Name: Wytwarzanie kationowych nanoliposomów w celu efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Poznaj metodę suchych filmów do wytwarzania kationowych nanoliposomów dla efektywnego dostarczania mRNA in vitro. Technika zwiększa ekspresję białek bez wpływu na żywotność komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Wytwarzanie kationowych nanoliposomów (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)
<ol>
	<li>Rozpuścić lipidy DC-cholesterolu (chlorowodorek cholesterolu 3β-[N-(N′,N′-dimetyloaminoetanu)-karbamoilo]cholesterolu) i DOPE (dioleoilofosfatydyloetanoloamina), dostarczane w postaci proszku, w chloroformie, aby osiągnąć końcowe stężenie 25 mg/ml. 
	Uwaga: Rozpuszczone lipidy przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Pracować z roztworem podstawowym obu lipidów o stężeniu 25 mg/ml. Zmieszać 40 μl rozpuszczonego cholesterolu DC i 80 μl rozpuszczonego DOPE w szklanej kolbie. 
	Uwaga: Całkowita ilość lipidów wynosi 3 mg. Aby uniknąć szybkiego odparowania chloroformu, podczas pipetowania należy umieścić lipidy na lodzie.</li>
	<li>Odparowywać chloroform przez 15 minut pod strumieniem argonu. Następnie napełnij eksykator żelem krzemionkowym, umieść w nim otwartą szklaną kolbę i zastosuj próżnię przez noc, aby upewnić się, że pozostały chloroform odparował, a wewnątrz szklanej kolby utworzy się film lipidowy. 
	Uwaga: Pracuj szybko i unikaj niepotrzebnego kontaktu O2</li>.
	<li>Uformowany film lipidowy należy ponownie uwodnić 1 ml wody wolnej od nukleaz i wirować zawiesinę przez 15 minut (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A). Następnie umieść zawiesinę w kąpieli sonizacyjnej na 1 godzinę (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). 
	Uwaga: Zawieszenie będzie lekko mętne.</li>
	<li>Zmontuj mini ekstruder zgodnie z instrukcjami producenta, napełnij strzykawkę zawiesiną lipidową i umieść napełnioną strzykawkę i pustą strzykawkę po obu stronach ekstrudera. Przeciśnij zawiesinę lipidową przez membranę z jednej strzykawki do drugiej, 20x – 25x, aby wytłoczyć zawiesinę (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2C). 
	Uwaga: Rozmiar NLps zależy od wielkości porów zastosowanej membrany.</li>
	<li>Przechowywać NLps w szklanej kolbie w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia. 
	Uwaga: Po dłuższym czasie przechowywania, NLps należy ponownie umieścić w łaźni sonizacyjnej na 15 minut przy 35 kHz, aby obejść tworzenie się kompleksu.</li>
</ol>
2. Transkrypcja in vitro syntetycznego mRNA
<ol>
	<li>Przygotuj mRNA kodujące eGFP zgodnie z opublikowanym wcześniej protokołem34.</li>
	<li>Amplifikuj sekwencję eGFP z plazmidu za pomocą 0,7 μM starterów do przodu (5'-TTG, GAC, CCT, CGT, ACA, GAA, GCT, AAT, ACG-3') i odwrotnie (5'-T,120 CTT, CTT, ACT, CAG, GCT, TTC, AAA, GAC, CA-3') oraz zestawu polimerazy z PCR.
	<ol>
		<li>Wymieszaj 20 μl komercyjnego roztworu buforowego, który zmienia topnienie DNA (tabela materiałów), a także 20 μl 5-krotnej mieszanki z zestawu polimerazy. Dodać 7 μl każdego startera (do przodu i do tyłu).</li>
		<li>Dodać 25 ng plazmidu eGFP do mieszaniny i 2 μl polimerazy z zestawu do polimerazy. 
		Uwaga: Utrzymuj polimerazę na lodzie przed pipetowaniem jej do roztworu.</li>
		<li>Do mieszaniny dodać H2O wolne od nukleaz do objętości 100 μl.</li>
		<li>Uruchom cykle PCR w termocyklerze zgodnie z protokołem w Tabeli 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyść sekwencję DNA kodującą eGFP za pomocą zestawu do oczyszczania PCR.
	<ol>
		<li>Dlatego roztwór PCR należy wymieszać z 500 μl buforu wiążącego z zestawu i użyć go do napełnienia kolumn oczyszczających.</li>
		<li>Odwirować kolumny z maksymalną prędkością przez 1 minutę i wyrzucić filtrat.</li>
		<li>Dodać 750 μl buforu płuczącego I do kolumny, ponownie odwirować z maksymalną prędkością przez 1 minutę i wyrzucić filtrat.</li>
		<li>Powtórz krok wirówki 1x, aby usunąć bufor z filtra kolumnowego.</li>
		<li>Przenieść kolumnę do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Dodać 20 μl H2O wolnego od nukleaz do kolumny, inkubować przez 1 minutę i wirować przez 1 minutę z maksymalną prędkością. Powtórz ten krok.</li>
		<li>Zmierzyć stężenie DNA za pomocą fotometru i przechowywać je w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Wykonaj analizy jakości DNA za pomocą elektroforezy żelowej. Dodać 0,5 g agarozy do buforu Tris-Borate-EDTA (TBE) i podgrzać w kuchence mikrofalowej na dużym ogniu, aż agaroza całkowicie się rozpuści.</li>
		<li>Do ciekłej agarozy dodać 5 μl roztworu barwiącego żel, wlać roztwór do komory żelowej i poczekać, aż żel się spolimeryzuje.</li>
		<li>Wymieszać 200 ng DNA z 2 μl 6-krotnie obciążającego barwnika i napełnić go do końcowej objętości 12 μl. Odpipetować drabinkę DNA wraz z próbką DNA do studzienek żelowych i uruchomić elektroforezę przez 1 godzinę przy napięciu 100 V.</li>
		<li>Przeanalizuj żel za pomocą stacji do analizy żelu w świetle UV.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom transkrypcję in vitro, aby wygenerować mRNA z sekwencji DNA za pomocą zestawu do transkrypcji in vitro zawierającego polimerazę T7 i zastąp zmodyfikowane nukleotydy UTP i CTP Ψ-UTP i metylo-CTP.
	<ol>
		<li>W przypadku transkrypcji in vitro należy wymieszać składniki zgodnie z tabelą 2. 
		Uwaga: Zastąp 1,5 μl metylo-CTP 1:10 Cy3-CTP rozcieńczonym w wolnym od nukleazH2Opodczas transkrypcji in vitro mRNA eGFP, aby uzyskać znakowanie Cy3 mRNA.</li>
		<li>Inkubować mieszaninę reakcyjną IVT przez 4 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Dodać 1 μl DNazy I z zestawu do polimerazy T7 i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C w celu wytrawienia matrycy DNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby oczyścić mRNA, użyj zestawu do czyszczenia RNA.
	<ol>
		<li>Napełnić mieszaninę IVT do objętości 100 μl H2O bez nukleaz.</li>
		<li>Dodać 350 μl buforu do lizy i mieszać, pipetując w górę i w dół.</li>
		<li>Dodaj 250 μl 100% etanolu i ponownie wymieszaj. Odpipetować mieszaninę do kolumn czyszczących.</li>
		<li>Wirować przez 15 s przy 8 000 x g i wyrzucić filtrat.</li>
		<li>Dodać 500 μl buforu płuczącego do kolumny, ponownie odwirować przez 15 s przy 8 000 x g i usunąć filtrat.</li>
		<li>Przemyć kolumnę 1x 500 μl buforu płuczącego i odwirować przez 2 minuty przy 8 000 x g.</li>
		<li>Przenieść kolumnę do świeżej probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml. Eluować mRNA 2x przez 1-minutową inkubację 20 μl wolnego od nukleazH2Ona membranie kolumny, a następnie 1-minutowe wirowanie z maksymalną prędkością.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń grupy fosforanowe z mRNA za pomocą zestawu do defosforylacji. Dodać 4,5 μl 10x buforu fosfatazy i 1 μl fosfatazy do mRNA i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Ponownie oczyść mRNA, wykonując kroki 2.5.1 - 2.5.7.</li>
	<li>Zmierz harmonijność mRNA za pomocą fotometru.</li>
	<li>Użyj elektroforezy żelowej, aby przeanalizować czystość i wielkość mRNA. Dlatego przygotuj żel agarozowy zgodnie z opisem w krokach 2.3.9 - 2.3.10.
	<ol>
		<li>Wymieszaj 3,3 μl formamidu, 1 μl 37% formaldehydu, 1 μL 10x MEN i 1,7 μL 6x barwnika ładującego z 200 ng mRNA i wypełnij do 10 μl wolnym od nukleazH2Odla każdej próbki i markera RNA.</li>
		<li>Inkubować mieszaninę przez 10 minut w temperaturze 65 °C w celu denaturacji mRNA. Załaduj dołki żelu markerem mRNA i RNA i uruchom żel przez 1 godzinę przy napięciu 100 V.</li>
		<li>Przeanalizuj żel za pomocą żelowej stacji doc ze światłem UV.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Kompleksowanie syntetycznego mRNA
<ol>
	<li>Rozmrozić syntetyczne mRNA na lodzie, odwirować je i odwirować na krótko przed otwarciem probówki.</li>
	<li>Wymieszaj 10 μl syntetycznego mRNA (stężenie mRNA wynosi 100 ng/μL) z 1 μl, 2,5 μL, 5 μL, 10 μL lub 20 μL zawiesiny NLp (stężenie NLp wynosi 3 mg/ml). Krótko odwirować i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT) w celu wytworzenia nanolipoplex. 
	Uwaga: Nie mieszać przez pipetowanie. Może to prowadzić do utraty objętości. Krótko zwirować, aby dokładnie wymieszać.</li>
	<li>Dodaj 1 ml zwykłej pożywki komórkowej do nanolipopleksów i wymieszaj je, pipetując w górę iw dół.</li>
</ol>
4. Analiza skuteczności enkapsulacji nanoliposomów
<ol>
	<li>Aby przeprowadzić eksperymenty z enkapsulacją, użyj zestawu do kwantyfikacji RNA.</li>
	<li>Przygotuj roztwór roboczy, rozcieńczając barwnik fluorescencyjny w stosunku 1:200 dla testu wysokiego zakresu i 1:2 000 dla testu niskiego zakresu. 
	Uwaga: Rozmrozić barwnik fluorescencyjny na lodzie. Roztwór roboczy należy przygotować bezpośrednio przed użyciem.</li>
	<li>Przygotować krzywe wzorcowe wysokiego i niskiego zakresu, używając 1 ml roztworu podstawowego mRNA eGFP o stężeniu 2 μg/ml w wolnym od nukleazH2O. 
	Uwaga: W przypadku krzywych wzorcowych należy użyć mRNA, które zostanie użyte w eksperymentach z enkapsulacją.</li>
	<li>Tabela 3 służy do przygotowania wzorca wysokiego zakresu (20 ng/ml - 1 μg/ml).</li>
	<li>W przypadku wzorca niskiego zakresu rozcieńczyć roztwór podstawowy mRNA eGFP w proporcji 2 μg/ml w stosunku 1:20, aby uzyskać końcowe stężenie 100 ng/ml. Przygotować wzorzec niskiego zakresu (1 ng/ml - 50 ng/ml) zgodnie z opisem w tabeli 4.</li>
	<li>Połączyć 1 μg mRNA eGFP (10 μl) i 7,5 μg NLps (2,5 μl) i inkubować przez 20 minut w temperaturze RT. 
	Uwaga: Utrzymuj mRNA na lodzie, aby uniknąć degradacji.</li>
	<li>Dodać 1 ml H2Owolnego od nukleaz, aby utworzyć nanolipopleksy i mieszać, pipetując w górę iw dół.</li>
	<li>Dodać 1 ml roztworu roboczego barwnika fluorescencyjnego 1:200 lub 1:2,000 RNA do kapsułkowanych próbek i wzorców i inkubować przez 5 minut w temperaturze RT w ciemności.</li>
	<li>Odpipetować wzorce i próbki w dwóch egzemplarzach do czarnej 96-dołkowej płytki i zmierzyć fluorescencję przy 530 nm na czytniku mikropłytek (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
</ol>
5. Przygotowanie komórek do transfekcji
<ol>
	<li>Płytka 1,5 x 105 komórek/basenik A549 na płytce 12-dołkowej 1 d przed transfekcją.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w zwykłej pożywce komórkowej (DMEM/wysoka glukoza z 10% płodową surowicą bydlęcą [FBS], 2 mM L-glutamina, 1% penicylina/streptomycyna) przez 24 godziny przed transfekcją.</li>
</ol>
6. Transfekcja komórek
<ol>
	<li>Przygotowane komórki przemyć 1x 1 ml/studzienkę PBS (bez Ca2+/Mg2+).</li>
	<li>Dodać 1 ml przygotowanej mieszaniny nanolipoplex, zawierającej 1 μg mRNA eGFP zamkniętego w 1 μl, 2,5 μl, 5 μl, 10 μl lub 20 μl NLps, do jednego dołka przygotowanej płytki z komórkami A549.</li>
	<li>Dodaj zawiesinę nanolipoplex do komórek i inkubuj w regularnych warunkach przez 24 godziny w celu analizy skuteczności transfekcji lub przez 24 godziny i 72 godziny w celu analizy żywotności komórek po transfekcji. 
	Uwaga: Transfekcja z NLps nie wymaga zmiany podłoża.</li>
</ol>
7. Analiza skuteczności transfekcji komórek za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii fluorescencyjnej
<ol>
	<li>Usunąć supernatant i przemyć komórki 1 ml/basenik PBS (bez Ca2+/Mg2+) w celu usunięcia pozostałych NLps.</li>
	<li>Przygotuj komórki do cytometrii przepływowej.
	<ol>
		<li>Trypsynizować komórki za pomocą 500 μl/studzienka trypsyna/EDTA (0,05%) w temperaturze 37 °C przez 3 minuty. Zatrzymaj proces i dezaktywuj trypsynę, dodając taką samą ilość (500 μl / dołek) zwykłej pożywki zawierającej FBS.</li>
		<li>Odwirować komórki przez 5 minut przy 400 x g i ostrożnie usunąć supernatant bez dotykania osadu komórkowego.</li>
		<li>Umyj komórki 1 ml PBS (bez Ca2+ / Mg2 +).</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 300 μl 1x roztworu utrwalającego i przenieść komórki do probówek do cytometrii przepływowej.</li>
		<li>Przeanalizuj komórki przy długości fali 488 nm w cytometrze przepływowym (<klasa silna="xfig">Rysunek 4A). 
		Uwaga: Wiruj komórki 1x bezpośrednio przed pomiarem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj komórki do mikroskopii fluorescencyjnej.
	<ol>
		<li>Utrwalić komórki 1 ml/studzienkę 100% metanolu, który był wcześniej przechowywany w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Dodać 500 μl/basenik 300 nM DAPI (4′,6-diamidyno-2-fenyloindol) rozpuszczony w PBS (bez Ca2+/Mg2+) i inkubować przez 5 minut w ciemności.</li>
		<li>Usunąć roztwór DAPI i ponownie umyć komórki 100% metanolem przechowywanym w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przeanalizuj komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B). 
		Uwaga: Należy stosować następujące długości fal wzbudzenia/emisji: eGFP 488/509 nm, DAPI 358/461 nm i Cy3 550/570 nm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Test żywotności komórek
<ol>
	<li>Rozpuścić 5 mg MTT (bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolu) w 1 ml RPMI (bez czerwieni fenolowej). 
	Uwaga: Przed użyciem rozpuszczony MTT należy dodatkowo rozcieńczyć w stosunku 1:10 (końcowe stężenie: 0,5 mg/ml) w RPMI.</li>
	<li>Przemyć transfekowane komórki 3x 1 ml/studzienkę PBS (bez Ca2 + / Mg2). 
	Uwaga: Resztki zwykłej pożywki komórkowej należy całkowicie usunąć.</li>
	<li>Dodać 500 μl/basenik rozcieńczonego roztworu MTT w stosunku 1:10 do komórek i inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Usunąć roztwór MTT z komórek po inkubacji i dodać 500 μl/dołek DMSO (dimetylosulfotlenek). Inkubować ponownie przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odpipetować roztwór DMSO w trójkach do 96-dołkowej płytki z przezroczystym dnem i zmierzyć adsorpcję przy długości fali 540 nm za pomocą czytnika mikropłytek.</li>
	<li>Ustaw żywotność nieleczonej komórki na 100% i oblicz żywotność komórek innych grup w porównaniu z nieleczonymi komórkami kontrolnymi (<silna klasa = "xfig">Rysunek 5).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Prezentowany protokół opisuje wytwarzanie NLps o wysokiej skuteczności enkapsulacji dla syntetycznie modyfikowanego mRNA, a także niezawodną transfekcję komórek in vitro. Co więcej, NLps gwarantują uwalnianie mRNA, które z kolei jest tłumaczone na funkcjonalne białko wewnątrz komórek. Dodatkowo, transfekcje za pomocą NLps mogą być wykonywane w zwykłej pożywce komórkowej, co skutkuje wysoką żywotnością komórek podczas transfekcji i trwa do trzech dni po transfekcji.
Aby używać mRNA jak...

Wykorzystanie zmodyfikowanego mRNA do zastosowań terapeutycznych wykazało ogromny potencjał w ciągu ostatnich kilku lat. W chorobach sercowo-naczyniowych, zapalnych i monogenetycznych, a także w opracowywaniu szczepionek, mRNA jest obiecującym środkiem terapeutycznym1.
Terapia zastępcza białkami z wykorzystaniem mRNA oferuje kilka zalet w porównaniu z klasyczną terapią genową, która opiera się na transfekcji DNA do komórek docelowych2. Funkcja mRNA rozpoczyna się bezpośrednio w cytozolu. Chociaż plazmidowe DNA (pDNA), konstrukt dwuniciowego, kolistego DNA zawierającego region promotorowy i sekwencję genu kodującą białko terapeutyczne3, działa również w cytozolu, może być włączony tylko do komórek, które przechodzą mitozę w momencie transfekcji. Zmniejsza to liczbę transfekowanych komórek w tissue1,4. W szczególności transfekcja tkanek o słabej aktywności mitozy, takich jak komórki serca, jest trudna5. W przeciwieństwie do pDNA, transfekcja i translacja mRNA zachodzą w komórkach mitotycznych i niemitotycznych w klasie tissue1,6. Wirusowa integracja DNA z genomem gospodarza może mieć skutki mutagenne lub reakcje immunologiczne7,8, ale po transfekcji komórek z mRNA kodującym białko, synteza de novo pożądanego białka rozpoczyna się autonomicznie9,10. Co więcej, synteza białek może być precyzyjnie dostosowana do potrzeb pacjenta poprzez indywidualne dawki, bez ingerencji w genom i ryzyka skutków mutagennych11. Potencjał aktywacyjny układu immunologicznego syntetycznie generowanego mRNA można radykalnie obniżyć, stosując pseudo-urydynę i 5'-metylocytydynę zamiast urydyny i cytydyny12. Wykazano również, że mRNA modyfikowane pseudo-urydyną ma zwiększoną stabilność biologiczną i znacznie wyższą zdolność translacyjną13.
Aby móc korzystać z obiecujących właściwości terapii opartej na mRNA w zastosowaniach klinicznych, konieczne jest stworzenie odpowiedniego nośnika do transportu mRNA do komórki. Nośnik ten powinien mieć nietoksyczne właściwości in vitro i in vivo, chronić mRNA przed degradacją nukleazy i zapewniać wystarczający wychwyt komórkowy dla przedłużonej dostępności i translacji mRNA14.
Spośród wszystkich możliwych typów nośników do dostarczania leków in vivo, takich jak nanorurki węglowe, kropki kwantowe i liposomy, te ostatnie były najczęściej badane15,16. Liposomy to pęcherzyki składające się z dwuwarstwy lipidowej10. Są amfifilowe z przekrojem hydrofobowym i hydrofilowym, a poprzez samoułożenie tych cząsteczek powstaje sferyczna podwójna warstwa17. Wewnątrz liposomów środki terapeutyczne lub leki mogą być zamknięte w kapsułkach, a tym samym chronione przed degradacją enzymatyczną18. Liposomy zawierające chlorek N-[1-(2,3-dioleyloksy)propylo]-N,N,N-trimetyloamoniowy chlorek (DOTMA)19, [1,2-bis(oleoiloksy)-3-(trimetyloamonio)propanu] (DOTAP)20 i dioctadecylamidoglycylspermine (DOGS)21, lub DC-cholesterol22, są dobrze scharakteryzowane i często używane do transfekcji komórkowej za pomocą DNA lub RNA.
Liposomy kationowe składają się z dodatnio naładowanego lipidu i nienaładowanego fosfolipidu23. Transfekcja za pomocą liposomów kationowych jest jedną z najczęstszych metod transportu kwasów nukleinowych do komórek24,25. Kationowe cząsteczki lipidów tworzą kompleksy z ujemnie naładowanymi grupami fosforanowymi w szkielecie cząsteczek kwasu nukleinowego26. Te tak zwane lipopleksy przyczepiają się do powierzchni błony komórkowej i dostają się do komórki poprzez endocytozę lub mechanizmy podobne do endocytozy27.
W 1989 roku, Malone et al. z powodzeniem opisali kationową transfekcję mRNA za pośrednictwem lipidów28. Jednak przy użyciu mieszaniny DOTMA i 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminy (DOPE), grupa odkryła, że DOTMA wykazywała działanie cytotoksyczne28. Dodatkowo Zohra i wsp. wykazali, że DOTAP (chlorek 1,2-dioleoiloksy-3-trimetyloamoniowo-propanowy) może być stosowany jako odczynnik do transfekcji mRNA29. Jednak w celu efektywnej transfekcji komórek, DOTAP powinien być używany w połączeniu z innymi odczynnikami, takimi jak fibronectin29 lub DOPE30. Do tej pory DOTMA była pierwszym kationowym lipidem na rynku używanym do dostarczania genów31. Inne lipidy są używane jako nośniki terapeutyczne lub są testowane na różnych etapach badań klinicznych (np. EndoTAG-I, zawierający DOTAP jako nośnik lipidów), jest obecnie badany w badaniu klinicznym fazy II32.
Ta praca opisuje protokół generowania NLps zawierających DC-cholesterol i DOPE. Ta metoda jest łatwa do wykonania i pozwala na generowanie NLp o różnych rozmiarach. Ogólnym celem generowania NLp metodą suchego filmu jest stworzenie liposomów do kompleksowania mRNA, umożliwiając w ten sposób wydajną i biokompatybilną transfekcję komórek in vitro14,33.

<table><tbody><tr><td>(bromek (3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolium (MTT)</td><td>AppliChem, Darmstadt, Niemcy</td><td>A2231</td><td></td></tr><tr><td>(3&beta;-[N-(N&prime;,N&prime;-dimetyloaminoetan)-karbamoilo]chlorowodorek cholesterolu (DC-Cholesterol)</td><td>Avanti, Alabama, USA</td><td>700001</td><td></td></tr><tr><td>4&nbsp; &prime;,6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Niemcy</td><td>System D1306</td><td></td></tr><tr><td>BD FACScan BD</td><td>Biosciences, Heidelberg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Fix (10x)</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Niemcy</td><td>340181</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Niemcy</td><td>20385.02</td><td></td></tr><tr><td>Dioleoilophosphatidyloetanoloamina (DOPE)</td><td>Avanti, Alabama, Stany Zjednoczone</td><td>850725</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Zeiss Axio, Oberkochen, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Niemcy</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Mini ekstruder</td><td>Avanti, Alabama, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Qiagen, Hilden, Niemcy</td><td>129114</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Mem</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Niemcy</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>bufor PBS (bez Ca2+/Mg2+)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Niemcy</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>zestaw odczynników Quant-iT Ribo Green RNA</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Niemcy</td><td>Q33140</td><td></td></tr><tr><td>RPMI (bez czerwieni fenolowej)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Niemcy</td><td>11835030</td><td></td></tr><tr><td>Żel krzemionkowy</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>P077</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna/EDTA (0,05%)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Niemcy</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>HotStar HiFidelity Polymerase Kit</td><td>Qiagen, Hilden, Niemcy</td><td>202602</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR</td><td>Qiagen, Hilden, Niemcy</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td> Pseudourydyno-5'-trifosforan (&Psi;-UTP)</td><td>TriLink Biotechnologies, San Diego, USA</td><td>N-1019</td><td></td></tr><tr><td>5-metylocytydyno-5'-trifosforan (metylo-CTP)</td><td>TriLink Biotechnologies, San Diego, USA</td><td>N-1014</td><td></td></tr><tr><td>3-ctp cyjaniny</td><td>PerkinElmer, Baesweiler, Niemcy</td><td></td><td></td>NEL580001EA</tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen, Hilden, Niemcy</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do transkrypcji MEGAscript T7</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Niemcy</td><td>AM1333</td><td></td></tr><tr><td>3&acute;-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog</td><td>New England Biolabs, Ipswich, USA</td><td>S1411L</td><td></td></tr><tr><td>Fosfataza antarktyczna</td><td>Nowość Anglia Biolabs, Ipswich, USA</td><td>M0289S</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Niemcy</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium, Fremont, USA</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>peqGOLD DNA ladder mix</td><td>VWR, Pensylwania, USA</td><td>25-2040</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen 0,5-10kb RNA ladder</td><td>Fisher Scientific, G&ouml; teborg, Szwecja</td><td>11528766</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie kationowych nanoliposomów w celu efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego rna

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Rozwój terapii opartych na informacyjnym RNA (mRNA) do leczenia różnych chorób staje się coraz ważniejszy ze względu na pozytywne właściwości mRNA transkrybowanego in vitro (IVT). Za pomocą mRNA IVT można indukować syntezę de novo pożądanego białka bez zmiany stanu fizjologicznego komórki docelowej. Co więcej, biosynteza białek może być precyzyjnie kontrolowana dzięki przejściowemu działaniu mRNA IVT.
Dla efektywnej transfekcji komórek, nanoliposomy (NLps) mogą stanowić bezpieczny i skuteczny nośnik terapeutycznego mRNA. W badaniu tym opisano protokół generowania bezpiecznych i wydajnych kationowych NLps składających się z DC-cholesterolu i 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminy (DOPE) jako wektora dostarczania mRNA IVT. NLps o określonej wielkości, jednorodnym rozmieszczeniu i wysokiej zdolności kompleksowania i mogą być wytwarzane metodą suchej folii. Ponadto przedstawiamy różne systemy testowe do analizy ich skuteczności kompleksowania i transfekcji przy użyciu mRNA syntetycznego wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (eGFP), a także ich wpływu na żywotność komórek. Ogólnie rzecz biorąc, przedstawiony protokół zapewnia skuteczne i bezpieczne podejście do kompleksowania mRNA, które może przyspieszyć i usprawnić podawanie terapeutycznego mRNA.

Zgodnie z opisanym protokołem, nanoliposomy (NLps) składające się z lipidów DC-cholesterol i DOPE zostały przygotowane metodą suchego filmu (Rysunek 1). Podczas przygotowania roztwór nanoliposomów przechodzi przez różne stadia zmętnienia (Rysunek 2).
Efektywność enkapsulacji NLp można następnie przeanalizować po enkapsulacji 1 µg mRNA kodującego eGFP poprzez oznaczenie ...

Tutaj opisujemy protokół generowania kationowych nanoliposomów, który opiera się na metodzie suchego filmu i może być wykorzystany do bezpiecznego i efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA.

Wytwarzanie kationowych nanoliposomów w celu efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

Protokół ten pozwala na produkcję bezpiecznych i wydajnych nanoliposomów, które mogą być wykorzystywane jako nośniki transfekcji dla terapeutycznego informacyjnego RNA. Te nanoliposomy ułatwiają wychwyt mRNA w komórkach, powodując zwiększony poziom ekspresji białek bez wpływu na żywotność komórek. Główną zaletą tej techniki jest szybkie i łatwe generowanie stabilnych nanoliposomów o określonej wielkości i jednorodnym rozmieszczeniu.Ponadto chronią zamknięte w kapsułkach mRNA przed degradacją i prowadzą do przedłużonej translacji. Procedurę zademonstruje Antonia Link, doktorantka z naszego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować roztwory podstawowe dla lipidów, cholesterolu DC i DOPE, rozpuszczając każdy z nich w chloroformie do końcowego stężenia 25 miligramów na mililitr.Wymieszać 40 mikrolitrów rozpuszczonego cholesterolu DC z 80 mikrolitrami rozpuszczonego DOPE w szklanej kolbie. Odparować chloroform pod strumieniem argonu przez 15 minut. Następnie napełnij eksykator żelem krzemionkowym.Umieść otwartą szklaną kolbę w środku i zastosuj próżnię przez noc, aby upewnić się, że pozostały chloroform odparował. Powstały film lipidowy utworzy się wewnątrz szklanej kolby. Następnego dnia dodaj jeden mililitr wody wolnej od nukleaz, aby nawodnić film lipidowy.I wirować zawiesinę przez 15 minut. Umieścić zawiesinę w łaźni sonikacyjnej na jedną godzinę. Następnie zmontuj mini ekstruder zgodnie z instrukcjami producenta.Napełnij strzykawkę płynną zawiesiną i umieść ją po jednej stronie ekstrudera. Umieścić pustą strzykawkę po drugiej stronie. Przecisnąć zawiesinę lipidową przez błonę z jednej strzykawki do drugiej, około 20-25 razy, aby wycisnąć zawiesinę.Następnie przechowuj nanoliposomy w szklanej kolbie w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będą gotowe do użycia. Najpierw rozmrozić syntetyczne mRNA na lodzie. Zwiruj zamrożone mRNA, a następnie odwiruj je na krótko przed otwarciem probówki.Następnie wymieszaj jeden mikrogram syntetycznego mRNA z różnymi ilościami zawiesiny nanoliposomów. Krótko odwirować i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut w celu wytworzenia nanolipoplexu. Następnie dodaj mililitr zwykłej pożywki komórkowej do nanolipoplexów i mieszaj, pipetując w górę iw dół.Przygotuj komórki na dzień przed transfekcją. Dlatego należy umieścić 150 000 komórek A549 w każdym dołku na 12-dołkowej płytce na dzień przed transfekcją. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i zwykłą pożywką komórkową przez 24 godziny.Następnie następnego dnia umyj każdą studzienkę przygotowanych komórek jeden raz jednym mililitrem PBS. Dodaj jeden mililitr przygotowanej mieszaniny nanolipoplex do jednego z dołków zawierających komórki A549. Inkubować w regularnych warunkach przez 24 godziny, aby przeanalizować wydajność transfekcji, lub przez 24-72 godziny, aby przeanalizować żywotność komórek po transfekcji.Usuń supernatant i umyj każdą studzienkę jednym mililitrem PBS, aby usunąć pozostałe nanoliposomy. Aby przygotować komórki do cytometrii, najpierw dodaj 500 mikrolitrów trypsyny EDTA do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty, aby trypsynizować komórki. Następnie dodaj 500 mikrolitrów zwykłej pożywki zawierającej FBS, aby zatrzymać proces i dezaktywować trypsynę.Odwirować komórki w temperaturze 400 razy G przez pięć minut. I ostrożnie usuń supernatant, nie naruszając osadu komórkowego. Umyj komórki jednym mililitrem PBS.Następnie ponownie zawiesić komórki w 300 mikrolitrach roztworu do utrwalania komórek i przenieść je do probówek do cytometrii przepływowej. Użyj cytometru przepływowego, aby przeanalizować komórki w odległości 488 nanometrów. Aby przygotować komórki do mikroskopii fluorescencyjnej, dodaj jeden mililitr schłodzonego metanolu do każdej studzienki, aby utrwalić komórki.Do każdej studzienki dodać 500 mikrolitrów 300-nanomolowego roztworu DAPI rozpuszczonego w PBS. Wysiaduj w ciemności przez pięć minut. Następnie usuń roztwór DAPI i ponownie umyj komórki 100% metanolem, który wcześniej był przechowywany w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.Użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby przeanalizować komórki przy użyciu pokazanych tutaj długości fal wzbudzenia i emisji. W tym badaniu nanoliposomy są generowane z wysoką skutecznością enkapsulacji dla syntetycznie modyfikowanego mRNA. Korzystając z zestawu do kwantyfikacji RNA, skuteczność enkapsulacji nanoliposomów można analizować po enkapsulacji jednego mikrograma mRNA kodującego eGFP, analizując wolną ilość mRNA, która nie jest zamknięta.Po enkapsulacji mRNA EGFP w różnych ilościach nanoliposomów, powstałe nanolipopleksy można inkubować z komórkami in vitro, a procent komórek eksprymujących eGFP można analizować za pomocą cytometrii przepływowej 24 godziny po transfekcji. Jak widać tutaj, nawet jeden mikrolitr roztworu nanoliposomów wystarczy, aby osiągnąć wysoką transfekcję komórek in vitro. Gdy komórki są transfekowane nanoliposomami zawierającymi mRNA eGFP znakowane Cy3, można uwidocznić obecność mRNA eGFP w cytoplazmie, a także już wytworzonego białka eGFP.Ponieważ transfekcja komórek za pomocą nanolipopleksów może mieć niekorzystny wpływ na komórki, żywotność komórek testowano po 24 godzinach i 72 godzinach po transfekcji. Nie można było wykryć wpływu na żywotność komórek, gdy komórki były traktowane 2,5 lub pięcioma mikrolitrami nanolipopleksów. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby cały czas pracować w środowisku wolnym od etanolu, ponieważ może to zaszkodzić stabilności nanoliposomów.Podczas przygotowywania i mieszania cholesterolu DC z DOPE należy używać szklanej pipety, aby uniknąć zanieczyszczenia rozpuszczonych lipidów rozpuszczalnymi składnikami plastikowych końcówek do pipet. Zgodnie z tym protokołem, wygenerowanymi nanoliposomami można łatwo manipulować w trakcie lub po przygotowaniu. Na przykład włączenie cząsteczek PEG lub specyficznych przeciwciał doprowadziłoby do zwiększenia stabilności lub zainicjowałoby aktywne celowanie w tkanki.Wygenerowane nanoliposomy spełniają niezbędne aspekty bezpieczeństwa i ułatwiają wychwyt mRNA do komórek docelowych. Nanoliposomy skompleksowane specyficznym terapeutycznym nRNA mogą wnieść istotny wkład w rozwój nowych terapii opartych na mRNA, na przykład w dziedzinie inżynierii tkankowej lub terapii substytucyjnej.

generation-cationic-nanoliposomes-for-efficient-delivery-vitro

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Powtarzające się retro-orbitalne iniekcje kompleksów liposomów kationowych/siRNA/ITSN-1s u myszy, co 72 godziny przez 24 dni, skutecznie dostarczają duplex siRNA do mikrokrążenia płuc myszy, zmniejszając ekspresję mRNA i białka ITSN-1s o 75%. Technika ta jest wysoce powtarzalna w modelu zwierzęcym, nie ma żadnych skutków ubocznych i pozwala uniknąć ofiar śmiertelnych.

Długotrwałe wyciszanie intersectin-1 w płucach myszy poprzez wielokrotne dostarczanie specyficznego siRNA przez kationowe liposomy. Ocena efektów knockdown za pomocą mikroskopii elektronowej

Celem tego protokołu jest użycie kationowych/anionowych liposomów z peptydem neurotargetującym jako systemu dostarczania OUN, aby umożliwić siRNA przejście przez BBB.  Optymalizacja systemu dostarczania leków, takich jak siRNA, pozwoliłaby na więcej opcji leczenia prionów i innych chorób neurodegeneracyjnych.

Dostarczanie terapeutycznego siRNA do OUN za pomocą liposomów kationowych i anionowych

Opisujemy metodę użycia superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza pokrytych polietylenoiminą (PEI) do transfekcji makrofagów za pomocą siRNA. Te nanocząstki mogą skutecznie dostarczać siRNA do makrofagów in vitro i in vivo oraz wyciszać ekspresję docelowych genów.

Nanocząstki tlenku żelaza pokryte polietylenopiną jako nośnik do dostarczania małych interferujących RNA do makrofagów in vitro i in vivo

Przedstawiono metody przygotowania i scharakteryzowania właściwości fizykochemicznych i bioaktywności neutralnie naładowanych, reagujących na pH nanocząstek siRNA. Omówiono kryteria skutecznego stosowania nanoleków siRNA, takie jak rozmiar, morfologia, ładunek powierzchniowy, obciążenie siRNA i wyciszanie genów.

Przygotowanie neutralnie naładowanych, reagujących na pH nanocząstek polimerowych do dostarczania cytozolowego siRNA

Nanocząsteczki lipidowe są opracowywane przy użyciu mikroprzepływowej platformy mieszania do enkapsulacji mRNA i DNA.

Formułowanie i charakteryzowanie nanocząstek lipidowych do dostarczania genów przy użyciu platformy mieszania mikroprzepływowego

Metody produkcji nanocząsteczek lipidowych (LNP) oparte na mikroprzepływach przyciągnęły uwagę w systemach dostarczania leków (DDS), w tym w dostarczaniu RNA. Protokół ten opisuje procesy wytwarzania, produkcji LNP (LNP ładowanego siRNA) i oceny LNP przy użyciu naszego oryginalnego urządzenia mikroprzepływowego o nazwie iLiNP.

Produkcja nanocząstek lipidowych obciążonych siRNA za pomocą urządzenia mikroprzepływowego

Używając taniego kationowego polimeru polietyleniminy (PEI), wyprodukowaliśmy cząsteczki lentiwirusowe do stabilnej ekspresji shRNA w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych H9 (hESC) i przejściowo transdukowaliśmy neuronalne komórki progenitorowe (NPC) pochodzące z H9 z wysoką wydajnością.

Dostarczanie shRNA za pośrednictwem lentiwirusów do hESC i NPC przy użyciu taniego kationowego polimeru polietyleniminy (PEI)

Samoorganizująca się nanocząstka peptydu-poloksaminy (PP-sNp) jest rozwijana przy użyciu mikroprzepływowego urządzenia mieszającego do kapsułkowania i dostarczania in vitro transkrybowanego informacyjnego RNA. Opisane mRNA/PP-sNp może skutecznie transfekować hodowane komórki in vitro.

Wydajna transfekcja transkrybowanego mRNA in vitro w hodowanych komórkach przy użyciu nanocząstek peptydowo-poloksaminowych

Tutaj przedstawiono protokół tworzenia nanocząsteczek lipidowych (LNP), które zawierają mRNA kodujące lucyferazy świetlika. Te LNP zostały przetestowane pod kątem ich siły działania in vitro w komórkach HepG2 i in vivo u myszy C57BL / 6.

Testowanie skuteczności in vitro i in vivo nanocząstek mRNA-lipidów powstałych metodą mieszania mikroprzepływowego

Szczegółowy protokół syntezy nanocząsteczek lipidowych (LNP) przy użyciu technologii mieszalnika CIJ (Limited Impinging Jet), w tym dwustrumieniowego CIJ i czterostrumieniowego mieszalnika wirowego z wieloma wlotami (μMIVM), jest zademonstrowany. Mieszalniki CIJ generują powtarzalne, turbulentne środowiska mikromieszania, co skutkuje produkcją monodyspersyjnych LNP.

Synteza nanocząstek lipidowych przez przepływ turbulentny w ograniczonych mieszalnikach strumieniowych z uderzeniem

Poznaj metodę suchych filmów do wytwarzania kationowych nanoliposomów dla efektywnego dostarczania mRNA in vitro. Technika zwiększa ekspresję białek bez wpływu na żywotność komórek.

Wytwarzanie kationowych nanoliposomów w celu efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA

Przeglądaj więcej filmów