Oczyszczanie trypanosomów zewnątrzkomórkowych, w tym afrykańskich, z krwi za pomocą wymieniaczy anionowych (kolumny dietyloaminoetylocelulozowe)

Trypanosomy afrykańskie są odpowiedzialne za ludzką trypanosomatozę afrykańską, czyli śpiączkę i trypanosomatozę afrykańską u zwierząt. Trypanosomy powodujące śpiączkę to pasożyty protistyczne przenoszone przez muchy tse-tse, obecne w wielu ogniskach geograficznych w Afryce Subsaharyjskiej. Wykrycie pasożyta jest niezbędne do diagnozy, leczenia i obserwacji.

Serologia może dawać wyniki fałszywie dodatnie i niestety fałszywie ujemne. Aby ułatwić wykrywanie we krwi, trypanosomy muszą być skoncentrowane. Zastosowano różne techniki zagęszczania pasożytów.

Najbardziej czułą metodą jest oddzielenie pasożytów od krwi za pomocą kolumny wymieniacza anionowego, celulozy DEAE, a następnie odwirowanie i obserwacja mikroskopowa. W związku z tym metoda celulozowa DEAE jest najlepszą i pozostaje do chwili obecnej referencyjną metodą wizualizacji i izolacji pasożytów z krwi w diagnostyce trypanosomatozy afrykańskiej u ludzi, zwłaszcza w warunkach polowych. Ta metoda, najbardziej odpowiednia diagnostyka trypanosomatozy afrykańskiej, zapewnia również oczyszczone pasożyty do badań immunologicznych, biologicznych, biochemicznych, farmaceutycznych i biologii molekularnej.

Wszystkie badania zgodne z przewodnikiem dotyczącym opieki i wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych i uzyskano zgodę władz francuskich, a wszystkie zastosowane protokoły zostały zatwierdzone przez naszą lokalną komisję etyczną. Odważyć każdą substancję zgodnie z pisemnym protokołem. Dodać wodę destylowaną i dokładnie dostosować do pH 8 za pomocą diwodorofosforanu potasu, aby uzyskać następujące roztwory buforowe, stężony bufor fosforanowy sól fizjologiczna 2X.

Dodaj wodę destylowaną i glukozę, aby uzyskać glukozę z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami. Na 100 mililitrów buforu elucyjnego dodać 100 jednostek na mililitr penicyliny, 100 mikrogramów na mililitr streptomycyny i pięć mikrogramów mililitra czerwieni fenolowej do buforowanej soli fizjologicznej glukozy buforowanej fosforanem. 100 gramów celulozy DEAE najpierw myje się trzema litrami wody destylowanej, a następnie pozostawia do osadzenia.

Drobne cząstki są odrzucane. Przemywanie powtarza się, aż supernatant będzie klarowny. Dodaje się stężoną sól fizjologiczną buforowaną fosforanem 2X i miesza celulozę DEAE.

pH dostosowuje się do ośmiu za pomocą jednego molowego fosforanu potasu. Celuloza jest następnie dwukrotnie przemywana wodą destylowaną i dwukrotnie buforowaną fosforanem soli fizjologicznej glukozy. Glukozę solankową buforowaną przez celulozę DEAE i fosforany miesza się w równych objętościach.

Stop pokrojony na ćwiartki i przechowywany w temperaturze pokojowej lub czterech stopniach Celsjusza lub w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do długotrwałego przechowywania. Krew zakażona trypanosomem jest przechowywana w ciekłym azocie. Kwarta stopu o pojemności jednego mililitra rozmraża się w temperaturze pokojowej.

Pasożyty są ostrożnie zbierane z krioprobówki za pomocą igły i jednomililitrowej strzykawki. Żywotność rozmrożonych pasożytów ocenia się na podstawie ruchliwości, którą uwidoczniono za pomocą obserwacji mikroskopem świetlnym przed zakażeniem. Pasożyty wstrzykuje się do jam otrzewnowych dwóch myszy po 500 mikrolitrów na mysz.

Każdego dnia po zakażeniu parazytemię ocenia się, pobierając kroplę krwi z ogona za pomocą igły i sprawdzając pod mikroskopem. Gdy parazytemia jest na odpowiednim poziomie, pobiera się zakażoną krew. Strzykawka o pojemności 10 mililitrów jest podtrzymywana w zacisku lub uchwycie i dodaje się wstępnie przycięty kawałek bibuły filtracyjnej.

Przygotowaną celulozę DEAE wlewa się do strzykawki do poziomu ośmiu lub dziewięciu mililitrów. Kolumnę przepłukuje się buforem elucyjnym. Dwa mililitry zakażonej krwi ostrożnie umieszcza się na wierzchu kolumny, a trypanosomy zbiera się w kolumnie, wymywa w 50-mililitrowej probówce wirówkowej.

Bufor elucyjny jest regularnie dodawany zgodnie z pasażem trypanosomów. Przejście trypanosomów przez kolumnę sprawdza się, pobierając kroplę eluatu kolumnowego w regularnych odstępach czasu i obserwując trypanosomy za pomocą mikroskopii świetlnej. Gdy trypanosomy nie są już obserwowane w eluacie, stożkową probówkę odwirowuje się w temperaturze 1 800 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Supernatant jest odrzucany, a trypanosomy na palecie są liczone za pomocą hemocytometru. Pobrane trypanosomy są następnie rozcieńczane w pożywce wymaganej do planowanego badania. Ta metoda, najbardziej odpowiednia diagnostyka trypanosomatozy afrykańskiej, zapewnia oczyszczone pasożyty do badań immunologicznych, biologicznych, biochemicznych, farmaceutycznych i biologii molekularnej.

Badania te zostały opracowane, ponieważ oczyszczone z celulozy DEAE pasożyty można łatwo uzyskać w dużych ilościach od naturalnie lub eksperymentalnie zakażonych gospodarzy, a w szczególności gryzoni. Żywotność trypanosomów w obecności środków farmaceutycznych ocenia się za pomocą obserwacji mikroskopowej. Żywotność pasożyta jest związana z ruchliwością i dlatego można ją sprawdzić wzrokowo pod mikroskopem świetlnym przy 40-krotnym lub większym powiększeniu.

Żywotność pasożyta ocenia się, mierząc procent form ruchliwych. Rozcieńczenia badanych związków dodaje się do każdej studzienki na 96-dołkowej płytce do hodowli tkankowej, podczas gdy studzienki kontrolne są poddawane próbnej obróbce. Każde stężenie ocenia się w trzech egzemplarzach.

Liczba żywotnych pasożytów w każdym rozcieńczeniu jest porównywana z liczbą pasożytów w studzienkach kontrolnych. Działanie pentamidyny, leku referencyjnego, stosowanego w terapii trypanosomatozy afrykańskiej u ludzi przedstawiono na tym rysunku. Kokultury makrofagów trypanosomów umożliwiają badanie interakcji pasożytów gospodarza na poziomie komórkowym.

W kokulturach pasożytów makrofagów trypanosomy zewnątrzkomórkowe indukują produkcję arginazy makrofagów, która hydrolizuje argininę do ornityny. Ornityna jest prekursorem poliamin i trypanotionu, niezbędnych do przetrwania i wzrostu pasożytów. Ponadto niedobór argininy zmniejsza produkcję trypanobójczego tlenku azotu.

Następnie, dodanie inhibitora arginazy, S-L-cysteiny do kokultur, radykalnie zmniejsza wzrost pasożytów wywołany przez makrofagi. Indukcja arginazy odbywa się za pośrednictwem czynników wydzielanych przez trypanosomy i/lub wydzielanych. Ten czynnik indukujący arginazę został zidentyfikowany jako kinezyna ortyny.

Kinezyna wiąże się z receptorami wiążącymi mannozę lektyny typu C. Indukowana jest arginaza, która wytwarza ornitynę, która sprzyja rozwojowi pasożytów. Arginaza nie jest indukowana przez kinezynę w makrofagach hodowanych z 12,5 milimolową mannozą lub w makrofagach od myszy, u których usunięto receptory mannozy makrofagów.

Dalsze przykłady biologii komórki i eksperymentów biochemicznych z wykorzystaniem trypanosomów oczyszczonych z celulozy DAEA przedstawiono w badaniach, w których zidentyfikowano nowe białka cytoszkieletu, takie jak BILBO1. BILBO1 jest niezbędny do biogenezy ważnych struktur cytoszkieletu i przeżycia pasożyta. W związku z tym BILBO1 stanowi ważny cel interwencji w patogennych trypanosomach.

Na tym rysunku pokazano obraz przedstawiający znakowanie immunofluorescencyjne formy hodowli krwi, komórki trypanosoma brucei sondowane przeciwciałem anty-BILBO1. Ponadto opisano metabolizm glukozy i treoniny przy użyciu trypanosomów oczyszczonych z celulozy DEAE, a enzymy biorące udział w tych procesach zostały eksperymentalnie zweryfikowane. Schematyczne przedstawienie metabolizmu glukozy i treoniny w trypanosomach tworzonych we krwi pokazano na tym rysunku.

Oczyszczanie afrykańskich trypanosomów z krwi przez wymianę anionów Kolumny celulozowe DEAE z ostatnimi ulepszeniami pozostają złotym standardem w wykrywaniu trypanosomów, nie tylko u naturalnych gospodarzy z niską liczbą pasożytów na obszarach endemicznych, ale także w przypadku zapotrzebowania na pasożyty w dużych ilościach do badań eksperymentalnych. Badania pozwoliły na zidentyfikowanie cząsteczek trypanosomów odgrywających istotną rolę w przetrwaniu i wzroście pasożytów. Zidentyfikowane cele mogą stanowić podstawę przyszłej szczepionki z potencjalnymi antygenami zarówno dla ludzi, jak i zwierząt w ramach podejścia "jedno zdrowie".