Name: Nowatorski model in vitro urazowego uszkodzenia mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Poznaj model urazowego uszkodzenia mózgu in vitro wykorzystujący rurę uderzeniową ze sprężonym powietrzem do badania wpływu fali uderzeniowej na kultury hipokampu myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wspierane przez: Royal Centre for Defence Medicine, Birmingham, Wielka Brytania, Royal British Legion Centre for Blast Injury Studies, Imperial College London, Wielka Brytania. Rada ds. Badań Medycznych, Londyn, Zjednoczone Królestwo (MC_PC_13064; MR/N027736/1). The Gas Safety Trust, Londyn, Wielka Brytania. Rita Campos-Pires otrzymała nagrodę doktorską przyznaną przez Fundação para a Ciência e a Tecnologia w Lizbonie, Portugalia. Katie Harris otrzymała stypendium doktoranckie w Westminster Medical School Research Trust w Londynie w Wielkiej Brytanii.
Ten model został opracowany przy wsparciu Centrum Badań nad Obrażeniami Wybuchowymi Royal British Legion (RBLCBIS) w Imperial College. Pragniemy podziękować za wsparcie finansowe Królewskiego Legionu Brytyjskiego. Badacze zainteresowani współpracą lub dalszymi szczegółami mogą skontaktować się z autorami lub RBLCBIS.
Dziękujemy Dr Amarjit Samra, Dyrektorowi ds. Badań, Królewskie Centrum Medycyny Obronnej, Birmingham, Wielka Brytania, za wsparcie tej pracy, Scottowi Armstrongowi, Departamentowi Chirurgii i Raka, Imperial College London, za pomoc we wstępnych eksperymentach, Theofano Eftaxiopolou, Hari Arora & Luz Ngoc Nguyen, Wydział Bioinżynierii Imperial College London, oraz Williamowi Proudowi, Wydziałowi Fizyki Imperial College London, za porady w sprawie rurki uderzeniowej, Raquel Yustos, technik badawczy, Wydział Nauk Przyrodniczych, Imperial College London, za wsparcie techniczne, Paul Brown MBE, kierownik warsztatu i Steve Nelson, technik warsztatowy, Wydział Fizyki, Imperial College London, za wykonanie metalowych pierścieni, Neal Powell z Wydziału Fizyki, Imperial College London, za grafikę.

Eksperymenty opisane w tym manuskrypcie zostały przeprowadzone zgodnie z Ustawą o Zwierzętach (Procedury Naukowe) w Wielkiej Brytanii z 1986 roku i zostały zatwierdzone przez Animal Welfare & Ethical Review Body of Imperial College London. Opieka nad zwierzętami była zgodna z wytycznymi instytucjonalnymi Imperial College London.
1. Przygotowanie i hodowla organicotypowych plastrów hipokampa
UWAGA: Ten protokół pozwala na produkcję organotypowych wycinków hipokampa zgodnie z metodą interfejsu opisaną przez Stoppiniego i współpracowników z niewielkimi modyfikacjami21,22,23. Idealnie byłoby, gdyby nie więcej niż trzy zwierzęta zostały poddane eutanazji i sekcji podczas jednej sesji, aby upewnić się, że każdy krok zostanie wykonany szybko i uniknąć pogorszenia jakości plastrów. Przez cały czas należy stosować technikę aseptyczną.
<ol>
	<li>Upewnij się, że przed rozpoczęciem protokołu sekcji podjęto następujące kroki.
	<ol>
		<li>Przygotuj i przefiltruj wszystkie roztwory z wyprzedzeniem za pomocą filtra 0,22 μm.</li>
		<li>Roztwory należy utrzymywać w temperaturze 4 °C podczas przechowywania oraz podczas preparowania mózgu i przygotowywania plastrów hipokampa, trzymając pojemniki do przechowywania i szalki Petriego na metalowym radiatorze przez cały czas na mokrym lodzie.</li>
		<li>Autoklawuj wszystkie metalowe instrumenty, pierścienie i chusteczki papierowe.</li>
		<li>Upewnij się, że wszystkie instrumenty i materiały, które mają być użyte na każdym etapie protokołu, są gotowe do użycia, ułożone z wyprzedzeniem i spryskane 70% etanolem. Upewnij się, że mogą ostygnąć i wyschnąć.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poddaj eutanazji 5-7-dniowe szczenię myszy C57BL/6N przez zwichnięcie szyjki macicy i krótko przetrzyj całą powierzchnię skóry sterylną chusteczką papierową nasączoną 70% etanolem. Osusz skórę i odetnij głowę szczeniakowi za pomocą nożyczek Mayo.</li>
	<li>Przetnij skórę głowy nożyczkami do tęczówki wzdłuż linii środkowej głowy, zaczynając w okolicy potylicznej, a kończąc w pobliżu pyska i cofnij ją na boki.</li>
	<li>Włóż końcówkę nożyczek Vannas w otwór wielki i wykonaj dwa małe boczne nacięcia na kości wzdłuż zatok poprzecznych, a następnie przetnij czaszkę wzdłuż linii środkowej aż do opuszki węchowej i wykonaj dwa małe nacięcia prostopadle do linii środkowej w tym obszarze.</li>
	<li>Za pomocą drobno zakrzywionych kleszczy odsuń płaty kości bocznie od linii środkowej, ostrożnie wyjmij mózg małą szpatułką i przenieś go na 90-milimetrową płytkę Petriego pokrytą elastomerem silikonowym, zawierającą "podłoże preparacyjne". 
	UWAGA: Pożywka preparcyjna to zbilansowany roztwór soli Geya (5 mg/ml D-glukozy, 1% roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy, z 10 000 jednostek/ml penicyliny, 10 mg/ml streptomycyny i 25 μg/ml amfoterycyny B).</li>
	<li>Usuń móżdżek i oddziel półkule mózgowe wzdłuż linii środkowej za pomocą żyletki. Za pomocą szpatułki przenieś półkule mózgowe na nową, pokrytą elastomerem silikonowym 90 mm szalkę Petriego, wypełnioną świeżym, lodowatym podłożem preparacyjnym. Jeśli w jednej sesji ma być wykorzystane więcej niż jedno zwierzę, powtórz kroki 1.2–1.6.</li>
	<li>Pod mikroskopem stereoskopowym przeciąć opuszkę węchową i czubek kory czołowej żyletką i oddzielić korę mózgową od reszty tkanki mózgowej za pomocą kleszczy z cienką końcówką. Ten krok pozostawia hipokamp odsłonięty na przyśrodkowej powierzchni tkanki korowej. Od tego kroku należy używać kaptura do hodowli tkanek z przepływem laminarnym (sterylizowanego ultrafioletem i czyszczonego 70% roztworem etanolu).</li>
	<li>Nałóż lodowato zimne podłoże preparacyjne na płaską plastikową tarczę do krojenia i za pomocą szpatułki ustaw tkankę mózgową na dysku tak, aby przyśrodkowa powierzchnia kory była skierowana do góry, a oś hipokampa była prostopadła do osi ostrza do siekania.</li>
	<li>Usuń jak najwięcej pożywki preparacyjnej z tarczy do siekania za pomocą pipety Pasteura z cienką końcówką.</li>
	<li>Pokrój mózg na plastry o grubości 400 μm za pomocą rozdrabniacza do tkanek z prędkością i siłą rozdrabniania 50%. 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby ten krok został wykonany tak szybko, jak to możliwe, ponieważ tkanka mózgowa nie jest zanurzona w pożywce preparującej.</li>
	<li>Zastąp pożywkę do preparacji na szalce Petriego pokrytej elastomerem silikonowym świeżą, lodowatą pożywką.</li>
	<li>Po zakończeniu rozdrabniania tkanek ostrożnie zanurz tkankę mózgową w świeżym pożywce preparacyjnej i przenieś przeciętą tkankę z powrotem na 90-milimetrową szalkę Petriego pokrytą elastomerem silikonowym za pomocą skalpela z prostym ostrzem.</li>
	<li>Pod mikroskopem stereoskopowym ostrożnie oddziel plastry kory mózgowej za pomocą kleszczyków z cienką końcówką. Dla każdego plasterka sprawdź hipokamp pod kątem morfologii i potencjalnych uszkodzeń tkanek wynikających z rozcięcia lub krojenia.</li>
	<li>Oddziel hipokampy od kory śródwęchowej i od fimbrii za pomocą kleszczy z cienką końcówką i małych nożyczek Vannas. Zazwyczaj na półkulę generowanych jest około 6 do 8 wycinków hipokampa.</li>
	<li>Przenieś do 6 wycinków hipokampa do wkładki do hodowli tkankowej za pomocą pociętej pipety Pasteura i umieść ją na szalce Petriego o średnicy 35 mm. Upewnij się, że plasterki są rozłożone w odległości kilku milimetrów od siebie (zapewni to, że każdy plasterek będzie mógł być obrazowany indywidualnie).</li>
	<li>Natychmiast dodaj lodowatą "pożywkę wzrostową" na dno każdej szalki Petriego, pod wkładką do hodowli tkankowej, tuż poniżej górnej krawędzi wkładki do hodowli tkankowej. 
	UWAGA: Pożywka wzrostowa zawiera 50% minimum niezbędnego podłoża Eagle, 25% zrównoważonego roztworu soli Hanksa, 25% surowicy końskiej, 5 mg/ml D-glukozy, 2 mmol/L L-glutaminy, 1% roztworu antybiotykowo-przeciwgrzybiczego i 10 mmol/L HEPES, miareczkowanych do pH 7,2 wodorotlenkiem sodu.</li>
	<li>Zmienić pożywkę następnego dnia po rozbiorze, a następnie co 2 do 3 dni (użyć pożywki wzrostowej w temperaturze 37 °C). Upewnij się, że pożywka wzrostowa została dodana w wystarczającej ilości, ale nie na tyle, aby przelała się przez błonę wkładki do hodowli tkankowej, co mogłoby zagrozić żywotności wycinków tkanki.</li>
	<li>Plastry tkanek należy przechowywać w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% dwutlenkiem węgla w powietrzu przez 12 do 14 dni przed użyciem w eksperymentach.</li>
</ol>
2. Przygotowanie wycinków organotypowych hipokampa do eksperymentalnego protokołu TBI Blast
UWAGA: Wszystkie etapy tej sekcji, z wyjątkiem obrazowania, odbywają się w kapturze do hodowli tkanek z przepływem laminarnym.
<ol>
	<li>Włóż wykonane na zamówienie pierścienie ze stali nierdzewnej do płytki 6-dołkowej (po jednym na dołek). 
	UWAGI: Pierścienie mają obręcz z wycięciem (które powinno znajdować się w pozycji godziny 12) i ściśle przylegają do studzienek, podczas gdy wkłady do hodowli tkankowych łatwo mieszczą się w tej obręczy. Upewnij się, że pierścienie zostały umyte bakteriobójczym środkiem dezynfekującym, dokładnie spłukane oczyszczoną wodą, autoklawowane i pozostawione do wcześniejszego ostygnięcia.</li>
	<li>Napełnić studzienkę 6-dołkowej płytki wstępnie podgrzanym (37 °C) "eksperymentalnym podłożem" bez surowicy z jodkiem propidyny. 
	UWAGA: Pożywka doświadczalna z jodkiem propidyny to: 75% Minimum niezbędne podłoże Eagle, 25% zrównoważony roztwór soli Hanksa, 5 mg/ml D-glukozy, 2 mmol/L L-glutamina, 1% roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy, 10 mmol/L HEPES i 4,5 μmol/L jodku propidyny, miareczkowane pH do 7,2 wodorotlenkiem sodu.</li>
	<li>Upewnij się, że poziom medium nie sięga powyżej wycięcia pierścienia. Przenieść 6-dołkową płytkę z pierścieniami z powrotem do inkubatora na 1 godzinę, aby upewnić się, że pożywka ma temperaturę 37 °C bezpośrednio przed przeniesieniem wkładek do kultur tkankowych.</li>
	<li>Przenieść wkładki do kultur tkankowych z plastrami organotypowymi z szalek Petriego o średnicy 35 mm na płytkę 6-dołkową z pierścieniami i pożywką doświadczalną za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Zrób kropkę na brzegu wkładki w pozycji godziny 3 za pomocą markera permanentnego. 
	UWAGA: Wkładki zostaną usunięte z płytki 6-dołkowej podczas eksperymentu, a ten krok ułatwia powrót wkładki do pierwotnej pozycji po ekspozycji na falę uderzeniową i łatwe śledzenie każdego wycinka przez cały protokół.</li>
	<li>Oznacz każdą 6-dołkową płytkę unikalną nazwą i datą oraz sporządź mapę dołków każdej płytki, nazywając każdą studzienkę (np. A, B, C itp.) i każdy plasterek w każdym dołku (np. 1, 2, 3 itd.), tak aby każdy plasterek miał unikalny identyfikator (np. A1, A2, A3 itp.).</li>
	<li>Przenieść 6-dołkową płytkę do inkubatora na 1 godzinę, aby upewnić się, że plastry mają temperaturę 37 °C bezpośrednio przed obrazowaniem. 
	UWAGA: Unikaj przelewania się pożywki lub pęcherzyków powietrza pod membraną wkładki do hodowli tkankowej, co mogłoby zagrozić żywotności plastrów.</li>
	<li>1 godzinę po przeniesieniu na pożywkę eksperymentalną należy zobrazować każdy plasterek indywidualnie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (obiektyw 2X, NA 0,06) wyposażonego w odpowiedni filtr wzbudzenia (BP 535/50 nm) i emisyjny (LP 610 nm) w celu oceny stanu warstwy przed przeprowadzeniem protokołu urazu. 
	UWAGI: Plastry, które na tym etapie wykazują obszary gęstego czerwonego zabarwienia, należy uznać za wykazujące zagrożoną żywotność i powinny być wyłączone z dalszej analizy (zazwyczaj stanowią one mniej niż 10% całkowitej liczby wygenerowanych plasterków). Upewnij się, że obrazowanie jest wykonywane w sposób sekwencyjny i tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować czas, w którym plastry znajdują się poza inkubatorem (zwykle obrazowanie 6 dołków powinno zająć nieco poniżej 30 minut).</li>
	<li>Pokrywkę płytki 6-dołkowej należy zawsze założyć. Po wewnętrznej stronie pokrywy może gromadzić się pewna kondensacja. Jeśli tak się stanie, krótko użyj suszarki do włosów na niskim ustawieniu.</li>
	<li>Upewnij się, że wszystkie warunki obrazowania są identyczne w różnych dniach i między eksperymentami. 
	UWAGA: Celem obrazowania jest ilościowe określenie fluorescencji tkanek, dlatego ten krok jest ważny, aby zapewnić odtwarzalność wyników i umożliwić porównanie uzyskanych danych.</li>
</ol>
3. Zanurzenie i transport wkładek kultur tkankowych z plastrami organotypowymi hipokampa
<ol>
	<li>Natychmiast po obrazowaniu, w kapturze z przepływem laminarnym, wyjmij jedną wkładkę do hodowli tkankowej z płytki 6-dołkowej za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Ostrożnie przenieś wkładkę do sterylnego worka polietylenowego (3" x 5") wstępnie wypełnionego 20 ml ciepłego (37 °C) eksperymentalnego podłoża świeżo bąbelkowanego 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla. 
	UWAGA: Upewnij się, że pożywka doświadczalna wzbogacona w tlen i dwutlenek węgla była bąbelkowana przez co najmniej 40 minut z 95% tlenem i 5% dwutlenkiem węgla za pomocą bełkotki ze spiekanego szkła wewnątrz butelki Dreschel i przeniesiona do sterylnych worków polietylenowych wewnątrz kaptura do hodowli tkanek z przepływem laminarnym za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml z filtrem bakteryjnym i dołączoną sterylną rurką do napełniania (127 mm). Natychmiast zszczelnić worki i przenieść je do inkubatora o temperaturze 37 °C na co najmniej 1 godzinę przed przeniesieniem wkładki do hodowli tkankowej.</li>
	<li>Upewnij się, że każdy sterylny worek jest prawidłowo oznakowany (z tabliczką i identyfikacją studzienki). Powtórz ten krok dla każdej wkładki do hodowli tkankowej. Ostrożnie wyklucz pęcherzyki powietrza po zamknięciu sterylnych torebek (zrób to bezpiecznie, przekręcając górną część worków i nakładając plastikowy zacisk).</li>
	<li>Sterylne worki z wkładkami do kultur tkankowych i 6-dołkowymi płytkami z pożywką doświadczalną należy umieścić z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po upływie 1 godziny ostrożnie zapakować sterylne worki z wkładkami do kultur tkankowych w plastikowe pudełka wewnątrz termoregulowanego pudełka wypełnionego wodą dejonizowaną o temperaturze 37 °C, aby utrzymać plastry organotypowe w temperaturze fizjologicznej przez cały protokół ekspozycji na falę uderzeniową.</li>
</ol>
4. Przygotowanie rurki uderzeniowej i ekspozycji na falę uderzeniową z organicotypowego plastra hipokampa
<ol>
	<li>Nosić buty ochronne ze stalowymi palcami, fartuch laboratoryjny i rękawice podczas przygotowywania rurki uderzeniowej i ekspozycji na falę uderzeniową.</li>
	<li>Przykręć sterylną ramę uchwytu worka do dystalnego kołnierza rurki amortyzatora, upewniając się, że środkowy otwór jest wyrównany z wylotem rurki amortyzującej (za pomocą pręta zaślepiającego).</li>
	<li>Zamontuj promieniowo dwa przetworniki ciśnienia: czujnik 1, w środkowej części sekcji napędzanej i czujnik 2 w dystalnym kołnierzu rury uderzeniowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Podłącz przetworniki ciśnienia do oscyloskopu za pomocą zasilacza źródła prądu.</li>
	<li>Upewnij się, że wszystkie zawory spustowe rurki uderzeniowej i regulatory przepływu są zamknięte.</li>
	<li>Otwórz zewnętrzny przewód sprężonego powietrza i naładuj zawór elektromagnetyczny do 2,5 bara.</li>
	<li>Otwórz zawór bezpieczeństwa butli ze sprężonym powietrzem i powoli otwórz regulator ciśnienia, aby zwiększyć ciśnienie do około 5 barów. 
	UWAGA: Ciśnienie ustawione dla tego regulatora powinno być nieco wyższe od najwyższego ciśnienia rozrywającego membrany.</li>
	<li>Przygotuj membrany, tnąc arkusze poliestru o grubości 23 μm na kwadraty o wymiarach 10 x 10 cm2. Przygotuj uchwyty za pomocą taśmy autoklawu i przyklej je do góry i dołu każdej membrany.</li>
	<li>Umieść jedną membranę (pojedynczy slot konfiguracji z podwójnym zamkiem - pojedynczą membraną) lub dwie membrany (obie szczeliny konfiguracji z podwójnym zamkiem - podwójną membraną) w zamku (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Wyśrodkuj membrany i zaciśnij je za pomocą czterech i nakrętek M24, mocując je sekwencyjnie w symetryczny sposób po przekątnej i upewniając się, że membrany są wolne od zmarszczek.</li>
	<li>Zacisnąć każdą sterylną torbę indywidualnie w pozycji pionowej na ramie uchwytu, upewniając się, że powierzchnia wkładek do hodowli tkankowych z organotypowymi plastrami hipokampa jest skierowana w stronę wylotu rurki szokowej, a wkładka do hodowli tkankowej jest wyśrodkowana wewnątrz sterylnej torby (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C). Upewnij się, że sterylna torba jest bezpiecznie zaciśnięta dookoła, aby zapewnić mocne i równomierne unieruchomienie.</li>
	<li>Nosić ochronniki słuchu i okulary ochronne podczas naciskania na rurkę amortyzującą. Włącz zasilacz źródła prądu i oscyloskop, aby uzyskać dane fali uderzeniowej (szybkość akwizycji 50 mega-próbek/s, długość rekordu 20 ms, 1 milion punktów) i zamknij zawór elektromagnetyczny.</li>
	<li>Za pomocą pokrętła regulacji przepływu na panelu sterowania rurki amortyzatora powoli zwiększaj ciśnienie w sekcji głośności przetwornika rurki amortyzatora w przypadku konfiguracji z pojedynczą membraną lub zarówno w sekcji głośności przetwornika, jak i w sekcji z podwójnym zamkiem rury amortyzatora w przypadku konfiguracji z podwójną membraną. 
	UWAGA: W przypadku konfiguracji z pojedynczą membraną ciśnienie rozrywające będzie zależeć tylko od materiału i grubości membrany, a membrana pęknie spontanicznie po osiągnięciu ciśnienia rozrywania materiału. W przypadku konfiguracji z podwójną membraną ciśnienie rozrywające będzie również zależało od różnicy ciśnień gazu zarówno w komorze kierowcy, jak i w podwójnej komorze zamkowej, a aby membrany pękały w kontrolowany sposób, zawór bezpieczeństwa z podwójnym zamkiem jest otwierany ręcznie po osiągnięciu ciśnienia docelowego.</li>
	<li>Gdy tylko membrana pęknie (wytwarzając głośny dźwięk), szybko zamknij przepływ sprężonego powietrza za pomocą pokrętła przepływu i otwórz zawór elektromagnetyczny. 
	UWAGA: Całkowita objętość sekcji sterującej może być modyfikowana przez wstawienie segmentów zaślepiających, co pozwala na uzyskanie szerszego zakresu szczytowego nadciśnienia fali uderzeniowej i czasu trwania. Idealna kombinacja parametrów fali uderzeniowej powinna wystarczyć, aby spowodować uszkodzenie tkanki, ale nie na tyle wysoka, aby spowodować zniekształcenie lub pęknięcie wkładki do hodowli tkankowej lub sterylnego worka.</li>
	<li>Każdą sterylną torbę z wkładką do hodowli tkankowej należy wystawić na działanie pojedynczej fali rurki uderzeniowej i natychmiast umieścić ją z powrotem w pudełku regulowanym termicznie, zanim nowy sterylny worek zostanie wyjęty z pudełka i zaciśnięty na ramie uchwytu. Upewnij się, że kroki 4.10–4.14 są wykonywane tak płynnie i szybko, jak to możliwe (w ciągu kilku minut), aby zapobiec wyschnięciu pożywki doświadczalnej, ponieważ temperatury poniżej 37 °C mogą zakłócać rozwój urazu.</li>
	<li>Gdy wszystkie wkładki do kultur tkankowych zostaną wystawione na działanie fali uderzeniowej (lub protokołu pozorowanego), należy umieścić wkładki do hodowli tkankowej na oryginalnej płytce 6-dołkowej i do odpowiedniego dołka (wewnątrz kaptura do hodowli tkanek z przepływem laminarnym) i wrócić do inkubatora.</li>
	<li>Przechowywać 6-dołkową płytkę w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w powietrzu w temperaturze 37 °C do czasu dalszego obrazowania.</li>
	<li>Uwzględnij pozorowane kontrole dla każdego eksperymentu, wraz z ekspozycją na falę uderzeniową wycinka. 
	UWAGA: Plastry Sham są traktowane identycznie jak plastry wystawione na działanie fali uderzeniowej (zamknięte w sterylnych workach z pożywką eksperymentalną, transportowane do laboratorium rurki szokowej w tym samym pudełku z regulacją termiczną i zawieszane na metalowej ramie przez równoważny okres czasu), ale rurka szokowa nie jest wypalana.</li>
</ol>
5. Kwantyfikacja uszkodzeń plastrów organotypowych w hipokampie
<ol>
	<li>Po 24 godzinach, 48 godzinach i 72 godzinach zobrazuj plasterki zgodnie z opisem w krokach 2.8 i 2.9.</li>
	<li>Po obrazowaniu po 72 godzinach od ekspozycji na falę uderzeniową, wyrzuć tkankę zgodnie z lokalnymi protokołami odpadów biologicznych, a następnie zdezynfekuj i autoklawuj metalowe pierścienie.</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Spośród wszystkich mechanizmów obrażeń związanych z TBI (pierwotne, wtórne i trzeciorzędowe mechanizmy uszkodzeń wybuchowych), pierwotne uszkodzenie wybuchowe jest unikalne dla urazu wybuchowego i jest najmniej poznanym z mechanizmów związanych z wybuchem 1,2. Opisany tutaj nowatorski protokół został opracowany w celu zbadania pierwotnego TBI wybuchu przy użyciu otwartej rurki uderzeniowej w celu wystawienia in vitro mysich kultur plastrów hipokampa na pojedynczą falę uderzeniową przy użyciu prostego i szybkiego protokołu, który pozwala na stworzenie powtarzalnego pierwotnego TBI blastu o wysokiej przepustowości.
W pierwszych modelach TBI pierwotnego wybuchu in vitro zastosowano fale ciśnienia hydrostatycznego do komórek26,27. Jednak ciśnienie wyjściowe nie modelowało funkcji Friedlandera, ponieważ czas trwania impulsu ciśnienia hydrostatycznego był znacznie dłuższy niż fale nadciśnienia unoszącego się w powietrzu13. Charakterystyczną funkcję Friedlandera można łatwo wymodelować w laboratorium za pomocą rurki uderzeniowej 1,8. Rurka uderzeniowa może wytwarzać fale uderzeniowe, które symulują rzeczywiste eksplozje w otwartym polu w konwencjonalnym środowisku laboratoryjnym, umożliwiając jednocześnie precyzyjną kontrolę parametrów fali, takich jak nadciśnienie szczytowe, czas trwania fali dodatniej i impuls, poprzez zmianę materiału i grubości membrany oraz objętości sterownika 8,28,29.
Proste modele in vitro, takie jak hodowle komórkowe, zwykle nie uwzględniają heterogeniczności typów komórek i połączeń synaptycznych30. Ostatnio badano wpływ blastu na "sferoidy" komórek mózgowych in vitro obejmujące różne typy komórek31. Dalsze badania nad tymi interesującymi preparatami są zasadne; Nie jest jednak jasne, w jaki sposób ich organizacja i łączność komórkowa odzwierciedla nienaruszony mózg. OHSC są dobrze ugruntowanym modelem eksperymentalnym in vitro 23,32, są łatwe do hodowli, a ich trójwymiarowa cytoarchitektura tkanek, różnicowanie komórek i łączność synaptyczna są dobrze zachowane i bardzo podobne do tych in vivo33,34,35,36. OHSC reprezentują pośredni poziom złożoności między hodowlą komórkową a modelem in vivo 23,32. Wykazano, że OHSC odtwarzają in vitro patologiczne kaskady neurodegeneracyjne obserwowane w modelach in vivo i są bardzo przydatne w badaniach przesiewowych potencjalnych leków neuroprotekcyjnych i w zrozumieniu ich mechanizmów działania 17,21,22,37,38. Wreszcie, badany obszar anatomiczny, hipokamp, jest bardzo istotny w translacyjnych badaniach TBI, ponieważ region ten jest często uszkodzony u pacjentów z TBI 39,40,41. OHSC zostały użyte do modelowania strumienia TBI 28,42,43,44, jednak nasz model jest stosunkowo prosty i może być dostosowany do istniejących rur uderzeniowych w konfiguracjach poziomych lub pionowych bez skomplikowanych adaptacji.
OHSC może być przechowywany w hodowli przez wiele dni, co ułatwia badanie procesów biologicznych w czasie34. W tym modelu uszkodzenie tkanki, które powstało w wyniku ekspozycji na falę uderzeniową, mierzono codziennie przez trzy dni, po ekspozycji na wybuch przy użyciu jodku propidyny, dobrze znanego markera uszkodzenia komórek. Jodek propidyny jest nietoksycznym, wysoce polarnym barwnikiem, który przenika do komórek z uszkodzonymi błonami komórkowymi, gdzie wiąże się z kwasami nukleinowymi i wykazuje charakterystyczną jaskrawoczerwoną fluorescencję 24,25,45. Wykazano, że fluorescencja mierzona jodkiem propidyny ma dobrą korelację z liczbą uszkodzonych komórek przy użyciu barwienia Nissl46,47.
Biorąc pod uwagę, że uraz wytworzony w tym modelu był rozproszony (ryc. 2C), fluorescencja całego wycinka została zmierzona podczas wykonywania analizy, podobnie jak w przypadku wcześniej opublikowanych prac w innych paradygmatach uszkodzenia mózgu21,22, zamiast używać określonych regionów, jak to miało miejsce w innych modelach TBI blastów in vitro 28,43,44,48. Globalne podejście zastosowane w modelu opisanym w tym artykule eliminuje również potencjalną zmienność, która jest wprowadzana podczas nakreślania zdefiniowanych obszarów zainteresowania i zapewnia bardziej kompleksowy obraz urazu związanego z wybuchem. Oba szczytowe nadciśnienia fali uderzeniowej, 50 kPa i 55 kPa, spowodowały znaczne (odpowiednio p <0,05 i p <0,0001) szkody w porównaniu z plastrami pozorowanymi (ryc. 2B). Zgodnie z przewidywaniami, fala uderzeniowa o najwyższym szczytowym nadciśnieniu, 55 kPa, spowodowała więcej obrażeń niż fala 50 kPa. W modelu in vitro z wyizolowaną tkanką mózgową bezpośrednio wystawioną na działanie fali uderzeniowej, dokładne skalowanie do całego organizmu lub człowieka nie jest proste. Niemniej jednak użyte przez nas fale uderzeniowe mieszczą się w zakresie szczytowych nadciśnieni obserwowanych w terenie, zwykle 50–1000 kPa 8,49.
W celu utrzymania OHSC wystawionego na działanie temperatury fizjologicznej oraz poziomów tlenu i dwutlenku węgla, przy jednoczesnym zapewnieniu, że są one wolne od zanieczyszczeń w całym protokole ekspozycji na falę uderzeniową, wkładki do hodowli tkankowych zostały zamknięte w sterylnych workach polietylenowych zgodnie z techniką aseptyczną, zanurzone w pożywce doświadczalnej ogrzanej do 37 °C i świeżo bąbelkowane 95% tlenem i 5% dwutlenkiem węgla, Podobnie jak w poprzednio opublikowanej pracy 28,43,44,48. W przeciwieństwie do tych modeli, w których do przytrzymywania sterylnych worków podczas ekspozycji na falę uderzeniową stosowano złożone urządzenia, w tym protokole zastosowano prostą i szybką metodę zawieszenia wkładek do hodowli tkankowych OHSC przed wylotem rurki uderzeniowej (Figura 1A, C). Model opisany w tym artykule pozwala na szybkie przetwarzanie i wysoką przepustowość, przy jednoczesnym zminimalizowaniu ryzyka hipotermii. Aspekty te są szczególnie istotne dla badań nad neuroprotekcją, biorąc pod uwagę, że niektóre interwencje terapeutyczne mogą mieć bardzo ograniczone okno czasowe potencjalnego zastosowania po TBI. Ten nowatorski protokół ekspozycji na falę uderzeniową pozwala na wystawienie od 6 do 9 wkładek do hodowli tkankowych (zwykle od 36 do 54 wycinków tkanki organotypowej hipokampa) na falę uderzeniową w krótkim odstępie czasu (około 1 godziny).
OHSC wymagają dobrej techniki aseptycznej przez cały czas. Ważne jest, aby używać aseptycznego okapu z przepływem laminarnym przez cały czas hodowli i podczas przenoszenia do sterylnych worków w celu nadmuchu. W celu przeprowadzenia obrazowania plastrów w warunkach aseptycznych z założonymi pokrywkami płytek 6-dołkowych, używamy specjalnie wykonanych metalowych pierścieni do podniesienia wkładek do hodowli komórkowych do płaszczyzny ogniskowej mikroskopu. Ważną częścią naszego protokołu jest to, że w każdym eksperymencie uwzględniamy nieuszkodzone plastry pozorowane. Plastry szmatu są traktowane identycznie jak plastry wydmuchiwane, z wyjątkiem tego, że rura uderzeniowa nie jest wystrzeliwana; Kolejnym ważnym krokiem jest to, że wszystkie plastry są obrazowane 1 godzinę przed urazem lub pozorowanym leczeniem, aby upewnić się, że stan zdrowia populacji użytych plastrów jest identyczny (ryc. 2B).
Oprócz ilościowego określenia uszkodzenia komórek w plasterkach w czasie, tkankę można utrwalić pod koniec eksperymentu dla konwencjonalnej immunohistochemii50. Opracowaliśmy i oceniliśmy metodę przy użyciu mysich wycinków hipokampa. Jednak naszą technikę można łatwo dostosować do wykorzystania innych tkanek, które można hodować w kulturze, takich jak rdzeń kręgowy, siatkówka, płuca lub tkanka nabłonkowa. W tym artykule i naszej poprzedniej pracy z modelem badaliśmy tylko wpływ ekspozycji na pojedynczy wybuch. Jednak model ten doskonale nadaje się do badania wpływu powtarzających się wybuchów o niskim poziomie na mózg lub inną tkankę. OHSC mogą być przechowywane w hodowli przez wiele tygodni, a nawet miesięcy, co pozwala na zbadanie przewlekłych skutków.
Modele in vitro, jako prostsze niż modele in vivo, mają większą przepustowość, są tańsze, a eksperymenty można zwykle przeprowadzić w krótszej skali czasowej17. Wyniki uzyskane przy użyciu modeli in vitro muszą jednak zostać zweryfikowane na modelach zwierzęcych, ponieważ tkanki hodowane in vitro są utrzymywane w sztucznym środowisku i mogą reagować na uraz inaczej niż w przypadku in vivo17. Niemniej jednak modele in vitro okazały się niezwykle cenne w zwiększaniu naszej wiedzy na temat kaskad urazów mózgu oraz w badaniach przesiewowych leków neuroprotekcyjnych przed zastosowaniem bardziej złożonych modeli in vivo 17,22,51,52. Pomimo wielu zalet oferowanych przez ten model, należy zauważyć, że w modelach in vitro brakuje kluczowych cech TBI obecnych u zwierząt i modeli in vivo, takich jak wpływ na układ naczyniowy, zwiększone ciśnienie śródczaszkowe, ogólnoustrojowa odpowiedź immunologiczna i funkcjonalne upośledzenie behawioralne, co podkreśla potrzebę walidacji wyników znalezionych w modelach in vitro na całym zwierzęciu. Niemniej jednak modele in vitro, takie jak model opisany w tym artykule, są niezwykle użytecznymi narzędziami naukowymi istotnymi z punktu widzenia translacji.
Podsumowując, praca ta opisuje prostą i nieskomplikowaną nowatorską metodę, w której organotypowe hodowle tkanek hipokampa myszy są wystawiane na ściśle kontrolowane i powtarzalne rzeczywiste fale uderzeniowe przy użyciu laboratoryjnej rurki uderzeniowej. Wynikowy globalny uraz, który został określony ilościowo przy użyciu jodku propidyny, dobrze znanego markera uszkodzenia komórek, jest bardzo powtarzalny i proporcjonalny do szczytowego nadciśnienia zastosowanych fal uderzeniowych.

Urazowe uszkodzenie mózgu (TBI) to złożony rodzaj uszkodzenia mózgu, który powstaje w wyniku detonacji urządzeń wybuchowych1,2. Blast TBI stał się poważnym problemem zdrowotnym w ciągu ostatnich 15 lat w związku z niedawnymi konfliktami zbrojnymi w Iraku i Afganistanie2,3. Ogólnie rzecz biorąc, szacuje się, że od 4,4% do 22,8% żołnierzy powracających z Iraku i Afganistanu doznało łagodnego TBI, z czego duża część jest związana z wybuchem, przy czym wskaźnik TBI wybuchu jest wyższy w siłach amerykańskich w porównaniu z siłami brytyjskimi4,5.
Użycie improwizowanych urządzeń wybuchowych było odpowiedzialne za większość urazów związanych z wybuchem, w tym TBI wybuchu, które przeżyły siły wojskowe6. Detonacja ładunku wybuchowego powoduje bardzo szybki – ale przejściowy – wzrost ciśnienia, który następuje w ciągu milisekund. Wynikająca z tego fala nadciśnienia spowodowana eksplozją w rzeczywistym polu swobodnym jest modelowana przez funkcję Friedlandera, z nagłym wzrostem szczytowego nadciśnienia, po którym następuje wykładniczy zanik7,8. Zakres ekstremalnych sił i ich szybki przebieg w czasie obserwowany w przypadku wybuchu zwykle nie występuje w urazach niezwiązanych z wybuchem1,9. Uważa się, że szczytowe nadciśnienie, które jest maksymalnym ciśnieniem kształtu fali, oraz czas trwania fali dodatniej są ważnymi czynnikami przyczyniającymi się do uszkodzenia mózgu w wyniku wybuchu, a te zależą od ładunku wybuchowego i odległości od detonacji10,11.
Uraz wynikający z wybuchu jest klasyfikowany jako cztery odrębne składniki, oznaczone jako główne, drugorzędne, trzeciorzędowe i czwartorzędowe uszkodzenie wybuchu10,12,13,14. Każdy z tych elementów jest związany z określonymi mechanizmami urazu. Pierwotne uszkodzenie spowodowane wybuchem wynika z bezpośredniego działania fali nadciśnienia na narządy i tkanki2,13. Wtórne obrażenia od wybuchu wynikają z uderzenia odłamków pocisku, powodując rany penetrujące i niepenetrujące2,15. Trzeciorzędne obrażenia spowodowane wybuchem występują, gdy ciało ofiary jest przemieszczone o ziemię lub otaczające obiekty i są związane z siłami przyspieszania/zwalniania1,10,13. Czwartorzędowe obrażenia spowodowane wybuchem opisują niejednorodną grupę urazów bezpośrednio związanych z eksplozją, które nie są objęte pierwszymi trzema opisanymi mechanizmami urazów12,13. Obejmuje to (między innymi) urazy termiczne, wdychanie dymu, promieniowanie, fale elektromagnetyczne i niekorzystne skutki psychologiczne13,15. Większość TBI związanych z wybuchem wynika bezpośrednio z pierwszych trzech mechanizmów urazu, podczas gdy czwartorzędowe mechanizmy uszkodzenia wybuchowego są zwykle związane z urazem ogólnoustrojowym13. Wpływ sił przyspieszających/zwalniających (np. urazów kręgosłupa szyjnego), i penetrujących urazowych uszkodzeń mózgu był szeroko badany w odniesieniu do innych rodzajów TBI (np. wypadki samochodowe, upadki, urazy balistyczne). Jednak pierwotna fala nadciśnienia wybuchowego jest unikalna dla uszkodzenia wybuchowego, a jej wpływ na tkankę mózgową jest znacznie mniej zrozumiały16. Pierwotne mechanizmy uszkodzeń spowodowanych wybuchem, związane z falą nadciśnienia, są pierwszymi siłami mechanicznymi, które oddziałują z mózgiem.
W ciągu ostatnich dziesięcioleci opracowano liczne przedkliniczne modele TBI, które były nieocenione dla zrozumienia mechanizmów uszkodzenia i patofizjologii TBI oraz zbadania potencjalnych nowych metod leczenia, które w innym przypadku byłyby niemożliwe do wykonania wyłącznie w warunkach klinicznych17,18,19. Chociaż żaden pojedynczy model przedkliniczny nie jest w stanie odtworzyć złożoności klinicznego urazu mózgu spowodowanego wybuchem, zazwyczaj różne przedkliniczne modele TBI odtwarzają różne aspekty TBI u ludzi. Niszczące działanie sił związanych z wybuchem może być badane w izolacji lub w połączeniu zarówno w modelach TBI wybuchów in vitro, jak i in vivo. Modele in vitro mają tę zaletę, że pozwalają na ścisłą kontrolę środowiska eksperymentalnego (warunki fizjologiczne tkanek i biomechanika urazu), co zmniejsza zmienność biologiczną i poprawia odtwarzalność, umożliwiając badanie określonych kaskad molekularnych bez czynników zakłócających obecnych w modelach zwierzęcych20. Naszym celem było opracowanie modelu in vitro w celu zbadania wpływu pierwotnego wybuchu na tkankę mózgową. Naszym celem było opracowanie modelu z naddźwiękową falą uderzeniową o kształcie fali Friedlandera reprezentatywnym dla eksplozji w polu swobodnym, takiej jak ta wytwarzana przez improwizowane urządzenie wybuchowe (IED).

<table><tbody><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Geys</td><td>Sigma UK</td><td>G9779</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Sigma UK</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk/antybiotyk przeciwgrzybiczy</td><td>Sigma UK</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Minimalna niezbędna pożywka Eagle</td><td>Sigma UK</td><td>M4655</td><td></td></tr><tr><td>Hanks zrównoważony roztwór soli</td><td>Sigma UK</td><td>H9269</td><td></td></tr><tr><td>Surowica dla koni</td><td>Sigma UK</td><td>H1138</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma UK</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR Prolabo, Belgia</td><td>441476L</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma UK</td><td>S-0945</td><td></td></tr><tr><td>Wkładki do hodowli tkankowych</td><td>Millicell CM 30 mm niska wysokość Millipore</td><td>PICM ORG 50</td><td></td></tr> płytki <tr><td>6-dołkowe</td><td>NUNC, Dania</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny</td><td>Sigma UK</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne torby polietylenowe - sterylne worki na próbki Twirl'em</td><td>Fisherbrand</td><td>01-002-30</td><td></td></tr><tr><td>Portex Avon Kwill Rurka do napełniania 5" (127 mm)</td><td>Smiths Medical Supplies</td><td>E910</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny</td><td>NIKON Eclipse 80i, Wielka Brytania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw mikroskopowy</td><td>Nikon Plan UW magn. 2x, NA 0,06, WC 7,5 mm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtr mikroskopowy</td><td>Nikon G-2B (emisja długoprzepustowa)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mylarowa folia elektroizolacyjna, 304 mm x 200 mm x 0,023 mm</td><td>RS Components UK</td><td>785-0782</td><td></td></tr><tr><td>Przetwornik ciśnienia</td><td>Dytran Instruments Inc.</td><td>2300V1</td><td></td></tr><tr><td>Rozdrabniacz tkanek</td><td>Mickle Laboratory Engineering Co., Guildford, Surrey, Wielka Brytania.</td><td>Rozdrabniacz</td><td></td>tkanek Mcllwain</tr><tr><td>Elastomer silikonowy</td><td>Dow Corning, Stany Zjednoczone</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do tworzenia wykresów i statystyk</td><td>Oprogramowanie GraphPad, USA</td><td>Prism 7.0</td><td></td></tr></tbody></table>

nowatorski model in vitro urazowego uszkodzenia mózgu

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

Urazowe uszkodzenie mózgu jest główną przyczyną śmierci i niepełnosprawności w populacjach wojskowych i cywilnych. Urazowe uszkodzenie mózgu spowodowane wybuchem wynika z detonacji urządzeń wybuchowych, jednak mechanizmy, które leżą u podstaw uszkodzenia mózgu wynikającego z ekspozycji na nadciśnienie, nie są w pełni zrozumiałe i uważa się, że są unikalne dla tego typu uszkodzenia mózgu. Modele przedkliniczne są kluczowymi narzędziami, które przyczyniają się do lepszego zrozumienia uszkodzenia mózgu wywołanego wybuchem. Nowatorski model TBI wybuchu in vitro został opracowany przy użyciu otwartej rurki uderzeniowej do symulacji rzeczywistych fal uderzeniowych w otwartym polu modelowanych przez kształt fali Friedlandera. Mysie organotypowe kultury plastrów hipokampa C57BL/6N wystawiono na działanie pojedynczych fal uderzeniowych, a rozwój uszkodzenia scharakteryzowano do 72 godzin przy użyciu jodku propidyny, dobrze znanego fluorescencyjnego markera uszkodzenia komórek, który wnika tylko do komórek z uszkodzonymi błonami komórkowymi. Fluorescencja jodku propidyny była znacznie wyższa w warstwach wystawionych na działanie fali uderzeniowej w porównaniu z plastrami pozorowanymi przez cały czas trwania protokołu. Uszkodzenie tkanki mózgowej jest bardzo powtarzalne i proporcjonalne do szczytowego nadciśnienia przyłożonej fali uderzeniowej.

Rura wstrząsowa wykorzystana w tej metodzie pozwala na generowanie przejściowych nadciśnień symulujących rzeczywiste wybuchy w otwartym polu, modelowane za pomocą funkcji Friedlandera7,8. Uzyskano naddźwiękowe fale uderzeniowe o prędkości 40 m/s (Mach 1,3) (Rysunek 2A). Przedstawione dane przebiegu fali pochodzą z czujnika 2, umieszczonego promieniście na końcu sekcji napędowej rury wstrząsowej.
Stosując opisany powyżej protokół, organotypowe hodowle plastrów hipokampa poddane pojedynczej fali uderzeniowej (Rysunek 2A) wykazują znaczne uszkodzenia, które ilościowo określono przy użyciu jodku propidium – silnie polarnego barwnika fluorescencyjnego, który przenika wyłącznie do komórek z uszkodzonymi błonami komórkowymi24,25 (Rysunek 2B, C).
Nawet w optymalnych warunkach i zgodnie z innymi opublikowanymi modelami OHSC21,22istnieje niski poziom tła fluorescencji jodku propidyny, wynikający częściowo z niewielkich uszkodzeń spowodowanych naturalnymi manipulacjami tkankowymi (takimi jak wymiany pożywki w okresie hodowli lub wyjmowanie z inkubatora w celu obrazowania). Niniejszy protokół blast TBI wiąże się ze znacznymi manipulacjami, które obejmują zanurzenie skrawków w pożywce wewnątrz sterylnych worków oraz znaczny stopień manipulacji podczas protokołu ekspozycji na falę uderzeniową (np.., mocując sterylne worki do ramy uchwytu). Jednakże, jeśli wszystkie kroki zostaną wykonane starannie, ta dodatkowa manipulacja nie wpływa na podstawowy stan zdrowia OHSC, ponieważ nie zaobserwowano istotnych różnic w porównaniu z grupą kontrolną skrawków utrzymywanych przez cały czas w płytkach 6-dołkowych (t. j.., wkłady nie były zanurzone ani manipulowane) oraz grupę pozorowaną (sham), w skład której wchodziły skrawki zanurzone w sterylnych woreczkach przymocowanych do rury wstrząsowej (Rysunek 2B).
Dwie wybrane fale uderzeniowe, o szczytowym nadciśnieniu 50 kPa i 5 kPa, wywołały istotne (p &lt;0,05 oraz p &lt;0,001, odpowiednio) i powtarzalne uszkodzenia w porównaniu z nieuszkodzonymi plastrami kontrolnymi (sham) we wszystkich punktach czasowych po zastosowaniu protokołu ekspozycji na wybuch (Rycina 2B), nie powodując przy tym żadnych uszkodzeń wkładów do hodowli tkankowych ani sterylnych worków. Aby określić czułość modelu na niewielkie różnice w szczytowym nadciśnieniu, zdecydowaliśmy się wybrać wartości różniące się o ok. 10 %. Wyniki te pokazują również, że, zgodnie z oczekiwaniami, uszkodzenia wynikające z nadciśnienia 5 kPa są większe niż po fali uderzeniowej o wartości 50 kPa.
Dane przedstawiono jako średnią ± błąd standardowy średniej. Istotność oceniono za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji z powtarzanymi pomiarami z zastosowaniem testu post hoc Holma-Sidaka. Czynnikiem 1 była grupa (kontrolna, pozorowana, poddana działaniu fali uderzeniowej), a czynnikiem 2 czas po urazie (-1 h, 24 h, 48 h i 72 h), przy czym czynnik 1 był czynnikiem powtarzanym. Zastosowano korektę wartości p dla porównań wielokrotnych. Wartości P mniejsze niż 0,05 uznano za wskazujące na istotną różnicę między grupami. Testy statystyczne przeprowadzono przy użyciu pakietu oprogramowania do analizy statystycznej i tworzenia wykresów.
<img alt="Schemat rury udarowej z panelem sterowania, czujnikami oraz konfiguracją oscyloskopu do analizy ciśnienia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58400/58400fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Schemat urządzenia w postaci rury udarowej z ramą mocującą sterylny worek. (A). Rura uderzeniowa to wykonana ze stali nierdzewnej rura o długości 3,8 m, złożona z trzech sekcji o długości 1,2 m każda, połączonych za pomocą uszczelek i kołnierzy, o średnicy wewnętrznej 59 mm. (B) Na wstawce przedstawiono zespół podwójnego zamka. W urządzeniu można zaciisnąć jedną lub dwie przepony z Mylaru, a szczelność zapewnia gumowa uszczelka typu o-ring.C) Rama uchwytu do sterylnych worków. Korpus ramy składa się z dwóch metalowych płyt z centralnie umieszczonym otworem okrągłym (średnica 59 mm), który jest wyrównany z wylotem rury uderzeniowej. Pomiędzy dwiema metalowymi płytami zamocowano dwa cienkie (4 mm) arkusze elastomeru silikonowego. Arkusze te służą do zapewnienia równej i antypoślizgowej powierzchni do zaciskania sterylnych worków. Odległość między workiem a wylotem rury uderzeniowej wynosi 7 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58400/58400fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres zależności ciśnienia od czasu, wykres słupkowy intensywności fluorescencji oraz obrazy fluorescencyjne komórek dla badania ekspozycji na falę uderzeniową." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58400/58400fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2: Typowa fala uderzeniowa i wynikający z niej uraz w organotypowych kulturach przekrojów hipokampa. (A) Reprezentatywny przykład fali uderzeniowej uzyskanej przy użyciu 23 µmgruba folia poliestrowa, ciśnienie rozrywające 2,16 bar, szczytowe nadciśnienie 5 kPa, czas trwania fali dodatniej 0,4 ms, impuls 10,1 kPa·ms. Dane dotyczące przebiegu fali uzyskano z czujnika 2, zamontowanego promieniście na dystalnej kołnierzu sekcji napędowej rury udarowej. Prędkość fali uderzeniowej wynosiła 40 m/s (Mach 1,3).B) Stopień rozwoju uszkodzeń jest proporcjonalny do intensywności fali uderzeniowej. Fale uderzeniowe z maksymalnym nadciśnieniem wynoszącym odpowiednio 50 kPa i 5 kPa spowodowały znaczne uszkodzenia, które rozwijały się w ciągu 72-godzinnego protokołu w porównaniu z grupą pozorowaną (sham). Uszkodzenia powstałe w wyniku narażenia na falę z maksymalnym nadciśnieniem 5 kPa były istotnie większe niż po ekspozycji na 50 kPa w 48. i 72. godzinie. Przecięcie z grupy pozorowanej traktowano w taki sam sposób jak przecięcie z grupy poddanej blastowi, jednak nie oddano ładunku w rurze szokowej. Przecięcia kontrolne utrzymywano w płytkach 6-dołkowych w inkubatorze, bez żadnych manipulacji. Słupki przedstawiają wartości średnie, a słupki błędu błędy standardowe (n = 7, kontrola; n = 48, grupa pozorowana; n = 30, blast 50 kPa; n = 51, blast 5 kPa; n = liczba przecięć, z 6 oddzielnych eksperymentów). *p &lt;0.05, ****p &lt;0,001 w porównaniu z grupą pozorowaną. #p &lt;0.05, ##p &lt;0,01 w porównaniu z blastem 5 kPa. (C) Reprezentatywne obrazy fluorescencji jodku propidynyum w organotypowych skrawkach z (i) pozorowany, (ii) podmuch 50 kPa i (iii) grupy poddane działaniu blastu o sile 55 kPa w 72 h po urazie. Przekrój kontrolny (sham) wykazuje niski poziom fluorescencji, t.j.., urazu, a plastry poddane działaniu fali uderzeniowej wykazują wysoki stopień rozległego uszkodzenia, bardziej wyraźny w plastrze poddanym szczytowemu nadciśnieniu 5 kPa (Pasek skali = 500 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58400/58400fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten artykuł opisuje nowy model pierwotnego uszkodzenia mózgu spowodowanego wybuchem. Rurka uderzeniowa napędzana sprężonym powietrzem służy do wystawiania in vitro mysich kultur hipokampa na pojedynczą falę uderzeniową. Jest to prosty i szybki protokół generujący powtarzalne uszkodzenie tkanki mózgowej o wysokiej przepustowości.

Nowatorski model in vitro urazowego uszkodzenia mózgu

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie urazowego uszkodzenia mózgu spowodowanego wybuchem i może być stosowana do badań przesiewowych leków neuroprotekcyjnych przed zastosowaniem bardziej złożonych modeli in vivo. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona instrument laboratoryjny do wystawienia in vitro masowej tkanki mózgowej na falę uderzeniową przy użyciu prostego i wysokoprzepustowego protokołu, który pozwala na stworzenie powtarzalnego urazu. Najpierw włóż sterylne, wykonane na zamówienie pierścienie ze stali nierdzewnej do dołków sześciodołkowej płytki.Następnie dodać do studzienek wstępnie podgrzaną, pozbawioną surowicy pożywkę doświadczalną z jodkiem propidyny, upewniając się, że poziom pożywki nie sięga powyżej wcięcia pierścienia. Przenieś płytkę do inkubatora na jedną godzinę, aby upewnić się, że podłoże ma temperaturę 37 stopni Celsjusza przed przeniesieniem wkładek do kultur tkankowych. Po godzinie przenieś wkładki do kultur tkankowych z plastrami organotypowymi z ich szalek wzrostowych na pierścienie w płytce sześciodołkowej.Zrób kropkę na brzegu wkładki w pozycji godziny trzeciej za pomocą markera permanentnego, aby ułatwić powrót wkładek do pierwotnej pozycji, a następnie oznacz każdą płytkę sześciodołkową unikalną nazwą i datą oraz sporządź mapę dołków każdej płytki, nazywając każdą studzienkę literą, a każdy plasterek w studzience numerem, aby każdy plasterek miał unikalny identyfikator. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, aby upewnić się, że plastry mają temperaturę 37 stopni Celsjusza bezpośrednio przed obrazowaniem. Godzinę po przeniesieniu do pożywki eksperymentalnej oceń stan skóry, szybko obrazując każdy plasterek indywidualnie i sekwencyjnie pod niską mocą.Mikroskop fluorescencyjny wyposażony w odpowiedni filtr wzbudzenia i emisji najlepiej należy używać w ciemnym pomieszczeniu lub pomieszczeniu o słabym oświetleniu. Podczas obrazowania trzymaj pokrywkę na płytce. Po wewnętrznej stronie pokrywy może gromadzić się pewna kondensacja.Jeśli tak się stanie, krótko użyj suszarki do włosów na niskim ustawieniu na zewnątrz pokrywy. Upewnij się, że warunki obrazowania są identyczne w różnych dniach i między eksperymentami. Na początku badania zdrowe plastry wykazują bardzo mało barwienia fluorescencyjnego.Warstwy, które wykazują obszary gęstego czerwonego zabarwienia, wskazują na upośledzoną żywotność i powinny zostać wyłączone z dalszej analizy. Dla porównania, fluorescencja z wycinka zranionego przez wybuch po 72 godzinach jest pokazana tutaj. Natychmiast po zobrazowaniu wyjmij jedną wkładkę do hodowli tkankowej z płytki sześciodołkowej i ostrożnie przenieś wkładkę do sterylnego worka polietylenowego zawierającego 20 mililitrów wstępnie podgrzanego podłoża doświadczalnego z pęcherzykami 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla.Ostrożnie usuń wszelkie pęcherzyki powietrza i zamknij sterylną torbę, przekręcając górną część i nakładając plastikowy zacisk. Upewnij się, że każdy sterylny worek jest prawidłowo oznakowany tabliczką i dokładną identyfikacją. Po przeniesieniu każdej wkładki do hodowli tkankowej do indywidualnego sterylnego worka, umieść worki i sześć dołków z pożywką doświadczalną w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po godzinie ostrożnie zapakuj sterylne worki z wkładkami do kultur tkankowych w plastikowe pudełka wewnątrz termicznie regulowanego pudełka wypełnionego zjonizowaną wodą o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Woda powinna utrzymywać plastry organotypowe w temperaturze fizjologicznej przez cały protokół ekspozycji na falę uderzeniową. Podczas przygotowywania rurki uderzeniowej i ekspozycji na falę uderzeniową należy nosić buty ochronne ze stalowymi noskami, fartuch laboratoryjny i rękawice.Użyj pręta zaślepiającego, aby przykręcić sterylną ramę uchwytu worka do dystalnego kołnierza rurki amortyzatora, upewniając się, że środkowy otwór jest wyrównany z wylotem rurki wstrząsowej. Czujnik pierwszy, przetwornik ciśnienia, znajduje się w środkowej części sekcji napędzanej, a czujnik drugi znajduje się w dystalnym kołnierzu rury uderzeniowej. Podłącz te przetworniki ciśnienia do oscyloskopu za pomocą zasilacza źródła prądu i włącz oscyloskop.Upewnij się, że zawór elektromagnetyczny rurki uderzeniowej i regulator przepływu są zamknięte, a następnie otwórz zewnętrzny przewód sprężonego powietrza i naładuj zawór elektromagnetyczny do 2.5 bara. Otwórz zawór bezpieczeństwa butli ze sprężonym powietrzem i powoli otwórz regulator ciśnienia, aby zwiększyć ciśnienie do około pięciu barów. Następnie przygotuj membrany, tnąc arkusze poliestru o grubości 23 mikronów na kwadraty o wymiarach 10 na 10 centymetrów.Przygotuj uchwyty z taśmy autoklawu i przyklej je do góry i dołu każdej membrany. Umieść jedną membranę w wyłomie i upewnij się, że są wyśrodkowane. Następnie zaciśnij membranę za pomocą czterech i nakrętek M24.Ułóż je sekwencyjnie w sposób symetryczny po przekątnej, upewniając się, że membrany są wolne od zmarszczek. Zacisnąć sterylną torbę w pozycji pionowej na ramie uchwytu, upewniając się, że powierzchnia wkładki do hodowli tkankowej z organotypowymi plastrami hipokampa jest skierowana w stronę wylotu rurki szokowej, a wkładka do hodowli tkankowej jest wyśrodkowana wewnątrz sterylnej torby. W przypadku konfiguracji z podwójną membraną ciśnienie rozrywające zależy od różnicy ciśnień gazu między sterownikiem a komorą z podwójnym naruszeniem.Dlatego, aby membrany pękały w kontrolowany sposób, zawór bezpieczeństwa z podwójnym wyważeniem jest otwierany ręcznie po osiągnięciu docelowych ciśnień. Załóż ochronniki słuchu i okulary ochronne, jeśli nie były jeszcze noszone. Zamknij zawór elektromagnetyczny.Włącz prąd źródła zasilania, aby uzyskać dane fali uderzeniowej. Manipuluj pokrętłem regulacji przepływu na panelu sterowania rurki amortyzatora, aby powoli zwiększać ciśnienie w sekcji głośności przetwornika rurki amortyzatora w przypadku konfiguracji z pojedynczą membraną lub zarówno w sekcji głośności przetwornika, jak i w sekcji z podwójnym naruszeniem rurki amortyzatora w przypadku konfiguracji z podwójną membraną. Gdy tylko membrana pęknie, szybko zamknij przepływ sprężonego powietrza za pomocą pokrętła przepływu i otwórz zawór elektromagnetyczny.Idealna kombinacja parametrów fali uderzeniowej powinna wystarczyć, aby spowodować uszkodzenie tkanki, ale nie na tyle wysoka, aby spowodować zniekształcenie lub pęknięcie wkładki do hodowli tkankowej lub sterylnego worka. Po wystawieniu każdego plasterka na pojedynczą falę rurki uderzeniowej, natychmiast włóż go z powrotem do pudełka z regulacją termiczną. Następnie wyjmij następną sterylną torbę z pudełka i zaciśnij ją na ramie uchwytu.Przełącz się płynnie i szybko, aby zapobiec wychłodzeniu pożywki eksperymentalnej, ponieważ temperatury poniżej 37 mogą zakłócać rozwój urazu. Gdy wszystkie wkładki do kultur tkankowych zostaną wystawione na działanie protokołu fali uderzeniowej lub pozorowanego, należy umieścić wkładki kultur tkankowych w dołkach na oryginalnej płytce sześciodołkowej i wrócić do inkubatora do czasu dalszego obrazowania. Zdjęcie jest reprezentatywnym przykładem fali uderzeniowej uzyskanej przy użyciu folii poliestrowej o grubości 23 mikronów z nadciśnieniem szczytowym 55 kilopaskalów.Prędkość fali uderzeniowej wynosiła 440 metrów na sekundę. Zarówno fale uderzeniowe o szczytowym ciśnieniu 50, jak i 55 kilopaskalów spowodowały znaczne obrażenia, które rozwinęły się w ciągu 72-godzinnego protokołu w porównaniu z grupą pozorowaną. Uraz wynikający z ekspozycji na szczytową falę nadciśnienia o mocy 55 kilopaskali był znacznie wyższy niż po 50 kilopaskalach po 48 godzinach i 72 godzinach, co pokazuje, że rozwój urazu jest proporcjonalny do intensywności fali uderzeniowej.To zdjęcie pokazuje wycinek 72 godziny po wybuchu o sile 50 kilopaskalów. Widoczny jest wysoki poziom rozlanego urazu. Uraz jest bardziej wyraźny po szczytowym podmuchu nadciśnienia o mocy 55 kilopaskalów.Ten obraz fluorescencji jodku propidyny przedstawia organotypowy plasterek z fikcyjnego eksperymentu. Pozorny plasterek wykazuje niski poziom fluorescencji. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zachowaniu techniki aseptyki przez cały czas, aby uniknąć zanieczyszczenia tkanki oraz o szybkim, ale bardzo delikatnym manipulowaniu kulturami tkankowymi, aby uniknąć niezamierzonego uszkodzenia komórek.Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak barwienie immunofluorescencyjne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak jakie są mechanizmy śmierci komórki zaangażowane w urazowe uszkodzenie mózgu wywołane wybuchem? Technika ta pozwala naukowcom zajmującym się neuroprotekcją na przeprowadzenie testu o wysokiej przepustowości w celu zbadania potencjału leków zapobiegających rozprzestrzenianiu się śmierci komórek i tkanki mózgowej po ekspozycji na fale uderzeniowe.

a-novel-in-vitro-model-of-blast-traumatic-brain-injury

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W tym filmie urządzenie z rurką uderzeniową jest używane do generowania fali uderzeniowej poprzez rozerwanie membrany polimerowej poprzez kontrolowane zwiększanie ciśnienia. Fala uderzeniowa uderza w wycinki mózgu znajdujące się w zabezpieczonej torbie, wywołując urazowe uszkodzenie wycinka mózgu.

Wywoływanie urazu urazowego w wycinku mózgu za pomocą urządzenia z rurką uderzeniową

Modele urazowego uszkodzenia mózgu in vitro są opracowywane do odtwarzania deformacji mózgu in vivo. Uraz wywołany rozciąganiem został zastosowany w przypadku astrocytów, neuronów, komórek glejowych, komórek aorty i śródbłonka mózgu. Jednak nasz system wykorzystuje model bariery krew-mózg (BBB), który posiada właściwości stanowiące legalny model bariery krew-mózg, aby ustanowić model TBI in vitro.

Rozciąganie w komórkach śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (cEND) jako model in vitro urazowego uszkodzenia mózgu bariery krew-mózg

Ostra uraz mózgu to poważny uraz, który do tej pory nie doczekał się odpowiedniego leczenia. Mikroskopia wielofotonowa pozwala na badanie podłużne procesu rozwoju ostrego urazu mózgu i sondowanie strategii terapeutycznych u gryzoni. W protokole przedstawiono dwa modele ostrego urazu mózgu badane za pomocą dwufotonowego obrazowania mózgu in vivo.

Ostry uraz mózgu u myszy, po którym następuje podłużne obrazowanie dwufotonowe

Urazowe uszkodzenia mózgu (TBI) pozostają poważnym problemem zdrowotnym. Wykorzystując model chirurgii kontrolowanego wpływu kory mózgowej, można przeprowadzić badania nad skutkami TBI i możliwymi metodami leczenia.

Kontrolowany model uderzenia kory mózgowej w przypadku urazowego uszkodzenia mózgu

Zmodyfikowana technika obniżania wagi jest łatwą, opłacalną procedurą stosowaną do indukcji łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu u młodych szczurów. Ta nowatorska technika daje klinicznie istotne symptomy, które posuną naprzód badania nad łagodnym urazowym uszkodzeniem mózgu (mTBI) i wstrząśnieniem mózgu.

Nowy model łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu u młodych szczurów

Tutaj opisujemy nowe podejście do zadawania urazów mózgu u Drosophila melanogaster. Nasza metoda ma tę zaletę, że bezpośrednio dostarcza powtarzalne uderzenia z regulowaną siłą do samej głowy. Dalsze badania układu bezkręgowców pomogą rzucić światło na patogenezę przewlekłej encefalopatii pourazowej.

Nowa metoda modelowania przewlekłej encefalopatii pourazowej u Drosophila

Sportowcy każdego roku doświadczają kilkuset łagodnych urazowych urazów mózgu (mTBI)/wstrząśnień mózgu; jednak ich konsekwencje dla mózgu są słabo poznane. W związku z tym zwierzęcy model pojedynczego i powtarzalnego mTBI, który konsekwentnie replikuje klinicznie istotne objawy, zapewnia środki do postępu w badaniach nad mTBI i wstrząsem mózgu.

Mysi model pojedynczego i powtarzalnego łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu

Zmiana neuroprzekaźnika to mechanizm dysfunkcji neuronalnej, który występuje po wstrząśnieniu mózgu i przyczynia się do czasami katastrofalnych długoterminowych konsekwencji. Ten model szczurzy łączy w sobie mikrodializę, umożliwiającą kwantyfikację neuroprzekaźników in vivo, z techniką spadku masy ciała, wywierającą gwałtowne przyspieszanie i zwalnianie głowy i tułowia, co jest ważnym czynnikiem urazów czaszkowo-mózgowych u ludzi.

Nowatorski i translacyjny szczurzy model wstrząsu mózgu łączący siłę i rotację z mikrodializą mózgową in vivo

Tutaj opisujemy protokół indukcji mysiego urazowego uszkodzenia mózgu poprzez kontrolowane uderzenie w korę mózgową z otwartą głową.

Mysi model kontrolowanego wpływu na korę mózgową w celu indukcji urazowego uszkodzenia mózgu

Prezentujemy tutaj protokół modelu fali uderzeniowej dla gryzoni w celu zbadania neurobiologicznych i patofizjologicznych skutków łagodnego do umiarkowanego urazowego uszkodzenia mózgu. Stworzyliśmy zasilany gazem, laboratoryjny zestaw wyposażony w czujniki ciśnienia, co pozwala na niezawodne i powtarzalne generowanie łagodnych lub umiarkowanych urazowych uszkodzeń mózgu wywołanych wybuchem.

Model fali uderzeniowej o niskiej intensywności do przedklinicznej oceny łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu u gryzoni

Protokół ten opisuje niestandardowy system powietrza nadciśnieniowego przeznaczony do wywoływania uszkodzeń ośrodkowego układu nerwowego (OUN) układu zamkniętego (OUN) u myszy, w tym urazów oczu, mózgu i rdzenia kręgowego. Celem tego protokołu jest zapewnienie naukowcom ram do łatwego dostosowywania i rozszerzania systemu do ich unikalnych badań nad urazami OUN.

System do leczenia ogniskowych, zamkniętych uszkodzeń ośrodkowego układu nerwowego

Poznaj model urazowego uszkodzenia mózgu in vitro wykorzystujący rurę uderzeniową ze sprężonym powietrzem do badania wpływu fali uderzeniowej na kultury hipokampu myszy.

Nowatorski model in vitro urazowego uszkodzenia mózgu

Przeglądaj więcej filmów