Name: Oczyszczanie trypanosomów zewnątrzkomórkowych, w tym afrykańskich, z krwi za pomocą wymieniaczy anionowych (kolumny dietyloaminoetylocelulozowe) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 26 s
Description: Naucz się oczyszczania trypanosomów afrykańskich z krwi metodą wymieniaczy anionowych DEAE. Technika ta umożliwia uzyskanie czystych pasożytów do badań immunologicznych i molekularnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy wszystkim członkom UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD Université de Bordeaux. Badania te były finansowane ze środków wewnętrznych Uniwersytetu w Bordeaux oraz ze strony ANR, LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024 oraz Association pour le développement de la recherche en parasitologie et médecine tropicale i Service de coopération et d'action culturelle de l'Ambassade de France à Bangi (Centrafrique).

Badania zgodne z Wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (Publikacja NIH nr 85±23, poprawiona w 1996 roku). Protokoły zostały zatwierdzone przez naszą lokalną komisję etyczną.
1. Zwierzęta
<ol>
	<li>Samice myszy szwajcarskich (OF-1) w wieku od ośmiu do dziesięciu tygodni, ważące 20-25 g, należy przechowywać w pomieszczeniach dla zwierząt piętnaście dni przed każdym eksperymentem. Umieść je w wentylowanych skrzynkach, które są przechowywane w chronionym pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze (22 °C) i wilgotności (50%), z 12-godzinnym cyklem włączania/wyłączania światła.</li>
	<li>Zapewnij zwierzętom swobodny dostęp do jedzenia i wody. Zminimalizuj ból, cierpienie i niepokój oraz wzbogac środowisko.</li>
	<li>Do trzymania używaj klatek o przezroczystych ściankach, wzbogacania drewnianymi patyczkami i kartonowych tuneli. Delikatnie wciągnij zwierzę do tunelu, aby przenieść je z klatki na dłoń.</li>
	<li>Wykonuj codzienne monitorowanie, aby ocenić oznaki pokłonu, izolacji społecznej, obrażeń ciała, potarganych włosów lub braku pielęgnacji.</li>
	<li>Waż każde zwierzę raz w tygodniu. Wykonuj regularne kontrole przez lekarza weterynarii.</li>
	<li>W przypadku pasożytów naturalnych należy pobrać krew w szczytowym momencie parazytemii, a w przypadku pasożytów powodujących śmierć zwierzęcia należy pobrać krew dzień przed domniemaną śmiercią. 
	UWAGA: Wszystkie eksperymenty z czynnikami zakaźnymi są przeprowadzane w dedykowanych pomieszczeniach, zgodnie z wytycznymi zatwierdzonymi przez uczelnię.</li>
</ol>
2., preparaty pożywek
<ol>
	<li>Odważyć każdą substancję i dodać wodę destylowaną do następujących:
	<ol>
		<li>Przygotować skoncentrowany roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami (2x): 
		Na2HPO4 (bezwodny) (MW 141,96 g) 10,14 g 
		NaH2PO4∙2H2O (MW 156,01 g) 0,62 g 
		NaCl (MW 58,44 g) 2,55 g 
		Destylowany H2O do 1 L</li>
		<li>Przygotować buforowaną fosforanami sól fizjologiczną glukozy: 
		Na2HPO4 (bezwodny) (MW 141,96 g) 5,39 g 
		NaH2PO4∙2H2O (MW 156,01 g) 0,31 g 
		NaCl (MW 58,44 g) 1,70 g 
		Glukoza (MW 180 g) 10 g 
		Destylowany H2O do 1 L</li>
		<li>Przygotować 1 m KH2PO4.</li>
		<li>Przygotować bufor elucyjny: Uzupełnij buforowaną fosforanem sól fizjologiczną glukozy za pomocą 
		Penicylina (100 μg/ml), streptomycyna (100 μg/ml) i czerwień fenolowa (5 μg/ml).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie DEAE-celulozy
<ol>
	<li>Zaplanuj około 5 godzin na przygotowanie DEAE-celulozy.</li>
	<li>Przemyć 100 g DEAE-celulozy wodą destylowaną w kolbie z wąską szyjką i pozostawić do osiadania, a następnie wyrzucić drobne cząstki. Powtarzać mycie, aż supernatant będzie klarowny.</li>
	<li>Dodaj 3 l zagęszczonej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i wymieszaj.</li>
	<li>Doprowadzić pH do 8,0 za pomocą 1 M KH2PO4 i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Umyj dwukrotnie wodą destylowaną i pozostaw do osiadania.</li>
	<li>Przemyć i pozostawić do dwukrotnego osadzenia się 3 litrami soli fizjologicznej i glukozy buforowanej fosforanami i wyrzucić supernatanty.</li>
	<li>Zmierzyć objętość celulozy i dodać równą objętość soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, rozprowadzić do plastikowych butelek i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
4. Pasożyty
<ol>
	<li>Zbieraj szczepy trypanosomów na obszarach endemicznych dla trypanosomatozy ludzkiej i zwierzęcej. Utrzymuj pasożyty zamrożone w ciekłym azocie. 
	UWAGA: Trypanosoma musculi nie jest patogenny dla ludzi i jest zewnątrzkomórkowym trypanosomem stosowanym do bezpiecznego zastępowania patogennych trypanosomów w różnych eksperymentach laboratoryjnych.</li>
	<li>W przypadku badań laboratoryjnych wymagających obecności czynników chorobotwórczych u ludzi, należy przeprowadzać doświadczenia z ostrożnością, w specjalnych warunkach i środkach ostrożności na odpowiednim poziomie zagrożenia biologicznego (BSL); BSL2 dla T. b. gambiense i BSL3 dla T. b. rhodesiense. W warunkach polowych ustala się standardową praktykę mikrobiologiczną: bezpieczne pobieranie próbek, pipetowanie mechaniczne, częste odkażanie powierzchni i sterylizację odpadów.</li>
</ol>
5. Infekcja myszy
<ol>
	<li>Pasożyty należy szybko rozmrozić w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Obserwuj kroplę rozmrożonej zakażonej krwi pod mikroskopem. Oceń żywotność pasożyta, mierząc procent form ruchliwych17.</li>
	<li>Wstrzyknąć pasożyty dootrzewnowo myszom (0,5 ml na mysz). Każdego dnia, po zakażeniu, należy pobrać 20 μl krwi z ogona przez nakłucie igłą i obserwować pod mikroskopem. Oceń parazytemię według Herberta i Lumsdena18, licząc pasożyty w kilku polach mikroskopowych lub używając hemocytometru.</li>
	<li>Gdy parazytemia osiągnie próg, który jest zdefiniowany dla każdego szczepu, należy zebrać krew (1 ml / mysz) w buforze elucyjnym (5 ml / mysz) zawierającym heparynę (10 U / ml). 
	UWAGA: Oryginalna i nowatorska praca Lanhama i Godfreya opisała optymalną siłę jonową buforowanej fosforanem glukozy soli dla kilku gatunków żywiciela/pasożyta z roztworu podstawowego o pH 8,0.</li>
</ol>
6. Separacja pasożytów
UWAGA: Wszystkie eksperymenty od tego momentu muszą być wykonywane w kapturze do hodowli tkankowej w rękawiczkach. Temperatura i wilgotność w pomieszczeniach laboratoryjnych wynosiły odpowiednio 22 °C i 45%. W warunkach polowych separację pasożytów udało się przeprowadzić w temperaturze 34 °C.
<ol>
	<li>Umieść strzykawkę o pojemności 10 ml w pionowym wsporniku i dodaj wcześniej wyciętą okrągłą bibułę, kawałek bibuły filtracyjnej, watę szklaną lub gąbkę celulozową.</li>
	<li>Wlać celulozę DEAE do strzykawki aż do osiągnięcia poziomu 8 ml, a następnie przemyć 25 ml buforu elucyjnego.</li>
	<li>Ostrożnie dodać 2 ml rozcieńczonej krwi na górze kolumny, a następnie dodać pożywkę elucyjną. Regularnie dodawać bufor elucyjny zgodnie z pasażem trypanosomów.</li>
	<li>Zbieraj krople ścieków z kolumn w probówce wirówkowej i regularnie sprawdzaj pod mikroskopem obecność pasożytów.</li>
	<li>Gdy pasożyty nie zostaną już wykryte w ściekach z kolumny, należy odwirować probówkę (1 800 x g, 10 minut, w temperaturze 4 °C w laboratorium i w temperaturze otoczenia w warunkach polowych).</li>
	<li>Usunąć supernatant i zawiesić pasożyty w 1 ml odpowiedniej pożywki wymaganej do następnego etapu badania.</li>
	<li>Policz pasożyty za pomocą hemocytometru i w razie potrzeby rozcieńcz je w odpowiednim podłożu.</li>
</ol>

<ol><li>Büscher, P., Cecchi, G., Jamonneau, V., Priotto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+African+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Human African trypanosomiasis.</a> Lancet. 390 (10110), 2397-2409 (2017).</li>
<li>Lejon, V., Bentivoglio, M., Franco, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+African+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Clinical+Neurology%22%5BJournal%5D)">Human African trypanosomiasis.</a> Handbook of Clinical Neurology. 114, 169-181 (2013).</li>
<li>Giordani, F., Morrison, L. J., Rowan, T. G., De Koning, H. P., Barrett, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+animal+trypanosomiases+and+their+chemotherapy%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">The animal trypanosomiases and their chemotherapy: a review.</a> Parasitology. 143 (14), 1862-1889 (2016).</li>
<li>Aksoy, S., Buscher, P., Lehane, M., Solano, P., Van Den Abbeele, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+African+trypanosomiasis+control%3A+Achievements+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Human African trypanosomiasis control: Achievements and challenges.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (4), e0005454(2017).</li>
<li>Büscher, P., Deborggraeve, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+can+molecular+diagnostics+contribute+to+the+elimination+of+human+African+trypanosomiasis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">How can molecular diagnostics contribute to the elimination of human African trypanosomiasis?</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (5), 607-615 (2015).</li>
<li>Truc, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+human+infections+by+animal+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Atypical human infections by animal trypanosomes.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2256(2013).</li>
<li>Lumsden, W. H., Kimber, C. D., Evans, D. A., Doig, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+brucei%3A+miniature+anion-exchange+centrifugation+technique+for+detection+of+low+parasitaemias%3A+adaptation+for+field+use%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma brucei: miniature anion-exchange centrifugation technique for detection of low parasitaemias: adaptation for field use.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (3), 312-317 (1979).</li>
<li>Büscher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Models+of+Mini+Anion+Exchange+Centrifugation+Technique+%28mAECT%29+and+Modified+Single+Centrifugation+%28MSC%29+for+sleeping+sickness+diagnosis+and+staging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Improved Models of Mini Anion Exchange Centrifugation Technique (mAECT) and Modified Single Centrifugation (MSC) for sleeping sickness diagnosis and staging.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (11), e471(2009).</li>
<li>Lanham, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+trypanosomes+from+the+blood+of+infected+rats+and+mice+by+anion-exchangers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Separation of trypanosomes from the blood of infected rats and mice by anion-exchangers.</a> Nature. 218 (5148), 1273-1274 (1968).</li>
<li>Lanham, S. M., Godfrey, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+salivarian+trypanosomes+from+man+and+other+mammals+using+DEAE-cellulose%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Isolation of salivarian trypanosomes from man and other mammals using DEAE-cellulose.</a> Experimental Parasitology. 28 (3), 521-534 (1970).</li>
<li>Humphrey, P. A., Ashraf, M., Lee, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+trypanosomes+in+vivo%2C+host+body+weight+gains%2C+and+food+consumption+in+zinc-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Growth of trypanosomes in vivo, host body weight gains, and food consumption in zinc-deficient mice.</a> Journal of the National Medical Association. 89 (1), 48-56 (1997).</li>
<li>Lowry, J. E., Leonhardt, J. A., Yao, C., Belden, E. L., Andrews, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+C57BL%2F6+mice+by+Trypanosoma+musculi+modulates+host+immune+responses+during+Brucella+abortus+cocolonization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wildlife+Diseases%22%5BJournal%5D)">Infection of C57BL/6 mice by Trypanosoma musculi modulates host immune responses during Brucella abortus cocolonization.</a> Journal of Wildlife Diseases. 50 (1), 11-20 (2014).</li>
<li>Vincendeau, P., Daëron, M., Daulouede, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+antibody+classes+and+Fc+receptors+responsible+for+phagocytosis+of+Trypanosoma+musculi+by+mouse+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Identification of antibody classes and Fc receptors responsible for phagocytosis of Trypanosoma musculi by mouse macrophages.</a> Infection and Immunity. 53 (3), 600-605 (1986).</li>
<li>Vincendeau, P., Daëron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+musculi+co-express+several+receptors+binding+rodent+IgM%2C+IgE%2C+and+IgG+subclasses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma musculi co-express several receptors binding rodent IgM, IgE, and IgG subclasses.</a> Journal of Immunology. 142 (5), 1702-1709 (1989).</li>
<li>Holzmuller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+and+pathogenicity+patterns+of+Trypanosoma+bruceigambiense+field+isolates+in+experimentally+infected+mouse%3A+differences+in+host+immune+response+modulation+by+secretome+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infections%22%5BJournal%5D)">Virulence and pathogenicity patterns of Trypanosoma bruceigambiense field isolates in experimentally infected mouse: differences in host immune response modulation by secretome and proteomics.</a> Microbes and Infections. 10 (1), 79-86 (2008).</li>
<li>Holzmuller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+parasites+and+their+excreted-secreted+factors+modulate+the+inducible+metabolism+of+L-arginine+in+macrophages%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">How do parasites and their excreted-secreted factors modulate the inducible metabolism of L-arginine in macrophages?</a> Frontiers in Immunology. 9, 778(2018).</li>
<li>Abrahamson, I. A., Da Silva, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-dependent+cytotoxicity+against+Trypanosoma+cruzi%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Antibody-dependent cytotoxicity against Trypanosoma cruzi.</a> Parasitology. 75 (3), 317-323 (1977).</li>
<li>Herbert, W. J., Lumsden, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+brucei%3A+a+rapid+%26%2334%3Bmatching%26%2334%3B+method+for+estimating+the+host%27s+parasitemia%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma brucei: a rapid &#34;matching&#34; method for estimating the host's parasitemia.</a> Experimental Parasitology. 40 (3), 427-431 (1976).</li>
<li>Dauchy, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+brucei+CYP51%3A+Essentiality+and+Targeting+Therapy+in+an+Experimental+Model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma brucei CYP51: Essentiality and Targeting Therapy in an Experimental Model.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (11), e0005125(2016).</li>
<li>Raz, B., Iten, M., Grether-Bühler, Y., Kaminsky, R., Brun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Alamar+Blue+assay+to+determine+drug+sensitivity+of+African+trypanosomes+%28T.+b.+rhodesiense+and+T.+b.+gambiense%29+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Tropica%22%5BJournal%5D)">The Alamar Blue assay to determine drug sensitivity of African trypanosomes (T. b. rhodesiense and T. b. gambiense) in vitro.</a> Acta Tropica. 68 (2), 139-147 (1997).</li>
<li>Albright, J. W., Albright, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+growth+of+Trypanosoma+musculi+in+cell-free+medium+conditioned+by+rodent+macrophages+and+mercaptoethanol%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">In vitro growth of Trypanosoma musculi in cell-free medium conditioned by rodent macrophages and mercaptoethanol.</a> International Journal for Parasitology. 10 (2), 137-142 (1980).</li>
<li>Gobert, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-Arginine+availability+modulates+local+nitric+oxide+production+and+parasite+killing+in+experimental+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">L-Arginine availability modulates local nitric oxide production and parasite killing in experimental trypanosomiasis.</a> Infection and Immunity. 68 (8), 4653-4657 (2000).</li>
<li>De Muylder, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Trypanosoma+brucei+kinesin+heavy+chain+promotes+parasite+growth+by+triggering+host+arginase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A Trypanosoma brucei kinesin heavy chain promotes parasite growth by triggering host arginase activity.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), e1003731(2013).</li>
<li>Nzoumbou-Boko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+musculi+Infection+in+Mice+Critically+Relies+on+Mannose+Receptor-Mediated+Arginase+Induction+by+a+TbKHC1+Kinesin+H+Chain+Homolog%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma musculi Infection in Mice Critically Relies on Mannose Receptor-Mediated Arginase Induction by a TbKHC1 Kinesin H Chain Homolog.</a> Journal of Immunology. 199 (5), 1762-1771 (2017).</li>
<li>Bonhivers, M., Nowacki, S., Landrein, N., Robinson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+the+trypanosome+endo-exocytotic+organelle+is+cytoskeleton+mediated%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of the trypanosome endo-exocytotic organelle is cytoskeleton mediated.</a> PLoS Biology. 6 (5), e105(2008).</li>
<li>Albisetti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+the+flagellar+pocket+collar+and+the+hook+complex+via+a+novel+microtubule-binding+protein+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Interaction between the flagellar pocket collar and the hook complex via a novel microtubule-binding protein in Trypanosoma brucei.</a> PLoS Pathogens. 13 (11), e1006710(2017).</li>
<li>Cross, G. A. M., Klein, R. A., Linstead, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+amino+acids+by+Trypanosoma+brucei+in+culture%3A+L-threonine+as+a+precursor+for+acetate%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Utilization of amino acids by Trypanosoma brucei in culture: L-threonine as a precursor for acetate.</a> Parasitology. 71 (2), 311-326 (1975).</li>
<li>Bringaud, F., Rivière, L., Coustou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+of+trypanosomatids%3A+adaptation+to+available+carbon+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 149 (1), 1-9 (2006).</li>
<li>Mazet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+the+central+metabolism+of+the+bloodstream+forms+of+Trypanosoma+brucei%3A+production+of+acetate+in+the+mitochondrion+is+essential+for+the+parasite+viability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Revisiting the central metabolism of the bloodstream forms of Trypanosoma brucei: production of acetate in the mitochondrion is essential for the parasite viability.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (12), e2587(2013).</li>
<li>Coutton, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+CFAP43+and+CFAP44+cause+male+infertility+and+flagellum+defects+in+Trypanosoma+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mutations in CFAP43 and CFAP44 cause male infertility and flagellum defects in Trypanosoma and human.</a> Nature Communications. 9 (1), 686(2018).</li>
<li>Cnops, J., Magez, S., De Trez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escape+mechanisms+of+African+trypanosomes%3A+Why+trypanosomosis+is+keeping+us+awake%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Escape mechanisms of African trypanosomes: Why trypanosomosis is keeping us awake.</a> Parasitology. 142 (3), 417-427 (2015).</li>
<li>Barrett, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-Based+Approaches+to+the+Isolation+of+African+Trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-Based Approaches to the Isolation of African Trypanosomes.</a> Pathogens. 6 (4), (2017).</li>
<li>Taylor, A. E., Lanham, S. M., Williams, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+methods+of+preparation+on+the+infectivity%2C+agglutination%2C+activity%2C+and+ultrastructure+of+bloodstream+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Influence of methods of preparation on the infectivity, agglutination, activity, and ultrastructure of bloodstream trypanosomes.</a> Experimental Parasitology. 35 (2), 196-208 (1974).</li>
<li>Gutteridge, W. E., Cover, B., Gaborak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+blood+and+intracellular+forms+of+Trypanosoma+cruzi+from+rats+and+other+rodents+and+preliminary+studies+of+their+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Isolation of blood and intracellular forms of Trypanosoma cruzi from rats and other rodents and preliminary studies of their metabolism.</a> Parasitology. 76 (2), 159-176 (1978).</li>
<li>Cruz-Saavedra, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Trypanosoma+cruzi+metacyclic+trypomastigotes+by+ion+exchange+chromatography+in+sepharose-DEAE%2C+a+novel+methodology+for+host-pathogen+interaction+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigotes by ion exchange chromatography in sepharose-DEAE, a novel methodology for host-pathogen interaction studies.</a> Journal of Microbiological Methods. 142, 27-32 (2017).</li>
<li>Lemesre, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+protection+against+canine+visceral+leishmaniasis+using+the+LiESAp-MDP+vaccine+in+endemic+areas+of+France%3A+double-blind+randomised+efficacy+field+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Long-lasting protection against canine visceral leishmaniasis using the LiESAp-MDP vaccine in endemic areas of France: double-blind randomised efficacy field trial.</a> Vaccine. 25 (21), 4223-4234 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Oczyszczone trypanosomy stanowią potężny środek do studiowania immunologii, biochemii, biologii komórkowej i molekularnej. Duże ilości danych i wyników uzyskano z trypanosomów, co następnie pomogło w uzyskaniu informacji z innych komórek eukariotycznych30. Trypanosomy są również przedmiotem ważnych i interesujących badań, ponieważ opracowali liczne mechanizmy, które pozwalają im przetrwać i rosnąć w dwóch bardzo różnych środowiskach: wektora muchy tse-tse i gospodarza ssaków23,31...

Opisana tutaj metoda pozwala na oddzielenie trypanosomów, pasożytów odpowiedzialnych za zwierzęcą i ludzką trypanosomatozę afrykańską (HAT), od krwi. Jest to najlepsza metoda diagnozowania pierwszego etapu HAT, a ponadto ta metoda oczyszczania pasożytów pozwala na solidne badania serologiczne i badawcze.
HAT jest spowodowany przez muchę Tse-tse przenoszoną przez muchę Trypanosoma brucei gambiense i T. b. rhodesiense1. Te pasożytnicze pierwotniaki namnażają się zewnątrzkomórkowo w krwiobiegu, limfie i płynach śródmiąższowych w pierwszym etapie choroby (stadium hemolimfy). Drugi etap (stadium opon mózgowo-rdzeniowych) rozpoczyna się, gdy pasożyty przekraczają barierę krew-mózg; Objawy neurologiczne, w tym zaburzenie snu, od którego pochodzi nazwa "śpiączka" tej choroby, są typowe dla tego drugiego etapu2. Pokrewne trypanosomy (T. evansi, T. congolense, T. vivax, T. b. brucei) są czynnikami sprawczymi zwierzęcej afrykańskiej trypanosomozy (AAT)3.
Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) dąży do wyeliminowania HAT jako problemu zdrowia publicznego do 2020 roku i zatrzymania transmisji do 2030 roku4. Niedawne wprowadzenie szybkich testów diagnostycznych poprawiło diagnostykę serologiczną1,4,5. Opracowano kilka molekularnych testów diagnostycznych, ale ich rola w diagnostyce terenowej nie została jeszcze ustalona5. Służą one do identyfikacji podgatunków z grupy brucei i trypanosomatozy atypowej wywoływanej przez pasożyty odpowiedzialne za trypanosomozę zwierzęcą6.
Wykrycie pasożyta jest niezbędne do diagnozy, leczenia i obserwacji, ponieważ badania serologiczne mogą dawać fałszywie pozytywne i niestety fałszywie ujemne wyniki1. Bezpośrednia obserwacja mikroskopowa tych protistów hemoflagellate jest trudna w przypadkach HAT wywoływanych przez T. b. gambiense (ponad 95% przypadków), ponieważ regułą są niskie parazytemie, podczas gdy w przypadku HAT wywołanych przez T. b. rhodesiense duża liczba pasożytów jest często obecna we krwi. Zastosowano różne techniki zagęszczania, takie jak wirowanie w grubej kropli i kapilarnej probówce (CTC), ale najbardziej czułą metodą jest oddzielenie pasożytów od krwi za pomocą kolumny wymieniacza anionowego (celulozy DEAE), a następnie odwirowanie i obserwacja mikroskopowa osadu, (można wykryć około 50 pasożytów/ml krwi)1,7. W związku z tym oczyszczanie trypanosomów metodą wymieniaczy anionowych (celuloza DEAE) jest najlepszą i jak dotąd referencyjną metodą wizualizacji i izolacji pasożytów z krwi w diagnostyce HAT. W warunkach polowych z powodzeniem zastosowano mini-kolumnę z celulozy DEAE, a kilka ulepszeń ułatwiło obserwację mikroskopową7,8.
Metoda oddzielania trypanosomów od krwi, opisana poniżej, zależy od ładunku powierzchniowego pasożyta, który jest mniej ujemny niż w przypadku komórek krwi ssaków9. Co ciekawe, metoda ta została opracowana 50 lat temu, w 1968 roku przez dr Sheilę Lanham, i pozostaje złotym standardem w wykrywaniu i przygotowywaniu trypanosomów krwi. Jest szybki i powtarzalny dla trypanosomów ślinowych od szerokiej gamy ssaków, co pozwala na diagnozę trypanosomatozy zarówno zwierzęcej, jak i ludzkiej10.
Aby uzyskać żywe, oczyszczone pasożyty, do kolumny wymieniacza anionowego dodaje się zakażoną krew. Warunki chromatograficzne (głównie pH, siła jonowa/pożywek) muszą być dostosowane do każdego rodzaju trypanosomów, a bardziej ogólnie, do każdej mieszaniny komórek krwi ssaków i trypanosomów10. Bufor elucyjny jest precyzyjnie dostosowany do pH 8 dla większości afrykańskich trypanosomów10. Metoda ta sprzyja stężeniu pasożytów znajdujących się we krwi pacjentów, ponieważ parazytemie mogą być zbyt niskie, aby można je było wykryć za pomocą samej obserwacji mikroskopowej, a także umożliwia badania laboratoryjne. Praca ze świeżo wyizolowanymi trypanosomami i na krwi zakażonych zwierząt, przy użyciu tej techniki, jest bardziej odpowiednia dla różnych badań niż badania z pasożytami, które były hodowane w warunkach aksenicznych w laboratorium przez czas nieokreślony.
Relacje między gospodarzem a pasożytem najlepiej badać z pasożytem infekującym swojego naturalnego gospodarza, dlatego T. musculi, naturalny pasożyt myszy, który jest reprezentatywny dla trypanosomów zewnątrzkomórkowych, ma wiele zalet, ponieważ zakażenie mysie występuje u małego zwierzęcia laboratoryjnego i nie wymaga warunków poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL). T. musculi nie zabija myszy immunokompetentnych, w przeciwieństwie do wielu innych gatunków Trypanosoma, w tym ludzkich patogenów. T. musculi nie są eliminowane u myszy pozbawionych limfocytów T, a parazytemie mogą być zwiększone u zakażonych myszy poprzez modyfikację spożycia pokarmu i składników odżywczych11. Pasożyt ten moduluje odpowiedź immunologiczną w koinfekcjach innymi patogenami12. T. musculi od zakażonych myszy wykazują różnice w stosunku do hodowanych T. musculi, na przykład ekspresja receptorów błonowych Fc jest tracona w kulturach aksenicznych T. musculi, w porównaniu z pasożytami oczyszczonymi z zakażonych myszy13,14. Czynniki wydzielane przez wydalanie (ESF) są również jakościowo i ilościowo mniej wyrażane w kulturach trypanosomów aksenowych i różnią się między szczepami izolowanymi na obszarach endemicznych15. ESF są pierwszymi antygenami, które są wyświetlane układowi odpornościowemu gospodarza i dlatego odgrywają ważną rolę w początkowej odpowiedzi immunologicznej gospodarza16.
U eksperymentalnie zakażonych zwierząt do badań laboratoryjnych, ten protokół ułatwia eksperymentowanie na większej liczbie pasożytów, minimalizując liczbę wymaganych myszy, zwłaszcza przy użyciu zwierząt z obniżoną odpornością. Wariantowe glikoproteiny powierzchniowe (VSG), które są używane w teście aglutynacji kart w kierunku trypanosomatozy (CATT) w masowych badaniach przesiewowych, są nadal oczyszczane z trypanosomów, które rozmnażają się u szczurów. Dwa szybkie testy diagnostyczne (indywidualnie pakowane kasety), które są obecnie dostępne do użytku w terenie, nadal wykorzystują infekcyjne źródło modelu natywnych VSG, a nie trypanosomów hodowanych in vitro1,4,5. Postęp w badaniach nad immunologią i biologią trypanosomów został ułatwiony, ponieważ te oczyszczone z celulozy pasożyty DEAE można łatwo uzyskać w dużych ilościach od naturalnie lub eksperymentalnie zakażonych żywicieli, a w szczególności gryzoni.

<table><tbody><tr><td>Pipety 10 ml&nbsp;</td><td>Pipety Falcon</td><td>357,551</td><td></td></tr><tr><td>2 ml&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352,507</td><td></td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa 50 ml</td><td>Falcon</td><td>352,070</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Sigma Aldrich</td><td>4K15</td><td></td></tr><tr><td>DEAE celuloza</td><td>Santa Cruz</td><td>s/c- 211213</td><td>100 G</td></tr><tr><td>bibuła filtracyjna&nbsp;</td><td>Whatman</td><td>1,001,125</td><td></td></tr><tr><td>Kolba z płaskim dnem wąska szyjka</td><td>Duran</td><td>21 711 76</td><td>6000 ml</td></tr><tr><td>Glukoza&nbsp;</td><td>VWR</td><td>101174Y</td><td>500 G</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149-50KU</td><td>5 000 U</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>VWR</td><td>120 26936.260</td><td>500 G</td></tr><tr><td></td><td>Mikroskop Olympus</td><td>CH-20</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe do mikroskopów</td><td>Thermofisher scientific</td><td>CB00100RA020MNT0</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Thermofisher</td><td>AGAA000001</td><td></td></tr><tr><td>naukowy Na2HPO4&nbsp;</td><td>VWR</td><td>100 28026; 260</td><td>500 G</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR</td><td>27800.291</td><td>1 KG</td></tr><tr><td>NaH2PO4&nbsp;</td><td>VWR</td><td>110 33616; 262</td><td>500 G</td></tr><tr><td>Plastikowe butelki na media Nalgene rozmiar 125 ml</td><td>Thermofisher scientific</td><td>342024-0125</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Plastikowe butelki na media rozmiar 500 ml</td><td>Thermofisher scientific</td><td>342024-0500</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura</td><td>VWR</td><td>BRND125400</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina 10 000 UI / Streptomycyna 10 000 i mikro; g</td><td>EUROBIO</td><td>CABPES01 OU</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>czerwień fenolowa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0290</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Syringue&nbsp;</td><td>Dutscher</td><td>SS+10S21381</td><td></td></tr><tr><td>Kaptur do hodowli tkankowych</td><td>Thermoelectro Corporation</td><td>MSC-12</td><td></td></tr><tr><td>Trypanosoma brucei brucei</td><td>Institute of Tropical Medicine (Antwerpia, Belgia).</td><td></td><td>ANTAT 1.1</td></tr><tr><td>Trypanosoma brucei gambiense</td><td>Instytut Medycyny Tropikalnej (Antwerpia, Belgia).</td><td></td><td>ITMAP 1893</td></tr><tr><td>Trypanosoma musculi</td><td>London School of Hygiene and Tropical Medicine (Wielka Brytania)</td><td></td><td>Partinico II</td></tr></tbody></table>

oczyszczanie trypanosomów zewnątrzkomórkowych, w tym afrykańskich, z krwi za pomocą wymieniaczy anionowych (kolumny dietyloaminoetylocelulozowe)

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers (Diethylaminoethyl-cellulose Columns)

Ta metoda pozwala na oddzielenie trypanosomów, pasożytów odpowiedzialnych za zwierzęcą i ludzką trypanosomatozę afrykańską (HAT), od zakażonej krwi. Jest to najlepsza metoda do diagnozowania pierwszego etapu HAT, a ponadto ta metoda oczyszczania pasożytów pozwala na badania serologiczne i badawcze.
HAT jest spowodowany przez muchę Tse-tse przenoszoną przez muchę Trypanosoma brucei gambiense i T. b. rhodesiense. Pokrewne trypanosomy są czynnikami wywołującymi trypanosomatozę zwierzęcą. Wykrywanie trypanosomów jest niezbędne w diagnostyce, leczeniu i obserwacji HAT. Opisana tutaj technika jest najbardziej czułą techniką wykrywania pasożytów, dostosowaną do warunków terenowych do diagnozy T. b. gambiense HAT i może być zakończona w ciągu jednej godziny. Krew jest nakładana warstwami na kolumnę wymieniacza anionowego (celuloza DEAE) uprzednio dostosowaną do pH 8 i dodaje się bufor elucyjny. Silnie ujemnie naładowane krwinki są adsorbowane na kolumnie, podczas gdy mniej ujemnie naładowane trypanosomy przechodzą przez nią. Zebrane trypanosomy są granulowane przez wirowanie i obserwowane pod mikroskopem. Co więcej, pasożyty są przygotowywane bez uszkodzeń komórkowych przy zachowaniu ich zakaźności.
Oczyszczone trypanosomy są wymagane do testów immunologicznych; są używane w teście trypanolizy, złotym standardzie w serologii HAT. Barwione pasożyty są wykorzystywane w karcianym teście aglutynacyjnym (CATT) w serologii terenowej. Antygeny z oczyszczonych trypanosomów, takie jak wariant glikoproteiny powierzchniowej, egzoantygeny, są również stosowane w różnych testach immunologicznych. Opisana tutaj procedura jest przeznaczona dla afrykańskich trypanosomów; W związku z tym warunki chromatografii muszą być dostosowane do każdego szczepu trypanosomów, a bardziej ogólnie, do krwi każdego gatunku ssaka gospodarza.
Te fascynujące patogeny są łatwo oczyszczane i dostępne do wykorzystania w badaniach biochemicznych, molekularnych i biologii komórki, w tym we wspólnej hodowli z komórkami gospodarza w celu zbadania relacji gospodarz-pasożyt na poziomie receptorów błonowych, sygnalizacji i ekspresji genów; testowania leków in vitro; badania delecji genów, mutacji lub nadekspresji w procesach metabolicznych, biogenezie cytoszkieletu i przeżywalności pasożytów.

Oczyszczone trypanosomy były wykorzystywane w testach farmakologicznych. Pasożyty przenosi się dołków hodowlanych zawierających szeregowe rozcieńczenia określonych leków, podawanych pojedynczo lub w kombinacjach19. Obserwacje mikroskopowe, w których ocena ruchliwości służy jako marker żywotności, mogą być stosowane w przypadku testowania niewielkiej liczby leków, natomiast test żywotności komórek AlamarBlue jest doskonałą metodą do przeprowadzania masowych analiz r...

Ta metoda oddzielania trypanosomów od krwi zależy od tego, czy ich ładunek powierzchniowy jest mniej ujemny niż u komórek krwi ssaków. Zakażoną krew umieszcza się i poddaje działaniu środka ciężkości na kolumnie wymieniacza anionowego. Ta metoda, najbardziej odpowiednia diagnostyka trypanosomatozy afrykańskiej, dostarcza oczyszczonych pasożytów do badań immunologicznych, biologicznych, biochemicznych, farmaceutycznych i biologii molekularnej.

Oczyszczanie trypanosomów zewnątrzkomórkowych, w tym afrykańskich, z krwi za pomocą wymieniaczy anionowych (kolumny dietyloaminoetylocelulozowe)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is ...

Trypanosomy afrykańskie są odpowiedzialne za ludzką trypanosomatozę afrykańską, czyli śpiączkę i trypanosomatozę afrykańską u zwierząt. Trypanosomy powodujące śpiączkę to pasożyty protistyczne przenoszone przez muchy tse-tse, obecne w wielu ogniskach geograficznych w Afryce Subsaharyjskiej. Wykrycie pasożyta jest niezbędne do diagnozy, leczenia i obserwacji.Serologia może dawać wyniki fałszywie dodatnie i niestety fałszywie ujemne. Aby ułatwić wykrywanie we krwi, trypanosomy muszą być skoncentrowane. Zastosowano różne techniki zagęszczania pasożytów.Najbardziej czułą metodą jest oddzielenie pasożytów od krwi za pomocą kolumny wymieniacza anionowego, celulozy DEAE, a następnie odwirowanie i obserwacja mikroskopowa. W związku z tym metoda celulozowa DEAE jest najlepszą i pozostaje do chwili obecnej referencyjną metodą wizualizacji i izolacji pasożytów z krwi w diagnostyce trypanosomatozy afrykańskiej u ludzi, zwłaszcza w warunkach polowych. Ta metoda, najbardziej odpowiednia diagnostyka trypanosomatozy afrykańskiej, zapewnia również oczyszczone pasożyty do badań immunologicznych, biologicznych, biochemicznych, farmaceutycznych i biologii molekularnej.Wszystkie badania zgodne z przewodnikiem dotyczącym opieki i wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych i uzyskano zgodę władz francuskich, a wszystkie zastosowane protokoły zostały zatwierdzone przez naszą lokalną komisję etyczną. Odważyć każdą substancję zgodnie z pisemnym protokołem. Dodać wodę destylowaną i dokładnie dostosować do pH 8 za pomocą diwodorofosforanu potasu, aby uzyskać następujące roztwory buforowe, stężony bufor fosforanowy sól fizjologiczna 2X.Dodaj wodę destylowaną i glukozę, aby uzyskać glukozę z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami. Na 100 mililitrów buforu elucyjnego dodać 100 jednostek na mililitr penicyliny, 100 mikrogramów na mililitr streptomycyny i pięć mikrogramów mililitra czerwieni fenolowej do buforowanej soli fizjologicznej glukozy buforowanej fosforanem. 100 gramów celulozy DEAE najpierw myje się trzema litrami wody destylowanej, a następnie pozostawia do osadzenia.Drobne cząstki są odrzucane. Przemywanie powtarza się, aż supernatant będzie klarowny. Dodaje się stężoną sól fizjologiczną buforowaną fosforanem 2X i miesza celulozę DEAE.pH dostosowuje się do ośmiu za pomocą jednego molowego fosforanu potasu. Celuloza jest następnie dwukrotnie przemywana wodą destylowaną i dwukrotnie buforowaną fosforanem soli fizjologicznej glukozy. Glukozę solankową buforowaną przez celulozę DEAE i fosforany miesza się w równych objętościach.Stop pokrojony na ćwiartki i przechowywany w temperaturze pokojowej lub czterech stopniach Celsjusza lub w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do długotrwałego przechowywania. Krew zakażona trypanosomem jest przechowywana w ciekłym azocie. Kwarta stopu o pojemności jednego mililitra rozmraża się w temperaturze pokojowej.Pasożyty są ostrożnie zbierane z krioprobówki za pomocą igły i jednomililitrowej strzykawki. Żywotność rozmrożonych pasożytów ocenia się na podstawie ruchliwości, którą uwidoczniono za pomocą obserwacji mikroskopem świetlnym przed zakażeniem. Pasożyty wstrzykuje się do jam otrzewnowych dwóch myszy po 500 mikrolitrów na mysz.Każdego dnia po zakażeniu parazytemię ocenia się, pobierając kroplę krwi z ogona za pomocą igły i sprawdzając pod mikroskopem. Gdy parazytemia jest na odpowiednim poziomie, pobiera się zakażoną krew. Strzykawka o pojemności 10 mililitrów jest podtrzymywana w zacisku lub uchwycie i dodaje się wstępnie przycięty kawałek bibuły filtracyjnej.Przygotowaną celulozę DEAE wlewa się do strzykawki do poziomu ośmiu lub dziewięciu mililitrów. Kolumnę przepłukuje się buforem elucyjnym. Dwa mililitry zakażonej krwi ostrożnie umieszcza się na wierzchu kolumny, a trypanosomy zbiera się w kolumnie, wymywa w 50-mililitrowej probówce wirówkowej.Bufor elucyjny jest regularnie dodawany zgodnie z pasażem trypanosomów. Przejście trypanosomów przez kolumnę sprawdza się, pobierając kroplę eluatu kolumnowego w regularnych odstępach czasu i obserwując trypanosomy za pomocą mikroskopii świetlnej. Gdy trypanosomy nie są już obserwowane w eluacie, stożkową probówkę odwirowuje się w temperaturze 1 800 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Supernatant jest odrzucany, a trypanosomy na palecie są liczone za pomocą hemocytometru. Pobrane trypanosomy są następnie rozcieńczane w pożywce wymaganej do planowanego badania. Ta metoda, najbardziej odpowiednia diagnostyka trypanosomatozy afrykańskiej, zapewnia oczyszczone pasożyty do badań immunologicznych, biologicznych, biochemicznych, farmaceutycznych i biologii molekularnej.Badania te zostały opracowane, ponieważ oczyszczone z celulozy DEAE pasożyty można łatwo uzyskać w dużych ilościach od naturalnie lub eksperymentalnie zakażonych gospodarzy, a w szczególności gryzoni. Żywotność trypanosomów w obecności środków farmaceutycznych ocenia się za pomocą obserwacji mikroskopowej. Żywotność pasożyta jest związana z ruchliwością i dlatego można ją sprawdzić wzrokowo pod mikroskopem świetlnym przy 40-krotnym lub większym powiększeniu.Żywotność pasożyta ocenia się, mierząc procent form ruchliwych. Rozcieńczenia badanych związków dodaje się do każdej studzienki na 96-dołkowej płytce do hodowli tkankowej, podczas gdy studzienki kontrolne są poddawane próbnej obróbce. Każde stężenie ocenia się w trzech egzemplarzach.Liczba żywotnych pasożytów w każdym rozcieńczeniu jest porównywana z liczbą pasożytów w studzienkach kontrolnych. Działanie pentamidyny, leku referencyjnego, stosowanego w terapii trypanosomatozy afrykańskiej u ludzi przedstawiono na tym rysunku. Kokultury makrofagów trypanosomów umożliwiają badanie interakcji pasożytów gospodarza na poziomie komórkowym.W kokulturach pasożytów makrofagów trypanosomy zewnątrzkomórkowe indukują produkcję arginazy makrofagów, która hydrolizuje argininę do ornityny. Ornityna jest prekursorem poliamin i trypanotionu, niezbędnych do przetrwania i wzrostu pasożytów. Ponadto niedobór argininy zmniejsza produkcję trypanobójczego tlenku azotu.Następnie, dodanie inhibitora arginazy, S-L-cysteiny do kokultur, radykalnie zmniejsza wzrost pasożytów wywołany przez makrofagi. Indukcja arginazy odbywa się za pośrednictwem czynników wydzielanych przez trypanosomy i/lub wydzielanych. Ten czynnik indukujący arginazę został zidentyfikowany jako kinezyna ortyny.Kinezyna wiąże się z receptorami wiążącymi mannozę lektyny typu C. Indukowana jest arginaza, która wytwarza ornitynę, która sprzyja rozwojowi pasożytów. Arginaza nie jest indukowana przez kinezynę w makrofagach hodowanych z 12,5 milimolową mannozą lub w makrofagach od myszy, u których usunięto receptory mannozy makrofagów.Dalsze przykłady biologii komórki i eksperymentów biochemicznych z wykorzystaniem trypanosomów oczyszczonych z celulozy DAEA przedstawiono w badaniach, w których zidentyfikowano nowe białka cytoszkieletu, takie jak BILBO1. BILBO1 jest niezbędny do biogenezy ważnych struktur cytoszkieletu i przeżycia pasożyta. W związku z tym BILBO1 stanowi ważny cel interwencji w patogennych trypanosomach.Na tym rysunku pokazano obraz przedstawiający znakowanie immunofluorescencyjne formy hodowli krwi, komórki trypanosoma brucei sondowane przeciwciałem anty-BILBO1. Ponadto opisano metabolizm glukozy i treoniny przy użyciu trypanosomów oczyszczonych z celulozy DEAE, a enzymy biorące udział w tych procesach zostały eksperymentalnie zweryfikowane. Schematyczne przedstawienie metabolizmu glukozy i treoniny w trypanosomach tworzonych we krwi pokazano na tym rysunku.Oczyszczanie afrykańskich trypanosomów z krwi przez wymianę anionów Kolumny celulozowe DEAE z ostatnimi ulepszeniami pozostają złotym standardem w wykrywaniu trypanosomów, nie tylko u naturalnych gospodarzy z niską liczbą pasożytów na obszarach endemicznych, ale także w przypadku zapotrzebowania na pasożyty w dużych ilościach do badań eksperymentalnych. Badania pozwoliły na zidentyfikowanie cząsteczek trypanosomów odgrywających istotną rolę w przetrwaniu i wzroście pasożytów. Zidentyfikowane cele mogą stanowić podstawę przyszłej szczepionki z potencjalnymi antygenami zarówno dla ludzi, jak i zwierząt w ramach podejścia "jedno zdrowie".

purification-extracellular-trypanosomes-including-african-from-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

MamA jest unikalnym białkiem powiązanym z magnetosomami, o którym wykazano, że bierze udział w ich aktywacji. W niniejszej pracy przedstawiamy protokół oczyszczania mutanta z delecją MamA (MamAΔ41) z M. magneticum AMB-1.

Oczyszczanie białka MamAΔ41 związanego z magnetosomami szczepu AMB-1 M. magneticum

W tym filmie demonstrujemy technikę chromatografii anionowo-wymiennej do oczyszczania ludzkiego białka wiążącego wapń S100A12 na podstawie ładunku powierzchniowego netto białka z hodowli Escherichia coli.

Oczyszczanie białek oparte na chromatografii anionowej: technika rozdzielania mająca na celu wyizolowanie białka będącego przedmiotem zainteresowania z dializowanego lizatu bakteryjnego na podstawie ładunku netto

Ten film demonstruje technikę chromatografii kationowymiennej do izolowania rekombinowanego białka z lizatu białka komórki owada.

Chromatografia kationowymienna: technika izolowania docelowego białka rekombinowanego z lizatu komórek owadów na podstawie ładunku powierzchniowego netto

Ten film demonstruje technikę chromatografii wykluczającej rozmiar (SEC) do oczyszczania bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z filtratu hodowlanego Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Technika ta wykorzystuje porowatą kolumnę wypełnioną żywicą w celu uzyskania oczyszczonych frakcji EV. Porowate cząsteczki selektywnie pozwalają mniejszym białkom wnikać do porów, co skutkuje wolniejszą elucją. Jednocześnie pojazdy elektryczne są wykluczone z wnikania do porów ze względu na ich większy...

Technika chromatografii wykluczającej wielkość do oczyszczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków

Pomiar funkcji przeciwciał jest kluczem do zrozumienia odporności na malarię Plasmodium falciparum. Metoda ta opisuje oczyszczanie żywotnych merozoitów i pomiar fagocytozy zależnej od opsonizacji za pomocą cytometrii przepływowej.

Wysokowydajne oczyszczanie merozoitów Plasmodium falciparum do stosowania w testach przeciwciał opsonizujących

Metoda Tandem Affinity Purification (TAP) była szeroko stosowana do izolowania natywnych kompleksów z ekstraktu komórkowego, głównie eukariotycznego, do proteomiki. W tym miejscu przedstawiamy protokół metody TAP zoptymalizowany pod kątem oczyszczania kompleksów natywnych do badań strukturalnych.

Oczyszczanie kompleksów natywnych do badań strukturalnych za pomocą metody tandemowego znacznika powinowactwa

Ten protokół opisuje oczyszczanie F 1-ATPazy z hodowli owadów Trypanosoma brucei. W wyniku zabiegu powstaje wysoce czysty, jednorodny i aktywny kompleks odpowiedni do badań strukturalnych i enzymatycznych.

Izolacja 1-ATPazy F z pasożytniczego protisty Trypanosoma brucei

Ten protokół izoluje pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) od wirionów z wysoką wydajnością i wydajnością, włączając wytrącanie EV, ultrawirowanie w gradiencie gęstości i wychwytywanie cząstek, aby umożliwić usprawnienie przepływu pracy i zmniejszenie wymagań dotyczących objętości początkowej, co skutkuje powtarzalnymi przygotowaniami do użycia we wszystkich badaniach nad EV.

Oczyszczanie wysokowydajnych preparatów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z wirusa

Ten protokół opisuje metodę oczyszczania dla rekombinowanego, bezznacznikowego białka wiążącego wapń S100A12 i jego indukowanych jonami oligomerów do testów stymulacji ludzkich monocytów.

Oczyszczanie S100A12 człowieka i jego indukowanych jonami oligomerów do stymulacji komórek odpornościowych

Protokół opisuje przygotowanie kolumn chromatografii powinowactwa błony komórkowej (CMAC) z unieruchomionymi fragmentami błony komórkowej zawierającymi funkcjonalne białka transbłonowego receptora B kinazy tropomiozyny. Wyjaśniono również zastosowanie kolumn CMAC w identyfikacji wyspecjalizowanych metabolitów roślinnych oddziałujących z tymi receptorami i obecnych w złożonych mieszaninach naturalnych.

Kolumny chromatograficzne powinowactwa błony komórkowej do identyfikacji wyspecjalizowanych metabolitów roślinnych oddziałujących z unieruchomionym receptorem kinazy tropomiozynowej B

Bakterie wydzielają nanometrowe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) przenoszące bioaktywne cząsteczki biologiczne. Badania nad EV koncentrują się na zrozumieniu ich biogenezy, roli w interakcjach i chorobach między drobnoustrojami a gospodarzem-mikroorganizmem, a także na ich potencjalnych zastosowaniach terapeutycznych. Przedstawiono proces pracy do skalowalnej izolacji pojazdów elektrycznych od różnych bakterii, aby ułatwić standaryzację badań nad pojazdami elektrycznymi.

Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii

Naucz się oczyszczania trypanosomów afrykańskich z krwi metodą wymieniaczy anionowych DEAE. Technika ta umożliwia uzyskanie czystych pasożytów do badań immunologicznych i molekularnych.

Oczyszczanie trypanosomów zewnątrzkomórkowych, w tym afrykańskich, z krwi za pomocą wymieniaczy anionowych (kolumny dietyloaminoetylocelulozowe) (Wideo) | JoVE Journal

Oczyszczanie trypanosomów zewnątrzkomórkowych, w tym afrykańskich, z krwi za pomocą wymieniaczy anionowych (kolumny dietyloaminoetylocelulozowe)

Przeglądaj więcej filmów