnego skanu. Po wybraniu wszystkich obrazów wielospektralnych, przełącz się na oprogramowanie Vectra i zmień zadanie ze skanowania na obrazowanie wielospektralne dla każdego slajdu. Następnie kliknij skanowanie, aby wykonać kolekcję obrazowania wielospektralnego.Po zakończeniu akwizycji obrazu wielospektralnego użyj oprogramowania do usuwania miksowania spektralnego, aby otworzyć pliki w folderze obrazu wielospektralnego. Pod formatem obrazu"wybierz wielospektralny"Pod formatem próbki"wybierz fluorescencję"I pod Źródło biblioteki spektralnej"wybierz wForma"Aby wybrać piętra, wybierz i załaduj wszystkie sześć pięter oraz dapi ze slajdów biblioteki próbek i kliknij przygotuj wszystko. Oprogramowanie do demiksowania spektralnego wykona demiksowanie spektralne na wszystkich otwartych obrazach przy użyciu dostarczonych profili spektralnych.Zidentyfikuj i opisz autofluorescencyjny profil spektralny. Należy upewnić się, że sprawdziłeś funkcję autofluorescencji, aby upewnić się, że jest ona całkowicie przechwycona w kanale autofluorescencyjnym po wymieszaniu i aby przetestować różne próbki do momentu, aż zostanie usunięta w akceptowalny sposób. Następnie oceń wzór barwienia w porównaniu z chromogennymi pojedynczymi plamami tego samego celu na sekwencyjnych szkiełkach tej samej tkanki z patologiem.Aby ocenić intensywność fluorescencji każdego kanału, użyj narzędzia do zliczania, aby zbadać otwarte obrazy. Następnie wróć do protokołu barwienia i dostosuj stężenie TSA, aby uwzględnić wszelkie znormalizowane liczby, które przekraczają lub nie osiągają dopuszczalnego zakresu. W tej reprezentatywnej analizie tkanka migdałków wykazała wyraźnie wyraźne zabarwienie cytokeratyną na powierzchni migdałka, nabłonek płaskonabłonkowy bez tła w tkance limfatycznej z cytokeratyną oraz barwienie PDL-1 widoczne w siatkowatym nabłonku krypt.Pęcherzykowe centra rozrodcze były łatwo rozpoznawalne i bogate w limfocyty Ki-67 dodatnie. Makrofagi obecne w centrach rozrodczych zostały zidentyfikowane na podstawie ich ekspresji CD-68, przy czym niektóre makrofagi obserwowano również poza centrum rozrodczym. Limfocyty barwione CD-8 z dystrybucją komórek T i ekspresją PD-1 silnie wybarwione małe limfocyty skupione na obrzeżach centrum rozrodczego, a także rozproszone w całym obszarze międzypęcherzykowym.Po potwierdzeniu oczekiwanego wzorca barwienia w kontroli tkanki migdałkowej, to samo barwienie można było następnie ocenić w próbce raka płuc. Należy również ocenić ujemne kontrole izotypu i kontrole upuszczania; Nie tylko do wykrywania tła i autofluorescencji, ale także do efektów parasolowych i spektralnego. Kontrole upuszczania są ważne dla oceny potencjalnych artefaktów w barwieniu spowodowanych metodą immunofluorescencji multi-plex podczas optymalizacji nowego panelu multi-plex.Każda kontrola kropli powinna wykazywać ten sam wzór barwienia, co pełny panel multipleksowy, z wyjątkiem pojedynczego przeciwciała pierwszorzędowego, które powinno być usunięte z każdej specyficznej kontroli. Profilowanie immunologiczne z immunofluorescencją wielospektralną pozwala na stratyfikację nowotworów i regionów według kryteriów immunologicznych, które można następnie badać za pomocą masowo multipleksowych badań genomicznych, transkryptomicznych i proteomicznych. Użyłem immunofluorescencji multi-plex do zbadania mechanizmów działania w onkologii i zaburzeniach autoimmunologicznych, co pozwala na identyfikację i charakterystykę komórek immunologicznych i patogennych w jednym wycinku w setu.Należy zachować ogólne środki ostrożności podczas pracy z przeciwciałami przeciwko białkom ludzkim, tyramidem i dapi, ale żaden odczynnik ani materiał w tym protokole nie jest znany jako szczególnie niebezpieczny.

automated-multiplex-immunofluorescence-panel-for-immuno-oncology

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Badanie mikrośrodowiska guza może zidentyfikować prognostyczne lub predykcyjne biomarkery klinicznej odpowiedzi na immunoterapię. Przedstawiona tutaj jest innowacyjna metoda oparta na obrazowaniu wielospektralnym fluorescencji in situ w celu automatycznej analizy i zliczania różnych subpopulacji limfocytów T CD8 +. Ta powtarzalna i niezawodna technika nadaje się do dużych analiz kohortowych.

Multipleksowa analiza immunofluorescencyjna i kwantyfikacja wewnątrznowotworowych limfocytów T PD-1 + Tim-3 + CD8 +

Tutaj opisujemy protokół barwienia immunohistochemicznego multipleksu fluorescencyjnego i obrazowania dla jednoczesnej lokalizacji wielu antygenów związanych z rakiem w chłoniaku. Protokół ten można rozszerzyć o analizę kolokalizacji biomarkerów we wszystkich sekcjach tkanki.

Multipleksowane fluorescencyjne barwienie immunohistochemiczne, obrazowanie i analiza w próbkach histologicznych chłoniaka

Multiplex fluorescencyjna immunohistochemia to nowa technologia, która umożliwia wizualizację wielu typów komórek w nienaruszonej, utrwalonej formaliną, zatopionej parafinie tkance (FFPE). Przedstawiono wytyczne dotyczące zapewnienia udanego 7-kolorowego multipleksu wraz z instrukcjami dotyczącymi optymalizacji przeciwciał i odczynników, przygotowaniem preparatów, projektem i wskazówkami dotyczącymi unikania typowych problemów.

Optymalizacja, projektowanie i unikanie pułapek w manualnej multipleksowej immunohistochemii fluorescencyjnej

W tym artykule opisany jest protokół ręcznego wzmacniania sygnału tyramidowego (TSA) multipleksowego immunofluorescencji (mIF) połączonego z analizą obrazu i analizą przestrzenną. Protokół ten może być stosowany z sekcjami zatopionymi w parafinie (FFPE) utrwalonymi w formalinie do barwienia od dwóch do sześciu antygenów na szkiełko, w zależności od skanera do szkiełek dostępnego w laboratorium.

Multipleksowa immunofluorescencja połączona z przestrzenną analizą obrazu w celu klinicznej i biologicznej oceny mikrośrodowiska guza

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak przeprowadzana jest charakterystyka komórek odpornościowych mikrośrodowiska guza za pomocą multipleksowej immunohistochemii.

Multipleksowa analiza immunohistochemiczna przestrzennego krajobrazu komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza

Ten eksperymentalny protokół opisuje i optymalizuje metodę barwienia metodą immunohistochemii multipleksowej (IHC), głównie poprzez optymalizację warunków inkubacji przeciwciał jednokanałowych i dostosowanie ustawień przeciwciał i kanałów do rozwiązania problemów autofluorescencji i przesłuchu kanałowego w tkankach raka płuc pochodzenia klinicznego.

Multipleksowe barwienie immunohistochemiczne tkanki raka płuc zatopionej w parafinie

Multipleksowa cykliczna immunohistochemia pozwala na wykrywanie in situ wielu markerów jednocześnie przy użyciu wielokrotnej inkubacji przeciwciał antygenowych, skanowania obrazu oraz dopasowywania i integracji obrazu. W tym miejscu przedstawiamy protokół operacyjny identyfikacji substratów komórek odpornościowych za pomocą tej technologii w próbkach raka płuc i sparowanych próbkach przerzutów do mózgu.

Multipleksowa cykliczna immunohistochemia fluorescencyjna

Ten raport opisuje zautomatyzowany protokół do multipleksowych testów immunofluorescencyjnych (mIF) na automatycznym barwniku do szkiełek. Wykazano wysoką odtwarzalność proteomiki przestrzennej na standardowych autostainerach tkankowych o wysokiej przepustowości i obrazach fluorescencyjnych na całych szkiełkach, co jest idealne do niestandardowych testów mIF na dużej liczbie szkiełek tkankowych w badaniach translacyjnych.

Wysokowydajne zautomatyzowane multipleksowe testy immunofluorescencyjne do badań translacyjnych

Protokół ten zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący projektowania multipleksowego panelu przeciwciał immunofluorescencyjnych do obrazowania mysich tkanek czerniaka FFPE na podstawie kodów kreskowych. Opisujemy również proces analizy obrazu przy użyciu narzędzi typu open source do generowania przestrzennych wglądów proteomicznych w mikrośrodowisku immunologicznym mysiego czerniaka.

Multipleksowe obrazowanie immunofluorescencyjne oparte na kodach kreskowych DNA do analizy próbek FFPE z genetycznie przeprogramowanego mysiego czerniaka

Multipleksowa immunofluorescencja umożliwia sekwencyjne oznaczyć wiele markerów przeciwciał w obrębie pojedynczej sekcji tkanki, aby wspierać przestrzenną analizę architektury tkanki i populacji komórek. Tutaj przedstawiono przepływ pracy dla wielokrotnego wykrywania markerów związanych z starzeniem się, strukturalnych i immunologicznych, łącznie z manualną i zautomatyzowaną przygotowaniem szkieł i iteracyjnym obrazowaniem oraz analizą pojedynczych komórek za pomocą oprogramowania do cyfrowej...

Wielobarwne badanie immunofluorescencyjne do przestrzennej oceny markerów starzenia in vivo

Poznaj zautomatyzowany protokół immunofluorescencji wielokrotnej dla badań immunoonkologicznych na tkankach nowotworowych utrwalonych formaliną. Ta metoda umożliwia ocenę wielu typów komórek immunologicznych w mikrośrodowisku guza.

Zautomatyzowany multipleksowy panel immunofluorescencyjny do badań immunoonkologicznych na próbkach tkanek raka utrwalonego formaliną (Wideo) | JoVE Journal

Zautomatyzowany multipleksowy panel immunofluorescencyjny do badań immunoonkologicznych na próbkach tkanek raka utrwalonego formaliną

Przeglądaj więcej filmów