Name: Podostre mikrokrwotoki mózgowe wywołane wstrzyknięciem lipopolisacharydu u szczurów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Poznaj metodę wywoływania mikrokrwotoków mózgowych u szczurów Sprague-Dawley poprzez wstrzyknięcie LPS. Technika ta pozwala badać patogenezę uszkodzeń naczyń mózgowych i mechanizmy zapalne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy nauczycielowi Jian Feng Lei i kolegom ze Stołecznego Uniwersytetu Medycznego za wskazówki podczas rezonansu magnetycznego. Dziękujemy również Jing Zeng z Oddziału Neurologii Drugiego Szpitala Ludowego w Yichang za udzielenie wsparcia technicznego.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (ACUC) Szpitala Ogólnego Armii ChALW.
1. Materiały
<ol>
	<li>Przygotowanie iniekcji LPS
	<ol>
		<li>Dodać 25 ml wody destylowanej do 25 mg proszku LPS pochodzącego z S. typhimurium do końcowego stężenia 1 mg/ml. Wstrzyknięcie należy przechowywać w sterylnej probówce o temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: LPS jest toksyczny.</li>
		<li>Przygotować 2% roztwór EB w normalnym 0,9% roztworze soli fizjologicznej, aby utrzymać wstrzyknięcie EB w stężeniu roboczym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Zwierzęta
<ol>
	<li>Podawać LPS samcom szczurów Sprague-Dawley (SD) w wieku 10 tygodni (średnia waga: 280 ± 20 g) we wstrzyknięciu dootrzewnowym. 
	UWAGA: Jeśli szczury są kupowane od innej organizacji, faza adaptacyjna nie powinna być krótsza niż 7 dni.</li>
</ol>
3. Zastrzyki LPS
<ol>
	<li>Każdemu szczurowi należy wstrzyknąć LPS dootrzewnowo w dawce 1 mg/kg mc. i umieścić szczury z powrotem w klatce domowej. 
	UWAGA: Znieczulenie nie jest konieczne.</li>
	<li>Sześć godzin później wstrzyknij szczurom tę samą dawkę zastrzyku LPS.</li>
	<li>Szesnaście godzin później wstrzyknij szczurom tę samą dawkę LPS. 
	UWAGA: Wstrzykiwanie szczurom SD LPS w dawce 1 mg/kg mc. może spowodować 5% śmiertelność. Śmiertelność może jeszcze bardziej wzrosnąć u młodszych lub starszych szczurów lub ciężarnych samic szczurów.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu LPS szczury należy umieścić z powrotem w klatkach i zapewnić im dostęp do jedzenia i picia ad libitum. 
	UWAGA: Szczury będą wykazywać wyraźną ogólnoustrojową reakcję zapalną, dlatego ważne jest, aby klatki pozostały czyste przez cały czas trwania eksperymentu. Szczury powinny często (2x dziennie) monitorować wagę, ogólny wygląd i nastawienie po pierwszym wstrzyknięciu LPS. Jeśli szczury zaczną wykazywać zgarbioną postawę, niechęć do poruszania się, znaczną utratę masy ciała (>20%), porfiryna plami, że zostaną humanitarnie poddane eutanazji przed 7-dniowym punktem końcowym badania EB.</li>
</ol>
4. Pobieranie próbek
<ol>
	<li>Iniekcja EB
	<ol>
		<li>Siedem dni po pierwszym wstrzyknięciu należy znieczulić szczura dootrzewnowo zgodnie z zatwierdzonym protokołem IACUC. </li>
		<li>Odczekaj 1-2 minuty, aż szczury nie będą wykazywać odruchów rogówkowych. Wykonaj nakłucie serca o głębokości 5–8 mm u każdego szczura; Punkt nakłucia powinien znajdować się 5 mm do lewego brzegu mostka w 3. i 4. przestrzeni międzyżebrowej.</li>
		<li>Poczekaj, aż zaobserwuje się regenerację krwi, a następnie wstrzyknąć EB w dawce 0,2 ml/100 g masy ciała do lewej komory serca. 
		UWAGA: Nakłucie serca i wstrzyknięcie EB należy wykonać ostrożnie. EB może być wstrzykiwany do klatki piersiowej lub osierdzia zamiast do lewej komory serca.
		<ol>
			<li>Odessać z powrotem pustą rurkę i zastąpić tę objętość rurką EB przed wstrzyknięciem, aby zmniejszyć wskaźnik niepowodzeń (np. błędne wstrzyknięcie do klatki piersiowej</li>).
		</ol>
		</li>
		<li>Trzymaj szczura w pozycji leżącej na plecach przez 10 min. 
		UWAGA: Jeśli próbka nie jest używana do wykrywania wycieku EB w obrazowaniu immunofluorescencyjnym, ten krok można pominąć.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwacja ogólna
	<ol>
		<li>Wykonaj perfuzje serca za pomocą lodowatego 1 M buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS), aby oczyścić naczynia krwionośne mózgu i mózg.
		<ol>
			<li>Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie brzucha na całej długości przepony.</li>
			<li>Przetnij żebra po lewej stronie linii środkowej klatki piersiowej</li>.
			<li>Otwórz klatkę piersiową. Użyj zacisków, aby odsłonić serce i ułatwić drenaż krwi i innych płynów.</li>
			<li>Trzymając stabilnie serce kleszczami (serce powinno nadal bić), bezpośrednio wbij igłę w występ lewej komory, aby przedłużyć go do około 5 mm. Zabezpiecz igłę w tej pozycji, zaciskając w pobliżu miejsca wprowadzenia. 
			UWAGA: Nie należy nadmiernie wysuwać igły, ponieważ może ona przebić ścianę wewnętrzną i utrudnić krążenie roztworów.</li>
			<li>Zwolnij zawór, aby umożliwić przepływ lodowatego roztworu PBS (200–300 ml) z powolną i stałą szybkością około 20 ml/min za pomocą pompy perfuzyjnej. Jeśli zwierzęta wymagają fiksacji zamiast ogólnej obserwacji, należy użyć tej samej dawki lodowatego 0,9% roztworu soli fizjologicznej.</li>
			<li>Za pomocą ostrych nożyczek wykonaj nacięcie w przedsionku, upewniając się, że roztwór stale płynie. Jeśli płyn nie przepływa swobodnie lub wypływa z nozdrzy lub pyska zwierzęcia, zmień położenie igły.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Badanie przesiewowe CMH według obserwacji brutto. 
		UWAGA: Jeżeli próbka nie jest używana do obliczania liczby CMH na podstawie obserwacji brutto, etap ten można pominąć.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrwalenie
	<ol>
		<li>Wykonaj perfuzje serca przy użyciu lodowatego 0,9% roztworu soli fizjologicznej (200-300 ml), aby oczyścić naczynia krwionośne mózgu i mózgu.</li>
		<li>Wykonaj perfuzje serca przy użyciu lodowatego 4% paraformaldehydu do utrwalenia.</li>
		<li>Odetnij głowę szczurowi, odizoluj mózg i zanurz mózg w 20% roztworze sacharozy na co najmniej 6 godzin.</li>
		<li>Zmień roztwór na 30% sacharozy i utrwalaj na kolejne 6 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj skrawki tkanek mózgowych o grubości 10 mm za pomocą kriostatu.</li>
</ol>
5. Barwienie HE
UWAGA: Ta procedura jest wykonywana przy użyciu zestawu do barwienia HE.
<ol>
	<li>Umyj szkiełka w wodzie destylowanej.</li>
	<li>Barwieć w roztworze hematoksyliny przez 8 min. Myć pod bieżącą wodą z kranu przez 5 min.</li>
	<li>Różnicować w 1% kwaśnym alkoholu przez 30 s. Myć pod bieżącą wodą z kranu przez 1 min.</li>
	<li>Plamić w 0,2% wodzie amoniakalnej (niebieszczenie) lub nasyconym roztworze węglanu litu przez 30 s do 1 min. Myć pod bieżącą wodą z kranu przez 5 min.</li>
	<li>Spłucz w 95% alkoholu (10 zanurzeń).</li>
	<li>Barwienie przeciwstawne roztworem eozyny przez 30 s do 1 minuty.</li>
	<li>Odwodnić przez 95% alkohol, dwie zmiany alkoholu bezwodnego, przez 5 minut każda.</li>
	<li>Klarować w ksylenie przez 30 s.</li>
	<li>Zamontuj za pomocą metody Liu9.</li>
	<li>Analiza za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego jasnego pola. 
	UWAGA: Czerwone krwinki uwalniane z naczyń krwionośnych, które są składnikami CMH, pojawiają się na czerwono-pomarańczowo pod barwieniem HE.</li>
</ol>
6. Perl Pruski niebieski kolor
UWAGA: Ta procedura jest wykonywana przy użyciu zestawu do barwienia Perls.
<ol>
	<li>Umyj szkiełka wodą destylowaną.</li>
	<li>Barwienie w roztworze reakcyjnym równą mieszaniną żelazocyjanku i kwasu solnego przez 10 min.</li>
	<li>Odwodnić, wyczyścić, zamontować i przeanalizować szkiełka zgodnie z opisem w krokach 5.7–5.10.</li>
</ol>
7. Podwójne barwienie EB
UWAGA: Ta procedura jest zgodna z krokiem 4.1.3.
<ol>
	<li>Umyj szkiełka PBS trzy razy po 5 minut każda.</li>
	<li>Inkubować szkiełka z roztworem 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj szkiełka roztworem PBS trzy razy po 5 minut każde, a następnie zamontuj szkiełka roztworem PBS-glicerolu.</li>
	<li>Analizuj obrazy pod mikroskopem fluorescencyjnym. Osadzanie się EB jest wskazywane przez czerwoną fluorescencję; Jądra są oznaczone niebieską fluorescencją.</li>
</ol>
8. Rezonans magnetyczny (MRI-SWI)
<ol>
	<li>Wykonaj rezonans magnetyczny na magnesie 7-T wyposażonym w aktywnie ekranowany system gradientowy (średnica wewnętrzna 16 cm).</li>
	<li>Siedem dni po zabiegu znieczulij szczury poprzez inhalację 1,5–2,0% izofluranu za pomocą systemu znieczulenia izofluranem.</li>
	<li>Nałóż maść weterynaryjną na oczy szczura, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
	<li>Utrzymuj szczury w pozycji leżącej i wykonaj skan MRI-SWI.</li>
	<li>Uzyskaj skany ważone SWI przy użyciu sekwencji echa o szybkim wirowaniu, używając następujących parametrów: czas echa (TE) 8 ms, czas powtarzania (TR) 40 ms, kąt odwrócenia = 12°, pole widzenia (FOV) 35 mm × 35 mm, matryca akwizycji 384 × 384, aby uzyskać warstwy o grubości 1 mm.</li>
	<li>Zidentyfikuj CMH w MRI-SWI według Greenberga i wsp.11, który zawierał następujące kryteria: (1) średnica ≤10 mm oraz (2) okrągłe, izolowane i o niskiej intensywności sygnału.</li>
	<li>Pod koniec eksperymentu należy poddać szczury eutanazji metodą przedawkowania dwutlenku węgla (przy przepływie 6 l/min lub 30% objętości pojemnika).</li>
</ol>

<ol><li>Sumbria, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+inflammation-induced+cerebral+microbleeds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">A murine model of inflammation-induced cerebral microbleeds.</a> J Neuroinflammation. 13 (1), 218(2016).</li>
<li>Vernooij, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+risk+factors+of+cerebral+microbleeds+the+Rotterdam+Scan+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Prevalence and risk factors of cerebral microbleeds the Rotterdam Scan Study.</a> Neurology. 70 (14), 1208-1214 (2009).</li>
<li>Pettersen, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbleed+topography%2C+leukoaraiosis%2C+and+cognition+in+probable+Alzheimer+disease+from+the+Sunnybrook+dementia+study%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Microbleed topography, leukoaraiosis, and cognition in probable Alzheimer disease from the Sunnybrook dementia study.</a> Archives of Neurology. 65 (6), 790-795 (2008).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+microbleeds+and+neuropsychiatric+symptoms+in+an+elderly+Asian+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurology%2C+Neurosurgery%2C+and+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Cerebral microbleeds and neuropsychiatric symptoms in an elderly Asian cohort.</a> Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 88 (1), 7-11 (2017).</li>
<li>Mcauley, G., Schrag, M., Barnes, S., Obenaus, A., Dickson, A., Kirsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+iron+quantification+in+collagenase-induced+microbleeds+in+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+Resonance+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo iron quantification in collagenase-induced microbleeds in rat brain.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 67 (3), 711-717 (2012).</li>
<li>Reuter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cerebral+microbleeds+in+the+APP23-transgenic+mouse+model+of+cerebral+amyloid+angiopathy-a+9.4+tesla+MRI+study%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development of cerebral microbleeds in the APP23-transgenic mouse model of cerebral amyloid angiopathy-a 9.4 tesla MRI study.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 8 (8), 170(2016).</li>
<li>Scott, L. L., Downing, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+neonatal+exposure+to+BMAA+in+a+rat+model+produces+neuropathology+consistent+with+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">A single neonatal exposure to BMAA in a rat model produces neuropathology consistent with neurodegenerative diseases.</a> Toxins. 10 (1), E22(2018).</li>
<li>Toth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+exacerbates+hypertension-induced+cerebral+microhemorrhages+in+mice%3A+role+of+resveratrol+treatment+in+vasoprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Aging exacerbates hypertension-induced cerebral microhemorrhages in mice: role of resveratrol treatment in vasoprotection.</a> Aging Cell. 14 (3), 400-408 (2015).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+H%26E+and+Prussian+blue+staining+in+a+mouse+model+of+cerebral+microbleeds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of H&E and Prussian blue staining in a mouse model of cerebral microbleeds.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (11), 767-773 (2014).</li>
<li>Zeng, J., Zhào, H., Liu, Z., Zhang, W., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+induces+subacute+cerebral+microhemorrhages+with+involvement+of+Nitric+Oxide+Synthase+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Stroke+and+Cerebrovascular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide induces subacute cerebral microhemorrhages with involvement of Nitric Oxide Synthase in rats.</a> Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 27 (7), 1905-1913 (2018).</li>
<li>Greenberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+microbleeds%3A+A+guide+to+detection+and+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cerebral microbleeds: A guide to detection and interpretation.</a> Lancet Neurology. 8 (2), 165-174 (2009).</li>
<li>Hoffmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Field+MRI+reveals+a+drastic+increase+of+hypoxia-induced+microhemorrhages+upon+tissue+reoxygenation+in+the+mouse+brain+with+strong+predominance+in+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">High-Field MRI reveals a drastic increase of hypoxia-induced microhemorrhages upon tissue reoxygenation in the mouse brain with strong predominance in the olfactory bulb.</a> Plos One. 11 (2), e0148441(2016).</li>
<li>Sumbria, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+phosphodiesterase+3A+modulation+on+murine+cerebral+microhemorrhages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Effects of phosphodiesterase 3A modulation on murine cerebral microhemorrhages.</a> Journal of Neuroinflammation. 14 (1), 114(2017).</li>
<li>Sumbria, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+exacerbates+development+of+cerebral+microbleeds+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Aging exacerbates development of cerebral microbleeds in a mouse model.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 69(2018).</li>
<li>Mello, B. S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+influences+in+behavior+and+brain+inflammatory+and+oxidative+alterations+in+mice+submitted+to+lipopolysaccharide-induced+inflammatory+model+of+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Sex influences in behavior and brain inflammatory and oxidative alterations in mice submitted to lipopolysaccharide-induced inflammatory model of depression.</a> Journal of Neuroimmunol. 320, 133-142 (2018).</li>
<li>Souza, D. F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+astroglial+markers+in+a+maternal+immune+activation+model+of+schizophrenia+in+Wistar+rats+are+dependent+on+sex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Changes in astroglial markers in a maternal immune activation model of schizophrenia in Wistar rats are dependent on sex.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (489), (2015).</li>
<li>Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lipopolysaccharide+Parkinson%27s+disease+animal+model%3A+mechanistic+studies+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Fundamental+%26+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The Lipopolysaccharide Parkinson's disease animal model: mechanistic studies and drug discovery.</a> Fundamental & Clinical Pharmacology. 22 (5), 453-464 (2008).</li>
<li>El-Sayed, N. S., Bayan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+role+of+resveratrol+targeting+estradiol+and+neprilysin+pathways+in+lipopolysaccharide+model+of+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Possible role of resveratrol targeting estradiol and neprilysin pathways in lipopolysaccharide model of Alzheimer disease.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 822 (822), 107-118 (2015).</li>
<li>Combrinck, M. I., Perry, V. H., Cunningham, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+infection+evokes+exaggerated+sickness+behaviour+in+pre-clinical+murine+prion+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Peripheral infection evokes exaggerated sickness behaviour in pre-clinical murine prion disease.</a> Neuroscience. 112 (1), 7-11 (2002).</li>
<li>Pantoni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+small+vessel+disease%3A+from+pathogenesis+and+clinical+characteristics+to+therapeutic+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cerebral small vessel disease: from pathogenesis and clinical characteristics to therapeutic challenges.</a> Lancet Neurology. 9 (7), 689-701 (2010).</li>
<li>Rosand, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+clustering+of+hemorrhages+in+probable+cerebral+amyloid+angiopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Spatial clustering of hemorrhages in probable cerebral amyloid angiopathy.</a> Annals of Neurology. 58 (3), 459-462 (2005).</li>
<li>Robinson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructural+and+microglial+changes+after+repetitive+mild+traumatic+brain+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice.</a> Journal of Neuroscience Research. 95 (4), 1025-1035 (2017).</li>
<li>Kraft, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypercholesterolemia+induced+cerebral+small+vessel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Hypercholesterolemia induced cerebral small vessel disease.</a> Plos One. 12 (8), e0182822(2017).</li>
<li>Schreiber, S., Bueche, C. Z., Garz, C., Baun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+brain+barrier+breakdown+as+the+starting+point+of+cerebral+small+vessel+disease%3F+-+New+insights+from+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Translational+Stroke+Medicine%22%5BJournal%5D)">Blood brain barrier breakdown as the starting point of cerebral small vessel disease? - New insights from a rat model.</a> Experimental & Translational Stroke Medicine. 5 (1), 4(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W ciągu ostatnich kilku lat nasiliły się badania naukowe nad CMH. Jednak mechanizm CMH pozostaje niejasny, co skłoniło naukowców do stworzenia modeli zwierzęcych, które symulują ten konkretny stan. Na przykład Hoffmann i wsp. opracowano mysi model CMH wywołany niedotlenieniem, który pokazuje, że CMH są spowodowane niedotlenieniem i zakłóceniem autoregulacji naczyń mózgowych12. Reuter i wsp.5 ustanowiło model CMHs u myszy transgenicznych APP23, który wykaza...

Klasyczne mikrokrwotoki mózgowe (CMHs) odnoszą się do maleńkich okołonaczyniowych złogów produktów degradacji krwi, takich jak hemozyderyna z czerwonych krwinek w mózgu1. Według Rotterdam Scan Study, CMH można znaleźć u prawie 17,8% osób w wieku 60-69 lat i 38,3% u osób powyżej 80 roku życia2. Częstość występowania CMH u osób starszych jest stosunkowo wysoka i ustalono korelację między akumulacją CMH a dysfunkcją poznawczą i neuropsychiatryczną3,4. Ostatnio opisano kilka modeli zwierzęcych CMH, w tym modele gryzoni wywołane przez stereotaktyczne wstrzyknięcie kolagenazy typu IV5, APP transgenic6, β-N-metyloamino-L-alanina exposure7, oraz hypertension8, z CMH wywołanymi ogólnoustrojowym zapaleniem jako jednym z najbardziej akceptowanych wyborów. Fisher i wsp.9 po raz pierwszy użył LPS pochodzącego z Salmonella typhimurium do opracowania mysiego modelu ostrego CMHs. Następnie ta sama grupa zgłosiła rozwój podostrego modelu myszy CMHs przy użyciu tego samego podejścia2.
LPS jest uważany za standaryzowany bodziec zapalny poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe. Wcześniejsze badania potwierdziły, że wstrzyknięcie LPS może powodować zapalenie nerwów, co znajduje odzwierciedlenie w dużych ilościach aktywacji mikrogleju i astrocytów w modelach zwierzęcych2,10. Ponadto ustalono dodatnią korelację między aktywacją aktywacji zapalenia układu nerwowego a liczbą CMHs2,10. Opierając się na tych wcześniejszych badaniach, zostaliśmy skłonieni do opracowania szczurzego modelu CMH poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie LPS.
Postęp w technologiach wykrywania spowodował wzrost liczby badań nad CMH. Do najbardziej uznanych metod wykrywania CMH należą: wykrywanie czerwonych krwinek za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną (HE), wykrywanie żelaza żelazowego za pomocą barwienia błękitem pruskim9, wykrywanie osadzania się błękitu Evansa (EB) za pomocą obrazowania immunofluorescencyjnego oraz obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego o napięciu ważonym podatnością 7,0 Tesli (MRI-SWI)10. Niniejsze badanie ma na celu opracowanie metody badań przesiewowych w kierunku CMH.

<table><tbody><tr><td>LPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-2630</td><td>do indukcji stanu zapalnego</td></tr><tr><td>EB</td><td>Sigma-aldrich</td><td>E2129</td><td>do wykrywania wycieków EB</td></tr><tr><td>Roztwór do barwienia DAPI</td><td>Pożywka zliczająca</td><td>Servicbio</td><td>G1012</td> dla IF</tr><tr><td>Perl' s Barwienie pruskie</td><td>Solarbio</td><td>G1424</td><td>Zestaw do barwienia pruskiego</td></tr><tr><td>Barwienie HE</td><td>Solarbio</td><td>G1120</td><td>Zestaw do barwienia HE</td></tr><tr><td>hydrat chloralu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47335U</td><td>Do znieczulenia</td></tr><tr><td>bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS)</td><td>Solarbio</td><td>P1022</td><td>rodzaj roztworu buforowego powszechnie stosowanego w eksperymencie</td></tr><tr><td>0,9% roztworu</td> <td>soli fizjologicznejHainan DonglianChangfu Pharmaceutical Co., Ltd., Chiny</td><td></td><td>roztwór do perfuzji</td></tr><tr><td>paraformaldehydu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>rodzaj roztworu powszechnie stosowanego do utrwalania</td></tr><tr><td>20% roztworu sacharozy</td><td>Solarbio</td><td>G2461</td><td>rodzaj roztworu powszechnie stosowanego do utrwalania</td></tr><tr><td>30% roztworu sacharozy</td><td>Solarbio</td><td>G2460</td><td>rodzaj roztworu powszechnie stosowanego do utrwalania</td></tr><tr><td>maść weterynaryjna</td><td>Solcoseryl żel pod oczy, Bacel, Szwajcaria</td><td></td><td>do ochrony oczu szczurów</td></tr></tbody></table>

podostre mikrokrwotoki mózgowe wywołane wstrzyknięciem lipopolisacharydu u szczurów

Sub-acute Cerebral Microhemorrhages Induced by Lipopolysaccharide Injection in Rats

Mikrokrwotoki mózgowe (CMH) są powszechne u starszych pacjentów i są skorelowane z różnymi zaburzeniami neuropsychiatrycznymi. Etiologia CMH jest złożona, a zapalenie układu nerwowego jest często obserwowane jako współwystępowanie. W tym miejscu opisujemy podostry model szczurzy CMH indukowany przez wstrzyknięcie lipopolisacharydu (LPS), a także metodę wykrywania CMH. Systemowe wstrzyknięcie LPS jest stosunkowo proste, ekonomiczne i opłacalne. Jedną z głównych zalet iniekcji LPS jest jego stabilność w wywoływaniu stanu zapalnego. CMH spowodowane wstrzyknięciem LPS można wykryć za pomocą obserwacji ogólnej, barwienia hematoksyliną i eozyną (HE), barwienia pruskiego Perla, podwójnego znakowania błękitem Evansa (EB) i technologii obrazowania ważonego podatnością rezonansu magnetycznego (MRI-SWI). Wreszcie, w niniejszym raporcie omówiono również inne metody opracowywania modeli zwierzęcych CMH, w tym ich zalety i/lub wady.

Mikrowylewy mózgowe (CMHs) można wykrywać za pomocą różnych podejść. Do najszerzej akceptowanych metod należą: (1) obserwacja makroskopowa i ocena powierzchniowych CMHs (pokazane na Rysunku 1, panel górny); (2) barwienie HE w celu wykrycia erytrocytów (pokazane na Rysunku 2A, panel górny) lub barwienie pruskie wykrywające żelazo trójwartościowe pochodzące z lizy erytrocytów (Rysunku 2A, panel dolny);...

Przedstawiamy protokół do indukowania i wykrywania CMH spowodowanych wstrzyknięciem LPS u szczurów Sprague-Dawley, który może być wykorzystany w przyszłych badaniach nad patogenezą CMH.

Podostre mikrokrwotoki mózgowe wywołane wstrzyknięciem lipopolisacharydu u szczurów

Cerebral microhemorrhages (CMHs) are common in aged patients and are correlated to various neuropsychiatric disorders. The etiology of CMHs is complex, ...

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mikrokrwotoków mózgowych, takie jak etiologia, dystrybucja i wykrywanie mikrokrwotoku mózgowego i tak dalej. Główną zaletą tej techniki jest to, że zastrzyki LPS stabilnie wywołują stan zapalny. Ponadto wtrysk LPS jest dość prosty, ekonomiczny i opłacalny.Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w indukcję krwotoku mózgowego, może być również stosowana do innych zaburzeń mózgu, takich jak depresja, schizofrenia, choroba Parkinsona, choroba Alzheimera i choroba prionowa. Podawaj LPS w dawce jednego miligrama na kilogram masy ciała 10-tygodniowym samcom szczurów Sprague Dawley we wstrzyknięciu dootrzewnowym, a następnie wróć do klatki domowej. Powtórzyć wstrzyknięcie LPS po sześciu godzinach i 16 godzinach.Należy pamiętać, że wstrzyknięcie szczurom SD LPS w dawce jednego miligrama na kilogram może spowodować 5% śmiertelność. Śmiertelność może jeszcze bardziej wzrosnąć u młodszych lub starszych szczurów lub ciężarnych samic szczurów. Po wstrzyknięciu LPS szczury należy umieścić z powrotem w klatkach i zapewnić im dostęp do jedzenia i picia ad libitum.W znieczuleniu terminalnym wykonaj nakłucie serca o głębokości od pięciu do ośmiu milimetrów u każdego szczura. Punkt nakłucia powinien znajdować się pięć milimetrów do lewego brzegu mostka w trzeciej i czwartej przestrzeni międzyżebrowej. Trzymać igłę na miejscu i zastąpić pustą probówkę probówką zawierającą niebieski Evans.Poczekaj, aż zaobserwuje się regenerację krwi, a następnie wstrzyknij niebieski Evans w dawce 0,2 mililitra na 100 gramów masy ciała do lewej komory serca. Utrzymuj szczura w pozycji leżącej na plecach przez 10 minut, jeśli oceniasz niebieski wyciek Evansa przez barierę krew/mózg za pomocą obrazowania immunofluorescencyjnego. Wykonaj perfuzje serca za pomocą lodowatego 200 do 300 mililitrów 0,9% roztworu soli fizjologicznej, aby oczyścić naczynia krwionośne mózgu i mózg.Przełącz się na lodowaty 4% paraformaldehyd do utrwalenia. Następnie, po wyizolowaniu mózgu, zanurz go w 20% sacharozie w PBS na co najmniej sześć godzin lub do momentu, gdy mózg opadnie na dno rurki. Zmień roztwór na 30% sacharozy i napraw go na kolejne sześć godzin.Na koniec przygotuj skrawki tkanki mózgowej o grubości 10 milimetrów za pomocą kriostatu. Przemyć szkiełka PBS trzy razy przez pięć minut każde, a następnie inkubować szkiełka z roztworem 4, 6'diamidyno-2-fenyloindolu lub DAPI przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po umyciu szkiełek w PBS jak poprzednio, zamontuj szkiełka z roztworem PBS-glicerolu.Rejestruj obrazy pod mikroskopem fluorescencyjnym. Osadzanie się EB jest oznaczone czerwoną fluorescencją, jądra są oznaczone niebieską fluorescencją. Barwienie H&E należy rozpocząć od umycia szkiełek w wodzie destylowanej.Następnie zanurz w roztworze hematoksyliny na osiem minut. Alternatywnie, w przypadku barwienia błękitem pruskim Perl, zabarwić w roztworze reakcyjnym mieszaniną żelazocyjanku i kwasu solnego w równych częściach przez 10 minut. Po zabarwieniu myj pod bieżącą wodą z kranu przez pięć minut.Różnicować w 1% kwaśnym alkoholu przez 30 sekund. Po umyciu pod bieżącą wodą z kranu przez minutę zaplamić w 0,2% wodzie amoniakalnej lub nasyconym roztworze węglanu litu przez 30 sekund do jednej minuty. Następnie myj pod bieżącą wodą z kranu przez pięć minut.Przeciw barwieniu roztworem eozyny przez 30 sekund do jednej minuty. Odwodnić się przez 90% alkoholu, następnie 95% alkoholu i alkoholu absolutnego przez 0,5 do dwóch minut każdy. Po odwodnieniu należy sklarować ksylen przez 30 sekund.Po zamontowaniu przeanalizuj barwienie H&E za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego jasnego pola. Czerwone krwinki uwalniane z naczyń krwionośnych, które są składnikami CMH, pojawiają się na czerwono-pomarańczowo w barwieniu H&E. Powierzchniowe CMH można wykryć za pomocą obserwacji ogólnej, jak wskazują czerwone strzałki.Niebieskie zabarwienie Evansa ujawnia widoczną czerwoną fluorescencję w miejscu, w którym niebieskie cząsteczki Evansa wyciekły z uszkodzonej bariery krew-mózg. Barwienie H&E pokazuje czerwone krwinki znajdujące się poza naczyniami włosowatymi, a barwienie pruskie ujawnia punkty jonów żelazowych pochodzące z lizy czerwonych krwinek. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, że dawka LPS w celu wywołania mikrokrwotoku mózgowego jest większa niż ta stosowana w modelu choroby Parkinsona lub schizofrenii.Dlatego środowisko zwierząt powinno być utrzymywane w czystości, aby zmniejszyć śmiertelność. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak mikroskopia elektronowa, rezonans magnetyczny i obrazowanie immunofluorescencyjne, w celu określenia uszkodzenia zewnętrznej struktury bariery krew-mózg w mikrokrwotoku mózgowym, dystrybucji mikrokrwotoków mózgowych w miąższu mózgu in vivo, a także aktywacji komórek glejowych.

sub-acute-cerebral-microhemorrhages-induced-lipopolysaccharide

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Aneuryzmalny krwotok podpajęczynówkowy (SAH) to krwawienie do przestrzeni podpajęczynówkowej następujące po pęknięciu tętniaka. Choć zapadalność i śmiertelność z powodu tego zdarzenia spadły dzięki lepszym metodom leczenia, ryzyko wystąpienia skurczu naczyń po krwotoku podpajęczynówkowym pozostaje na tym samym poziomie, co kilka lat temu. Znaczenie opracowania kompleksowego i powtarzalnego modelu zwierzęcego w celu zidentyfikowania zdarzeń inicjujących mózgowy skurcz naczyń było przedmiotem...

Model szczura o niskiej śmiertelności do oceny opóźnionego naczyniowego skurczu mózgu po eksperymentalnym krwotoku podpółczepkowym

Klinicznie istotne modele zwierzęce krwotoku wewnątrzczaszkowego (ICH) są niezbędne do poszerzenia naszej wiedzy na temat udaru krwotocznego oraz do badania nowych strategii terapeutycznych. W niniejszym badaniu opisujemy i oceniamy dwa modele ICH, w których stosuje się jednostronne wstrzyknięcia autologicznej krwi pełnej lub bakteryjnej kolagenazy do jąder podstawy (ciała prążkowanego) myszy.

Modelowanie krwotoku wewnątrzczaszkowego u myszy: wstrzykiwanie krwi autologicznej lub bakteryjnej kolagenazy

Ten film pokazuje proces wywoływania zaburzeń bariery krew-mózg (BBB) i mikrokrwotoków mózgowych w modelu szczurzym przy użyciu lipopolisacharydu (LPS). Podkreśla sekwencję odpowiedzi immunologicznych, które prowadzą do zwiększonej przepuszczalności BBB, a następnie uszkodzenia tkanki mózgowej.

Indukcja mikrokrwotoków mózgowych w modelu szczurzym przy użyciu lipopolisacharydu

Ten film demonstruje test do wykrywania mikrokrwotoków mózgowych (CMH) w modelu szczurzym. CMH to krwawienia do mózgu spowodowane przerwaniem bariery krew-mózg, identyfikowane przez wyciekające czerwone krwinki (RBC). W modelu szczurzym utrwalona tkanka mózgowa jest kriochroniona, cięta i barwiona hematoksyliną-eozyną dla erytrocytów, co pozwala na mikroskopową wizualizację CMH. Wyciekające erytrocyty pojawiają się pod mikroskopem jako czerwono-pomarańczowe.

Wykrywanie mikrokrwotoków mózgowych w modelu szczurzym

Przedkliniczne modele krwotoku śródmózgowego są wykorzystywane do naśladowania pewnych aspektów klinicznej choroby. W ten sposób można badać mechanizmy urazów i potencjalne strategie terapeutyczne. W tym protokole opisano dwa modele krwotoku śródmózgowego, doprążkowiowe (zwoje podstawy) iniekcje krwi autologicznej lub kolagenazy.

Doprążkowiowe wstrzyknięcie krwi autologicznej lub kolagenazy Clostridium jako mysie modele krwotoku śródmózgowego

Encefalopatia wcześniaków obejmuje nieprawidłowości ośrodkowego układu nerwowego związane z uszkodzeniem spowodowanym przedwczesnym porodem. W niniejszym raporcie opisano klinicznie istotny szczurzy model przejściowego ogólnoustrojowego niedotlenienia i niedokrwienia w macicy oraz podawania lipopolisacharydów owodniowych (LPS), który naśladuje zapalenie błon płodowych i związanego z tym wpływu bodźców zakaźnych i niedostatecznej perfuzji łożyska na rozwój OUN.

Modelowanie encefalopatii wcześniaków za pomocą prenatalnej hipoksji-niedokrwienia lipopolisacharydem wewnątrzowodniowym u szczurów

Przedstawiony tutaj protokół pozwala na reprodukcję rozległej demielinizacji istoty szarej obu półkul korowych u dorosłych samców szczurów Dark Agouti. Metoda polega na domózgowym wszczepieniu cewnika, subklinicznej immunizacji przeciwko glikoproteinie mielinowych oligodendrocytów oraz domózgowej iniekcji prozapalnej mieszaniny cytokin przez wszczepiony cewnik.

Szczurzy model rozległej demielinizacji kory mózgowej indukowanej przez domózgowe wstrzyknięcie cytokin prozapalnych

Przedstawiamy protokół do stworzenia modelu masywnego krwotoku pontine u szczura poprzez podwójne wstrzyknięcie krwi autologicznej.

Masywny krwotok mostowy przez podwójne wstrzyknięcie krwi autologicznej

Krwotok pajęczynówkowy nadal niesie ze sobą duże obciążenie śmiertelnością i zachorowalnością u człowieka. Aby ułatwić dalsze badania nad schorzeniem i jego patofizjologią, przedstawiono model prechiazmatycznego pojedynczego wstrzyknięcia.

Przedchiazmatyczne, pojedyncze wstrzyknięcie autologicznej krwi w celu wywołania eksperymentalnego krwotoku podpajęczynówkowego w modelu szczurzym

Pokrwawiąca wodogłowie przedwczesnego (PHHP) można modelować u noworodków szczurów poprzez połączenie zapalenia chorioamnionitisu i krwotoku wewnątrzkomorowego. Połączenie tych wydarzeń prenatalnych i poporodowych wiernie oddaje kliniczne cechy PHHP, w tym makrocefalię, brzuszną omegę oraz podwyższone ciśnienie wewnątrzczaszkowe, przez całe życie.

Modelowanie pokrwaconego wodogłowia przedwczesnego u szczurów

W tym badaniu wykazano, że nieinwazyjna technika instylacji tchawicy pozwala na rozwój ALI u szczurów za pomocą podstawowego laryngoskopu, aby zapewnić precyzyjne dostarczanie LPS do płuc. LPS jest wprowadzany za pomocą rurki tchawicowej za pomocą laryngoskopu. Skala uszkodzenia płuc jest oceniana w wielu punktach czasowych.

Nieinwazyjne podanie lipopolisacharydu przez endotchawicę w celu wywołania ostrego uszkodzenia płuc u gryzoni

Poznaj metodę wywoływania mikrokrwotoków mózgowych u szczurów Sprague-Dawley poprzez wstrzyknięcie LPS. Technika ta pozwala badać patogenezę uszkodzeń naczyń mózgowych i mechanizmy zapalne.

Podostre mikrokrwotoki mózgowe wywołane wstrzyknięciem lipopolisacharydu u szczurów

Przeglądaj więcej filmów