Wizualny przewodnik do badania obrony behawioralnej przed atakami patogenów u mrówek tnących liście

Zobrazowany protokół stanowi punkt odniesienia dla szerszych badań nad mechanizmami obronnymi i mrówkami hodującymi grzyby. Główną zaletą tego podejścia jest to, że pomoże ono badaczom rozpoznać kluczowe zachowania obronne, aby zapewnić wspólne zrozumienie dla przyszłych prac. Odniesienie do badań nad mrówkami hodującymi grzyby może być szczególnie przydatne dla młodych badaczy, którzy nie są zaznajomieni z tymi zachowaniami.

Wiele z tych zachowań jest rzadkich, więc doświadczeni badacze mogli nigdy ich nie zaobserwować. Ten przewodnik ułatwi porównania między badaniami i gatunkami mrówek, ilustrując kluczowe zachowania obronne wraz ze spójnymi definicjami. Co więcej, zrozumienie zachowań w kontrolowanych warunkach pomoże w badaniach w naturalnych siedliskach, w których warunki są trudne do kontrolowania.

Na początek wyizoluj szczepy Escovopsis z kolonii laboratoryjnych Acromyrmex echinatior, umieszczając fragmenty ogrodu grzybów, z usuniętymi mrówkami, na szalce Petriego z wilgotną watą na kilka dni, aż Escovopsis wykiełkuje i zarodnikuje. Przenieś zarodniki na płytki agarowe z dekstrozą ziemniaczaną i inkubuj w temperaturze około 23 stopni Celsjusza przez dwa tygodnie. Za pomocą sterylnej igły usuń dojrzałe zarodniki z płytek.

Następnie zaszczepij zarodniki na nowych płytkach w sterylnych warunkach i inkubuj je w temperaturze około 23 stopni Celsjusza przez dwa tygodnie. Kiedy strzępki wyrosną na całą płytkę i staną się dojrzałymi brązowymi zarodnikami, zaszczepij zarodniki na nowych płytkach w sterylnych warunkach. Używając trzech oryginalnych kolonii A.Echinatior, uzyskaj w sumie 36 podkolonii z 12 podkoloniami z każdej rodziny rodzicielskiej.

Cztery godziny przed wprowadzeniem mrówek dodaj do pudełka kawałek ogrodu grzybowego wielkości łyżeczki oryginalnej kolonii, kilka liści jeżyny i kawałek nasączonej wodą waty. W przypadku podkolonii, które mają zostać zainfekowane, wypełnij pętlę inokulacyjną zarodnikami Escovopsis. Następnie zaszczepij zarodniki, delikatnie stukając w niewielką część ogrodu grzybów od 10 do 20 razy.

W przypadku podkolonii kontrolnych naśladuj aplikację zarodników Escovopsis, stukając w ogród grzybów sterylną pętlą inokulacyjną od 10 do 20 razy. W przypadku 72-godzinnych obserwacji po zakażeniu należy pozostawić połowę podkolonii w spokoju przez 72 godziny po wprowadzeniu Escovopsis. W przypadku obserwacji po infekcji w godzinie zero, natychmiast dodaj dwa czerwie, cztery małe robotnice i cztery główne robotnice z kolonii rodzicielskiej do każdego pudełka 30 minut przed rejestracją.

Następnie dodaj tę samą mieszaninę pracowników do 72-godzinnych obserwacji po infekcji 30 minut przed nagraniem. Nagrywaj wideo przez cztery godziny dla każdej podkolonii. Po nagraniu wszystkich 36 podkolonii przejrzyj materiał filmowy i oceń interesujące zachowania dla każdego osobnika w każdej podkolonii.

Poniższe klipy zawierają opis kluczowych odrębnych zachowań, które należy zaobserwować podczas obserwacji. Przeglądając film, zwróć uwagę, czy mrówka zatrzymuje ruch nóg, aby zainicjować samodzielną pielęgnację. Sprawdź, czy anteny przechodzą przez czyściki do anten na przednich nogach.

Następnie mrówka powinna oczyścić nogi i czyściki antenowe za pomocą części gębowych. Zauważ również, czy mrówka zatrzymuje jakiekolwiek ruchy nóg w ustalonym punkcie w ogrodzie grzybów. Obserwuj, czy czułki są nieruchome i równoległe, skierowane w stronę grzyba i prawie stykają się ze sobą blisko czubka żuchwy.

Następnie powinna pojawić się glossa, aby polizać grzyba. Jedna lub więcej mrówek może również pielęgnować się nawzajem. Podczas tego zachowania mrówki zatrzymują wszelki ruch i stoją blisko siebie, utrzymując kontakt fizyczny.

Następnie mrówka pielęgnująca powinna skierować czułki w stronę mrówki odbiorczej i lekko dotknąć odbiornika. Zwróć uwagę, że górna i dolna część ust osobników pielęgnujących jest otwarta, a glossa wyłania się, aby polizać mrówkę odbiorczą. Obserwuj, kiedy mrówka przestaje się ruszać, aby zainicjować pielęgnację gruczołów śródopłucnowych.

Mrówka powinna przechylić się na bok i sięgnąć jedną z przednich nóg do tyłu, aby pocierać otwór gruczołu, jednocześnie liżąc drugą przednią nogę glossą. Następnie mrówka powtórzy zachowanie z przeciwnymi nogami. Kiedy mrówka zatrzymuje ruchy nóg w ustalonym punkcie ogrodu grzybów, zwróć uwagę, że czułki są nieruchome i równoległe, skierowane w stronę stałego punktu ogrodu grzybów.

Następnie mrówka złapie widoczne zarodniki Escovopsis i wyniesie je z gniazda. Mrówka może również zatrzymać ruchy nóg w ustalonym punkcie grzyba, skierować luźno czułki w stronę kawałka grzyba i stuknąć w kawałek grzyba czułkami. Następnie mrówka oderwie kawałek grzyba od reszty uprawy grzyba.

Innym potencjalnym zachowaniem można zaobserwować, gdy mrówka zatrzymuje ruchy nóg w ustalonym punkcie ogrodu grzybowego. Mrówka zgina gaster i kieruje się do siebie, aby nałożyć kroplę płynu kałowego na swoje części gębowe. Pojedynczo mrówka będzie przeciągać przednie nogi przez żuchwy, a antena przez czyściki do anteny.

Głównym celem tego badania było stworzenie katalogu krótkich klipów ilustrujących zachowania obronne u mrówek tnących liście. Zachowania opisane w protokole zostały ocenione w eksperymentalnym scenariuszu infekcji. W koloniach kontrolnych drobni robotnicy zajmowali się pielęgnacją upraw ogrodowych bardziej niż główni robotnicy.

W zakażonych koloniach stwierdzono nieistotną tendencję do wzmożonej pielęgnacji grzybów w stosunku do kolonii kontrolnych. Nieistotny wzrost pielęgnacji kału był związany z infekcją, ale nie wykryto różnicy między mniejszymi i większymi pracownikami. Zarówno odchwaszczanie zarodników, jak i pielenie grzybów były rzadkie, nie zaobserwowano znaczącej różnicy między zakażonymi koloniami a grupą kontrolną.

Tendencja do odchwaszczania grzybów nasila się z czasem od momentu zaobserwowania infekcji. Niewiele zakażonych kolonii z wczesnymi stadiami infekcji miało widoczne zarodniki pozostałe po czterogodzinnym okresie obserwacji. Co ciekawe, w późniejszych stadiach infekcji mrówki nie były w stanie całkowicie usunąć zarodników z żadnej z kolonii.

Wyniki tego eksperymentu są zatem ilustracyjnym przykładem tego, w jaki sposób kompilacja klipów może być wykorzystana do badań behawioralnych, do obliczenia średnich częstotliwości dla mniejszych i głównych zachowań pracowników. Udokumentowaliśmy zachowania, które przyczyniają się do obrony u mrówek hodujących grzyby i systematycznie zidentyfikowaliśmy, opisaliśmy i uchwyciliśmy te zachowania na filmie. Nasze wyniki wzmacniają badania w tej dziedzinie, sugerując, dlaczego patogenowi trudno jest zainfekować kolonie w obliczu obszernego zestawu zachowań i związanych z nimi związków przeciwdrobnoustrojowych.

Zapewniamy nowe narzędzie do przyszłych prac w tej dziedzinie i mamy nadzieję, że katalog zachowań okaże się cenny w zapewnianiu konsensusu i usprawnionych definicji, obserwacji i interpretacji zachowań.