Test amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP) dla wirusa Zika i genów porządkowych w próbkach moczu, surowicy i komarów
14 września 2018
Ten protokół zapewnia skuteczną i tanią metodę wykrywania wirusa Zika lub celów kontrolnych w próbkach ludzkiego moczu i surowicy lub u komarów za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP). Ta metoda nie wymaga izolacji RNA i można ją wykonać w ciągu 30 minut.
Ta metoda może szybko określić, czy próbki zawierają wirusa Zika. Jest to przydatne dla kobiet w ciąży, par starających się o dziecko lub nadzoru nad lokalnymi populacjami komarów, które są zagrożone zakażeniem wirusem Zika. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest szybka, łatwa, nie wymaga drogiego sprzętu i może być wykonana bez etapu izolacji RNA.
Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku diagnozowania zakażenia wirusem Zika, ponieważ zakażenie w czasie ciąży wiąże się z poronieniem, urodzeniem martwego dziecka i innymi poważnymi wrodzonymi, neurologicznymi wadami wrodzonymi. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w wirusa Zika, może być również stosowana do innych chorób zakaźnych, takich jak denga, chikungunya lub wirus Zachodniego Nilu, przy użyciu starterów specyficznych dla wirusa. Na początek rozpuść każdy starter RT-LAMP w wodzie molekularnej do końcowego stężenia 100 mikromolowych.
Krótko zmieszaj roztwór podkładu, aby upewnić się, że roztwór jest jednorodny. Wirować przez około pięć sekund z maksymalną prędkością, aby zebrać roztwór startera. Następnie przygotuj 10-krotną mieszankę podkładów RT-LAMP, jak opisano w tabeli drugiej protokołu technicznego.
Krótko wirować, aby zapewnić jednorodność. I odwiruj krótko z maksymalną prędkością, aby uniknąć strat. Przechowuj podkłady w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza między użyciami, unikając cykli zamrażania i rozmrażania.
W przypadku próbek moczu ludzkiego należy użyć moczu świeżego, moczu zamrożonego lub moczu w środku konserwującym. Przed użyciem rozmrozić zamrożone próbki na lodzie. Próbki surowicy ludzkiej powinny być świeże lub zamrożone, podczas gdy linie komórkowe zakażone ZIKV powinny zawierać kondycjonowane pożywki lub lizaty komórkowe.
Wreszcie, w przypadku komarów Aedes aegypti należy używać całych tusz, świeżych lub mrożonych. Rozmrozić zamrożone zwłoki komarów na lodzie. Umieść pojedynczego komara w 100 mikrolitrach PBS.
Za pomocą końcówki pipety P10 zmiażdż komara 10 razy i zhomogenizuj go, aby uzyskać surowy lizat komarów. Krótko odwirować surowy lizat w celu osadzenia wszelkich zanieczyszczeń i użyć supernatantu do dalszej analizy RT-LAMP. Na początek należy przygotować reakcję mieszania wzorcowego RT-LAMP na lodzie dla każdego zestawu starterów, który ma być użyty, zgodnie z tabelą trzecią w protokole technicznym.
Każdą próbkę należy odwirować, aby upewnić się, że jest dobrze wymieszana. Następnie krótko je obróć, aby zapobiec utracie głośności. Dla każdej reakcji odpipetować 23,0 mikrolitrów wzorca RT-LAMP w probówce do PCR o pojemności 200 mikrolitrów.
Następnie dodaj dwa mikrolitry próbki, aby uzyskać całkowitą objętość do 25,0 mikrolitrów. Użyj wody molekularnej do kontroli ujemnej i upewnij się, że uwzględniłeś kontrolę pozytywną. Opcjonalnie należy uwzględnić reakcję kontroli swoistości pokrewnego arbowirusa, takiego jak wirus dengi, zgodnie z opisem w protokole technicznym.
Za pomocą bloku grzewczego, łaźni wodnej lub termocyklera podgrzewaj próbki w temperaturze 61 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie zwiększ ogień do 80 stopni Celsjusza na 10 minut, aby ciepło dezaktywować polimerazę. Wykonaj analizę RT-LAMP w oddzielnej, zamkniętej przestrzeni.
Rozcieńczyć fluorescencyjny barwnik kwasu nukleinowego od jednego do dziesięciu w buforze TAE. Dodać dwa mikorlitery fluorescencyjnego roztworu barwnika kwasu nukleinowego do 12 mikorliterów reakcji RT-LAMP. Oceń reakcje RT-LAMP wizualnie, szukając obecności zmiany koloru.
Opcjonalnie użyj aparatu, aby zrobić zdjęcia reakcji RT-LAMP na białym tle. Następnie umieść próbki pod światłem UV o długości fali 302 nanometrów, aby potwierdzić obecność produktów RT-LAMP metodą fluorescencji. Użyj aparatu, aby zrobić zdjęcie wyniku.
Aby rozpocząć wykonywanie elektroforezy, wlej 2% żel agarozowy do 1x buforu TAE z barwnikiem kwasu nukleinowego w celu wizualizacji. Dodaj pięć mikrolitrów drabiny DNA na pierwszym pasie, aby porównać masy cząsteczkowe. Dla każdej reakcji RT-LAMP należy zmieszać 13 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej RT-LAMP z dwoma mikrolitrami barwnika ładującego DNA.
Załaduj tę mieszaninę o pojemności 15 mikrolitrów. Uruchom żel pod napięciem 90 V przez 90 minut lub do momentu rozdzielenia pasków. Obraz ze światłem UV o długości fali 302 nm.
Po zakończeniu wyrzuć reakcje RT-LAMP do podwójnie zamkniętych worków. W tym badaniu wykorzystano trzy różne metody analizy reakcji RT-LAMP. Podczas stosowania barwnika fluorescencyjnego kwasu nukleinowego pozytywne reakcje stają się żółto-zielone, podczas gdy negatywne reakcje pojawiają się na pomarańczowo.
Barwnik ten powoduje również sygnał fluorescencyjny, gdy próbki są wzbudzane przez światło UV. Wreszcie, reakcje RT-LAMP można przeprowadzić na żelu agarozowym. Pozytywne reakcje RT-LAMP będą miały wzór prążkowy, podczas gdy negatywne reakcje nie będą miały prążków DNA.
Metody te stosuje się w celu wykazania specyficzności reakcji ZIKV RT-LAMP. Tylko kontrola molekularna ZIKV ma dodatnią reakcję RT-LAMP. Ponadto, podczas gdy ZIKV jest wykrywany zarówno w moczu, jak i surowicy pacjenta ze stwierdzonym zakażeniem ZIKV, nie obserwuje się go u bezobjawowego pacjenta kontrolnego bez zakażenia ZIKV.
Próbki są następnie badane na obecność ludzkiego 18S rRNA. Tylko próbki pobrane od pacjentów są dodatnie dla 18S rRNA. Próbki komarów mogą być podobnie badane pod kątem ZIKV lub kontroli jakości RT-LAMP AEDAE.
Tylko dodatnia kontrola molekularna dla ZIKV i komara zakażonego ZIKV są postrzegane jako dodatnie dla ZIKV. Jednak wszystkie komary są pozytywne dla AEDAE firmy RT-LAMP. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż 30 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Ważne jest, aby pamiętać, że reakcje RT-LAMP są podatne na fałszywie dodatnie reakcje. Kroki zapobiegawcze obejmują stosowanie termolabilnej glikozylazy DNA uracylu w reakcjach, stosowanie bocznego przepływu pracy, przeprowadzanie analizy w oddzielnej przestrzeni oraz skracanie czasu otwarcia probówek po amplifikacji. Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak QPCR, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak liczba kopii wirusa lub innych celów obecnych w próbce.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać RT-LAMP do wykrywania wirusa Zika i zwalczania celów w ludzkim moczu i surowicy, a także u komarów. Nie zapominaj, że praca z wirusem Zika i barwieniem kwasami nukleinowymi może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek. Biorąc pod uwagę związek zakażenia wirusem Zika z wadami wrodzonymi, kobiety w ciąży, starające się o dziecko lub partnerzy tych kobiet powinni znacznie zminimalizować swoje narażenie laboratoryjne na wirusa Zika.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia szybką i kosztowo efektywną metodę wykrywania wirusa Zika w ludzkim moczu, próbkach surowicy lub komarach z wykorzystaniem izotermicznej amplifikacji zapętlonej z odwrotną transkrypcją (RT-LAMP). Technika ta jest korzystna, ponieważ nie wymaga izolacji RNA i może zostać przeprowadzona w około 30 minut.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Wirusologia
- Choroby zakaźne
- Techniki diagnostyczne
Wstęp
- Wirus Zika stwarza znaczne zagrożenie dla zdrowia, szczególnie w czasie ciąży.
- Infekcja może prowadzić do ciężkich wad wrodzonych i neurologicznych.
- Obecne metody diagnostyczne mogą być czasochłonne i kosztowne.
- Metoda RT-LAMP stanowi szybką alternatywę w wykrywaniu wirusa Zika.
Cel badania
- Zapewnienie szybkiego narzędzia diagnostycznego do wykrywania wirusa Zika.
- Ułatwienie monitorowania populacji komarów narażonych na Zika.
- Wsparcie zdrowia reprodukcyjnego poprzez pomoc w diagnozowaniu zakażeń Zika.
Zastosowane metody
- Izotermiczna amplifikacja zapętlona z odwrotną transkrypcją (RT-LAMP).
- Analiza próbek pochodzących z ludzkiego moczu, surowicy oraz komarów.
- Wykorzystanie specyficznych dla wirusa starterów w celu detekcji.
- Krótki czas przetwarzania wynoszący około 30 minut.
Główne wyniki
- Wydajna detekcja wirusa Zika w różnych typach próbek.
- Metoda wykazująca łatwość w obsłudze oraz efektywność kosztową.
- Brak wymogu izolacji RNA upraszcza cały proces.
- Potencjalna możliwość zastosowania w przypadku innych wirusów, takich jak wirus dengi i chikungunya.
Wnioski
- RT-LAMP jest obiecującym narzędziem do szybkiej diagnostyki wirusa Zika.
- Metoda ta może usprawnić działania nadzorowe w odniesieniu do wirusa Zika i wirusów pokrewnych.
- Dalsze badania mogą rozszerzyć jej zastosowanie na inne choroby zakaźne.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Szybka detekcja wirusa Zika w próbkach klinicznych i wektorowych, niewymagająca specjalistycznej aparatury, wspomaga wczesną interwencję w obszarze zdrowia reprodukcyjnego oraz nadzór nad ogniskami epidemicznymi. Metoda RT-LAMP umożliwia zdecentralizowane testowanie bez konieczności ekstrakcji RNA, co skraca czas oczekiwania na wynik i zmniejsza obciążenie infrastrukturalne. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów dla opracowywania leków przeciwwirusowych oraz strategii kontroli wektorów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia funkcjonalną analizę obecności wirusa w ludzkich płynach ustrojowych i tkankach komarów w celu potwierdzenia związania z celem.
- Wartość operacyjna: Eliminuje etap izolacji RNA, upraszczając proces wysokoprzepustowego przesiewu próbek klinicznych.
- Wartość prognostyczna: Zapewnia odczyt jakościowy służący do segregacji próbek pod kątem dalszej kwantyfikacji lub sekwencjonowania.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Wykorzystuje startery specyficzne dla wirusa do detekcji ZIKV z wykazaną swoistością względem kontroli bezobjawowych oraz powiązanych arbowirusów.
- Wartość operacyjna: Kompatybilność z detekcją wizualną poprzez zmianę koloru lub fluorescencję UV, co umożliwia zastosowanie formatów testów w warunkach ograniczonych zasobów.
- Skalowalność: Wspiera testowanie pulowe homogenatów komarów w zastosowaniach nadzorowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wykrywa ZIKV w moczu i surowicy zakażonych pacjentów, co potwierdza znaczenie kliniczne dla oceny ryzyka transmisji pionowej.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje geny housekeepingowe (18S rRNA u ludzi, aktynę u komarów) jako kontrole wewnętrzne w celu walidacji integralności próbek.
- Wartość prognostyczna: Umożliwia długoterminowe monitorowanie dynamiki ładunku wirusowego w systemach modelowych bez konieczności inwazyjnego pobierania próbek.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda RT-LAMP wpisuje się w kontinuum badawcze, począwszy od wstępnej weryfikacji hipotez w biologii wektorów, aż po przedkliniczną ocenę kandydatów na leki przeciwwirusowe, szczególnie w sytuacjach wymagających szybkiej segregacji próbek.
- Biologia odkryć: Wspiera walidację celu poprzez potwierdzenie obecności wirusa w próbkach moczu, surowicy i komarów w celu zbadania dróg transmisji.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie próbek gotowych do analizy z odczytem wizualnym lub fluorescencyjnym, co zapewnia kompatybilność z wysokoprzepustowymi metodami analizy.
- Analityka: Generuje dane binarne (dodatnie/ujemne) i półilościowe za pomocą elektroforezy w żelu do analizy porównawczej warunków.
- Badania translacyjne: Łączy detekcję w próbkach ludzkich z badaniami mechanistycznymi nad ryzykiem wrodzonym w modelach przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Schemat projektowania starterów pozwala na szybką adaptację do pojawiających się arbowirusów (np. dengi, chikungunya) przy użyciu tego samego podstawowego protokołu.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w detekcji wirusów poprzez zapewnienie specyficznego odczytu bez konieczności użycia specjalistycznego sprzętu.
- Wartość operacyjna: umożliwia zdecentralizowane testowanie przy minimalnym oprzyrządowaniu (blok grzewczy lub łaźnia wodna).
- Wartość strategiczna: przyspiesza podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w przesiewaniu leków przeciwwirusowych poprzez szybkie potwierdzenie modulacji celu.
- Wpływ na portfolio: wspiera priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka na podstawie zaangażowania celu w matrycach istotnych klinicznie.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza z zakresu biologii molekularnej w obszarze projektowania starterów i postępowania z kwasami nukleinowymi.
- Wymagane jest urządzenie do inkubacji termicznej (61°C przez 30 min, 80°C przez 10 min) oraz transiluminator UV do walidacji.
- Wymagany jest rozdzielony proces pracy w celu zapobiegania kontaminacji amplikonami i wynikom fałszywie dodatnim.
- Wymagana jest optymalizacja dla różnych typów próbek (mocz, surowica, lizat komórek komara) w celu uwzględnienia inhibitorów.
- Metoda ogranicza się do wyników jakościowych lub półilościowych, chyba że zostanie połączona z qPCR w celu kwantyfikacji ładunku wirusowego.
