Nowatorski model in vitro urazowego uszkodzenia mózgu

Ten artykuł opisuje nowy model pierwotnego uszkodzenia mózgu spowodowanego wybuchem. Rurka uderzeniowa napędzana sprężonym powietrzem służy do wystawiania in vitro mysich kultur hipokampa na pojedynczą falę uderzeniową. Jest to prosty i szybki protokół generujący powtarzalne uszkodzenie tkanki mózgowej o wysokiej przepustowości.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie urazowego uszkodzenia mózgu spowodowanego wybuchem i może być stosowana do badań przesiewowych leków neuroprotekcyjnych przed zastosowaniem bardziej złożonych modeli in vivo. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona instrument laboratoryjny do wystawienia in vitro masowej tkanki mózgowej na falę uderzeniową przy użyciu prostego i wysokoprzepustowego protokołu, który pozwala na stworzenie powtarzalnego urazu. Najpierw włóż sterylne, wykonane na zamówienie pierścienie ze stali nierdzewnej do dołków sześciodołkowej płytki.

Następnie dodać do studzienek wstępnie podgrzaną, pozbawioną surowicy pożywkę doświadczalną z jodkiem propidyny, upewniając się, że poziom pożywki nie sięga powyżej wcięcia pierścienia. Przenieś płytkę do inkubatora na jedną godzinę, aby upewnić się, że podłoże ma temperaturę 37 stopni Celsjusza przed przeniesieniem wkładek do kultur tkankowych. Po godzinie przenieś wkładki do kultur tkankowych z plastrami organotypowymi z ich szalek wzrostowych na pierścienie w płytce sześciodołkowej.

Zrób kropkę na brzegu wkładki w pozycji godziny trzeciej za pomocą markera permanentnego, aby ułatwić powrót wkładek do pierwotnej pozycji, a następnie oznacz każdą płytkę sześciodołkową unikalną nazwą i datą oraz sporządź mapę dołków każdej płytki, nazywając każdą studzienkę literą, a każdy plasterek w studzience numerem, aby każdy plasterek miał unikalny identyfikator. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, aby upewnić się, że plastry mają temperaturę 37 stopni Celsjusza bezpośrednio przed obrazowaniem. Godzinę po przeniesieniu do pożywki eksperymentalnej oceń stan skóry, szybko obrazując każdy plasterek indywidualnie i sekwencyjnie pod niską mocą.

Mikroskop fluorescencyjny wyposażony w odpowiedni filtr wzbudzenia i emisji najlepiej należy używać w ciemnym pomieszczeniu lub pomieszczeniu o słabym oświetleniu. Podczas obrazowania trzymaj pokrywkę na płytce. Po wewnętrznej stronie pokrywy może gromadzić się pewna kondensacja.

Jeśli tak się stanie, krótko użyj suszarki do włosów na niskim ustawieniu na zewnątrz pokrywy. Upewnij się, że warunki obrazowania są identyczne w różnych dniach i między eksperymentami. Na początku badania zdrowe plastry wykazują bardzo mało barwienia fluorescencyjnego.

Warstwy, które wykazują obszary gęstego czerwonego zabarwienia, wskazują na upośledzoną żywotność i powinny zostać wyłączone z dalszej analizy. Dla porównania, fluorescencja z wycinka zranionego przez wybuch po 72 godzinach jest pokazana tutaj. Natychmiast po zobrazowaniu wyjmij jedną wkładkę do hodowli tkankowej z płytki sześciodołkowej i ostrożnie przenieś wkładkę do sterylnego worka polietylenowego zawierającego 20 mililitrów wstępnie podgrzanego podłoża doświadczalnego z pęcherzykami 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla.

Ostrożnie usuń wszelkie pęcherzyki powietrza i zamknij sterylną torbę, przekręcając górną część i nakładając plastikowy zacisk. Upewnij się, że każdy sterylny worek jest prawidłowo oznakowany tabliczką i dokładną identyfikacją. Po przeniesieniu każdej wkładki do hodowli tkankowej do indywidualnego sterylnego worka, umieść worki i sześć dołków z pożywką doświadczalną w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po godzinie ostrożnie zapakuj sterylne worki z wkładkami do kultur tkankowych w plastikowe pudełka wewnątrz termicznie regulowanego pudełka wypełnionego zjonizowaną wodą o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Woda powinna utrzymywać plastry organotypowe w temperaturze fizjologicznej przez cały protokół ekspozycji na falę uderzeniową. Podczas przygotowywania rurki uderzeniowej i ekspozycji na falę uderzeniową należy nosić buty ochronne ze stalowymi noskami, fartuch laboratoryjny i rękawice.

Użyj pręta zaślepiającego, aby przykręcić sterylną ramę uchwytu worka do dystalnego kołnierza rurki amortyzatora, upewniając się, że środkowy otwór jest wyrównany z wylotem rurki wstrząsowej. Czujnik pierwszy, przetwornik ciśnienia, znajduje się w środkowej części sekcji napędzanej, a czujnik drugi znajduje się w dystalnym kołnierzu rury uderzeniowej. Podłącz te przetworniki ciśnienia do oscyloskopu za pomocą zasilacza źródła prądu i włącz oscyloskop.

Upewnij się, że zawór elektromagnetyczny rurki uderzeniowej i regulator przepływu są zamknięte, a następnie otwórz zewnętrzny przewód sprężonego powietrza i naładuj zawór elektromagnetyczny do 2.5 bara. Otwórz zawór bezpieczeństwa butli ze sprężonym powietrzem i powoli otwórz regulator ciśnienia, aby zwiększyć ciśnienie do około pięciu barów. Następnie przygotuj membrany, tnąc arkusze poliestru o grubości 23 mikronów na kwadraty o wymiarach 10 na 10 centymetrów.

Przygotuj uchwyty z taśmy autoklawu i przyklej je do góry i dołu każdej membrany. Umieść jedną membranę w wyłomie i upewnij się, że są wyśrodkowane. Następnie zaciśnij membranę za pomocą czterech i nakrętek M24.

Ułóż je sekwencyjnie w sposób symetryczny po przekątnej, upewniając się, że membrany są wolne od zmarszczek. Zacisnąć sterylną torbę w pozycji pionowej na ramie uchwytu, upewniając się, że powierzchnia wkładki do hodowli tkankowej z organotypowymi plastrami hipokampa jest skierowana w stronę wylotu rurki szokowej, a wkładka do hodowli tkankowej jest wyśrodkowana wewnątrz sterylnej torby. W przypadku konfiguracji z podwójną membraną ciśnienie rozrywające zależy od różnicy ciśnień gazu między sterownikiem a komorą z podwójnym naruszeniem.

Dlatego, aby membrany pękały w kontrolowany sposób, zawór bezpieczeństwa z podwójnym wyważeniem jest otwierany ręcznie po osiągnięciu docelowych ciśnień. Załóż ochronniki słuchu i okulary ochronne, jeśli nie były jeszcze noszone. Zamknij zawór elektromagnetyczny.

Włącz prąd źródła zasilania, aby uzyskać dane fali uderzeniowej. Manipuluj pokrętłem regulacji przepływu na panelu sterowania rurki amortyzatora, aby powoli zwiększać ciśnienie w sekcji głośności przetwornika rurki amortyzatora w przypadku konfiguracji z pojedynczą membraną lub zarówno w sekcji głośności przetwornika, jak i w sekcji z podwójnym naruszeniem rurki amortyzatora w przypadku konfiguracji z podwójną membraną. Gdy tylko membrana pęknie, szybko zamknij przepływ sprężonego powietrza za pomocą pokrętła przepływu i otwórz zawór elektromagnetyczny.

Idealna kombinacja parametrów fali uderzeniowej powinna wystarczyć, aby spowodować uszkodzenie tkanki, ale nie na tyle wysoka, aby spowodować zniekształcenie lub pęknięcie wkładki do hodowli tkankowej lub sterylnego worka. Po wystawieniu każdego plasterka na pojedynczą falę rurki uderzeniowej, natychmiast włóż go z powrotem do pudełka z regulacją termiczną. Następnie wyjmij następną sterylną torbę z pudełka i zaciśnij ją na ramie uchwytu.

Przełącz się płynnie i szybko, aby zapobiec wychłodzeniu pożywki eksperymentalnej, ponieważ temperatury poniżej 37 mogą zakłócać rozwój urazu. Gdy wszystkie wkładki do kultur tkankowych zostaną wystawione na działanie protokołu fali uderzeniowej lub pozorowanego, należy umieścić wkładki kultur tkankowych w dołkach na oryginalnej płytce sześciodołkowej i wrócić do inkubatora do czasu dalszego obrazowania. Zdjęcie jest reprezentatywnym przykładem fali uderzeniowej uzyskanej przy użyciu folii poliestrowej o grubości 23 mikronów z nadciśnieniem szczytowym 55 kilopaskalów.

Prędkość fali uderzeniowej wynosiła 440 metrów na sekundę. Zarówno fale uderzeniowe o szczytowym ciśnieniu 50, jak i 55 kilopaskalów spowodowały znaczne obrażenia, które rozwinęły się w ciągu 72-godzinnego protokołu w porównaniu z grupą pozorowaną. Uraz wynikający z ekspozycji na szczytową falę nadciśnienia o mocy 55 kilopaskali był znacznie wyższy niż po 50 kilopaskalach po 48 godzinach i 72 godzinach, co pokazuje, że rozwój urazu jest proporcjonalny do intensywności fali uderzeniowej.

To zdjęcie pokazuje wycinek 72 godziny po wybuchu o sile 50 kilopaskalów. Widoczny jest wysoki poziom rozlanego urazu. Uraz jest bardziej wyraźny po szczytowym podmuchu nadciśnienia o mocy 55 kilopaskalów.

Ten obraz fluorescencji jodku propidyny przedstawia organotypowy plasterek z fikcyjnego eksperymentu. Pozorny plasterek wykazuje niski poziom fluorescencji. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zachowaniu techniki aseptyki przez cały czas, aby uniknąć zanieczyszczenia tkanki oraz o szybkim, ale bardzo delikatnym manipulowaniu kulturami tkankowymi, aby uniknąć niezamierzonego uszkodzenia komórek.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak barwienie immunofluorescencyjne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak jakie są mechanizmy śmierci komórki zaangażowane w urazowe uszkodzenie mózgu wywołane wybuchem? Technika ta pozwala naukowcom zajmującym się neuroprotekcją na przeprowadzenie testu o wysokiej przepustowości w celu zbadania potencjału leków zapobiegających rozprzestrzenianiu się śmierci komórek i tkanki mózgowej po ekspozycji na fale uderzeniowe.