Wytwarzanie kationowych nanoliposomów w celu efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA

Protokół ten pozwala na produkcję bezpiecznych i wydajnych nanoliposomów, które mogą być wykorzystywane jako nośniki transfekcji dla terapeutycznego informacyjnego RNA. Te nanoliposomy ułatwiają wychwyt mRNA w komórkach, powodując zwiększony poziom ekspresji białek bez wpływu na żywotność komórek. Główną zaletą tej techniki jest szybkie i łatwe generowanie stabilnych nanoliposomów o określonej wielkości i jednorodnym rozmieszczeniu.

Ponadto chronią zamknięte w kapsułkach mRNA przed degradacją i prowadzą do przedłużonej translacji. Procedurę zademonstruje Antonia Link, doktorantka z naszego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować roztwory podstawowe dla lipidów, cholesterolu DC i DOPE, rozpuszczając każdy z nich w chloroformie do końcowego stężenia 25 miligramów na mililitr.

Wymieszać 40 mikrolitrów rozpuszczonego cholesterolu DC z 80 mikrolitrami rozpuszczonego DOPE w szklanej kolbie. Odparować chloroform pod strumieniem argonu przez 15 minut. Następnie napełnij eksykator żelem krzemionkowym.

Umieść otwartą szklaną kolbę w środku i zastosuj próżnię przez noc, aby upewnić się, że pozostały chloroform odparował. Powstały film lipidowy utworzy się wewnątrz szklanej kolby. Następnego dnia dodaj jeden mililitr wody wolnej od nukleaz, aby nawodnić film lipidowy.

I wirować zawiesinę przez 15 minut. Umieścić zawiesinę w łaźni sonikacyjnej na jedną godzinę. Następnie zmontuj mini ekstruder zgodnie z instrukcjami producenta.

Napełnij strzykawkę płynną zawiesiną i umieść ją po jednej stronie ekstrudera. Umieścić pustą strzykawkę po drugiej stronie. Przecisnąć zawiesinę lipidową przez błonę z jednej strzykawki do drugiej, około 20-25 razy, aby wycisnąć zawiesinę.

Następnie przechowuj nanoliposomy w szklanej kolbie w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będą gotowe do użycia. Najpierw rozmrozić syntetyczne mRNA na lodzie. Zwiruj zamrożone mRNA, a następnie odwiruj je na krótko przed otwarciem probówki.

Następnie wymieszaj jeden mikrogram syntetycznego mRNA z różnymi ilościami zawiesiny nanoliposomów. Krótko odwirować i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut w celu wytworzenia nanolipoplexu. Następnie dodaj mililitr zwykłej pożywki komórkowej do nanolipoplexów i mieszaj, pipetując w górę iw dół.

Przygotuj komórki na dzień przed transfekcją. Dlatego należy umieścić 150 000 komórek A549 w każdym dołku na 12-dołkowej płytce na dzień przed transfekcją. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i zwykłą pożywką komórkową przez 24 godziny.

Następnie następnego dnia umyj każdą studzienkę przygotowanych komórek jeden raz jednym mililitrem PBS. Dodaj jeden mililitr przygotowanej mieszaniny nanolipoplex do jednego z dołków zawierających komórki A549. Inkubować w regularnych warunkach przez 24 godziny, aby przeanalizować wydajność transfekcji, lub przez 24-72 godziny, aby przeanalizować żywotność komórek po transfekcji.

Usuń supernatant i umyj każdą studzienkę jednym mililitrem PBS, aby usunąć pozostałe nanoliposomy. Aby przygotować komórki do cytometrii, najpierw dodaj 500 mikrolitrów trypsyny EDTA do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty, aby trypsynizować komórki. Następnie dodaj 500 mikrolitrów zwykłej pożywki zawierającej FBS, aby zatrzymać proces i dezaktywować trypsynę.

Odwirować komórki w temperaturze 400 razy G przez pięć minut. I ostrożnie usuń supernatant, nie naruszając osadu komórkowego. Umyj komórki jednym mililitrem PBS.

Następnie ponownie zawiesić komórki w 300 mikrolitrach roztworu do utrwalania komórek i przenieść je do probówek do cytometrii przepływowej. Użyj cytometru przepływowego, aby przeanalizować komórki w odległości 488 nanometrów. Aby przygotować komórki do mikroskopii fluorescencyjnej, dodaj jeden mililitr schłodzonego metanolu do każdej studzienki, aby utrwalić komórki.

Do każdej studzienki dodać 500 mikrolitrów 300-nanomolowego roztworu DAPI rozpuszczonego w PBS. Wysiaduj w ciemności przez pięć minut. Następnie usuń roztwór DAPI i ponownie umyj komórki 100% metanolem, który wcześniej był przechowywany w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby przeanalizować komórki przy użyciu pokazanych tutaj długości fal wzbudzenia i emisji. W tym badaniu nanoliposomy są generowane z wysoką skutecznością enkapsulacji dla syntetycznie modyfikowanego mRNA. Korzystając z zestawu do kwantyfikacji RNA, skuteczność enkapsulacji nanoliposomów można analizować po enkapsulacji jednego mikrograma mRNA kodującego eGFP, analizując wolną ilość mRNA, która nie jest zamknięta.

Po enkapsulacji mRNA EGFP w różnych ilościach nanoliposomów, powstałe nanolipopleksy można inkubować z komórkami in vitro, a procent komórek eksprymujących eGFP można analizować za pomocą cytometrii przepływowej 24 godziny po transfekcji. Jak widać tutaj, nawet jeden mikrolitr roztworu nanoliposomów wystarczy, aby osiągnąć wysoką transfekcję komórek in vitro. Gdy komórki są transfekowane nanoliposomami zawierającymi mRNA eGFP znakowane Cy3, można uwidocznić obecność mRNA eGFP w cytoplazmie, a także już wytworzonego białka eGFP.

Ponieważ transfekcja komórek za pomocą nanolipopleksów może mieć niekorzystny wpływ na komórki, żywotność komórek testowano po 24 godzinach i 72 godzinach po transfekcji. Nie można było wykryć wpływu na żywotność komórek, gdy komórki były traktowane 2,5 lub pięcioma mikrolitrami nanolipopleksów. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby cały czas pracować w środowisku wolnym od etanolu, ponieważ może to zaszkodzić stabilności nanoliposomów.

Podczas przygotowywania i mieszania cholesterolu DC z DOPE należy używać szklanej pipety, aby uniknąć zanieczyszczenia rozpuszczonych lipidów rozpuszczalnymi składnikami plastikowych końcówek do pipet. Zgodnie z tym protokołem, wygenerowanymi nanoliposomami można łatwo manipulować w trakcie lub po przygotowaniu. Na przykład włączenie cząsteczek PEG lub specyficznych przeciwciał doprowadziłoby do zwiększenia stabilności lub zainicjowałoby aktywne celowanie w tkanki.

Wygenerowane nanoliposomy spełniają niezbędne aspekty bezpieczeństwa i ułatwiają wychwyt mRNA do komórek docelowych. Nanoliposomy skompleksowane specyficznym terapeutycznym nRNA mogą wnieść istotny wkład w rozwój nowych terapii opartych na mRNA, na przykład w dziedzinie inżynierii tkankowej lub terapii substytucyjnej.