Monitorowanie aktywności szlaku sygnałowego hipopotama za pomocą biosensora LATS (Large Tumor Suppressor) opartego na lucyferazie

Moje laboratorium badało rolę szlaku hipopotama w raku piersi i płuc, a ostatnio opracowaliśmy nowy bioczujnik do monitorowania aktywności sygnalizacyjnej hipopotama. Metoda ta może być wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące komórkowych sieci sygnalizacyjnych, takich jak sposób, w jaki szlak Hippo reaguje na czynniki i jak oddziałuje z innymi szlakami sygnałowymi. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami jest jej duża czułość, a także duża liczba próbek może być przetwarzana szybko i jednocześnie.

Technika ta ma różnorodne zastosowania w badaniach podstawowych i translacyjnych w celu zbadania regulatorów szlaku sygnałowego hipopotama zarówno in vitro, jak i in vivo. Na początek mini-przygotuj plazmidy LATS-BS świeże z płynnej kultury bakterii DH5-Alpha. Na godzinę przed transfekcją odessać pożywkę z płytki i dodać 500 mikrolitrów pożywki wzrostowej do każdej studzienki.

Ważną kwestią jest to, że biosensor LATS musi być przygotowany na świeżo, aby uzyskać maksymalną ekspresję i aktywność. Zaleca się również, aby zawsze używać regulatora poprzedzającego szlak hipopotama, takiego jak MSD, jako kontroli pozytywnej podczas wykonywania testu lucyferazy. Następnie włóż komórki z powrotem do inkubatora.

Następnie przygotuj roztwór A, roztwór DNA i roztwór B, rozcieńczony odczynnik do transfekcji na bazie polimeru, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie natychmiast dodaj roztwór B do roztworu A i delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby wymieszać. Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby umożliwić utworzenie się kompleksów transfekcji.

Następnie dodaj kroplami całkowitą objętość kompleksów transfekcyjnych do każdego dołka płytki, delikatnie obracając. Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia należy usunąć pożywkę zawierającą kompleks transfekcji i zastąpić ją świeżą, kompletną pożywką.

Następnie hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza jeszcze przez jeden dzień. Rozcieńczyć odpowiednią ilość 5x Pasywny bufor do lizy wodą destylowaną. Następnie całkowicie odessać pożywkę z płytki.

Dodaj jeden mililitr PBS do każdej studzienki i delikatnie zakręć płytką, aby usunąć oderwane komórki i resztki pożywki wzrostowej. Następnie całkowicie odessać PBS. Następnie dodaj 250 mikrolitrów 1xPLB do każdej studzienki.

Umieść płytkę hodowlaną na platformie kołyszącej na 15 minut, aby zapewnić równomierne pokrycie monowarstwy komórek PLB. Następnie przenieś lizat do 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki. Wyjmij LAR-2 z magazynu w temperaturze 80 stopni Celsjusza i wyrównaj go do temperatury pokojowej.

Następnie należy przygotować odczynnik do wykrywania Renilla na odpowiednią ilość testów. Dodaj odczynnik do wykrywania Renilla do 50x substratu i jego buforu. Następnie dozuj 10 mikrolitrów każdego lizatu komórkowego do 1,5 mililitrowych probówek.

Następnie zaprogramuj luminometr tak, aby wykonywał dwusekundowe opóźnienie przed pomiarem, po którym następuje 10-sekundowy okres pomiaru. Ostrożnie przenieś 20 mikrolitrów odczynnika LAR-2 do jednej probówki i szybko pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać. Następnie natychmiast umieść rurkę w luminometrze i rozpocznij odczyt.

Po odczycie wyjmij probówkę z próbką z luminometru, dodaj 20 mikrolitrów odczynnika Renilla i pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać. Następnie umieść próbkę w luminometrze i rozpocznij następny odczyt. Po pierwsze, posiew, odłącz, policz i umieść na płytce komórki AD HEK293 zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Następnie, na godzinę przed transfekcją, odessać pożywkę z płytki i zastąpić ją pięcioma mililitrami świeżej, kompletnej pożywki wzrostowej. Na koniec dodać rozcieńczony roztwór B do roztworu A i pipetować w górę i w dół, aby wymieszać. Następnie inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut przed dodaniem całkowitej objętości kompleksów transfekcyjnych do płytki, delikatnie mieszając.

Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia trypsynizuj i policz komórki. Umieść 10 000 do 20 000 komórek w każdym dołku 96-dołkowej płytki w całkowitej objętości 100 mikrolitrów pożywki na studzienkę.

Następnie inkubuj komórki jeszcze przez jeden dzień. Na jedną do czterech godzin przed wykonaniem testu lucyferazy dodaj środki potencjalnie regulujące szlak hipopotama w końcowym stężeniu 10 mikromolów na studzienkę. Następnie całkowicie odessać pożywkę z komórek i umyć komórki w każdym dołku 100 mikrolitrami PBS.

Następnie dodaj 20 mikrolitrów PLB do każdej studzienki. Umieść płytkę hodowlaną na bujanej platformie na 15 minut. Następnie przenieś 20 mikrolitrów odczynnika LAR-2 do każdego dołka płytki i pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać.

Natychmiast po tym umieść płytkę w luminometrze do odczytu płytowego i rozpocznij odczyt. W pierwszej części tego protokołu LATS-BS został poddany kotransfekcji z różnymi genami w celu oceny ich wpływu na aktywność kinazy LATS. W drugim protokole LATS-BS został transfekowany do HEK293-Ad, a komórki przekazano do płytek 96-dołkowych.

40 godzin po transfekcji komórki poddano działaniu różnych znanych małocząsteczkowych regulatorów sygnalizacji Hippo, a następnie testowi lucyferazy. Interpretując wyniki tych testów, należy zauważyć, że białka i terapie lekowe mogą aktywować szlaki sprzężenia zwrotnego, które wpływają na aktywność bioczujników. Konieczne będą dalsze eksperymenty, aby potwierdzić związek między kandydatem a szlakiem sygnałowym hipopotama.

Zgodnie z tą procedurą, inne metody, takie jak ilościowy Real-Time PCR lub Western Blot, mogą być wykorzystane do udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące aktywności kinazy LATS. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią nowotworów do zbadania dynamiki i aktywności kinazy LATS i szlaku sygnałowego Hippo w wielu procesach biologicznych i biochemicznych. Nie zapominaj, że leki do badań przesiewowych mogą być bardzo niebezpieczne i zawsze należy zachować odpowiednie środki ostrożności podczas wykonywania tej procedury.