Name: Badanie importu białek do chloroplastów przy użyciu protoplastów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Poznaj metodę transformacji PEG do badania lokalizacji białek i ich importu do chloroplastów w protoplastach roślinnych. Protokół umożliwia analizę procesów komórkowych in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wykonana przy wsparciu Wspólnego Programu Badawczego na rzecz Rozwoju Nauki i Technologii Rolniczych (Projekt nr. PJ010953012018), Administracja Rozwoju Obszarów Wiejskich oraz grant Narodowej Fundacji Badawczej (Korea) finansowany przez Ministerstwo Nauki i Technologii Informacyjnych i Komunikacyjnych (nr 2016R1E1A1A02922014), Republika Korei.

1. Wzrost roślin Arabidopsis
<ol>
	<li>Przygotować 1 l pożywki Gamborg B5 (B5), dodając 3,2 g pożywki B5 zawierającej witaminy, 20 g sacharozy, 0,5 g kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES) do około 800 ml wody dejonizowanej i dostosować pH do 5,7 za pomocą wodorotlenku potasu (KOH). Dodać więcej wody dejonizowanej, zwiększyć całkowitą objętość do 1 l. Dodać 8 g fitoagaru i sterylizować w autoklawie przez 15 minut w temperaturze 121 °C.</li>
	<li>Pozostawić pożywkę do ostygnięcia do temperatury 55 °C i wlać 20-25 ml pożywki B5 na szalkę Petriego (o średnicy 9 cm, wysokości 1,5 cm) na czystej ławce. Suszyć talerze przez 2 – 3 dni, zawinąć je w czystą folię i przechowywać w lodówce do czasu użycia.</li>
	<li>Wysterylizuj nasiona Arabidopsis thaliana z 1 ml 70% (v/v) etanolu w probówce wirówkowej (e-tube), wytrząsając w sposób ciągły przez 2 – 3 minuty. Usuń supernatant, dodaj 1 ml 1% (v/v) roztworu podchlorynu sodu i wstrząsaj w sposób ciągły przez 2 – 3 minuty. Przygotuj 100 – 150 nasion na szalkę Petriego.
	<ol>
		<li>Usunąć supernatanty i umyć nasiona 1 ml wody destylowanej. Powtórz ten krok 4 razy. Umieść wysterylizowane nasiona w temperaturze 4 °C na 3 dni, aby zsynchronizować kiełkowanie nasion.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiewaj 100 – 150 nasion na płytki B5 za pomocą mikropipety i uszczelnij płytkę taśmą chirurgiczną.</li>
	<li>Uprawiaj rośliny w pomieszczeniu do uprawy z cyklem 16 godzin/8 godzin światła/ciemności przy natężeniu światła 100 μmol·m-2·s-1, wilgotności względnej 70% i temperaturze 20 °C przez 2 tygodnie.</li>
</ol>
2. Przygotowanie plazmidu
UWAGA: Plazmidy o wysokiej czystości powinny być używane do transformacji; zaleca się użycie komercyjnego zestawu do oczyszczania plazmidów.
<ol>
	<li>Oczyść plazmid (RbcS-nt:GFP) za pomocą zestawu do izolacji DNA. Aby zagęścić DNA, należy przeprowadzić wytrącanie etanolu w probówce o pojemności 1,5 ml i rozpuścić osad DNA w 100 μl wody destylowanej. Oznaczyć stężenie plazmidu za pomocą spektrofotometru przy długości fali 260 nm. Rozcieńczyć plazmid do końcowego stężenia ~ 2 μg/μL. Plazmid należy przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
3. Izolacja protoplastów
<ol>
	<li>Przygotuj następujące rozwiązania.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór enzymu tak, aby zawierał 0,25% (m/v) macerozymu, 1,0% (m/v) celulazy, 400 mM D-mannitolu, 8 mM chlorku wapnia (CaCl2), 0,1% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 5 mM MES. Dostosuj pH do 5,6 za pomocą KOH.
		<ol>
			<li>Przefiltrować roztwór enzymatyczny za pomocą jednostki filtrującej z octanu celulozy o wielkości porów 0,45 μm. Podzielić 25 ml roztworu enzymu na stożkowe probówki o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozmrozić roztwór enzymu w temperaturze pokojowej (RT) i dobrze wymieszać tuż przed użyciem.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować 21% (w/v) roztwór sacharozy, rozpuszczając 21 g sacharozy w 100 ml wody dejonizowanej i autoklawować roztwór.</li>
		<li>Przygotować roztwór W5 zawierający 154 mM chlorku sodu (NaCl), 125 mM CaCl2, 5 mM chlorku potasu (KCl), 5 mM glukozy i 1,5 mM MES. Dostosuj pH do 5,6 za pomocą KOH i autoklaw roztworu.</li>
		<li>Przygotować roztwór MaMg zawierający 400 mM D-mannitolu, 15 mM chlorku magnezu (MgCl2) i 5 mM MES. Dostosuj pH do 5,6 za pomocą KOH i autoklaw roztworu.</li>
		<li>Przygotować 1 M roztwory podstawowe D-mannitolu i 1 M azotanu wapnia w celu przygotowania roztworu PEG. Autoklaw tych roztworów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbierz nienaruszone tkanki liści z 2-tygodniowych roślin z ~ 1 – 2 płytek B5 za pomocą noża chirurgicznego i umieść zebrane liście w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 25 ml roztworu enzymu. Umieść stożkową rurkę zawierającą roztwór enzymu i tkanki liści poziomo na wytrząsarce obrotowej, delikatnie mieszając w ciemności. Pełne trawienie tkanek liści trwa od 8 do 12 godzin.</li>
	<li>Po 8 – 12 godzinach od inkubacji wlać roztwór enzymu (zawierający protoplasty uwolnione z tkanek liści) na świeżą szalkę Petriego przez siatkę o wielkości porów 140 μm. Ostrożnie nałożyć roztwór enzymu zawierający protoplasty na 15 ml 21% (m/v) roztworu sacharozy i odwirować go przy 98 x g przez 10 minut przy najniższych ustawieniach przyspieszenia i opóźnienia w wirniku z wahliwym kubełkiem.</li>
	<li>Za pomocą pipety Pasteura ostrożnie przenieść protoplasty z najwyższej warstwy (roztworu enzymu) i na granicy faz między roztworem enzymu a roztworem sacharozy do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 30 ml roztworu W5. Odwirować tę probówkę o masie 51 x g przez 6 minut. Na tym etapie protoplasty będą znajdować się w osadzie na dnie stożkowej rurki.</li>
	<li>Supernatant należy ostrożnie wyrzucić za pomocą pipety, nie naruszając osadu protoplastów. Dodać 25 ml roztworu W5 i delikatnie zawiesić protoplasty. Inkubować roztwór protoplastu w lodówce o temperaturze 4 °C przez co najmniej 1 godzinę w celu ustabilizowania.</li>
</ol>
4. Transformacja protoplastu przy użyciu glikolu polietylenowego
<ol>
	<li>Przygotuj 40% roztwór PEG, dodając 4 g PEG 8000, 4 ml 1 M roztworu mannitolu, 1 ml 1 M Ca(NO3)2 i 1,8 ml wody destylowanej do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i dobrze wymieszaj. Rozpuść PEG przez ogrzewanie w kuchence mikrofalowej przez 20 – 30 s. Umieść 40% roztwór PEG w temperaturze pokojowej w celu ostygnięcia. 
	UWAGA: 40% roztwór PEG należy za każdym razem przygotowywać na świeżo. Jeżeli protoplasty nie zostaną całkowicie granulowane podczas inkubacji w temperaturze 4 °C w lodówce, należy odwirować materiał w temperaturze 46 x g przez 2 minuty.</li>
	<li>Usunąć sklarowany osad ostrożnie, ale całkowicie i dodać roztwór MaMg do osadu protoplastu, aby uzyskać stężenie 5 x 106/mL. 
	UWAGA: Liczbę protoplastów można określić za pomocą hemocytometru oglądanego pod mikroskopem.</li>
	<li>Umieścić 10 μg plazmidowego DNA w każdej pustej probówce okrągłodennej o pojemności 13 ml i dodać 300 μl roztworu protoplastu za pomocą pipety. 
	UWAGA: Koniec końcówki pipety powinien być odcięty. Za każdym razem, gdy pobiera się próbkę z protoplastów, roztwór zawierający protoplasty powinien być ponownie zawieszony tuż przed pipetowaniem, tak aby do każdej probówki dodać tę samą liczbę protoplastów.</li>
	<li>Wymieszaj plazmidowe DNA z protoplastami, delikatnie obracając probówki i natychmiast dodaj 300 μl 40% roztworu PEG za pomocą pipety. Wymieszać delikatnie, ale całkowicie, obracając probówki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej; Przechyl rurkę prawie poziomo i obróć ją kilka razy.</li>
	<li>Dodać 1 ml roztworu W5 i delikatnie, ale całkowicie wymieszać, obracając probówkę ręcznie w podobny sposób. Inkubować próbkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Powtórz ten krok jeszcze dwa razy, używając odpowiednio 1,5 ml i 2 ml roztworu W5. Inkubować przez 30 minut po ostatnim dodaniu roztworu W5.</li>
	<li>Wirować przy 46 x g przez 4 min. Odrzucić supernatant i dodać 2 ml roztworu W5. Wymieszaj delikatnie, ale całkowicie. Inkubować w temperaturze 22 °C w ciemnej komorze.</li>
</ol>
5. Analiza importu białek do chloroplastów
UWAGA: Po transformacji protoplastów za pośrednictwem PEG, czas inkubacji wynosi od 8 do 24 godzin.
<ol>
	<li>Mikroskopia fluorescencyjna
	<ol>
		<li>Umieścić 10 μl roztworu protoplastu na szkiełku szkiełkowym za pomocą pipety z przyciętą końcówką i ostrożnie przykryć szkiełkiem nakrywkowym, aby uniknąć uszkodzenia protoplastów.</li>
		<li>Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w zestawy filtrów wzbudzenia/emisji do obserwacji białka zielonej fluorescencji (GFP) i autofluorescencji chlorofilu.</li>
		<li>Rejestruj obrazy za pomocą chłodzonej kamery ze sprzężeniem ładunkowym (CCD) i przetwarzaj obrazy za pomocą oprogramowania do edycji obrazów w celu uzyskania pseudokolorowych obrazów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja białka całkowitego i immunoblotting
	<ol>
		<li>Przygotować bufor denaturacyjny zawierający 2,5% (w/v) dodecylosiarczanu sodu (SDS) i 2% (v/v) 2-merkaptoetanolu. 
		UWAGA: Import białka do chloroplastów można określić ilościowo, mierząc stopień przetwarzania peptydów tranzytowych za pomocą analizy immunoblot przy użyciu przeciwciała anty-GFP.</li>
		<li>Przenieść protoplasty do probówki wirówkowej i wirować przy 46 x g przez 4 min.</li>
		<li>Usunąć supernatant i dodać 80 μl buforu denaturacyjnego. Energicznie wirować przez 5 s i dodać 5x bufor próbki SDS (250 mM Tris-Cl (pH 6,8), 0,5 M DTT, 10% (w/v) SDS, 0,05% (w/v) błękit bromofenolowy i 50% (v/v) glicerol). Dobrze wymieszaj i gotuj przez 10 minut.</li>
		<li>Poddaj tę próbkę białka standardowemu SDS-PAGE i immunoblottingowi z przeciwciałem anty-GFP.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Jarvis, P., Lopez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li>
<li>Neuhaus, H. E., Emes, M. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15012188">Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).</li>
<li>Rolland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biosynthetic+capacities+of+the+plastids+and+integration+between+cytoplasmic+and+chloroplast+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes.</a> Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).</li>
<li>Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+nucleus-encoded+proteins+to+chloroplasts+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants.</a> New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).</li>
<li>Li, H. M., Chiu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Transport+into+Chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein Transport into Chloroplasts.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 157-180 (2010).</li>
<li>Keegstra, K., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+import+and+routing+systems+of+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein import and routing systems of chloroplasts.</a> Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).</li>
<li>Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Import+of+proteins+into+mitochondria.+Energy-dependent+uptake+of+precursors+by+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).</li>
<li>Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+transit+peptide+in+the+routing+of+precursors+toward+different+chloroplast+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments.</a> Cell. 46 (3), 365-375 (1986).</li>
<li>Lee, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+nuclear-encoded+plastid+transit+peptides+contain+multiple+sequence+subgroups+with+distinctive+chloroplast-targeting+sequence+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs.</a> Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+targeting+of+the+Arabidopsis+F1-ATPase+gamma-subunit+via+multiple+compensatory+and+synergistic+presequence+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs.</a> Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).</li>
<li>Jin, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+dynamin-like+protein%2C+ADL6%2C+is+involved+in+trafficking+from+the+trans-Golgi+network+to+the+central+vacuole+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).</li>
<li>Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+import+experiments+in+protoplasts+reveal+the+importance+of+the+overall+context+but+not+specific+amino+acid+residues+of+the+transit+peptide+during+import+into+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+and+Cells%22%5BJournal%5D)">In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts.</a> Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).</li>
<li>Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sequence+motifs+in+the+rubisco+small+subunit+transit+peptide+independently+contribute+to+Toc159-dependent+import+of+proteins+into+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts.</a> Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).</li>
<li>Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+motifs+in+transit+peptides+act+as+independent+functional+units+and+can+be+transferred+to+new+sequence+contexts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts.</a> Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+the+hydrophobicity+and+a+positively+charged+region+flanking+the+C-terminal+region+of+the+transmembrane+domain+of+signal-anchored+proteins+play+critical+roles+in+determining+their+targeting+specificity+to+the+endoplasmic+reticulum+or+endosymbiotic+organelles+in+Arabidopsis+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells.</a> Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).</li>
<li>Cleary, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+plant+mitochondria+import+chloroplast+precursor+proteins+in+vitro+with+the+same+efficiency+as+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dostarczyliśmy szczegółowy protokół wykorzystania protoplastów Arabidopsis do badania importu białek do chloroplastów. Ta metoda jest skuteczna w badaniu procesu importu białek. Ta prosta, wszechstronna technika jest przydatna do badania kierowania zamierzonych białek ładunku do chloroplastów. Za pomocą tej metody z tkanek liści rzodkiewnika11,12 przygotowuje się protoplasty, które można uzyskać z roślin na wielu różnych etapach wzrostu, od bard...

Chloroplast jest jednym z najważniejszych organelli w roślinach. Jedną z głównych funkcji chloroplastów jest przeprowadzanie fotosyntezy1. Chloroplasty przeprowadzają również wiele innych reakcji biochemicznych w celu produkcji kwasów tłuszczowych, aminokwasów, nukleotydów i licznych metabolitów wtórnych1,2. Do wszystkich tych reakcji chloroplasty wymagają dużej liczby różnych typów białek. Jednak genom chloroplastów zawiera tylko około 100 genów3,4. Dlatego chloroplasty muszą importować większość swoich białek z cytozolu. W rzeczywistości wykazano, że większość białek chloroplastowych została zaimportowana z cytozolu po translacji4,5,6. Komórki roślinne wymagają specyficznych mechanizmów importowania białek z cytozolu do chloroplastów. Jednak, mimo że te mechanizmy importu białek są badane od kilkudziesięciu lat, nadal nie rozumiemy ich w pełni na poziomie molekularnym. W tym miejscu przedstawiamy szczegółową metodę otrzymywania protoplastów i egzogennej ekspresji genów w protoplastach. Metoda ta może być cenna dla szczegółowego wyjaśnienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw importu białek do chloroplastów.
Import białek może być badany przy użyciu wielu różnych podejść. Jedna z tych metod polega na wykorzystaniu systemu importu białek in vitro7,8. Stosując to podejście, prekursory białek ulegające translacji in vitro są inkubowane z oczyszczonymi chloroplastami in vitro, a import białek jest analizowany za pomocą SDS-PAGE, a następnie analizy western blot. Zaletą tego podejścia jest to, że każdy etap importu białka do chloroplastów może być szczegółowo zbadany. W związku z tym metoda ta jest szeroko stosowana do definiowania składników maszynerii molekularnej importu białek oraz do analizy informacji o sekwencji peptydów tranzytowych. Niedawno opracowano inne podejście polegające na wykorzystaniu protoplastów z tkanek liści, które stało się szeroko stosowane do badania importu białek do chloroplastów9,10. Zaletą tego podejścia jest to, że protoplasty zapewniają środowisko komórkowe, które jest bliższe środowisku nienaruszonych komórek niż system in vitro. W ten sposób system protoplastów pozwala nam zająć się wieloma dodatkowymi aspektami tego procesu, takimi jak związane z nim zdarzenia cytozolowe i sposób określania specyficzności sygnałów docelowych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół wykorzystania protoplastów do badania importu białek do chloroplastów.

<table><tbody><tr><td>GAMBORG B5 POŻYWKA ZAWIERAJĄCA WITAMINY</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>G0210.0050</td><td></td></tr><tr><td>SACHAROZA</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0809.5000</td><td></td></tr><tr><td>MES MONOHYDRAT</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M1503.0250</td><td></td></tr><tr><td>Agar, proszek</td><td>JUNSEI</td><td>24440S1201</td><td></td></tr><tr><td>Taśma chirurgiczna Micropore</td><td>3M</td><td>1530-0</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze chirurgiczne nierdzewna nr 10</td><td>PIÓRO</td><td>Niedostępna</td><td></td></tr><tr><td>probówka stożkowa, 50ml</td><td>SPL LIFE SCIENCES</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme R-10</td><td>YAKULT PHARMACEUTICAL IND.</td><td>Niedostępna</td><td></td></tr><tr><td>celulaza ONOZUKA R-10</td><td>YAKULT PHARMACEUTICAL IND.</td><td>Niedostępne</td><td></td></tr><tr><td>ALBUMINA, BYDLĘCA (BSA)</td><td>VWR</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>SIGMA</td><td>M1902-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CHLOREK WAPNIA, DIHYDRAT</td><td>MP BIOMEDICALS</td><td>0219463505-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Twister</td><td>VISION SCIENTIFIC</td><td>VS-96TW</td><td></td></tr><tr><td>Sitka do CD-1</td><td>SIGMA</td><td>S1145</td><td></td></tr><tr><td>Sitka do CD-1</td><td>SIGMA</td><td>S3895</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>SPL LIFE SCIENCES</td><td>10090</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura</td><td>HILGENBERG</td><td>3150102</td><td></td></tr><tr><td>WIRÓWKA LABORATORYJNA /</td><td>WIZJA</td> LABORATORYJNA SCIENTIFIC <td>VS-5500N</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>JUNSEI</td><td>19015S0350</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>SIGMA</td><td>P3911-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-GLUKOZA, BEZWODNA</td><td>BIO BASIC</td><td>GB0219</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu</td><td>DUKSAN</td><td>40</td><td></td></tr><tr><td>Czterowodny azotan wapnia</td><td>SIGMA</td><td>C2786-500G</td><td></td></tr><tr><td>Poli(glikol etylenowy)</td><td>SIGMA</td><td>P2139-2KG</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu sześciowodny</td><td>SIGMA</td><td>M2393-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tubka 13ml, 100x16mm, PP</td><td>SARSTEDT</td><td>55.515</td><td></td></tr><tr><td>Preparaty mikroskopowe</td><td>MARIENFELD</td><td>1000412</td><td></td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe do mikroskopów</td><td>MARIENFELD</td><td>101030</td><td></td></tr><tr><td>Komora licząca</td><td>MARIENFELD</td><td>650030</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop obrazowy Axioplan 2</td><td>Carl Zeiss</td><td>Niedostępny</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówka 1,5 ml</td><td>SARSTEDT</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>2- Merkaptoetanol</td><td>SIGMA</td><td>M3148-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS), klasa proteomiczna</td><td>VWR</td><td>M107-500G</td><td></td></tr><tr><td>TRIS, ultra czysty VWR</td><td></td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-Ditiothreitol), klasa biotechnologiczna</td><td>VWR</td><td>0281-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa niebieskiego bromofenolu ACS</td><td>VWR</td><td>0312-50G</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>JUNSEI</td><td>27210S0350</td><td></td></tr><tr><td>Living Colors A.v. Przeciwciało monoklonalne (JL-8)</td><td>TAKARA</td><td>632381</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie importu białek do chloroplastów przy użyciu protoplastów

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

Chloroplast jest niezbędnym organellem, który jest odpowiedzialny za różne procesy komórkowe w roślinach, takie jak fotosynteza i produkcja wielu wtórnych metabolitów i lipidów. Chloroplasty wymagają dużej liczby białek do tych różnych procesów fizjologicznych. Ponad 95% białek chloroplastowych jest kodowanych przez jądro i importowanych do chloroplastów z cytozolu po translacji na rybosomy cytozolowe. Tak więc właściwy import lub ukierunkowanie tych kodowanych przez jądro białek chloroplastowych na chloroplasty jest niezbędne do prawidłowego funkcjonowania chloroplastów, a także komórki roślinnej. Białka chloroplastowe kodowane w jądrze zawierają sekwencje sygnałowe do specyficznego kierowania na chloroplasty. Maszyneria molekularna zlokalizowana w chloroplastie lub cytozolu rozpoznaje te sygnały i przeprowadza proces importu. Aby zbadać mechanizmy importu białek lub kierowania ich do chloroplastów in vivo, opracowaliśmy szybką, wydajną metodę analizy importu białek do chloroplastów rzodkiewnika (Arabidopsis) opartą na protoplastach. W tej metodzie wykorzystujemy protoplasty wyizolowane z tkanek liści rzodkiewnika. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół użycia protoplastów do zbadania mechanizmu, za pomocą którego białka są importowane do chloroplastów.

Import białek do chloroplastów można badać za pomocą dwóch metod: mikroskopii fluorescencyjnej oraz analizy immunoblotowej po rozdziale za pomocą SDS-PAGE. W niniejszej pracy wykorzystano RbcS-nt:GFP, konstrukt fuzyjny kodujący 79 reszt aminokwasowych końca N-terminalnego RbcS zawierających peptyd sygnałowy, połączony z GFP. Podczas importu białek do chloroplastów sygnały zielonej fluorescencji białka docelowego RbcS-nt:GFP powinny nakładać się na czerwone sygnały fluorescencyjne pochodzą...

Tutaj opisujemy protokół ekspresji białek do protoplastów za pomocą metody transformacji za pośrednictwem PEG. Metoda ta zapewnia łatwą ekspresję białek będących przedmiotem zainteresowania oraz efektywne badanie lokalizacji białek i procesu importu dla różnych warunków eksperymentalnych in vivo.

Badanie importu białek do chloroplastów przy użyciu protoplastów

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Ta tajemnica może pomóc odpowiedzieć na kilka pytań z dziedziny biologii komórki, takich jak wprowadzanie białek do chloroplastów. Główną zaletą tej technologii jest to, że wprowadzanie białek do chloroplastów może być badane w warunkach en vivo. Procedurę zademonstrują Junho Lee i Hyangju Kang, dwaj pracownicy mojego laboratorium.Na początek zbierz nienaruszone tkanki liści z dwutygodniowych roślin z jednej do dwóch płytek B5. Użyj noża chirurgicznego, aby zebrać liście i umieść je w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów zawierającej 25 mililitrów roztworu enzymatycznego. Umieścić probówkę poziomo na wytrząsarce obrotowej i inkubować z delikatnym mieszaniem w temperaturze 22 stopni Celsjusza w ciemności przez osiem do 12 godzin, aż w roztworze pozostaną tylko ogonki liściowe i łodygi.Po zakończeniu inkubacji przefiltrować roztwór enzymu zawierający uwolnione protoplasty przez siatkę o wielkości porów 140 mikrometrów do świeżej szalki Petriego. Następnie ostrożnie ułóż roztwór na 15 mililitrach 21% roztworu sacharozy w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Odwirować probówkę w obracającym się wirniku kubełkowym o masie 98 g przez 10 minut przy najniższych ustawieniach przyspieszania i zwalniania.Następnie za pomocą pipety patura ostrożnie usuń protoplasty z najwyższej warstwy zawierającej roztwór enzymu oraz z granicy faz między roztworem enzymów a roztworem sacharozy. Przenieś ten roztwór do 50-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej 30 mililitrów roztworu W5 i odwróć probówkę do wymieszania. Odwirować probówkę o masie 51 g przez sześć minut.Za pomocą pipety ostrożnie usunąć ten supernatant, nie naruszając protoplastów w osadzie. Dodaj 25 mililitrów roztworu W5 i delikatnie ponownie zawiesić protoplasty. W celu stabilizacji inkubować w lodówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę.Po inkubacji w czterech stopniach Celsjusza całkowicie osadzaj protoplasty, odwirowując je w temperaturze 46 g przez dwie minuty. Ostrożnie całkowicie usuń supernatent i dodaj roztwór MANG do osadu protoplastu, aby uzyskać pięć razy dziesięć do sześciu na mililitr. Za pomocą pipety dodaj 10 mikrogramów DNA osocza i 300 mikrolitrów roztworu protoplastu do świeżej 13-mililitrowej probówki z okrągłym dnem.Wymieszaj, delikatnie obracając ręcznie tubki, a następnie natychmiast dodaj 300 mikrolitrów świeżo przygotowanego 40% roztworu PEG. Wymieszaj całkowicie, przechylając tubkę prawie poziomo i kilkakrotnie delikatnie obracając ją ręcznie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Następnie dodaj jeden mililitr roztworu W5 i całkowicie wymieszaj, delikatnie obracając rurkę ręcznie, jak poprzednio. Inkubować próbkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz jeszcze dwa razy, dodając najpierw 1,5 mililitra, a następnie dwa mililitry W5 i po ostatnim dodaniu i wymieszaniu inkubować przez 30 minut.Odwirować probówkę o masie 46 g przez cztery minuty, a następnie wyrzucić supernatant. Dodaj dwa mililitry roztworu W5 do granulki i delikatnie wymieszaj, ale całkowicie, w taki sam sposób jak poprzednio. Inkubować w temperaturze 22 stopni Celsjusza w ciemnej komorze przez 18 godzin.Aby przeanalizować import białka za pomocą mikroskopii florescencyjnej, użyj pipety z przyciętą końcówką, aby umieścić 10 mikrolitrów roztworu protoplastu na szkiełku podstawowym. Użyj szkiełka nakrywkowego, aby ostrożnie przykryć roztwór, aby uniknąć uszkodzenia protoplastów. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego z filtrem wstępnym wzbudzenia, który jest ustawiony na obserwację białka zielonej fluorescencji i autofluorescencji chlorofilu.Użyj chłodzonej kamery z parą ładowaną, aby przechwytywać obrazy i przetwarzać je za pomocą oprogramowania do edycji obrazów w celu tworzenia pseudokolorowych obrazów. W celu całkowitej ekstrakcji białka i immunoblottingu usuń jeden mililitr z roztworu protoplastu i wymieszaj pozostały jeden mililitr. Przenieść ten roztwór protoplastu do probówki wirówkowej i wirować w temperaturze 46 g przez cztery minuty.Po zakończeniu wirowania usunąć supernatant i dodać 80 mikrolitrów buforu denaturacyjnego. Wiruj energicznie przez pięć sekund. Dodać pięć próbek buforowych XDS, dobrze wymieszać i gotować przez 10 minut w celu denaturacji.Postępuj zgodnie ze standardową stroną STS i immunoblottingiem z przeciwciałem anty-GFP. RbcS i TGFT, konstrukt fuzyjny kodujący 79 końcowych reszt aminokwasowych RBCS zawierających peptyd tranzytowy połączony z GFP, wykorzystano do zbadania importu białek do chloroplastów za pomocą mikroskopii florescencyjnej i immunoblottingu. Podczas badania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej zielone sygnały fluorescencyjne z białka docelowego łączyły się z czerwonymi sygnałami fluorescencyjnymi z autoflorescencji chlorofilu, co wskazuje na import białka do chloroplastów.Po wyizolowaniu białka całkowitego w immunoblot obserwuje się dwa prążki białkowe, co pokazuje, że białko zostało prawidłowo zaimportowane do chloroplastów. Górne pasmo odpowiada prekursorowi o pełnej długości, a dolne pasmo postaci przetworzonej po przywozie do chloroplastów. Ilość przetworzonej formy białka zwiększyła się w sposób zależny od czasu, co sugeruje, że białko jest importowane do chloroplastów.Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią komórki, którzy badali zmęczenie białek lub zrywanie nici błonowych u rzodkiewnika.

studying-protein-import-into-chloroplasts-using-protoplasts

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Tworzenie kompleksów białkowych in vivo można wizualizować za pomocą dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji. Partnerzy interakcji są łączeni z komplementarnymi częściami znaczników fluorescencyjnych i przejściowo ulegają ekspresji w liściach tytoniu, co skutkuje odtworzonym sygnałem fluorescencyjnym po bliskim zbliżeniu dwóch białek.

Interakcje białko-białko uwidocznione przez dwucząsteczkową komplementację fluorescencyjną w protoplastach i liściach tytoniu

Tutaj opisujemy nową metodę badania importu białek do izolowanych chloroplastów pod wpływem stresu. Metoda jest szybka i prosta i może być stosowana do badania konsekwencji różnych warunków stresowych dla importu białka chloroplastowego i odpowiednich mechanizmów regulacyjnych.

Analiza importu białek do chloroplastów wyizolowanych z roślin zestresowanych

Tutaj prezentujemy protokół przechwytywania interaktomii zastosowany do protoplastów mezofilu z liści Arabidopsis thaliana. Metoda ta opiera się w dużej mierze na sieciowaniu UV in vivo i pozwala na izolację i identyfikację białek wiążących mRNA roślin ze środowiska fizjologicznego.

Wychwytywanie interaktomu mRNA z protoplastów roślinnych

Prezentujemy tutaj protokoły do wysokowydajnej izolacji fizjologicznie aktywnych tylakoidów i testów transportu białek dla szlaków translokacji bliźniaczej argininy chloroplastów (cpTat), wydzielniczej (cpSec1) i rozpoznawania sygnałów cząstek (cpSRP).

Izolacja fizjologicznie aktywnych tylakoidów i ich zastosowanie w testach transportu białek zależnych od energii

Prezentujemy tutaj sprawdzony i przetestowany protokół oczyszczania kompleksów importujących białka chloroplastowe (kompleks TOC-TIC) za pomocą znacznika TAP. Jednoetapowy protokół izolacji powinowactwa może być potencjalnie zastosowany do dowolnego białka i może być wykorzystany do identyfikacji nowych partnerów interakcji za pomocą spektrometrii mas.

Oczyszczanie powinowactwa kompleksów białkowych chloroplastów translokonu za pomocą znacznika TAP

Tutaj opisujemy metodę oczyszczania nienaruszonych chloroplastów z liści Arabidopsis i ich trzech głównych podkomór (otoczka, zrąb i tylakoidy), używając kombinacji wirowania różnicowego, ciągłych gradientów Percoll i nieciągłych gradientów sacharozy. Metoda ta jest cenna dla subplastydialnej i subkomórkowej lokalizacji białek za pomocą immunoblottingu i proteomiki.

Przygotowanie podkompartmentów chloroplastowych z Arabidopsis do analizy lokalizacji białek za pomocą immunoblottingu lub proteomiki

Mitochondria są kluczowymi organellami metabolicznymi, które wykazują wysoki poziom plastyczności fenotypowej w mięśniach szkieletowych. Import białek z cytozolu jest krytycznym szlakiem biogenezy organelli, niezbędnym do ekspansji retikulum i utrzymania funkcji mitochondriów.  Dlatego import białka służy jako barometr zdrowia komórek.

Pomiar zdolności importowej białek z mitochondriów mięśni szkieletowych

Ten artykuł opisuje metodę oceny interakcji i zespołów integralnych białek błonowych in vitro z różnymi czynnikami partnerskimi w środowisku lipidowo-proksymalnym.

Wykorzystanie liposomów rusztowania do odtworzenia interakcji lipidowo-proksymalnych białko-białko in vitro

Elastyczność konformacyjna odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu białek. W tym artykule opisujemy zastosowanie czasowo-rozdzielczej spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą sprzężoną z wymianą wodorowo-deuterową do badania szybkich zmian strukturalnych, które napędzają funkcję w uporządkowanych i nieuporządkowanych białkach.

Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

Tutaj prezentujemy protokół beztlenowego oczyszczania białek, koncentracji białka beztlenowego i późniejszej charakterystyki kinetycznej za pomocą systemu elektrod tlenowych. Metodę zilustrowano przy użyciu enzymu DesB, enzymu dioksygenazy, który jest bardziej stabilny i aktywny, gdy jest oczyszczany i przechowywany w środowisku beztlenowym.

Oczyszczanie białek beztlenowych i analiza kinetyczna za pomocą elektrody tlenowej do badania aktywności i inhibicji dioksygenazy DesB

Poznaj metodę transformacji PEG do badania lokalizacji białek i ich importu do chloroplastów w protoplastach roślinnych. Protokół umożliwia analizę procesów komórkowych in vivo.

Badanie importu białek do chloroplastów przy użyciu protoplastów

Przeglądaj więcej filmów