Odwrotna sekcja i DiceCT ujawniają ukryte dane dotyczące ewolucji twarzy naczelnych
7 stycznia 2019
Mimika twarzy to sposób komunikacji wizualnej wytwarzany przez mięśnie mimetyczne. W tym miejscu przedstawiamy protokoły dla nowatorskich technik odwrotnej sekcji i DiceCT w celu pełnej wizualizacji i oceny mięśni mimetycznych. Te połączone techniki mogą badać zarówno morfologiczne, jak i fizjologiczne aspekty mięśni mimetycznych w celu określenia aspektów funkcjonalnych.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania biologii ewolucyjnej, takie jak ewolucja komunikacji społecznej. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że dostarcza ona bezpośrednich dowodów na formę i obecność mimetycznej muskulatury. Eliminuje domysły w procesie preparacji i zachowuje warstwy mięśni.
W połączeniu z DiceCT, odwrotna sekcja jest nowym złotym standardem w mimetycznym badaniu mięśni. Aby rozpocząć, postępuj zgodnie z dołączonym protokołem tekstowym dotyczącym utrwalania i przygotowania próbki. Następnie przenieś próbkę do dygestorium.
Następnie płucz próbkę przez kilka godzin pod bieżącą wodą. Po spłukaniu próbki osusz ją ręcznikami papierowymi i przenieś do stanowiska pracy. Po usunięciu mózgu i leżącej nad nim kalwarii wykonaj jedno nacięcie w pobliżu obszaru glabella czaszki, a drugie wzdłuż ogonowej części czaszki, gdzie kość czaszki jest nienaruszona.
Badanie palpacyjne zewnętrznej wypukłości potylicznej na ogonowej krawędzi czaszki. Oznacza to obszar, w którym czaszka styka się z kręgosłupem. Następnie użyj skalpela i wykonaj nacięcie w linii środkowej, zaczynając od zewnętrznej wypukłości potylicznej.
Przeciąć próbkę rostralnie nad ciemieniową i czołową częścią czaszki. Kontynuuj i przejdź przez obszar oczodołu między oczami, w dół okolicy nosa, aż do zewnętrznego obszaru nosa między nozdrzami. Następnie wykonaj nacięcie na żuchwie między dolnymi i środkowymi siekaczami i przesuń skalpel doogonowo w kierunku obojczyka.
W tym momencie wybierz jedną stronę maski na twarz i zwolnij ją z czaszki, pozostawiając drugą stronę na miejscu. Zaczynając w okolicy potylicznej, użyj skalpela, aby odciąć maskę na twarz, w tym mięśnie mimetyczne, z dala od kości potylicznej czaszki, ciągnąc maskę rostrale i na boki. Odetnij mięsień potyliczny od czaszki, pozostawiając niewielką ilość mięśnia na czaszce, tak aby jego przyczep można było nadal uwidocznić po zdjęciu maski na twarz.
Pozostawiając pewną część mięśnia na kostnej i chrzęstnej czaszce, przyczepy mogą zostać zachowane i zarejestrowane w późniejszym czasie. Po uderzeniu w ucho zewnętrzne zlokalizuj mięśnie małżowiny usznej. Przetnij te mięśnie, tak aby niewielka część każdego mięśnia pozostała z czaszką.
Następnie przeciąć elastyczną chrząstkę mocującą ucho zewnętrzne do czaszki. Kontynuuj naciąganie maski rostrale i uwalniaj każdy mimetyczny mimień z czaszki, pozostawiając niewielką część każdego mięśnia na czaszce. Gdy maska na twarz jest nienaruszona z jednej strony czaszki, pozwól jej siedzieć z mięśniami wystawionymi na działanie powietrza przez jedną do trzech godzin, w zależności od wielkości próbki.
Spowoduje to wysuszenie tkanki łącznej na masce na twarz i zwiększenie kontrastu kolorów między mięśniami a tkanką łączną. Mając teraz zwiększony kontrast między mięśniami a tkanką łączną, użyj skalpela numer trzy, kleszczy i mikronożyczek, aby usunąć wystarczającą ilość tkanki łącznej, aby uwidocznić muskulaturę. Powierzchowna warstwa mięśni mimetycznych w tej odwrotnej sekcji delikatnie podnosi i oddziela głęboką warstwę mięśni od warstwy powierzchownej i usuwa tkanki łączne otaczające mięśnie powierzchowne.
Po zakończeniu włóż powstałą maskę z powrotem do formaliny. W tym miejscu procedurę można wstrzymać, przed przejściem do dalszej sekcji lub przed kontynuowaniem barwienia. Na każdym etapie pośrednim należy odczekać, aż maska na twarz wyschnie wystarczająco długo, aby można było łatwo odróżnić tkankę łączną od tkanki mięśniowej.
W celu uwidocznienia mimetycznej muskulatury za pomocą tomografii komputerowej, należy zabarwić maski roztworem jodu, umieszczając maskę w roztworze barwiącym Lugola, zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Proces barwienia trwa zazwyczaj około dwóch tygodni w 1,75% płynie Lugola. Jednak ten czas różni się w zależności od kilku czynników.
Zalecane jest skanowanie przerywane z towarzyszącą korektą barwienia. Do tomografii komputerowej najpierw przygotuj maskę na twarz za pomocą drewnianych wykałaczek, aby zamontować maskę na twarz na materiale o niskiej gęstości, takim jak pianka florystyczna. Wyeliminuje to wszelkie zmarszczki na masce i ograniczy jej ruch, ponieważ lekko wysycha podczas skanowania.
Następnie umieść próbkę w pojemniku o małej gęstości i zabezpiecz ją na miejscu. Po zabezpieczeniu umieść próbkę w skanerze, zamknij drzwi i włącz promieniowanie rentgenowskie. Następnie ustaw parametry tomografii komputerowej dla rentgenowskiej tomografii komputerowej o wysokiej rozdzielczości.
Używanie odstępów między warstwami i odległości między pikselami wynoszącej około 0,05 milimetra dla tych skanów, ponieważ małe pęczki będą zasłonięte w niższej rozdzielczości. Jeśli pęczki nie mogą być w pełni uwidocznione z powodu nadmiernego przebarwienia, umieść maskę na twarz w roztworze odbarwiającym, takim jak 10% formalina lub 5% tiosiarczan sodu, aby usunąć część plamy. Po dostosowaniu barwienia ponownie zeskanuj maskę na twarz i kontynuuj dokonywanie niezbędnych korekt, aż wszystkie pęczki będą mogły być w pełni uwidocznione.
Stosując odwróconą sekcję do stworzenia maski na twarz, czasami można zobaczyć pełniejsze odwzorowanie mięśni mimetycznych niż w tradycyjnej metodologii sekcji. Ta metoda działa na różnych rozmiarach ciała, od maleńkiego, małego ciała marmozety po duże naczelne, takie jak szympans. U małych naczelnych, które mają gracil mięśnie twarzy, część mięśni twarzy może być nie do odróżnienia od otaczającej tkanki łącznej i może zostać utracona podczas sekcji.
Barwienie jodowe, takie jak barwienie Lugola, może poprawić kontrast i pomóc w rozwiązaniu zarówno pojedynczych mięśni mimetycznych, jak i pojedynczych pęczków mięśniowych, a także po raz pierwszy uzyskać pełne objętości tych mięśni gracilowych. Jak pokazano tutaj, niektóre z bardzo małych mięśni, związanych z uchem zewnętrznym, są wyraźnie widoczne na skanach DiceCT. Nierzadko zdarza się, że mięśnie te są pomijane w niektórych procedurach odwrotnego rozwarstwienia, być może ze względu na ich mały rozmiar.
To trójwymiarowe renderowanie objętości pozwala na podstawowe progowanie objętości i mapowanie kolorów, aby łatwiej zobrazować muskulaturę niż w przypadku samego badania krzyżowego. Tutaj widać, że poszczególne pęczki mięśniowe są wyraźnie widoczne w przekroju poprzecznym, co umożliwia cyfrową preparację. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że należy poruszać się powoli, ostrożnie i z rozmysłem, ponieważ ta metoda jest z natury destrukcyjna.
Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak przetwarzanie histologiczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak średnica włókien lub typowanie włókien miozynowych. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny biologii ewolucyjnej do zbadania ewolucji wyrazu twarzy i komunikacji wizualnej u ssaków innych niż ludzie oraz u ludzi. Nie zapominaj, że praca z formaliną i załadowanym skalpelem może być niezwykle niebezpieczna.
Podczas wykonywania tej procedury należy podjąć środki ostrożności, takie jak płukanie próbki i wiedza o tym, gdzie znajduje się skalpel
.Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nowe protokoły odwrotnej sekcji połączonej z technikami obrazowania DiceCT w celu wizualizacji i oceny mięśni mimicznych. Metody te odpowiadają na zapytania z zakresu biologii ewolucyjnej, pogłębiając zrozumienie komunikacji społecznej poprzez dostarczenie szczegółowych informacji morfologicznych i fizjologicznych na temat muskulatury mimicznej.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Biologia ewolucyjna
- Komunikacja społeczna
- Badania nad muskulaturą mimiczną
Wstęp
- Znaczenie mimiki w komunikacji wizualnej
- Ograniczenia tradycyjnych metod sekcji
- Potrzeba wyraźniejszej wizualizacji struktur mięśniowych
Zastosowane metody
- Technika sekcji wstecznej
- Mimetyka mięśniowa różnych gatunków naczelnych
- Obrazowanie DiceCT dla lepszej wizualizacji mięśni
Główne wyniki
- Ustanowienie nowego standardu badania mięśni mimicznych
- Bezpośrednie dowody na formę i obecność struktur mięśniowych
- Zachowanie przyczepów mięśniowych do dalszej analizy
Wnioski
- Badanie potwierdza skuteczność odwrotnej dyssekcji oraz DiceCT w badaniach nad mięśniami
- Wyniki mają szersze znaczenie dla zrozumienia komunikacji społecznej u naczelnych
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie przemysłowe
Zrozumienie podstaw strukturalnych muskulatury mimicznej wspiera walidację celów w neuronauce i farmakologii behawioralnej, łącząc mechanizmy ekspresji twarzy ze szlakami komunikacji społecznej. Ten postęp metodologiczny umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w modelach przedklinicznych, w których fenotypy twarzy służą jako biomarkery translacyjne dla schorzeń neuropsychiatrycznych. Połączone podejście odwzorowania anatomicznego (reverse dissection) i DiceCT dostarcza ilościowych, powtarzalnych danych na temat architektury mięśni, zwiększając wiarygodność predykcyjną w badaniach nad zaangażowaniem celu z wykorzystaniem modeli naczelnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia bezpośrednią analizę formy i obecności mięśni mimicznych w celu wyjaśnienia biologicznych substratów szlaków ekspresji twarzy.
- Wartość operacyjna: Eliminuje domysły podczas przygotowania tkanek, zmniejszając zmienność w ocenach morfologicznych u różnych gatunków naczelnych.
- Wartość prognostyczna: Pozwala na zachowanie przyczepów mięśniowych do późniejszej analizy funkcjonalnej, wspierając testowanie hipotez dotyczących celów nerwowo-mięśniowych zaangażowanych w zachowania społeczne.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia wizualizację poszczególnych pęczków mięśniowych, co pozwala na ilościowy screening morfometryczny muskulatury u różnych wariantów ewolucyjnych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia nieniszczącą metodę obrazowania (DiceCT) do monitorowania podłużnego struktury mięśni w preparatach utrwalonych.
- Gotowość do analizy: Zwiększa kontrast między mięśniami a tkanką łączną poprzez barwienie jodem, co poprawia stosunek sygnału do szumu podczas cyfrowej sekcji i analizy wolumetrycznej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dopasowanie biomarkerów translacyjnych: Wspiera porównania międzygatunkowe mimicznej muskulatury naczelnych, co ułatwia ekstrapolację wyników z modeli nie-ludzkich na ludzkie szlaki komunikacji społecznej.
- Znaczenie dla modeli przedklinicznych: Umożliwia ocenę architektury mięśni w systemach istotnych dla przebiegu chorób, w których zmieniona ekspresja twarzy może wskazywać na fenotypy neuropsychologiczne.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Zapewnia strukturalną walidację celów nerwowo-mięśniowych przed przeprowadzeniem testów funkcjonalnych, co zmniejsza liczbę wyników fałszywie dodatnich w kaskadach walidacji celów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z przepływami pracy w biologii odkrywczej, dostarczając danych strukturalnych, które pomagają w wyborze celu, przechodzi przez etap opracowywania testów za pomocą znormalizowanego obrazowania i wspiera badania translacyjne, umożliwiając międzygatunkowe porównania morfologiczne w walidacji przedklinicznej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących szlaków nerwowo-mięśniowych leżących u podstaw ekspresji twarzy, dostarczając bezpośrednich dowodów na morfologię mięśni mimicznych.
- Przesiew: Umożliwia zstandaryzowaną, powtarzalną wizualizację pęczków mięśniowych, co wspiera ilościowe porównania między okazami i warunkami.
- Analityka: Generuje dane wolumetryczne i morfometryczne ze skanów DiceCT, które pozwalają na statystyczne porównanie architektury mięśni w różnych wariantach ewolucyjnych.
- Badania translacyjne: Ułatwia przejście od fazy odkryć do prac przedklinicznych, zapewniając zachowany odczyt strukturalny (objętość mięśni/wzór pęczków) możliwy do zastosowania u różnych gatunków naczelnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia wielokrotnie wykorzystywalny schemat obrazowania i sekcji do fenotypowania układu mięśniowo-szkieletowego w programach neuronauki behawioralnej.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez ograniczenie niejednoznaczności anatomicznej w badaniach nad mięśniami mimetycznymi.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje protokoły przygotowania tkanek i obrazowania, poprawiając odtwarzalność między laboratoriami w analizach muskulatury naczelnych.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektu w wyborze celu poprzez zapewnienie walidacji strukturalnej celów nerwowo-mięśniowych przed przesiewem funkcjonalnym.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o zachowane cechy strukturalne w modelach translacyjnych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga biegłości w technikach sekcji, obchodzeniu się z kontrastami oraz obsłudze mikro-CT w celu optymalnego przygotowania tkanek i obrazowania.
- Zależne od dostępu do skanerów CT o wysokiej rozdzielczości oraz roztworów do barwienia i odbarwiania (np. jod Lugola, formalina, tiosiarczan sodu) w celu wizualizacji na poziomie pęczków.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w jednostkach histologii, obrazowania i nauk o zachowaniu, aby zapewnić spójne przygotowanie próbek i interpretację danych.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji międzygatunkowej ze względu na różnice w wielkości pyska, smukłości mięśni oraz gęstości tkanki łącznej, co wpływa na efektywność sekcji i barwienia.
- Ograniczone przez destrukcyjny charakter sekcji wstecznej, co uniemożliwia pobieranie próbek podłużnych z tego samego egzemplarza i wymaga starannego przydziału materiału badawczego.
