Podostre mikrokrwotoki mózgowe wywołane wstrzyknięciem lipopolisacharydu u szczurów

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mikrokrwotoków mózgowych, takie jak etiologia, dystrybucja i wykrywanie mikrokrwotoku mózgowego i tak dalej. Główną zaletą tej techniki jest to, że zastrzyki LPS stabilnie wywołują stan zapalny. Ponadto wtrysk LPS jest dość prosty, ekonomiczny i opłacalny.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w indukcję krwotoku mózgowego, może być również stosowana do innych zaburzeń mózgu, takich jak depresja, schizofrenia, choroba Parkinsona, choroba Alzheimera i choroba prionowa. Podawaj LPS w dawce jednego miligrama na kilogram masy ciała 10-tygodniowym samcom szczurów Sprague Dawley we wstrzyknięciu dootrzewnowym, a następnie wróć do klatki domowej. Powtórzyć wstrzyknięcie LPS po sześciu godzinach i 16 godzinach.

Należy pamiętać, że wstrzyknięcie szczurom SD LPS w dawce jednego miligrama na kilogram może spowodować 5% śmiertelność. Śmiertelność może jeszcze bardziej wzrosnąć u młodszych lub starszych szczurów lub ciężarnych samic szczurów. Po wstrzyknięciu LPS szczury należy umieścić z powrotem w klatkach i zapewnić im dostęp do jedzenia i picia ad libitum.

W znieczuleniu terminalnym wykonaj nakłucie serca o głębokości od pięciu do ośmiu milimetrów u każdego szczura. Punkt nakłucia powinien znajdować się pięć milimetrów do lewego brzegu mostka w trzeciej i czwartej przestrzeni międzyżebrowej. Trzymać igłę na miejscu i zastąpić pustą probówkę probówką zawierającą niebieski Evans.

Poczekaj, aż zaobserwuje się regenerację krwi, a następnie wstrzyknij niebieski Evans w dawce 0,2 mililitra na 100 gramów masy ciała do lewej komory serca. Utrzymuj szczura w pozycji leżącej na plecach przez 10 minut, jeśli oceniasz niebieski wyciek Evansa przez barierę krew/mózg za pomocą obrazowania immunofluorescencyjnego. Wykonaj perfuzje serca za pomocą lodowatego 200 do 300 mililitrów 0,9% roztworu soli fizjologicznej, aby oczyścić naczynia krwionośne mózgu i mózg

Przełącz się na lodowaty 4% paraformaldehyd do utrwalenia. Następnie, po wyizolowaniu mózgu, zanurz go w 20% sacharozie w PBS na co najmniej sześć godzin lub do momentu, gdy mózg opadnie na dno rurki. Zmień roztwór na 30% sacharozy i napraw go na kolejne sześć godzin.

Na koniec przygotuj skrawki tkanki mózgowej o grubości 10 milimetrów za pomocą kriostatu. Przemyć szkiełka PBS trzy razy przez pięć minut każde, a następnie inkubować szkiełka z roztworem 4, 6'diamidyno-2-fenyloindolu lub DAPI przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po umyciu szkiełek w PBS jak poprzednio, zamontuj szkiełka z roztworem PBS-glicerolu.

Rejestruj obrazy pod mikroskopem fluorescencyjnym. Osadzanie się EB jest oznaczone czerwoną fluorescencją, jądra są oznaczone niebieską fluorescencją. Barwienie H&E należy rozpocząć od umycia szkiełek w wodzie destylowanej.

Następnie zanurz w roztworze hematoksyliny na osiem minut. Alternatywnie, w przypadku barwienia błękitem pruskim Perl, zabarwić w roztworze reakcyjnym mieszaniną żelazocyjanku i kwasu solnego w równych częściach przez 10 minut. Po zabarwieniu myj pod bieżącą wodą z kranu przez pięć minut.

Różnicować w 1% kwaśnym alkoholu przez 30 sekund. Po umyciu pod bieżącą wodą z kranu przez minutę zaplamić w 0,2% wodzie amoniakalnej lub nasyconym roztworze węglanu litu przez 30 sekund do jednej minuty. Następnie myj pod bieżącą wodą z kranu przez pięć minut.

Przeciw barwieniu roztworem eozyny przez 30 sekund do jednej minuty. Odwodnić się przez 90% alkoholu, następnie 95% alkoholu i alkoholu absolutnego przez 0,5 do dwóch minut każdy. Po odwodnieniu należy sklarować ksylen przez 30 sekund.

Po zamontowaniu przeanalizuj barwienie H&E za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego jasnego pola. Czerwone krwinki uwalniane z naczyń krwionośnych, które są składnikami CMH, pojawiają się na czerwono-pomarańczowo w barwieniu H&E. Powierzchniowe CMH można wykryć za pomocą obserwacji ogólnej, jak wskazują czerwone strzałki.

Niebieskie zabarwienie Evansa ujawnia widoczną czerwoną fluorescencję w miejscu, w którym niebieskie cząsteczki Evansa wyciekły z uszkodzonej bariery krew-mózg. Barwienie H&E pokazuje czerwone krwinki znajdujące się poza naczyniami włosowatymi, a barwienie pruskie ujawnia punkty jonów żelazowych pochodzące z lizy czerwonych krwinek. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, że dawka LPS w celu wywołania mikrokrwotoku mózgowego jest większa niż ta stosowana w modelu choroby Parkinsona lub schizofrenii.

Dlatego środowisko zwierząt powinno być utrzymywane w czystości, aby zmniejszyć śmiertelność. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak mikroskopia elektronowa, rezonans magnetyczny i obrazowanie immunofluorescencyjne, w celu określenia uszkodzenia zewnętrznej struktury bariery krew-mózg w mikrokrwotoku mózgowym, dystrybucji mikrokrwotoków mózgowych w miąższu mózgu in vivo, a także aktywacji komórek glejowych.