Name: Test amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP) dla wirusa Zika i genów porządkowych w próbkach moczu, surowicy i komarów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Poznaj metodę RT-LAMP do szybkiej detekcji wirusa Zika w moczu, surowicy i komarach bez izolacji RNA. Ta technika umożliwia tanie i efektywne diagnozowanie zakażeń w ciągu 30 minut.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez filantropijny wkład rodziny Maureen i Ronalda Hirschów oraz Field Neurosciences Institute, St. Mary's of Michigan. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu. Dziękujemy również dr Bernadette Zwaans i Elijahowi Wardowi za ich krytyczną recenzję manuskryptu.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board (IRB) Beaumont Health. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami.
UWAGA: Wszystkie potencjalnie zakaźne materiały powinny być obsługiwane zgodnie ze standardami bezpieczeństwa biologicznego na poziomie 2, w tym przy użyciu środków ochrony osobistej. Wszelkie procedury, które mogą powodować powstawanie aerozolu, powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Dodatkowo praca z żywymi komarami powinna być wykonywana w odpowiednim obiekcie o poziomie hermetyzacji stawonogów 1-3. Biorąc pod uwagę związek zakażenia ZIKV z wadami wrodzonymi, kobiety w ciąży, starające się o dziecko lub partnerzy tych kobiet powinni znacznie zminimalizować narażenie laboratoryjne na ZIKV. Transport próbek ZIKV jest klasyfikowany w Stanach Zjednoczonych jako substancje biologiczne kategorii B zgodnie z przepisami Departamentu Transportu dotyczącymi materiałów niebezpiecznych (49 CFR część 171-180), dlatego wysyłka próbek powinna być zgodna z tymi wytycznymi. Import do Stanów Zjednoczonych próbek biologicznych ZIKV wymaga zezwolenia na import Centrów Kontroli i Prewencji Chorób (CDC). Import jakichkolwiek stawonogów, które mogą służyć jako wektor transmisji ZIKV, nawet jeśli nie są zainfekowane, wymaga zezwolenia Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (USDA). Informacje te są aktualne w momencie publikacji. Aktualne zalecenia można znaleźć na stronie https://www.cdc.gov/zika/laboratories/lab-safety.html.
UWAGA: Reakcje RT-LAMP są podatne na wyższe wskaźniki fałszywych pozytywnych reakcji, więc należy podjąć środki ostrożności w planowaniu eksperymentalnym. Wszystkie ustawienia i przeprowadzanie reakcji RT-LAMP powinno odbywać się przy użyciu wyznaczonych pipet i końcówek filtrujących. Idealnie byłoby, gdyby został ustalony boczny przepływ pracy. Jeśli to możliwe, analiza i obrazowanie (sekcja 5) powinny odbywać się w oddzielnym, zamkniętym pomieszczeniu, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Otwieranie probówek zawierających produkty RT-LAMP powinno być ograniczone do minimum.
1. Przygotowanie podkładu RT-LAMP
<ol>
	<li>Rozpuść każdy liofilizowany starter RT-LAMP w wodzie molekularnej do końcowego stężenia 100 μM (Tabela 1). Krótko zmieszaj roztwór startera, aby zapewnić jednorodny roztwór, a następnie krótko odwiruj roztwór z maksymalną prędkością w wirówce stołowej, aby zebrać cały roztwór startera.</li>
	<li>Przygotuj 10-krotną mieszankę podkładów FIP, BIP, F3, B3, LF i LB RT-LAMP, korzystając z objętości podanych w Tabeli 2. Krótko zmieszaj roztwór startera, aby uzyskać jednorodny roztwór, i krótko odkręć roztwór z maksymalną prędkością w wirówce stołowej, aby uniknąć strat. 
	UWAGA: Zestaw starterów RT-LAMP dla aktyny Ae. aegypti (AEDAE) nie zawiera startera LB (startery pętlowe nie zawsze są konieczne w reakcjach RT-LAMP). W takim przypadku zastąp objętość startera LB wodą o jakości cząsteczkowej.</li>
	<li>Przechowuj podkłady w temperaturze -20 °C między użyciami i unikaj cykli swobodnego rozmrażania.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>W przypadku próbek moczu ludzkiego: Użyj świeżego moczu, zamrożonego moczu lub moczu w środku konserwującym. W przypadku próbki świeżej lub mrożonej: natychmiast po pobraniu próbki należy odwirowywać przez 10 minut w temperaturze 700 x g i użyć supernatantu do analizy lub zamrozić w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości. Przed użyciem rozmrozić zamrożone próbki na lodzie.</li>
	<li>W przypadku próbek surowicy ludzkiej: Należy użyć świeżych lub mrożonych próbek surowicy.</li>
	<li>W przypadku linii komórkowych zakażonych wirusem ZIKV: Należy użyć kondycjonowanych pożywek lub lizatów komórkowych. 
	UWAGA: Media kondycjonowane bezkomórkowo firmy Ae. Komórki albopictus C6/36 8 dni po zakażeniu mogą być stosowane jako kontrola pozytywna reakcji ZIKV RT-LAMP.</li>
	<li>W przypadku komarów Ae. aegypti: Należy użyć całych świeżych lub mrożonych tusz komarów. Rozmrozić zamrożone komary na lodzie. Przygotuj surowy lizat komarów, umieszczając pojedynczego komara w 100 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i homogenizuj, miażdżąc komara 10 razy za pomocą końcówki pipety P10 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Krótko odwirować surowy lizat, aby osadzać wszelkie zanieczyszczenia. Użyć supernatantu do dalszej analizy RT-LAMP. 
	Uwaga: Kontrole pozytywne można wytworzyć w warunkach laboratoryjnych poprzez zakażenie samic komarów za pomocą mikroiniekcji doklatkowej z około 103 odpowiednikami genomu wirusa w objętości 200 nL i pobraniem komara 5 dni po zakażeniu.</li>
</ol>
3. Przygotuj RT-LAMP Master Mix
<ol>
	<li>Przygotować reakcję mieszania wzorcowego RT-LAMP na lodzie dla każdego zestawu podkładów, który ma być użyty, korzystając z przewodnika objętości w tabeli 3. 
	UWAGA: Stosowanie termolabilnej glikozylazy DNA uracylu (UDG) pomaga w zapobieganiu fałszywie dodatnim wynikom.</li>
	Krótko przemieszać<li>, aby upewnić się, że wszystkie próbki są dobrze wymieszane, a następnie krótko odwirować, aby zapobiec utracie objętości.</li>
</ol>
4. Test RT-LAMP
<ol>
	<li>Odpipetować 23,0 μl mieszanki wzorcowej RT-LAMP na reakcję do probówki PCR o pojemności 200 μl. Dodać 2,0 μl próbki (mocz, surowica lub surowy supernatant lizatu komarów, jak opisano w kroku 2). Dzięki temu całkowita objętość wyniesie 25,0 μl na reakcję RT-LAMP. Do kontroli ujemnej należy użyć wody molekularnej. Uwzględnij kontrolę pozytywną. 
	UWAGA: Jako kontrolę pozytywną można użyć wzorca PCR lub zapasów wirusa z supernatantu zakażonych linii komórkowych.
	<ol>
		<li>Opcjonalnie: należy uwzględnić reakcję kontroli swoistości pokrewnego arbowirusa, takiego jak wirus dengi (DENV). Przygotuj próbkę zgodnie z opisem w kroku 2 w zależności od typu próbki. Dodać 2,0 μl kontroli swoistości do 23,0 μl mieszanki wzorcowej RT-LAMP do probówki PCR o pojemności 200 μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podgrzewać próbki w temperaturze 61 °C przez 30 minut za pomocą bloku grzewczego, łaźni wodnej lub termocyklera.</li>
	<li>Dezaktywować polimerazę na gorąco przez ogrzewanie do 80 °C przez 10 min.</li>
</ol>
5. Analiza RT-LAMP
UWAGA: Przeprowadź analizę RT-LAMP w oddzielnej, zamkniętej przestrzeni.
<ol>
	<li>Po inkubacji uzyskaj wizualny dostęp do reakcji RT-LAMP, szukając obecności zmiany koloru.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć barwnik fluorescencyjnego kwasu nukleinowego w stosunku 1:10 w buforze TAE (40 mM Tris, 20 mM kwas octowy, 1 mM EDTA). 
		UWAGA: Każda plama z kwasu nukleinowego wiąże się z kwasami nukleinowymi i dlatego jest czynnikiem rakotwórczym. Podczas obsługi należy nosić rękawice.</li>
		<li>Do 12 μl reakcji RT-LAMP dodać 2 μl fluorescencyjnego rozcieńczenia barwnika kwasem nukleinowym. 
		UWAGA: Negatywne reakcje będą koloru pomarańczowego, a pozytywne będą koloru żółto-zielonego.</li>
		<li>Opcjonalnie: Zrób zdjęcia reakcji RT-LAMP na białym tle za pomocą aparatu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść próbki w świetle UV o długości fali 302 nm, aby potwierdzić obecność produktów RT-LAMP metodą fluorescencji. Zrób zdjęcie wyniku za pomocą aparatu. 
	UWAGA: Dodatnie reakcje RT-LAMP będą miały moc fluorescencyjną. 
	UWAGA: Podczas pracy ze światłem UV należy nosić okulary chroniące przed promieniowaniem UV lub osłonę twarzy.</li>
	<li>Opcjonalnie: Potwierdź obecność produktów RT-LAMP, wykonując elektroforezę żelową na próbkach.
	<ol>
		<li>Wlej 2% żel agarozowy do 1x bufor TAE z barwnikiem kwasu nukleinowego w celu wizualizacji. 
		UWAGA: Każda plama z kwasu nukleinowego wiąże się z kwasami nukleinowymi i dlatego jest czynnikiem rakotwórczym. Podczas obsługi należy nosić rękawice.</li>
		<li>Dodaj 5 μl drabinki DNA w pierwszym pasie, aby porównać masy cząsteczkowe.</li>
		<li>Dla każdej reakcji RT-LAMP zmieszać 13 μl mieszaniny reakcyjnej RT-LAMP z 2 μl barwnika ładującego DNA. Załadować 15 μl mieszaniny zawierającej barwnik ładujący DNA.</li>
		<li>Uruchom żel pod napięciem 90 V przez 90 minut lub do momentu, gdy pasma zostaną rozdzielone i zobrazuj światłem UV 302 nm. 
		UWAGA: Pozytywne reakcje RT-LAMP będą miały wzorzec drabinkowy. Ujemne reakcje RT-LAMP nie powinny zawierać żadnych prążków.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Utylizacja
<ol>
	<li>Reakcje RT-LAMP należy utylizować w podwójnie zamkniętych workach. Nie należy sterylizować w autoklawie, ponieważ może to spowodować rozpylenie produktów RT-LAMP, prowadząc do fałszywie dodatnich reakcji w przyszłości.</li>
</ol>

<ol><li>Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. <a target="_blank" href="https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra1602113">Zika Virus.</a> New England Journal of Medicine. 374 (16), 1552-1563 (2016).</li>
<li>Francois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+European+Microbiological+Societies+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications.</a> Federation of European Microbiological Societies Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).</li>
<li>Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29+of+gene+sequences+and+simple+visual+detection+of+products%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.</a> Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).</li>
<li>Gandasegui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rapid-Heat+LAMPellet+Method%3A+A+Potential+Diagnostic+Method+for+Human+Urogenital+Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">The Rapid-Heat LAMPellet Method: A Potential Diagnostic Method for Human Urogenital Schistosomiasis.</a> Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 9 (7), 0003963(2015).</li>
<li>Barkway, C. P., Pocock, R. L., Vrba, V., Blake, D. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25741643">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the species-specific detection of Eimeria that infect chickens.</a> The Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li>
<li>Lamb, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Detection+of+Zika+Virus+in+Urine+Samples+and+Infected+Mosquitos+by+Reverse+Transcription-Loop-Mediated+Isothermal+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rapid Detection of Zika Virus in Urine Samples and Infected Mosquitos by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3803(2018).</li>
<li>Faye, O., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18674965">One-step RT-PCR for detection of Zika virus.</a> Journal of Clinical Virology. 43 (1), 96-101 (2008).</li>
<li>Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+inhibitors+-+occurrence%2C+properties+and+removal%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">PCR inhibitors - occurrence, properties and removal.</a> Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).</li>
<li>Poole, C. B., Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C., Carlow, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+brugian+filariasis+by+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of brugian filariasis by loop-mediated isothermal amplification.</a> Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 6 (12), 1948(2012).</li>
<li>Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+multiple+target+detection+in+real-time+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification.</a> Biotechniques. 53 (2), 81-89 (2012).</li>
<li>Chan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+Affordable+and+Portable+Medium-Throughput+Molecular+Device+for+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rapid, Affordable and Portable Medium-Throughput Molecular Device for Zika Virus.</a> Scientific Reports. 6, 38223(2016).</li>
<li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+Highly+Sensitive+Molecular+Diagnosis+of+Zika+Virus+by+Lateral+Flow+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays.</a> Analytical Chemistry. 88 (24), 12272-12278 (2016).</li>
<li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-Cost+Detection+of+Zika+Virus+Using+Programmable+Biomolecular+Components%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li>
<li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instrument-Free+Point-of-Care+Molecular+Detection+of+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus.</a> Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).</li>
<li>Yaren, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point+of+sampling+detection+of+Zika+virus+within+a+multiplexed+kit+capable+of+detecting+dengue+and+chikungunya%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya.</a> BioMed Central Infectious Diseases. 17 (1), 293(2017).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+detection+of+Zika+virus+by+reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification.</a> Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).</li>
<li>Priye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+smartphone-based+diagnostic+platform+for+rapid+detection+of+Zika%2C+chikungunya%2C+and+dengue+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A smartphone-based diagnostic platform for rapid detection of Zika, chikungunya, and dengue viruses.</a> Scientific Reports. 7, 44778(2017).</li>
</ol>

LEL i MBC posiadają własność intelektualną dotyczącą metod diagnozowania wirusa Zika. Pozostali autorzy nie mają sprzecznych interesów.

Test ZIKV RT-LAMP opisany w tym artykule działa przy użyciu zarówno próbek od ludzi, jak i komarów6. Granica wykrywalności wynosiła około 1 ekwiwalent genomu6, co powinno wystarczyć, ponieważ typowe miano wirusa u objawowego pacjenta zakażonego ZIKV wynosi 103 do 106 PFU/ml7. Ponadto metoda ta może wykrywać ZIKV w próbkach bez uprzedniego wyizolowania RNA i bez amplifikacji wirusa w hodowli komórkowej. To znacznie skr...

W 2015 roku wirus Zika (ZIKV) zyskał światową uwagę jako choroba zakaźna budząca obawy, ponieważ infekcja w czasie ciąży była powiązana z poronieniem, urodzeniem martwego dziecka, ciężkimi neurologicznymi wadami wrodzonymi, w tym małogłowiem, a także innymi wrodzonymi wadami wrodzonymi1. W rzadkich przypadkach ZIKV jest związany z zespołem Guillaina-Barrégo. ZIKV jest przenoszony głównie przez komary Aedes; Jednak może być również rozprzestrzeniany poprzez kontakt seksualny1. Biorąc pod uwagę, że zakażenie wirusem ZIKV przebiega bezobjawowo u większości osób lub objawia się łagodnymi objawami grypopodobnymi, które pokrywają się z objawami infekcji innymi arborwirusami1, istniała potrzeba ulepszenia metod szybkiego i opłacalnego wykrywania ZIKV w celu badania przesiewowego zarówno ludzi, jak i lokalnych populacji komarów.
Ilościowy PCR z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR) jest niezawodnym testem do wykrywania ZIKV; jednak ta technika wymaga drogiego specjalistycznego sprzętu, wyszkolonego personelu i izolacji RNA od interesującej nas próbki. Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP) to jednoetapowa metoda amplifikacji kwasów nukleinowych oparta na technologii PCR, która wymaga tylko jednej temperatury inkubacji ze względu na zastosowanie termofilnej polimerazy DNA o właściwościach przemieszczenia nici. Pozwala to obejść potrzebę stosowania termocyklera i skrócić czas potrzebny na wykonanie testu. Dodatkowymi zaletami RT-LAMP są wysoka specyficzność i czułość, wytrzymałość w zakresie poziomów pH i temperatur oraz odporność na wiele inhibitorów PCR2. Ma stosunkowo niski koszt, a odczynniki są stabilne w temperaturze pokojowej. Biorąc pod uwagę te cechy, RT-LAMP może być stosowany w laboratorium lub w terenie. W związku z tym reakcje LAMP zostały opracowane w celu wykrywania szeregu patogenów i innych rodzajów infekcji3,4,5. Celem protokołu RT-LAMP opisanego w tym artykule jest wykrycie ZIKV bez izolacji RNA w próbkach ludzkiej surowicy i moczu, a także u pojedynczego zakażonego komara w ciągu 30 minut za pomocą RT-LAMP. Metoda ta może być stosowana do zastąpienia qRT-PCR, ponieważ jest to czułe, szybkie narzędzie diagnostyczne, które działa szybko i w warunkach poza laboratorium.

<table><tbody><tr><td>Bst 2.0 Polimeraza DNA WarmStart</td><td>New England Biolabs</td><td>M0537S</td> Bufor do amplifikacji izotermicznej<td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B0537S</td><td></td></tr><tr><td>WarmStart RTx Odwrotna transkryptaza</td><td>New England Biolabs</td><td>M0380S</td><td></td></tr><tr><td>Antarktyczna termolabilna UDG</td><td>New England Biolabs</td><td>M0372S</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>New England Biolabs</td><td>B1003S</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dATP Solution</td><td>New England Biolabs</td><td>N0440S</td><td>Zestaw deoksynukleotydów N0446S</td></tr><tr><td>100 mM dCTP Roztwór</td><td>New England Biolabs</td><td>N0441S</td><td>Zestaw deoksynukleotydów N0446S</td></tr><tr><td>100 mM dTTP Roztwór</td><td>New England Biolabs</td><td>N0443S</td><td>Zestaw deoksynukleotydów N0446S</td></tr><tr><td>100 mM dGTP Roztwór</td><td>New England Biolabs</td><td>N0442S</td><td>Zestaw deoksynukleotydów N0446S</td></tr><tr><td>100 mM roztwór dUTP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0133</td><td></td></tr><tr><td>Kwas nukleinowy SYBR Green I Gel Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>Nancy-520</td><td>Sigma Aldrich</td><td>01494</td><td></td></tr><tr><td>Drabinka o niskiej masie DNA</td><td>Invitrogen</td><td>10-068-013</td><td></td></tr><tr><td>Zika Postive Control</td><td>Instytut Roberta Kocha, Niemcy</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1600</td><td></td></tr><tr><td>BlueJuice Żel Bufor ładujący</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10816015 Startery</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>Niestandardowe Oligo</td><td></td></tr><tr><td>Nucleazo-Free Water</td><td>Ambion</td><td>AM9938</td><td></td></tr><tr><td>Środek konserwujący mocz</td><td>Norgen Biotek</td><td>18126</td><td></td></tr><tr><td>ZIKV PCR Standard</td><td>Robert Koch Institute</td><td>N/A</td><td>Supernatanty komórkowe Vero E6</td></tr><tr><td>DENV2 Nowa Gwinea C</td><td>Control Connecticut Eksperyment rolniczy Stacja</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

test amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (rt-lamp) dla wirusa zika i genów porządkowych w próbkach moczu, surowicy i komarów

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Zakażenie wirusem Zika (ZIKV) może przebiegać bezobjawowo u dorosłych, jednak zakażenie w czasie ciąży może prowadzić do poronienia i poważnych neurologicznych wad wrodzonych. Celem tego protokołu jest szybkie wykrycie ZIKV zarówno w próbkach pobranych od ludzi, jak i komarów. Obecnie złotym standardem w wykrywaniu ZIKV jest ilościowy PCR z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR); Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP) może pozwolić na bardziej wydajne i tanie testowanie bez konieczności stosowania drogiego sprzętu. W tym badaniu RT-LAMP jest używany do wykrywania ZIKV w różnych próbkach biologicznych w ciągu 30 minut, bez uprzedniego izolowania RNA od próbki. Technikę tę zademonstrowano przy użyciu moczu i surowicy pacjenta zakażonego ZIKV oraz próbek zakażonych komarów. Rybosomalny kwas rybonukleinowy 18S i aktyna są stosowane jako kontrole odpowiednio w próbkach od ludzi i komarów.

Reakcje RT-LAMP można analizować za pomocą trzech różnych metod. Po pierwsze, przy zastosowaniu fluorescencyjnego barwnika kwasów nukleinowych, reakcje pozytywne będą miały kolor żółto-zielony, podczas gdy reakcje negatywne będą w ocenie wizualnej wydawać się pomarańczowe. Po drugie, dodanie fluorescencyjnego barwnika kwasów nukleinowych do reakcji RT-LAMP skutkuje uzyskaniem sygnału fluorescencyjnego po wzbudzeniu próbek światłem UV. Reakcje negatywne nie będą wykazywać wykrywalnego sygn...

Ten protokół zapewnia skuteczną i tanią metodę wykrywania wirusa Zika lub celów kontrolnych w próbkach ludzkiego moczu i surowicy lub u komarów za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP). Ta metoda nie wymaga izolacji RNA i można ją wykonać w ciągu 30 minut.

Test amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP) dla wirusa Zika i genów porządkowych w próbkach moczu, surowicy i komarów

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Ta metoda może szybko określić, czy próbki zawierają wirusa Zika. Jest to przydatne dla kobiet w ciąży, par starających się o dziecko lub nadzoru nad lokalnymi populacjami komarów, które są zagrożone zakażeniem wirusem Zika. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest szybka, łatwa, nie wymaga drogiego sprzętu i może być wykonana bez etapu izolacji RNA.Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku diagnozowania zakażenia wirusem Zika, ponieważ zakażenie w czasie ciąży wiąże się z poronieniem, urodzeniem martwego dziecka i innymi poważnymi wrodzonymi, neurologicznymi wadami wrodzonymi. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w wirusa Zika, może być również stosowana do innych chorób zakaźnych, takich jak denga, chikungunya lub wirus Zachodniego Nilu, przy użyciu starterów specyficznych dla wirusa. Na początek rozpuść każdy starter RT-LAMP w wodzie molekularnej do końcowego stężenia 100 mikromolowych.Krótko zmieszaj roztwór podkładu, aby upewnić się, że roztwór jest jednorodny. Wirować przez około pięć sekund z maksymalną prędkością, aby zebrać roztwór startera. Następnie przygotuj 10-krotną mieszankę podkładów RT-LAMP, jak opisano w tabeli drugiej protokołu technicznego.Krótko wirować, aby zapewnić jednorodność. I odwiruj krótko z maksymalną prędkością, aby uniknąć strat. Przechowuj podkłady w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza między użyciami, unikając cykli zamrażania i rozmrażania.W przypadku próbek moczu ludzkiego należy użyć moczu świeżego, moczu zamrożonego lub moczu w środku konserwującym. Przed użyciem rozmrozić zamrożone próbki na lodzie. Próbki surowicy ludzkiej powinny być świeże lub zamrożone, podczas gdy linie komórkowe zakażone ZIKV powinny zawierać kondycjonowane pożywki lub lizaty komórkowe.Wreszcie, w przypadku komarów Aedes aegypti należy używać całych tusz, świeżych lub mrożonych. Rozmrozić zamrożone zwłoki komarów na lodzie. Umieść pojedynczego komara w 100 mikrolitrach PBS.Za pomocą końcówki pipety P10 zmiażdż komara 10 razy i zhomogenizuj go, aby uzyskać surowy lizat komarów. Krótko odwirować surowy lizat w celu osadzenia wszelkich zanieczyszczeń i użyć supernatantu do dalszej analizy RT-LAMP. Na początek należy przygotować reakcję mieszania wzorcowego RT-LAMP na lodzie dla każdego zestawu starterów, który ma być użyty, zgodnie z tabelą trzecią w protokole technicznym.Każdą próbkę należy odwirować, aby upewnić się, że jest dobrze wymieszana. Następnie krótko je obróć, aby zapobiec utracie głośności. Dla każdej reakcji odpipetować 23,0 mikrolitrów wzorca RT-LAMP w probówce do PCR o pojemności 200 mikrolitrów.Następnie dodaj dwa mikrolitry próbki, aby uzyskać całkowitą objętość do 25,0 mikrolitrów. Użyj wody molekularnej do kontroli ujemnej i upewnij się, że uwzględniłeś kontrolę pozytywną. Opcjonalnie należy uwzględnić reakcję kontroli swoistości pokrewnego arbowirusa, takiego jak wirus dengi, zgodnie z opisem w protokole technicznym.Za pomocą bloku grzewczego, łaźni wodnej lub termocyklera podgrzewaj próbki w temperaturze 61 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie zwiększ ogień do 80 stopni Celsjusza na 10 minut, aby ciepło dezaktywować polimerazę. Wykonaj analizę RT-LAMP w oddzielnej, zamkniętej przestrzeni.Rozcieńczyć fluorescencyjny barwnik kwasu nukleinowego od jednego do dziesięciu w buforze TAE. Dodać dwa mikorlitery fluorescencyjnego roztworu barwnika kwasu nukleinowego do 12 mikorliterów reakcji RT-LAMP. Oceń reakcje RT-LAMP wizualnie, szukając obecności zmiany koloru.Opcjonalnie użyj aparatu, aby zrobić zdjęcia reakcji RT-LAMP na białym tle. Następnie umieść próbki pod światłem UV o długości fali 302 nanometrów, aby potwierdzić obecność produktów RT-LAMP metodą fluorescencji. Użyj aparatu, aby zrobić zdjęcie wyniku.Aby rozpocząć wykonywanie elektroforezy, wlej 2% żel agarozowy do 1x buforu TAE z barwnikiem kwasu nukleinowego w celu wizualizacji. Dodaj pięć mikrolitrów drabiny DNA na pierwszym pasie, aby porównać masy cząsteczkowe. Dla każdej reakcji RT-LAMP należy zmieszać 13 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej RT-LAMP z dwoma mikrolitrami barwnika ładującego DNA.Załaduj tę mieszaninę o pojemności 15 mikrolitrów. Uruchom żel pod napięciem 90 V przez 90 minut lub do momentu rozdzielenia pasków. Obraz ze światłem UV o długości fali 302 nm.Po zakończeniu wyrzuć reakcje RT-LAMP do podwójnie zamkniętych worków. W tym badaniu wykorzystano trzy różne metody analizy reakcji RT-LAMP. Podczas stosowania barwnika fluorescencyjnego kwasu nukleinowego pozytywne reakcje stają się żółto-zielone, podczas gdy negatywne reakcje pojawiają się na pomarańczowo.Barwnik ten powoduje również sygnał fluorescencyjny, gdy próbki są wzbudzane przez światło UV. Wreszcie, reakcje RT-LAMP można przeprowadzić na żelu agarozowym. Pozytywne reakcje RT-LAMP będą miały wzór prążkowy, podczas gdy negatywne reakcje nie będą miały prążków DNA.Metody te stosuje się w celu wykazania specyficzności reakcji ZIKV RT-LAMP. Tylko kontrola molekularna ZIKV ma dodatnią reakcję RT-LAMP. Ponadto, podczas gdy ZIKV jest wykrywany zarówno w moczu, jak i surowicy pacjenta ze stwierdzonym zakażeniem ZIKV, nie obserwuje się go u bezobjawowego pacjenta kontrolnego bez zakażenia ZIKV.Próbki są następnie badane na obecność ludzkiego 18S rRNA. Tylko próbki pobrane od pacjentów są dodatnie dla 18S rRNA. Próbki komarów mogą być podobnie badane pod kątem ZIKV lub kontroli jakości RT-LAMP AEDAE.Tylko dodatnia kontrola molekularna dla ZIKV i komara zakażonego ZIKV są postrzegane jako dodatnie dla ZIKV. Jednak wszystkie komary są pozytywne dla AEDAE firmy RT-LAMP. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż 30 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Ważne jest, aby pamiętać, że reakcje RT-LAMP są podatne na fałszywie dodatnie reakcje. Kroki zapobiegawcze obejmują stosowanie termolabilnej glikozylazy DNA uracylu w reakcjach, stosowanie bocznego przepływu pracy, przeprowadzanie analizy w oddzielnej przestrzeni oraz skracanie czasu otwarcia probówek po amplifikacji. Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak QPCR, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak liczba kopii wirusa lub innych celów obecnych w próbce.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać RT-LAMP do wykrywania wirusa Zika i zwalczania celów w ludzkim moczu i surowicy, a także u komarów. Nie zapominaj, że praca z wirusem Zika i barwieniem kwasami nukleinowymi może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek. Biorąc pod uwagę związek zakażenia wirusem Zika z wadami wrodzonymi, kobiety w ciąży, starające się o dziecko lub partnerzy tych kobiet powinni znacznie zminimalizować swoje narażenie laboratoryjne na wirusa Zika.

reverse-transcription-loop-mediated-isothermal-amplification-rt-lamp

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ten film demonstruje ilościową metodę wykrywania infekcji wirusowej za pomocą PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym. Krok odwrotnej transkrypcji przekształca RNA w cDNA, które jest następnie amplifikowane w cyklach PCR. Obecność wirusowego RNA w próbce potwierdza się analizując krzywe amplifikacji i dysocjacji DNA uzyskane z PCR.

Ilościowy PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym do diagnozowania infekcji wirusowych

Wirus Zika (ZIKV), nowy patogen, jest powiązany z nieprawidłowościami rozwojowymi płodu i małogłowiem. Stworzenie skutecznego systemu hodowli komórek zakaźnych ma kluczowe znaczenie dla badań nad replikacją ZIKV, a także dla opracowywania szczepionek i leków. W niniejszej pracy zilustrowano i omówiono różne testy wirusologiczne dotyczące ZIKV.

System zakaźnych hodowli komórek wirusa Zika i profilaktyczne działanie interferonów in vitro

Obecna diagnostyka multipleksowa do wykrywania wirusów Zika, chikungunya i denga wymaga skomplikowanego przygotowania próbek i kosztownego oprzyrządowania, a także jest trudna do użycia w środowiskach o niskich zasobach. Pokazujemy diagnostykę, która wykorzystuje amplifikację izotermiczną z sondami z przemieszczonymi niciami specyficznymi dla celu, aby wykryć i zróżnicować te wirusy z wysoką czułością i swoistością.

Multipleksowana platforma diagnostyczna oparta na amplifikacji izotermicznej do wykrywania wirusów Zika, Chikungunya i Denga 1

Dla efektywnej kontroli przenoszenia wirusów przenoszonych przez komary, szczególnie interesująca jest wiedza na temat potencjału wektorowego poszczególnych komarów. Opisujemy wymuszone ślinotok jako metodę analizy kompetencji wektorowych Aedes albopictus i trzech różnych taksonów Culex pod kątem przenoszenia wirusa Zika.

Wymuszone wydzielanie śliny jako metoda analizy kompetencji wektorowych komarów

Opisujemy metodę oceny wpływu istniejącej wcześniej odporności na wirusa dengi na infekcję wirusem Zika za pomocą ludzkiej surowicy, pierwotnych komórek ludzkich i kwantyfikacji infekcji za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym.

Kwantyfikacja zależnego od przeciwciał wzmocnienia wirusa Zika w pierwotnych komórkach ludzkich

Prezentowany protokół może określić kompetencję wektorową populacji komarów Aedes aegypti dla danego wirusa, takiego jak Zika, w warunkach powstrzymywania.

Wektorowe analizy kompetencyjne komarów Aedes aegypti z wykorzystaniem wirusa Zika

W tej pracy opisujemy protokoły używane w testach opartych na replikonie i enzymach wirusowych do badań przesiewowych na obecność inhibitorów replikacji wirusa Zika w formacie wysokoprzepustowych.

Wysokoprzepustowe testy przeciwwirusowe do badań przesiewowych w kierunku inhibitorów replikacji wirusa Zika

Dostęp do zdecentralizowanej, taniej i wydajnej diagnostyki, która może być wdrożona w społeczności do zdecentralizowanych testów, jest kluczowy dla walki z globalnymi kryzysami zdrowotnymi. W tym manuskrypcie opisano, jak zbudować papierową diagnostykę sekwencji wirusowego RNA, które można wykryć za pomocą przenośnego czytnika optycznego.

Badanie projektowe i wdrożeniowe w celu opracowania i walidacji pacjenta w papierowej diagnostyce przełącznika Toehold

Tutaj prezentujemy protokół, który ułatwia funkcjonalną charakterystykę genów i konstruktów promotorowych w wtórnej tkance pnia drzewa w stosunkowo krótkim czasie. Jest wydajny, łatwy w użyciu i ma szerokie zastosowanie w przypadku wielu gatunków drzew.

Wykorzystanie indukowanej analizy sektora somatycznego (ISSA) do badania genów i promotorów zaangażowanych w tworzenie drewna i wtórny rozwój łodyg

Śmierć komórek β wysepek poprzedza rozwój cukrzycy typu 1, a wykrycie tego procesu może pozwolić na wczesną interwencję terapeutyczną. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis, w jaki sposób mierzyć różnicowo metylowane gatunki INS DNA w ludzkiej surowicy jako biomarker śmierci komórek β.

Pomiar różnicowo metylowanych gatunków INS DNA w próbkach surowicy ludzkiej jako biomarker śmierci β komórki wyspy trzustkowej

Poznaj metodę RT-LAMP do szybkiej detekcji wirusa Zika w moczu, surowicy i komarach bez izolacji RNA. Ta technika umożliwia tanie i efektywne diagnozowanie zakażeń w ciągu 30 minut.

Test amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP) dla wirusa Zika i genów porządkowych w próbkach moczu, surowicy i komarów (Wideo) | JoVE Journal

Test amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP) dla wirusa Zika i genów porządkowych w próbkach moczu, surowicy i komarów

Przeglądaj więcej filmów