Generowanie ludzkich kultur 3D tkanki płuc (3D-LTC) do modelowania chorób
12 lutego 2019
Tutaj prezentujemy protokół przygotowania wypełnionych agarozą precyzyjnie wyciętych ludzkich wycinków płuc z wyciętej tkanki pacjenta, które są odpowiednie do generowania 3D kultur tkanki płucnej do modelowania ludzkich chorób płuc w badaniach biologicznych i biomedycznych.
Metoda ta pozwala na badanie żywej tkanki ludzkiej w jej naturalnej strukturze i składzie 3D w celu przełożenia kluczowych wyników badań laboratoryjnych na potencjalne terapie. Technika ta umożliwia w szczególności generowanie kultur tkankowych z chirurgicznie wyciętej lub eksplantowanej ludzkiej tkanki płucnej w celu wizualizacji próbek tkanki płucnej poszczególnych zmarłych pacjentów. Wolna od chorób tkanka płucna może być wykorzystywana jako hodowle tkankowe 3D do modelowania chorób płuc ex vivo, umożliwiając analizę wczesnych patomechanizmów w wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej.
Zacznij od umieszczenia wyciętej próbki płuc w 15 mililitrach podłoża hodowlanego w sterylnym 15-centymetrowym naczyniu hodowlanym i sterylnej metalowej tacy pokrytej bibułą, a następnie napełnij 30-mililitrową strzykawkę agarozą o niskiej temperaturze topnienia o temperaturze topnienia 42 stopni Celsjusza. Wyjmij zasłonę z cewnika do żył obwodowych i podłącz cewnik do 30-mililitrowej strzykawki. Zidentyfikuj oskrzela o średnicy od 0,5 do 3 milimetrów w tkance wentylującej w nienaruszonym fragmencie tkanki i delikatnie włóż kaniulę do oskrzeli tak daleko, jak to możliwe.
Użyj kleszczy, aby ścisnąć ścianę oskrzelika wokół kaniuli, najlepiej zaciskając jednocześnie sąsiednią tętnicę płucną, aby uszczelnić oskrzela wokół kaniuli i użyć zacisku chirurgicznego, aby zatkać wszelkie inne dodatkowe drogi oddechowe, aby zapobiec wyciekowi agarozy. Następnie użyj kleszczy, aby podnieść tkankę płucną z naczynia hodowlanego i użyj strzykawki, aby ręcznie dostarczyć agarozę przez kaniulę, nie szybciej niż 0,3 mililitra na sekundę. Gdy tkanka płucna zostanie całkowicie wypełniona bez nadmiernego napompowania tkanki, natychmiast usuń kaniulę i zaciśnij oskrzela.
Zanurz tkankę w pożywce hodowlanej w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 30 minut, aby ułatwić zestalenie agarozy, i powtórz procedurę napełniania agarozą dla wszelkich dodatkowych otworów oskrzelików. Następnie przechowuj wypełnione agarozą skrawki tkanki płucnej w pożywce o temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu pokrojenia. W celu precyzyjnego krojenia płuc należy zidentyfikować obszary wypełnione solidnie agarozą w tkance płucnej, które nie zapadają się po delikatnym dociśnięciu pęsetą do dna naczynia do hodowli komórkowej.
Wyciąć blok o objętości od 1 do 1,5 centymetra sześciennego solidnie wypełnionego obszaru, z jedną stroną nadal pokrytą opłucną, i użyć kleju cyjanoakrylowego, aby przymocować liczbę mnogą każdego bloku tkanki do uchwytu wibratomu. Przetnij całą drogę przez długi blok tkanki, aż pozostaną tylko dwa do trzech milimetrów tkanki niepokrojonej. Za pomocą kleszczy przenieś każdy odcinek o wielkości 500 mikrometrów do jednego dołka dwunastodołkowej płytki zawierającej podłoże uprawowe, w miarę ich uzyskiwania.
Po pocięciu całej tkanki przenieś próbki z każdej studzienki do indywidualnych dziesięciocentymetrowych szalek hodowlanych i umieść czteromilimetrowy dziurkacz do biopsji prostopadle do górnej powierzchni precyzyjnie wyciętego wycinka płuca. Następnie, przesuwając dziurkacz w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, uzyskaj przebicia tkankowe próbki płuc. Umieszczanie każdego stempla w pożywce do hodowli komórkowych w indywidualnych dołkach 96-dołkowej płytki w miarę ich otrzymywania.
Po uzyskaniu wszystkich stempli tkankowych należy umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na okres do pięciu dni. Znakowanie immunologiczne fibronektyny w jądrach komórkowych za pomocą immunofluorescencji w ludzkich hodowlach 3-D tkanki płucnej umożliwia obrazowanie zachowanej struktury pęcherzyków płucnych ex vivo. Leczenie precyzyjnych wykrojników ludzkich plastrów płuc profibrotycznym koktajlem cytokin przez 48 godzin powoduje zmiany podobne do zwłóknienia w hodowlach tkanek 3D ludzkich płuc, w tym znaczną indukcję istotnych dla zwłóknienia składników macierzy zewnątrzkomórkowej, kolagenu typu pierwszego i genów fibronektyny.
Dodatkowo, poziomy białka mezenchymalnego markera wimentyny są regulowane w górę u trzech z czterech pacjentów po leczeniu stemplami 3-D do hodowli tkanki płucnej. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza RNA za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym lub analiza białek za pomocą western blotting, w celu oceny ekspresji genów i białek odpowiednio w tkance. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę do badań w dziedzinie pulmonologii eksperymentalnej, do eksplantacji biologii płuc, a także do wykonywania badań toksykologicznych i farmakologicznych na próbkach tkanek ludzkich.
Należy pamiętać, że żywa tkanka ludzka jest potencjalnie zakaźna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak stosowanie środków ochrony osobistej oraz właściwe przechowywanie tkanek, transport i postępowanie z odpadami
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono protokół przygotowania wypełnionych agaroza precyzyjnie ciętych plastrów płuc człowieka z tkanki pobranej od pacjentów w drodze resekcji. Plastry te nadają się do tworzenia trójwymiarowych kultur tkanki płucnej w celu modelowania chorób płuc człowieka w badaniach biologicznych i biomedycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Badania biomedyczne
- Modelowanie chorób płuc
- Techniki trójwymiarowej hodowli tkanek
Wstęp
- Ludzka tkanka płucna może być wykorzystywana do badania chorób w naturalnej strukturze 3D.
- Metoda ta pozwala na wizualizację próbek płuc od poszczególnych pacjentów.
- Umożliwia ona analizę wczesnych patomechanizmów z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną.
- Ze względu na zakaźny charakter żywej tkanki ludzkiej konieczne jest zastosowanie środków ostrożności.
Cel badania
- Opracowanie protokołu tworzenia trójwymiarowych (3D) kultur tkanki płucnej.
- Ułatwienie badania chorób płuc ex vivo.
- Umożliwienie analizy ekspresji genów i białek w ludzkiej tkance płucnej.
Zastosowane metody
- Przygotowanie próbek tkanki płucnej z wykorzystaniem agarozy o niskiej temperaturze topnienia.
- Precyzyjne cięcie sekcji płuc wypełnionych agarozą.
- Techniki immunoznakowania w celu wizualizacji struktury tkanki.
- Analiza ekspresji genów i białek przy użyciu PCR oraz western blottingu.
Główne wyniki
- Indukcja zmian o charakterze włóknistym w hodowlach tkanki płucnej po traktowaniu cytokinami.
- Zwiększenie ekspresji genów kolagenu typu I oraz fibronektyny.
- Podwyższony poziom białka vimentyny, markera mezenchymalnego, w próbkach traktowanych.
- Potencjał do dalszych badań w dziedzinie eksperymentalnej pulmonologii i farmakologii.
Wnioski
- Technika ta poszerza wiedzę na temat biologii płuc.
- Stanowi ona platformę do badań toksykologicznych i farmakologicznych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodzie w celu lepszego modelowania chorób.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Trójwymiarowe hodowle tkanki płucnej człowieka pochodzące z precyzyjnie wycinanych plastrów płuc stanowią fizjologicznie istotny model ex vivo do badania mechanizmów chorobowych i odpowiedzi na leki w natywnej architekturze tkanki ludzkiej. Podejście to wspiera walidację celów terapeutycznych i redukcję ryzyka mechanistycznego, umożliwiając bezpośrednią ocenę efektów działania związków w chorych lub peritumoralnych próbkach płuc pobranych od poszczególnych pacjentów. Model ten zwiększa pewność prognostyczną w ocenie przedklinicznej poprzez zachowanie różnorodności komórkowej, składu macierzy zewnątrzkomórkowej oraz właściwości biomechanicznych, które są kluczowe dla istotności translacyjnej.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych w nienaruszonej tkance płuc człowieka z zachowaną strukturą 3D i różnorodnością typów komórek.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez pomiar zmian wywołanych lekami w biomarkerach związanych z włóknieniem, takich jak kolagen typu I i fibronektyna.
- Wartość naukowa: Ułatwia wyjaśnienie szlaków sygnałowych poprzez analizę spacjoczasową wczesnych patomechanizmów w istotnej dla choroby ludzkiej tkance.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ustandaryzowanych, powtarzalnych wycinków tkankowych odpowiednich do przesiewania związków z wykorzystaniem płytek wielodołkowych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia ilościowe odczyty za pomocą immunofluorescencji, qPCR i western blottingu w celu przeprowadzenia analizy zależności dawka-odpowiedź oraz analizy przebiegu czasowego.
- Wartość naukowa: Zwiększa wydajność tkanek z ograniczonych próbek pacjentów dzięki pobieraniu wycinków biopsyjnych, co poprawia skalowalność testów i możliwości replikacji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Modeluje specyficzne dla ludzi procesy włóknienia na poziomie subkomórkowym, wykorzystując zmiany przypominające włóknienie indukowane cytokinami w precyzyjnie ciętych plastrach płuc.
- Wartość operacyjna: Zapewnia system istotny z punktu widzenia choroby do oceny zaangażowania celu i mechanizmu działania w tkance ludzkiej przed badaniami in vivo.
- Wartość naukowa: Wspiera dopasowanie translacyjnych biomarkerów, umożliwiając korelację odczytów molekularnych z funkcjonalnymi wynikami na poziomie tkanki.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć – od wczesnego testowania hipotez dotyczących celów terapeutycznych, poprzez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną, umożliwiając iteracyjną optymalizację w oparciu o odpowiedzi tkanek ludzkich.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez, umożliwiając wizualizację struktury pęcherzyków płucnych i odpowiedzi komórkowych w nienaruszonych eksplantach ludzkiego płuca.
- Screening: Dostarcza gotowe do analizy wycinki tkankowe o powtarzalnym rozmiarze i żywotności, przeznaczone do screeningu bibliotek związków w formatach 96-dołkowych.
- Analityka: Umożliwia multipleksowe odczyty, w tym ekspresję genów (qPCR), poziomy białek (western blot) oraz obrazowanie strukturalne (immunofluorescencja), w celu porównania warunków traktowania.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z pracami przedklinicznymi poprzez zachowanie złożoności ludzkiej tkanki i umożliwienie analizy odpowiedzi z rozwarstwieniem na pacjentów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy reużywalną platformę do modelowania chorób płuc, która może być stosowana w wielu projektach i obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez zmniejszenie luk w translacji gatunkowej dzięki bezpośredniemu wykorzystaniu ludzkiej tkanki płucnej.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie tkanki poprzez zatapianie w agarozie i precyzyjne krojenie, co poprawia powtarzalność między użytkownikami i ośrodkami.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje typu go/no-go, dostarczając wczesnych sygnałów dotyczących skuteczności i toksyczności w oparciu o ludzką tkankę.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o efekty mechanistyczne w chorych lub około guzowych próbkach ludzkich płuc.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z tkankami ludzkimi, stosowania technik sterylnych oraz wykonywania sekcji z użyciem wibratomu.
- Zależne od dostępu do chirurgicznie wyciętej tkanki płuc oraz agarozy o niskiej temperaturze topnienia w celu zachowania struktury.
- Wymaga standaryzacji warunków hodowli i kontroli zanieczyszczeń ze względu na potencjał zakaźny żywej tkanki ludzkiej.
- Wiąże się z optymalizacją rozmiaru wycinaka do biopsji oraz techniki rotacji w celu zapewnienia jednorodności próbek w powtórzeniach.
- Ograniczone oknem żywotności tkanki, co wymaga sprawnego przetworzenia i rozpoczęcia hodowli po resekcji.
