Badanie importu białek do chloroplastów przy użyciu protoplastów
December 10th, 2018
Tutaj opisujemy protokół ekspresji białek do protoplastów za pomocą metody transformacji za pośrednictwem PEG. Metoda ta zapewnia łatwą ekspresję białek będących przedmiotem zainteresowania oraz efektywne badanie lokalizacji białek i procesu importu dla różnych warunków eksperymentalnych in vivo.
Ta tajemnica może pomóc odpowiedzieć na kilka pytań z dziedziny biologii komórki, takich jak wprowadzanie białek do chloroplastów. Główną zaletą tej technologii jest to, że wprowadzanie białek do chloroplastów może być badane w warunkach en vivo. Procedurę zademonstrują Junho Lee i Hyangju Kang, dwaj pracownicy mojego laboratorium.
Na początek zbierz nienaruszone tkanki liści z dwutygodniowych roślin z jednej do dwóch płytek B5. Użyj noża chirurgicznego, aby zebrać liście i umieść je w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów zawierającej 25 mililitrów roztworu enzymatycznego. Umieścić probówkę poziomo na wytrząsarce obrotowej i inkubować z delikatnym mieszaniem w temperaturze 22 stopni Celsjusza w ciemności przez osiem do 12 godzin, aż w roztworze pozostaną tylko ogonki liściowe i łodygi.
Po zakończeniu inkubacji przefiltrować roztwór enzymu zawierający uwolnione protoplasty przez siatkę o wielkości porów 140 mikrometrów do świeżej szalki Petriego. Następnie ostrożnie ułóż roztwór na 15 mililitrach 21% roztworu sacharozy w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Odwirować probówkę w obracającym się wirniku kubełkowym o masie 98 g przez 10 minut przy najniższych ustawieniach przyspieszania i zwalniania.
Następnie za pomocą pipety patura ostrożnie usuń protoplasty z najwyższej warstwy zawierającej roztwór enzymu oraz z granicy faz między roztworem enzymów a roztworem sacharozy. Przenieś ten roztwór do 50-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej 30 mililitrów roztworu W5 i odwróć probówkę do wymieszania. Odwirować probówkę o masie 51 g przez sześć minut.
Za pomocą pipety ostrożnie usunąć ten supernatant, nie naruszając protoplastów w osadzie. Dodaj 25 mililitrów roztworu W5 i delikatnie ponownie zawiesić protoplasty. W celu stabilizacji inkubować w lodówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę.
Po inkubacji w czterech stopniach Celsjusza całkowicie osadzaj protoplasty, odwirowując je w temperaturze 46 g przez dwie minuty. Ostrożnie całkowicie usuń supernatent i dodaj roztwór MANG do osadu protoplastu, aby uzyskać pięć razy dziesięć do sześciu na mililitr. Za pomocą pipety dodaj 10 mikrogramów DNA osocza i 300 mikrolitrów roztworu protoplastu do świeżej 13-mililitrowej probówki z okrągłym dnem.
Wymieszaj, delikatnie obracając ręcznie tubki, a następnie natychmiast dodaj 300 mikrolitrów świeżo przygotowanego 40% roztworu PEG. Wymieszaj całkowicie, przechylając tubkę prawie poziomo i kilkakrotnie delikatnie obracając ją ręcznie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
Następnie dodaj jeden mililitr roztworu W5 i całkowicie wymieszaj, delikatnie obracając rurkę ręcznie, jak poprzednio. Inkubować próbkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz jeszcze dwa razy, dodając najpierw 1,5 mililitra, a następnie dwa mililitry W5 i po ostatnim dodaniu i wymieszaniu inkubować przez 30 minut.
Odwirować probówkę o masie 46 g przez cztery minuty, a następnie wyrzucić supernatant. Dodaj dwa mililitry roztworu W5 do granulki i delikatnie wymieszaj, ale całkowicie, w taki sam sposób jak poprzednio. Inkubować w temperaturze 22 stopni Celsjusza w ciemnej komorze przez 18 godzin.
Aby przeanalizować import białka za pomocą mikroskopii florescencyjnej, użyj pipety z przyciętą końcówką, aby umieścić 10 mikrolitrów roztworu protoplastu na szkiełku podstawowym. Użyj szkiełka nakrywkowego, aby ostrożnie przykryć roztwór, aby uniknąć uszkodzenia protoplastów. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego z filtrem wstępnym wzbudzenia, który jest ustawiony na obserwację białka zielonej fluorescencji i autofluorescencji chlorofilu.
Użyj chłodzonej kamery z parą ładowaną, aby przechwytywać obrazy i przetwarzać je za pomocą oprogramowania do edycji obrazów w celu tworzenia pseudokolorowych obrazów. W celu całkowitej ekstrakcji białka i immunoblottingu usuń jeden mililitr z roztworu protoplastu i wymieszaj pozostały jeden mililitr. Przenieść ten roztwór protoplastu do probówki wirówkowej i wirować w temperaturze 46 g przez cztery minuty.
Po zakończeniu wirowania usunąć supernatant i dodać 80 mikrolitrów buforu denaturacyjnego. Wiruj energicznie przez pięć sekund. Dodać pięć próbek buforowych XDS, dobrze wymieszać i gotować przez 10 minut w celu denaturacji.
Postępuj zgodnie ze standardową stroną STS i immunoblottingiem z przeciwciałem anty-GFP. RbcS i TGFT, konstrukt fuzyjny kodujący 79 końcowych reszt aminokwasowych RBCS zawierających peptyd tranzytowy połączony z GFP, wykorzystano do zbadania importu białek do chloroplastów za pomocą mikroskopii florescencyjnej i immunoblottingu. Podczas badania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej zielone sygnały fluorescencyjne z białka docelowego łączyły się z czerwonymi sygnałami fluorescencyjnymi z autoflorescencji chlorofilu, co wskazuje na import białka do chloroplastów.
Po wyizolowaniu białka całkowitego w immunoblot obserwuje się dwa prążki białkowe, co pokazuje, że białko zostało prawidłowo zaimportowane do chloroplastów. Górne pasmo odpowiada prekursorowi o pełnej długości, a dolne pasmo postaci przetworzonej po przywozie do chloroplastów. Ilość przetworzonej formy białka zwiększyła się w sposób zależny od czasu, co sugeruje, że białko jest importowane do chloroplastów.
Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią komórki, którzy badali zmęczenie białek lub zrywanie nici błonowych u rzodkiewnika.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę transformacji pośredniczoną przez PEG do ekspresji białek w protoplastach, umożliwiającą badanie lokalizacji białek i procesów importu in vivo. Protokół jest demonstrowany przez Junho Lee i Hyangju Kang, dostarczając wgląd w proces importu białek do chloroplastów.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biologia Komórki
- Biologia Roślin
- Ekspresja Białek
Tło
- Rozumienie lokalizacji białek jest kluczowe w biologii komórki.
- Chloroplasty odgrywają znaczącą rolę w metabolizmie roślin.
- Badanie procesów importu białek może zwiększyć naszą wiedzę o funkcjach komórkowych.
- Transformacja pośredniczona przez PEG jest szeroko stosowaną techniką dla protoplastów.
Cel badania
- Dostarczyć protokół ekspresji białek w protoplastach.
- Zbadać lokalizację białek w warunkach in vivo.
- Ułatwić badania nad procesami importu białek do chloroplastów.
Zastosowane metody
- Zbieranie nienaruszonych tkanek liści z dwutygodniowych roślin.
- Używanie noża chirurgicznego do przygotowania próbek liści.
- Inkubacja tkanek liści w roztworze enzymatycznym w celu izolacji protoplastów.
- Zastosowanie transformacji pośredniczonej przez PEG do ekspresji białek.
Główne wyniki
- Skuteczna ekspresja białek w protoplastach.
- Efektywne badanie lokalizacji białek.
- Demonstracja protokołu przez przeszkolonych badaczy.
- Wgląd w proces importu białek do chloroplastów.
Wnioski
- Metoda transformacji pośredniczona przez PEG jest skuteczna w ekspresji białek.
- Podejście to umożliwia badanie dynamiki białek in vivo.
- Dalsze badania mogą rozwijać wnioski z importu białek do chloroplastów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding protein import mechanisms into chloroplasts provides foundational insights for target validation in plant-based bioproduction systems. This protoplast-based assay enables mechanistic de-risking of nuclear-encoded protein trafficking pathways, supporting predictive confidence in chloroplast engineering for therapeutic protein expression. The method offers a disease-relevant system for evaluating targeting signal functionality and import efficiency under near-physiological conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates chloroplast targeting signal functionality and import kinetics for nuclear-encoded proteins.
- Operational Value: Enables rapid assessment of protein localization using fluorescence microscopy and immunoblotting readouts.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing of transit peptide efficacy and import machinery engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative immunoblot data showing precursor-to-processed protein conversion over time.
- Operational Value: Provides a reproducible protoplast isolation and transfection workflow using PEG-mediated transformation.
- Assay Readiness: Delivers dual-readout capability (fluorescence and immunoblot) for import validation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage targeting signal analysis to preclinical evaluation of chloroplast-expressed biologics.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed protein accumulation results from proper import versus cytosolic aggregation.
- Predictive Confidence: Time-dependent increase in processed protein band correlates with functional import progression.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where target validation precedes lead identification, particularly for chloroplast-directed expression systems. It supports screening campaigns by providing import-competent biological systems ready for effector protein testing. Analytics derived from the assay include fluorescence co-localization metrics and immunoblot-based quantification of import efficiency.
- Discovery Biology: Tests whether candidate proteins achieve proper subcellular localization via endogenous import pathways.
- Screening: Delivers standardized protoplast preparations suitable for high-content localization screening.
- Analytics: Enables quantification of import kinetics through precursor/product band ratios in immunoblots.
- Translational Research: Informs construct design for chloroplast expression vectors by validating transit peptide functionality.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating multiple targeting signals across protein therapeutics candidates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in protein targeting hypotheses through direct visualization of import.
- Operational Value: Delivers a standardized, scalable protoplast isolation protocol with defined centrifugation and resuspension steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for chloroplast expression constructs by confirming import competence.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targeting sequences based on empirical import data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant protoplast isolation, PEG-mediated transfection, and fluorescence microscopy.
- Dependent on enzymatic tissue digestion equipment, sucrose gradient centrifugation, and PEG solution preparation.
- Necessitates standardization of protoplast density (5×10⁶/mL) and DNA input (10 µg) for reproducible expression.
- Involves adaptation considerations when extending to non-Arabidopsis species or alternative chloroplast transformation systems.
- Practical limitations include protoplast viability window post-isolation and sensitivity to osmotic stress during PEG incubation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:33
Protoplast Isolation
2:19
Protoplast Transformation using Polyethylene Glycol
3:53
Analysis of the Protein Import into Chloroplasts
5:10
Results: Fluorescence Microscopy and Immunoblotting to Analyze the Import of Proteins into Chloroplasts
6:07
Conclusion
