Name: Test koimmunoprecypitacji do badania funkcjonalnych interakcji między receptorami i enzymami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Poznaj metodę koimmunoprecypitacji do badania interakcji receptor-enzym i aktywności enzymatycznej na kulkach. Technika ta pozwala jednocześnie analizować rekrutację i aktywację enzymów w komórkach HEK 293-T.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt został sfinansowany przez NIH Grants 1R01AI125640-01 oraz Rheumatology Research Foundation.

1. Transfekcja komórek
<ol>
	<li>Wysiewaj komórki HEK 293T na dwanaście 10-centymetrowych płytek (5 x 10,6 komórek na płytkę) dzień przed transfekcją (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Wykonaj zliczanie komórek za pomocą hemocytometru. Na każdą płytkę użyj 10 ml DMEM uzupełnionego 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
	<li>Gdy komórki są w 80-90% zlewne, transfekuj 5 płytek HEK 293T za pomocą odczynnika transfekcyjnego na bazie lipidów z jednym z następujących plazmidów: wektor eksprymujący SHP2, wektor eksprymujący PD-1-GFP [wersja PD-1 typu dzikiego (WT)], zmutowana ITIM wersja (Y223F) wektora eksprymującego PD-1-GFP i zmutowana ITSM wersja (Y248F) wektora eksprymującego PD-1-GFP (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). 
UWAGA: Dwie płytki zostaną transfekowane wektorem ekspresji WT PD-1-GFP. Jedna dodatkowa płytka posłuży jako kontrola komórek nietransfekowanych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Wykonaj transfekcję zgodnie z protokołem producenta dla komórek przylegających w płytkach 10 cm. 
	UWAGA: W zmutowanych wersjach PD-1 tyrozyna (Y) w każdym motywie została zastąpiona fenyloalaniną (F), która nie może być fosforylowana.</li>
	<li>Transfekować drugi identyczny zestaw pięciu płytek i jedną dodatkową płytkę służącą jako nietransfekowana kontrola do pomiaru wyrażonej ilości białka [wejście; znane również jako lizat całych komórek (WCL)] przed immunoprecypitacją (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Inkubować transfekowane komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w inkubatorze do hodowli tkankowych. 
	UWAGA: Aby upewnić się, że transfekcja przebiegła pomyślnie, zbadaj komórki pod kątem ekspresji GFP za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
</ol>
2. Promowanie fosforylacji w transfekowanych komórkach
<ol>
	<li>Po inkubacji przygotować świeży perwanadate, mieszając 50 μl ortowanadanu sodu (ze 100 mM bulionu) z 50 μl 30% H2O2, 
	UWAGA: Mieszanina powinna zmienić kolor na żółtawy. Perwanadat jest przepuszczalnym dla komórek inhibitorem fosfatazy, który wspomaga fosforylację reszt tyrozyny13. W tym teście służy do silnego indukowania fosforylacji ogonów PD-1.</li>
	<li>Aby fosforylować oznaczone wersje PD-1, usuń pożywkę z komórek transfekowanych PD-1-GFP i dodaj 10 ml zwykłego DMEM (bez surowicy lub antybiotyków) razem z 10 μl perwanadanu (krok 2.1) do każdej 10 cm płytki (co daje osiem płytek wyrażających różne wersje PD-1) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Umieść talerze w temperaturze pokojowej w ciemności przez 15 min. 
	UWAGA: Komórki transfekowane SHP2 (dwie płytki; <silna klasa="xfig">Rysunek 1) a dwie nietransfekowane płytki kontrolne nie są traktowane perwanadatem, ponieważ płytki te będą służyć jako źródło aktywnego enzymu SHP2.</li>
	<li>Umyj komórki 5 ml lodowatego 1x PBS. Powtórz ten krok dwukrotnie.</li>
</ol>
3. Immunoprecypitacja
UWAGA: Następujące kroki powinny być wykonywane na lodzie lub w temperaturze 4 °C.
<ol>
	<li>Uzupełnij bufor do lizy (50 mM Tris-HCl o pH 7,2, 250 mM NaCl, 0,1% NP-40, 2 mM EDTA, 10% glicerolu) inhibitorami proteazy (rozpuścić 1 tabletkę w 10 ml buforu do lizy) i 1 mM orthovanadatem sodu. Dodać 500 μl lodowatego buforu do lizy do komórek i natychmiast usunąć i zebrać komórki z płytek za pomocą skrobaka do komórek. 
	UWAGA: Ważne jest, aby dodawać ortowananian sodu tylko do buforu do lizy, który będzie używany do płytek transfekowanych PD-1-GFP, ponieważ płytki transfekowane SHP2 i nietransfekowane płytki kontrolne muszą zachować aktywność fosfatazy.</li>
	<li>Przenieść lizaty do zimnych probówek o pojemności 1,5 ml i obracać je w temperaturze 0,005 x g, 4 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Aby zebrać supernatant postjądrowy (PNS) z lizatów, należy wirować lizaty przez 10 minut w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C i przenieść supernatanty do nowych probówek. Wyrzuć granulkę. Przechowuj supernatanty z drugiego zestawu sześciu płytek (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) na lodzie do późniejszej analizy WCL.</li>
	<li>Przygotowanie kulek anty-GFP do immunoprecypitacji PD-1-GFP z lizatów transfekowanych PD-1-GFP z pierwszego zestawu (cztery płytki) (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1).
	<ol>
		<li>Aby zapobiec osadzaniu się koralików, przed otwarciem delikatnie potrząśnij butelką z koralikami. Usunąć 40 μl kulek anty-GFP z gnojowicy na każdy warunek.</li>
		<li>Wirować w temperaturze 500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant w celu umycia kulek. 
		UWAGA: Ważne jest, aby zminimalizować kontakt plastikowych końcówek pipety z kulkami agarozy, aby zapobiec utracie. Zaleca się przecięcie krawędzi końcówki o pojemności 200 μl przed przeniesieniem kulek do innej tuby.</li>
		<li>Ponownie zawiesić kulki w 80 μl buforu do lizy (na próbkę).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać umyte kulki bezpośrednio do lizatu komórkowego (PNS) z komórek wykazujących ekspresję PD-1-GFP z pierwszego zestawu (cztery płytki) (krok 3.3). Obracać w temperaturze 0,005 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu immunoprecypitacji białek znakowanych GFP.</li>
	<li>Umyj kulki 1 ml zimnego buforu do lizy (bez ortowanadatu) 3 razy. Odwirować probówkę o masie 2 500 x g przez 10 s. 
	UWAGA: Dodając bufor do lizy do kulek, dodaj go bezpośrednio na kulki, nie dotykając ich końcówkami. Nie ma potrzeby pipetowania w górę i w dół podczas mycia.</li>
	<li>Równo podzielić lizat aktywnego SHP2 z pierwszego zestawu (jedna płytka; krok 3.3) i dodać go do trzech probówek z przemytymi kulkami zawierającymi PD-1-GFP (WT PD-1-GFP i dwie różne mutacje z niedoborem fosforu, Y223F i Y248F). Dodać jedną trzecią objętości z lizatu komórek nietransfekowanych do drugiej probówki kulek WT PD-1-GFP. Odrzuć pozostałe dwie trzecie.</li>
	<li>Inkubować kulki przez 4 godziny w temperaturze 4 °C z delikatnymi obrotami (0,005 x g).</li>
	<li>Przemyć kulki dwukrotnie 1 ml zimnego buforu do lizy (bez perwanadatu lub ortowanadatu), jak opisano w kroku 3.6.</li>
	<li>Dodać 80 μl buforu do lizy (bez perwanadatu lub ortowanadatu) na próbkę, upewniając się, że całkowita objętość w każdej probówce wynosi 100 μl (20 μl kulek i 80 μl buforu do lizy). Delikatnie wymieszaj i przenieś 50 μl z każdej probówki do dwóch świeżych probówek o pojemności 1,5 ml. 
	UWAGA: Po tym kroku zostaną dwie probówki wypełnione mieszaniną zawierającą kulki i bufor do lizy: jedna probówka zostanie użyta do przetestowania koimmunoprecypitowanego SHP2 metodą western blot, a druga zostanie użyta do testu aktywności fosfatazy.</li>
</ol>
4. Test aktywności fosfatazy
<ol>
	<li>Przemyć kulki raz buforem do przemywania fosfatazy (30 mM Hepes o pH 7,4 i 120 mM NaCl). Całkowicie usunąć supernatant.</li>
	<li>Dodać 100 μl buforu do oznaczania (30 mM Hepes przy pH 7,4, 120 mM NaCl, 5 mM DTT, 10 mM p-nitrofenylofosforanu) do kulek i inkubować w temperaturze 30 °C przez 30 minut pod delikatnym mieszaniem. UWAGA: Czas inkubacji może się różnić, ale poczekaj, aż bufor zmieni kolor na żółty po defosforylacji.</li>
	<li>Aby zakończyć reakcję, dodać 50 μl 1 M NaOH, gdy bufor zmieni kolor na żółty.</li>
	<li>Wirować w dół przy 2,500 x g przez 10 s i przenieść 50 μl supernatantu do dwóch studzienek (duplikatów po 50 μl na studzienkę) o połowie powierzchni w 96-dołkowej płytce. Odczytać absorbancję przy 405 nm.</li>
	<li>Wyrazić wyniki jako względną gęstość optyczną (OD) w kontrolnej wersji PD-1-GFP typu dzikiego.</li>
</ol>
5. Analiza SHP2 Western Blot
<ol>
	<li>Zakręć koraliki i usuń supernatant.</li>
	<li>Dodać 20 μl 2x buforu Laemmli (patrz tabela materiałów) do kulek i gotować w temperaturze 95 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Zmierz stężenie białka w kontrolkach wejściowych (drugi zestaw) za pomocą zestawu BCA (patrz tabela materiałów). Przenieść 30 μl najbardziej rozcieńczonej próbki do nowej probówki. Rozcieńczyć pozostałe kontrole wejściowe buforem do lizy do tego samego stężenia, co najbardziej rozcieńczona próbka i przenieść 30 μl z każdej z nich do nowej probówki. 
	UWAGA: Po tym kroku będą 4 probówki po 30 μl każda, o podobnych stężeniach białka, reprezentujące wejściowe lizaty kontrolne.</li>
	<li>Dodać równe objętości 2x buforu Laemmli do lizatów i gotować w temperaturze 95 °C przez 5 minut. Odwirować kulki i załadować supernatant na 4–20% żelu na bazie SDS-PAGE Tris (patrz tabela materiałów) do analizy western blot. Ponadto załadować 50 μl z każdej próbki z drugiego zestawu.</li>
	<li>Kontynuuj analizę western blot zgodnie z wcześniej opisanym protokołem12.</li>
</ol>

<ol><li>Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+tyrosine+kinases+and+downstream+pathways+as+druggable+targets+for+cancer+treatment%3A+the+current+arsenal+of+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors.</a> Molecular Cancer. 17 (1), (2018).</li>
<li>Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selected+signalling+proteins+recruited+to+the+T-cell+receptor-CD3+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex.</a> Immunology. 153 (1), 42-50 (2018).</li>
<li>Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coreceptor+programmed+death+1+inhibits+T-cell+adhesion+by+regulating+Rap1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (2), 564-567 (2015).</li>
<li>Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHP-1+and+SHP-2+associate+with+immunoreceptor+tyrosine-based+switch+motif+of+programmed+death+1+upon+primary+human+T+cell+stimulation%2C+but+only+receptor+ligation+prevents+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation.</a> The Journal of Immunology. 173 (2), 945-954 (2004).</li>
<li>Patsoukis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+effects+of+PD-1+on+Akt+and+Ras+pathways+regulate+molecular+components+of+the+cell+cycle+and+inhibit+T+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation.</a> Science Signaling. 5 (230), 46(2012).</li>
<li>Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+death-1+concentration+at+the+immunological+synapse+is+determined+by+ligand+affinity+and+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (45), (2007).</li>
<li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+1+forms+negative+costimulatory+microclusters+that+directly+inhibit+T+cell+receptor+signaling+by+recruiting+phosphatase+SHP2%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).</li>
<li>Hui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+costimulatory+receptor+CD28+is+a+primary+target+for+PD-1-mediated+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition.</a> Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).</li>
<li>Sheppard, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+inhibits+T-cell+receptor+induced+phosphorylation+of+the+ZAP70%2FCD3zeta+signalosome+and+downstream+signaling+to+PKCtheta%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta.</a> FEBS Letters. 574 (1-3), 37-41 (2004).</li>
<li>Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+immunoreceptor+inhibits+B+cell+receptor-mediated+signaling+by+recruiting+src+homology+2-domain-containing+tyrosine+phosphatase+2+to+phosphotyrosine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13866-13871 (2001).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonism+between+binding+site+affinity+and+conformational+dynamics+tunes+alternative+cis-interactions+within+Shp2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2.</a> Nature Communications. 4, 2037(2013).</li>
<li>Peled, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+mass+spectrometry+analysis+of+PD-1+uncovers+SAP+as+a+new+checkpoint+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E468-E477 (2018).</li>
<li>Jang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+tyrosine+phosphatase+inhibitor%2C+pervanadate%2C+inhibits+angiotensin+II-Induced+beta-arrestin+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+and+Cells%22%5BJournal%5D)">A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage.</a> Molecules and Cells. 28 (1), 25-30 (2009).</li>
<li>Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+stimulation+of+SH-PTP2+phosphatase+activity+by+simultaneous+occupancy+of+both+SH2+domains%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 2897-2900 (1995).</li>
<li>McAvoy, T., Nairn, A. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20890902">Serine/threonine protein phosphatase assays.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 18, Unit18 18 (2010).</li>
<li>Shlapatska, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD150+association+with+either+the+SH2-containing+inositol+phosphatase+or+the+SH2-containing+protein+tyrosine+phosphatase+is+regulated+by+the+adaptor+protein+SH2D1A%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A.</a> The Journal of Immunology. 166 (9), 5480-5487 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Interakcje receptor-enzym mają kluczowe znaczenie dla sygnalizacji wewnątrzkomórkowej. Wiele enzymów jest rekrutowanych do receptorów poprzez domeny SH2 wiążące się z fosforylowanymi tyrozynami, które ozdabiają ogony tych samych receptorów. Jednak enzymy są często składane w zamknięte nieaktywne konformacje, a aktywacja wymaga zmiany konformacyjnej11 , w której mogą pośredniczyć inne domeny tego samego receptora. Opisany tutaj test mierzy interakcje między receptorami i enzymami, a także aktywność...

Receptory katalityczne i receptorowe kinazy tyrozynowe to białka transbłonowe, w których wiązanie liganda zewnątrzkomórkowego powoduje aktywność enzymatyczną po stronie wewnątrzkomórkowej1. Niektóre receptory pełnią zarówno funkcje receptorowe, jak i enzymatyczne, podczas gdy inne rekrutują określone enzymy, takie jak kinazy i fosfatazy, do swoich ogonów cytoplazmatycznych. Rekrutacja enzymu do ogona receptora i późniejsze działanie katalityczne tego enzymu to dwa odrębne procesy, które nie zawsze są regulowane przez te same domeny białkowe2. Niestety, nie ma konkretnych narzędzi do jednoczesnej oceny zarówno interakcji, jak i aktywności enzymatycznej. Opisany tutaj funkcjonalny test koimmunoprecypitacji jest użyteczną metodą do analizy rekrutacji enzymu do ogona receptora od jego aktywacji. Test ten wykorzystuje immunoprecypitację oznakowanych receptorów za pomocą kulek pokrytych przeciwciałami. Następnie przeprowadza się zarówno test aktywności enzymatycznej, jak i analizę western blot na kulkach. Ogólnym celem tej metody jest odkrycie, które domeny białkowe są niezbędne do interakcji między receptorami a enzymami (oceniane za pomocą analizy western blot) i które domeny są niezbędne do pełnej aktywacji enzymów (mierzonej za pomocą testu aktywności enzymatycznej na kulce). Istotne jest opracowanie narzędzi do badania odrębnych funkcji enzymów związanych z receptorami ze względu na ich udział w patogenezie chorób człowieka. Co więcej, dalsze zrozumienie mechanizmów działania tych białek może pomóc w projektowaniu nowych interwencji terapeutycznych.
Programowana śmierć-1 (PD-1) jest receptorem hamującym na powierzchni limfocytów T i jest niezbędna do ograniczenia nadmiernych odpowiedzi limfocytów T. W ostatnich latach przeciwciała anty-PD-1 zostały zaangażowane w leczenie wielu nowotworów złośliwych1,2. Ligacja PD-1 ogranicza liczne funkcje limfocytów T, w tym proliferację, adhezję i wydzielanie wielu cytokin3,4,5. PD-1 jest zlokalizowany w synapsie immunologicznej, interfejsie między limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen6, gdzie kolokalizuje się z receptorem limfocytów T (TCR)7. Następnie fosfataza tyrozynowa SHP2 [domena homologii Src 2 (SH2) zawierająca fosfatazę tyrozynową 2] jest rekrutowana do ogona cytoplazmatycznego PD-1, co prowadzi do defosforylacji kluczowych reszt tyrozyny w kompleksie TCR i związanych z nim proksymalnych cząsteczkach sygnałowych3,4,5,8,9. Ogon cytoplazmatyczny PD-1 zawiera dwa motywy tyrozynowe, motyw hamujący oparty na tyrozynie (ITIM) i motyw przełącznika opartego na tyrozynie (ITSM) 10. Oba motywy są fosforylowane po podwiązaniu PD-19,10. Badania mutagenezy ujawniły pierwszoplanową rolę ITSM w rekrutacji SHP2, w przeciwieństwie do ITIM, którego rola w sygnalizacji i funkcji PD-1 nie jest jasna4.
SHP2 przyjmuje albo konformację zamkniętą (złożoną), zahamowaną, albo konformację otwartą (rozszerzoną), aktywną11. Udział każdej domeny ogonowej PD-1 w wiązaniu lub aktywacji SHP2 nie został jeszcze wyjaśniony. Aby odpowiedzieć na to pytanie, opracowaliśmy test, który umożliwia równoległe testowanie rekrutacji SHP2 do ogona PD-1 i jego aktywności12. Zastosowaliśmy koimmunoprecypitację i test aktywności fosfatazy na kulkach, aby równolegle przetestować zarówno interakcję, jak i aktywność enzymatyczną. Za pomocą tego testu pokazujemy, że ITSM PD-1 jest wystarczający do rekrutacji SHP2 do ogona PD-1, podczas gdy ITIM PD-1 jest potrzebny do pełnego rozciągnięcia i aktywacji enzymu.
Istnieje wiele receptorów, które mają kilka sąsiadujących domen w swoich cytoplazmatycznych ogonach. Funkcjonalny test koimmunoprecypitacji może odkryć rolę określonych domen, które są niezbędne do rekrutacji białek lub aktywacji enzymatycznej.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td> Mikrowirówka z <td>solą fizjologiczną buforowaną fosforanem</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5424-R</td><td>1,5 ml</td></tr><tr><td>trypsyny-EDTA (0,25%) Czerwień fenolowa</td><td>Gibco</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie FBS</td><td>Denville</td><td>FB5001-H</td><td>Płodowa surowica bydlęca</td></tr><tr><td>Penicylina / Streptomycyna</td><td>Fisher</td><td>BP295950</td><td></td></tr><tr><td>DMEM wysoka glukoza bez L-glutaminy</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>SuperFect Odczynnik do transfekcji</td><td>Qiagen</td><td>301305</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SHP2</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-280</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; GFP-agaroza</td><td>MBL</td><td>D153-8</td><td></td></tr><tr><td>Anty-GFP</td><td>Roche</td><td>118144600</td><td></td></tr><tr><td>Antyaktyna</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-1616</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293 komórki</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Orthovanadate</td><td>Sigma</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma</td><td>216763</td><td>30%</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>wolny od EDTA</td></tr><tr><td>Bufor do próbek Tris-Glycine SDS (2x)</td><td>Invitrogen</td><td>LC2676</td><td>Zmodyfikowany bufor Laemmli</td></tr><tr><td>4-20% Tris-Glycine Mini Gels</td><td>Invitrogen</td><td>XP04205BOX</td><td>15-dołkowe</td></tr><tr><td>membrany nitrocelulozowe</td><td>General Electric</td><td>10600004</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>Sód chlorek</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>Kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-2-etanosulfonowy</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>D1532</td><td>Ditiotreitol</td></tr><tr><td>pNPP</td><td>Sigma</td><td>20-106</td><td>fosforan p-nitrofenylu</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td>Wodorotlenek sodu</td></tr><tr><td>BCA</td><td>Fisher</td><td>23225</td><td>Test kwasu bichinowego</td></tr></tbody></table>

test koimmunoprecypitacji do badania funkcjonalnych interakcji między receptorami i enzymami

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Enzymy związane z receptorami są głównymi mediatorami aktywacji komórkowej. Enzymy te są regulowane, przynajmniej częściowo, przez fizyczne interakcje z cytoplazmatycznymi ogonami receptorów. Interakcje często zachodzą poprzez określone domeny białkowe i powodują aktywację enzymów. Istnieje kilka metod badania interakcji między białkami. Podczas gdy koimmunoprecypitacja jest powszechnie stosowana do badania domen, które są wymagane do interakcji białko-białko, nie ma testów, które dokumentowałyby udział określonych domen w aktywności rekrutowanych enzymów w tym samym czasie. W związku z tym opisana tutaj metoda łączy koimmunoprecypitację i test aktywności enzymatycznej na kulkach w celu jednoczesnej oceny interakcji między białkami i związanej z nimi aktywacji enzymatycznej. Celem tego protokołu jest zidentyfikowanie domen, które są krytyczne dla fizycznych interakcji między białkiem a enzymem oraz domen, które są niezbędne do pełnej aktywacji enzymu. Wykazano znaczenie tego testu, ponieważ niektóre domeny białek receptorowych przyczyniają się do wiązania enzymu z ogonem cytoplazmatycznym receptora, podczas gdy inne domeny są niezbędne do regulacji funkcji tego samego enzymu.

Podczas gdy wkład motywu ITSM białka PD-1 w wiązanie SHP2 jest dobrze udokumentowany, rola motywu ITIM białka PD-1 jest mniej jasna. Ponieważ SHP2 posiada dwie domeny SH2, które mogą wiązać się z dwiema następującymi po sobie fosfotyrozynami w PD-1 (jedną tyrozyną w ITSM i drugą w ITIM), postawiliśmy hipotezę, że ITSM białka PD-1 zakotwicza SHP2 w PD-1, podczas gdy ITIM białka PD-1 wspomaga aktywność SHP2 poprzez stabilizację jego otwartej konformacji11,...

Tutaj prezentujemy protokół koimmunoprecypitacji i test aktywności enzymatycznej na koraliku, aby jednocześnie badać udział specyficznych domen białkowych receptorów błony komórkowej zarówno w rekrutacji enzymów, jak i ich aktywności.

Test koimmunoprecypitacji do badania funkcjonalnych interakcji między receptorami i enzymami

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie sygnalizacji komórkowej, takie jak znaczenie różnych domen białkowych w interakcji enzymów receptorowych i aktywacji enzymatycznej. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona jednoczesne badanie interakcji enzymów receptorowych i funkcjonalnych konsekwencji tych interakcji dla aktywności enzymu. Na każdą płytkę użyj 10 mililitrów DMEM uzupełnionego o 10% FBS i 1% penicylinę oraz streptomycynę.Dzień przed transfekcją wysiewaj ludzkie embrionalne komórki T nerki 293-T na 12 10-centymetrowych płytek za pomocą hemocytometru do policzenia komórek. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% C02. Gdy komórki zlewają się w 80 do 90%, użyj środka do transfekcji na bazie lipidów, aby transfekować pięć płytek.Wykonaj transfekcję zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi komórek przylegających w 10-centymetrowych płytkach. Następnie należy przetoczyć identyczny drugi zestaw pięciu płytek wraz z jedną dodatkową płytką służącą jako nietransfekowana kontrola do pomiaru wyrażonej ilości białka przed immunoprecypitacją. Inkubować transfekowane płytki w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% CO2 przez 48 godzin.Użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby zbadać komórki pod kątem ekspresji GFP i upewnić się, że transfekcja przebiegła pomyślnie. Wymieszaj 15 mikrolitrów 100-milimolowego ortowanadanu sodu z 50 mikrolitrami 30% nadtlenku wodoru, aby przygotować świeżą mieszaninę perwanadatów. Aby fosforylować oznaczone wersje PD-1, usuń pożywkę z komórek transfekowanych PD-1-GFP.Dodaj 10 mililitrów zwykłego DMEM i 10 mikrolitrów perwanadatu do każdej płytki. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie umyj komórki trzy razy w lodowatym PBS, używając pięciu mililitrów PBS na pranie.Podczas wykonywania immunoprecypitacji wszystkie etapy powinny być wykonywane albo na lodzie, albo w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Uzupełnij bufor do lizy inhibitorami proteazy, rozpuszczając jedną tabletkę inhibitorów w 10 mililitrach buforu. Dodać również jeden milimol ortowanaradanu sodu do buforu, który będzie używany na płytkach transfekowanych PD-1-GFP.Dodaj 500 mikrolitrów lodowatego buforu do lizy do komórek, upewniając się, że dodajesz bufor do lizy zawierający ortowanadan sodu tylko do płytek zawierających komórki transfekowane PD-1-GFP. Użyj skrobaka do komórek, aby natychmiast usunąć i zebrać komórki z płytek. Przenieś lizaty do 1,5-mililitrowych zimnych probówek i obracaj je pod kątem 0,005-krotności grawitacji i czterech stopni Celsjusza przez 30 minut.Aby zebrać supernatant post-jądrowy z lizatów, wiruj je w dół w temperaturze 10 000 razy grawitacji i 4 stopni Celsjusza przez 10 minut. Przenieść supernatanty do nowych probówek i wyrzucić osad. Przechowywać supernatanty w drugim zestawie sześciu płytek na lodzie do późniejszej analizy WCL.Aby rozpocząć przygotowywanie kulek anty-GFP, delikatnie potrząśnij butelką zawierającą kulki przed otwarciem, aby zapobiec osiadaniu. Usuń 40 mikrolitrów kulek anty-GFP z gnojowicy na każdy warunek. Wirować przy 500-krotności grawitacji i czterech stopniach Celsjusza przez trzy minuty.Usuń supernatant, aby umyć kulki, upewniając się, że minimalizujesz kontakt pipety z kulkami, aby zapobiec utracie. Ponownie zawiesić kulki w 80 mikrolitrach buforu do lizy na próbkę. Dodać umyte kulki bezpośrednio do lizatu komórkowego z komórek wykazujących ekspresję PD-1-GFP z pierwszego zestawu czterech płytek.Obracaj się z prędkością 0,005 razy większą od grawitacji przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby immunoprecypitować białka znakowane GFP. Umyj kulki trzy razy za pomocą jednego mililitra buforu do lizy na zimno, który nie zawiera ortowanadatu do każdego prania. Następnie odwirować przy 2 500 razy większej grawitacji przez 10 sekund.Podzielić lizat aktywnego SHP2 z pierwszego zestawu płytek na trzy równe porcje i dodać porcję do każdej z trzech probówek zawierających przemyte kulki zawierające PD-1-GFP. Dodać 1/3 objętości lizatu z nietransfekowanych komórek do drugiej probówki z kulkami PD-1-GFP typu dzikiego. Wyrzuć pozostałe 2/3.Inkubuj koraliki przez cztery godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym obrotem przy 0,005-krotności grawitacji. Następnie umyj kulki dwukrotnie, używając jednego mililitra zimnego buforu do lizy na każde pranie. Dodaj 80 mikrolitrów buforu do lizy do każdej próbki, upewniając się, że całkowita objętość w każdej probówce wynosi 100 mikrolitrów.Za pomocą odciętej końcówki pipety delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby wymieszać. Następnie przenieś 50 mikrolitrów z każdej probówki do dwóch, świeżych, 1,5 mililitrowych probówek. Umyj kulki raz buforem do płukania fosfatazy.Następnie całkowicie usunąć supernatant. Dodać 100 mikrolitrów buforu do testu do kulek i inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 30 minut pod delikatnym mieszaniem. Gdy bufor zmieni kolor na żółty, zakończ reakcję, dodając 50 mikrolitrów jednego molowego roztworu wodorotlenku sodu.Wirować przy 2 500-krotności grawitacji przez 10 sekund. Następnie przenieś supernatant do dwóch studzienek o połowie powierzchni na 96-dołkowej płytce. Odczytaj absorbenty w 405 nanometrach i wyraź wyniki jako względną gęstość optyczną w stosunku do kontrolnej wersji PD-1-GFP typu dzikiego.Najpierw obracaj kulki w dół przy 2000 razy grawitacji i czterech stopniach Celsjusza przez 30 sekund i usuń supernatant. Dodaj 20 mikrolitrów dwukrotnego buforu Laemmli i gotuj w 95 stopniach Celsjusza przez pięć minut. Za pomocą zestawu BCA zmierz stężenie białka w kontrolkach wejściowych.Przenieść 30 mikrolitrów najbardziej rozcieńczonej próbki do nowej probówki. Użyć buforu do lizy, aby rozcieńczyć resztę wejściowych kontroli do tego samego stężenia, co najbardziej rozcieńczona próbka. Następnie przenieś 30 mikrolitrów każdego z rozcieńczonych elementów sterujących wejściowych do nowej probówki.Dodaj równe objętości dwukrotnego buforu Laemmli do lizatów i gotuj je w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie wiruj koraliki pod kątem 2000 razy grawitacji i czterech stopni Celsjusza przez 30 sekund przed wykonaniem analizy Western Blot, jak opisano w protokole tekstowym. W tym badaniu opracowano połączony test koimmunoprecypitacji i aktywności enzymatycznej do równoległej oceny interakcji i aktywacji enzymów receptorowych.Nic dziwnego, że SHP2 nie związał się z PD-1, gdy ITSM był zmutowany. Co ciekawe, zmutowana wersja ITIM hamowała wiązanie SHP2 tylko w ograniczonym stopniu. Niemniej jednak test aktywności fosfatazy SHP2 ujawnia, że ITIM i ITSM są równie niezbędne dla aktywności enzymatycznej.Ujawnia to dwuetapowy model aktywacji, w którym SHP2 jest fałdowany do autoinhibicyjnej konformacji w warunkach spoczynku. Po aktywacji PD-1, SHP2 jest rekrutowany do fosforylowanego ITSM. Jednak ITIM musi być również fosforylowany, aby rozwinąć SHP2 do jego aktywnej konformacji.Po opracowaniu technika ta może utorować drogę naukowcom zajmującym się sygnalizacją komórkową do zbadania funkcji domen białkowych w interakcjach receptor-enzym.

co-immunoprecipitation-assay-for-studying-functional-interactions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje koimmunoprecypitowane kompleksy białkowe na membranie PVDF do analizy interakcji białko-białko. Zredukowane białka z kompleksów potraktowano trypsyną w celu rozszczepienia poszczególnych białek na mniejsze peptydy, a następnie pozostałe peptydy wyekstrahowano z błony PVDF. Wyciągnięty peptyd pochodzący z obu białek w kompleksie został następnie wysuszony i ponownie zawieszony w niskim stężeniu kwasu mrówkowego w celu dalszej analizy.

Trawienie białek na błonie w celu przygotowania białek współimmunoprecypitowanych do badań interakcji

W tym filmie demonstrujemy technikę przeprowadzania ko-immunoprecypitacji oznaczonych przez GFP dzikich i zmutowanych białek PD-1 za pomocą koralików pokrytych przeciwciałami anty-GFP. Białka PD-1-GFP związane z kulkami są inkubowane z białkami SHP2, które oddziałują z PD-1, umożliwiając identyfikację określonych motywów strukturalnych w PD-1, które odgrywają kluczową rolę w interakcji SHP2.

Test immunoprecypitacyjny do badania interakcji receptorów enzymatycznych w transfekowanych komórkach

Oligomeryzacja receptora ryanodyny, homo-tetramerycznego kanału jonowego pośredniczącego w uwalnianiu Ca2+ z wewnątrzkomórkowych magazynów, jest krytyczna dla skurczu mięśnia szkieletowego i sercowego. W tym artykule przedstawiono komplementarne metody in vivo i in vitro do wykrywania samoasocjacji białek i wyznaczania stechiometrii homo-oligomerów.

Genetyczne i biochemiczne podejścia do oceny oligomeryzacji białek in vivo i in vitro: studium przypadku receptora ryanodyny

Ustaliliśmy metodę oczyszczania białek interakcji koregulacyjnych za pomocą systemu LC-MS/MS.

Metoda przygotowania białek do wysokoprzepustowej identyfikacji białek oddziałujących z kofaktorem jądrowym za pomocą analizy LC-MS/MS

Tutaj prezentujemy protokół techniki trawienia na błonie do przygotowania próbek do spektrometrii mas. Technika ta ułatwia wygodną analizę oddziaływań białko-białko.

Ocena interakcji białko-białko przy użyciu techniki trawienia na błonie

Ilościowe Multiplex Immunoprecipitation (QMI) wykorzystuje cytometrię przepływową do czułego wykrywania różnic w obfitości docelowych interakcji białko-białko między dwiema próbkami. QMI można wykonać przy użyciu niewielkiej ilości biomateriału, nie wymaga genetycznie modyfikowanych znaczników i może być dostosowany do dowolnej wcześniej zdefiniowanej sieci interakcji białek.

Kwantyfikacja dynamiki sieci interakcji białek za pomocą multipleksowanej koimmunoprecypitacji

Opisany jest proces proteomiki do identyfikacji partnerów interakcji białkowych z frakcji subkomórkowej jądrowej za pomocą wzbogacenia immunopowinowactwa danego białka i bezznacznikowej spektrometrii mas. Przepływ pracy obejmuje frakcjonowanie subkomórkowe, immunoprecypitację, przygotowywanie próbek wspomagane filtrem, oczyszczanie offline, spektrometrię mas i dalszy potok bioinformatyczny.

Bezznacznikowa spektrometria mas immunoprecypitacji do profilowania interaktomii jądrowej na dużą skalę

Interakcje białko-białko są ważne dla wyjaśnienia funkcji docelowych białek, a koimmunoprecypitacja (co-IP) może łatwo potwierdzić IPP. Przejściowo transfekowaliśmy plazmid kodujący białko znakowane epitopem do komórek HEK-293 i opracowaliśmy metodę immunoprecypitacji, aby łatwo potwierdzić wiązanie dwóch białek docelowych.

Immunoprecypitacja za pomocą żelu powinowactwa do znaczników antyepitopowych w celu zbadania interakcji białko-białko

Niniejszy protokół zawiera instrukcje dotyczące selekcji klonalnych linii komórkowych oraz testu bioluminescencji wapniowej w celu analizy relacji struktura-aktywność syntetycznych neuropeptydów stawonogów względem ich pokrewnych receptorów GPCR. Test ten może być wykorzystany do deorfanizacji receptorów oraz badań relacji struktura-aktywność na potrzeby projektowania analogów syntetycznych oraz odkrywania peptydów i potencjalnych leków.

Analiza funkcjonalna receptorów sprzężonych z białkiem G u komarów (Aedes aegypti) i kleszczy (Rhipicephalus microplus) z wykorzystaniem testu bioluminescencji wapniowej

Opracowano nową metodę ewolucji kierowanej, specyficzną dla dziedziny inżynierii termostabilności, a następnie zwalidowano ją dla enzymów bakteriolitycznych. Po zaledwie jednej rundzie mutagenezy losowej ewoluowany enzym bakteriolityczny, PlyC 29C3, wykazał ponad dwukrotnie wyższą aktywność resztkową w porównaniu z białkiem typu dzikiego po inkubacji w podwyższonej temperaturze.

Nowa metoda przesiewowa dla ewolucji sterowanej termostabilnych enzymów bakterio();tycznych

Poznaj metodę koimmunoprecypitacji do badania interakcji receptor-enzym i aktywności enzymatycznej na kulkach. Technika ta pozwala jednocześnie analizować rekrutację i aktywację enzymów w komórkach HEK 293-T.

Test koimmunoprecypitacji do badania funkcjonalnych interakcji między receptorami i enzymami

Przeglądaj więcej filmów