Test koimmunoprecypitacji do badania funkcjonalnych interakcji między receptorami i enzymami

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie sygnalizacji komórkowej, takie jak znaczenie różnych domen białkowych w interakcji enzymów receptorowych i aktywacji enzymatycznej. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona jednoczesne badanie interakcji enzymów receptorowych i funkcjonalnych konsekwencji tych interakcji dla aktywności enzymu. Na każdą płytkę użyj 10 mililitrów DMEM uzupełnionego o 10% FBS i 1% penicylinę oraz streptomycynę.

Dzień przed transfekcją wysiewaj ludzkie embrionalne komórki T nerki 293-T na 12 10-centymetrowych płytek za pomocą hemocytometru do policzenia komórek. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% C02. Gdy komórki zlewają się w 80 do 90%, użyj środka do transfekcji na bazie lipidów, aby transfekować pięć płytek.

Wykonaj transfekcję zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi komórek przylegających w 10-centymetrowych płytkach. Następnie należy przetoczyć identyczny drugi zestaw pięciu płytek wraz z jedną dodatkową płytką służącą jako nietransfekowana kontrola do pomiaru wyrażonej ilości białka przed immunoprecypitacją. Inkubować transfekowane płytki w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% CO2 przez 48 godzin.

Użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby zbadać komórki pod kątem ekspresji GFP i upewnić się, że transfekcja przebiegła pomyślnie. Wymieszaj 15 mikrolitrów 100-milimolowego ortowanadanu sodu z 50 mikrolitrami 30% nadtlenku wodoru, aby przygotować świeżą mieszaninę perwanadatów. Aby fosforylować oznaczone wersje PD-1, usuń pożywkę z komórek transfekowanych PD-1-GFP.

Dodaj 10 mililitrów zwykłego DMEM i 10 mikrolitrów perwanadatu do każdej płytki. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie umyj komórki trzy razy w lodowatym PBS, używając pięciu mililitrów PBS na pranie.

Podczas wykonywania immunoprecypitacji wszystkie etapy powinny być wykonywane albo na lodzie, albo w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Uzupełnij bufor do lizy inhibitorami proteazy, rozpuszczając jedną tabletkę inhibitorów w 10 mililitrach buforu. Dodać również jeden milimol ortowanaradanu sodu do buforu, który będzie używany na płytkach transfekowanych PD-1-GFP.

Dodaj 500 mikrolitrów lodowatego buforu do lizy do komórek, upewniając się, że dodajesz bufor do lizy zawierający ortowanadan sodu tylko do płytek zawierających komórki transfekowane PD-1-GFP. Użyj skrobaka do komórek, aby natychmiast usunąć i zebrać komórki z płytek. Przenieś lizaty do 1,5-mililitrowych zimnych probówek i obracaj je pod kątem 0,005-krotności grawitacji i czterech stopni Celsjusza przez 30 minut.

Aby zebrać supernatant post-jądrowy z lizatów, wiruj je w dół w temperaturze 10 000 razy grawitacji i 4 stopni Celsjusza przez 10 minut. Przenieść supernatanty do nowych probówek i wyrzucić osad. Przechowywać supernatanty w drugim zestawie sześciu płytek na lodzie do późniejszej analizy WCL.

Aby rozpocząć przygotowywanie kulek anty-GFP, delikatnie potrząśnij butelką zawierającą kulki przed otwarciem, aby zapobiec osiadaniu. Usuń 40 mikrolitrów kulek anty-GFP z gnojowicy na każdy warunek. Wirować przy 500-krotności grawitacji i czterech stopniach Celsjusza przez trzy minuty.

Usuń supernatant, aby umyć kulki, upewniając się, że minimalizujesz kontakt pipety z kulkami, aby zapobiec utracie. Ponownie zawiesić kulki w 80 mikrolitrach buforu do lizy na próbkę. Dodać umyte kulki bezpośrednio do lizatu komórkowego z komórek wykazujących ekspresję PD-1-GFP z pierwszego zestawu czterech płytek.

Obracaj się z prędkością 0,005 razy większą od grawitacji przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby immunoprecypitować białka znakowane GFP. Umyj kulki trzy razy za pomocą jednego mililitra buforu do lizy na zimno, który nie zawiera ortowanadatu do każdego prania. Następnie odwirować przy 2 500 razy większej grawitacji przez 10 sekund.

Podzielić lizat aktywnego SHP2 z pierwszego zestawu płytek na trzy równe porcje i dodać porcję do każdej z trzech probówek zawierających przemyte kulki zawierające PD-1-GFP. Dodać 1/3 objętości lizatu z nietransfekowanych komórek do drugiej probówki z kulkami PD-1-GFP typu dzikiego. Wyrzuć pozostałe 2/3.

Inkubuj koraliki przez cztery godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym obrotem przy 0,005-krotności grawitacji. Następnie umyj kulki dwukrotnie, używając jednego mililitra zimnego buforu do lizy na każde pranie. Dodaj 80 mikrolitrów buforu do lizy do każdej próbki, upewniając się, że całkowita objętość w każdej probówce wynosi 100 mikrolitrów.

Za pomocą odciętej końcówki pipety delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby wymieszać. Następnie przenieś 50 mikrolitrów z każdej probówki do dwóch, świeżych, 1,5 mililitrowych probówek. Umyj kulki raz buforem do płukania fosfatazy.

Następnie całkowicie usunąć supernatant. Dodać 100 mikrolitrów buforu do testu do kulek i inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 30 minut pod delikatnym mieszaniem. Gdy bufor zmieni kolor na żółty, zakończ reakcję, dodając 50 mikrolitrów jednego molowego roztworu wodorotlenku sodu.

Wirować przy 2 500-krotności grawitacji przez 10 sekund. Następnie przenieś supernatant do dwóch studzienek o połowie powierzchni na 96-dołkowej płytce. Odczytaj absorbenty w 405 nanometrach i wyraź wyniki jako względną gęstość optyczną w stosunku do kontrolnej wersji PD-1-GFP typu dzikiego.

Najpierw obracaj kulki w dół przy 2000 razy grawitacji i czterech stopniach Celsjusza przez 30 sekund i usuń supernatant. Dodaj 20 mikrolitrów dwukrotnego buforu Laemmli i gotuj w 95 stopniach Celsjusza przez pięć minut. Za pomocą zestawu BCA zmierz stężenie białka w kontrolkach wejściowych.

Przenieść 30 mikrolitrów najbardziej rozcieńczonej próbki do nowej probówki. Użyć buforu do lizy, aby rozcieńczyć resztę wejściowych kontroli do tego samego stężenia, co najbardziej rozcieńczona próbka. Następnie przenieś 30 mikrolitrów każdego z rozcieńczonych elementów sterujących wejściowych do nowej probówki.

Dodaj równe objętości dwukrotnego buforu Laemmli do lizatów i gotuj je w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie wiruj koraliki pod kątem 2000 razy grawitacji i czterech stopni Celsjusza przez 30 sekund przed wykonaniem analizy Western Blot, jak opisano w protokole tekstowym. W tym badaniu opracowano połączony test koimmunoprecypitacji i aktywności enzymatycznej do równoległej oceny interakcji i aktywacji enzymów receptorowych.

Nic dziwnego, że SHP2 nie związał się z PD-1, gdy ITSM był zmutowany. Co ciekawe, zmutowana wersja ITIM hamowała wiązanie SHP2 tylko w ograniczonym stopniu. Niemniej jednak test aktywności fosfatazy SHP2 ujawnia, że ITIM i ITSM są równie niezbędne dla aktywności enzymatycznej.

Ujawnia to dwuetapowy model aktywacji, w którym SHP2 jest fałdowany do autoinhibicyjnej konformacji w warunkach spoczynku. Po aktywacji PD-1, SHP2 jest rekrutowany do fosforylowanego ITSM. Jednak ITIM musi być również fosforylowany, aby rozwinąć SHP2 do jego aktywnej konformacji.

Po opracowaniu technika ta może utorować drogę naukowcom zajmującym się sygnalizacją komórkową do zbadania funkcji domen białkowych w interakcjach receptor-enzym.