Izolacja, charakterystyka i różnicowanie sercowych komórek macierzystych z serca dorosłej myszy

Ogólnym celem tego artykułu jest standaryzacja protokołu izolacji, charakterystyki i różnicowania sercowych komórek macierzystych, CSC z serca dorosłej myszy. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu chorób układu krążenia i terapii regionalnej, takich jak terapia komórkami macierzystymi serca i niewydolność serca. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest opłacalna, z dużą pomocą w krótkim czasie.

Rozpocznij ten eksperyment od przygotowania wszystkich niezbędnych materiałów, instrumentów i izolacyjnych w stanie wysterylizowanym, zgodnie z opisem w protokole. Po usunięciu skóry z brzucha myszy poddanej eutanazji, przeciąć klatkę piersiową wewnątrz sterylnego kaptura, aby otworzyć klatkę piersiową. Odsłoń serce, a następnie usuń krew w pobliżu serca za pomocą jednomililitrowej strzykawki.

Aby usunąć krew w pobliżu serca, przemyj okolice lodowatym PBS. Używając nożyczek chirurgicznych i pęsety do wypreparowania serca, umieść je na 100-milimetrowej szalce Petriego zawierającej 10 mililitrów lodowatego PBS. Użyj kleszczy z zakrzywionym trzonkiem, aby kołatać serce i usunąć resztki krwi z serca.

Przenieś cztery do pięciu izolowanych serc na 100-mililitrową szalkę Petriego zawierającą 10 mililitrów lodowatego roztworu soli szynki. Ponownie obmacuj serca, aby je umyć i usunąć resztki krwi z serca. Aby zapewnić całkowite usunięcie krwi, należy zmieniać roztwór HBSS po każdym praniu.

Przytrzymaj każde serce parą kleszczy i użyj ostrza chirurgicznego, aby pokroić każde serce na dwa do czterech milimetrowych kawałków na 100-milimetrowej szalce Petriego, zawierającej od pięciu do siedmiu mililitrów HBSS. Często zmieniaj roztwór, aby zapewnić całkowite usunięcie krwi. Na koniec zmiel serca w roztworze HBSS.

Odwirować zmielone serca umieszczone w 50-mililitrowej stożkowej probówce o temperaturze 500 razy G, w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie wyrzucić supernatant. Dodaj pięć do sześciu mililitrów, 0,2% roztworu kolagenazy II do granulki, aby strawić tkankę. Ponownie dokładnie zawiesić osad, kołysząc rurką na wytrząsarce pod ciśnieniem 75 razy G, w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 45 do 60 minut.

Co 20 do 30 minut energicznie potrząsaj probówką ręcznie, aby wzmocnić lizę. Rozetrzeć zmieloną mieszaninę tkanek za pomocą pięciomililitrowej pipety serologicznej i jednomililitrowej końcówki pipety, aby zdysocjować grudkę tkanki do zawiesiny pojedynczej komórki. Aby zatrzymać enzymatyczną lizę tkanki, dodaj dwa do trzech razy więcej dostępnego na rynku pożywki podtrzymującej CSC niż objętość lizowanej tkanki.

Przełóż strawioną zawiesinę komórkową przez sitko o średnicy 100 mikrometrów umieszczone na stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów, aby usunąć wszelkie niestrawione kawałki tkanki. Aby oddzielić komórki do wirowania w gradionym gradinie gęstości, dodaj 37 stopni Celsjusza, wstępnie podgrzany, polisacharozę i roztwór diatrizoinianu sodu do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Następnie delikatnie i powoli dodać równą objętość filtratu do roztworu, unikając mieszania się dwóch roztworów.

Bardzo ważne jest, aby powoli dodawać filtrat do roztworu polisacharozy i ditrizoinianu sodu, bez mieszania, przechylając probówkę pod kątem 45 stopni i przy ściance probówki. Nie dodawać roztworu polisacharozy i ditrizoinianu sodu do filtratu. Umieść probówkę bardzo powoli w wirówce z wiadrem obrotowym, uważając, aby nie naruszyć roztworów.

Wirować przy 500 razy G przez 20 minut w temperaturze pokojowej ustawionej na niższą prędkość przyspieszania i zwalniania, aby uniknąć mieszania się dwóch roztworów i w celu prawidłowego oddzielenia komórek macierzystych serca. Bardzo ważne jest, aby bardzo ostrożnie umieścić roztwór gradientowy bez zakłóceń w wirówce. Ustaw przyspieszenie i opóźnienie wirówki na najniższą prędkość, taką jak jeden lub zero.

Użyj pipety o długości jednego milimetra, aby przenieść kożuchową powłokę zawierającą CSC wraz z dodatkowym roztworem z górnej warstwy do 15-mililitrowej sterylizowanej probówki. Dodać równą objętość pożywki podtrzymującej CSC i odpowiednio wymieszać, aby zneutralizować pozostały roztwór polisacharozy i diatrizoinianu sodu. Odwirować tę zawiesinę w temperaturze 500 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odrzucić supernatant. Powtórzyć mycie CSC niekompletnym roztworem DMEM co najmniej dwa razy. Wirować w temperaturze 500 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby pozbyć się pozostałości roztworu polisacharozy i diatrizoinianu sodu.

Po usunięciu supernatantu ponownie zawieś osad zawierający oczyszczone CSC w jednym mililitrowym podłożu konserwacyjnym CSC, a następnie policz komórki. Wysiewaj CSC na sześciodołkowej płytce hodowlanej pokrytej 0,02% roztworem żelatyny zawierającym 0,5% fibronektyny i dodaj dwa mililitry kompletnej pożywki konserwacyjnej. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% CO2.

Gdy hodowla CSC osiągnie zbieg, przenieś komórki na nową płytkę pokrytą żelatyną i fibronektyną, jak opisano w protokole tekstowym. Hoduj te przeniesione CSC P0 w kompletnej pożywce konserwacyjnej CSC w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze 5% CO2 aż do konfluacji. Powtórzyć transfer komórek na nową płytkę, aby wytworzyć CSC P1, które można wykorzystać do dalszych eksperymentów.

Aby utrzymać hodowlę CSC na początkowym etapie, należy wysiewać komórki dalej, jak opisano w protokole tekstowym. Aby scharakteryzować hodowane komórki, należy umieścić płytkę zawierającą CSC na obiektywie mikroskopu fluorescencyjnego. Użyj dziesięciokrotnego powiększenia, aby ustawić ostrość komórek.

Aby obserwować komórki, użyj apertury z kontrastem fazowym i zwiększ powiększenie do 20 razy, zmieniając soczewkę obiektywu, a następnie zobrazuj CSC. Po wykonaniu barwienia immunologicznego należy umieścić płytkę hodowlaną pod mikroskopem fluorescencyjnym. Ustaw ostrość komórki pod różnymi powiększeniami i obserwuj komórki pod wpływem kontrastu fazowego i różnych filtrów wzbudzenia, a następnie zapisz obrazy.

W celu różnicowania komórek hoduj CSC na sześciodołkowej płytce z dwoma mililitrami 37 stopni Celsjusza, wstępnie podgrzanym podłożem konserwacyjnym CSC. Gdy komórki osiągną zbieżność od 80 do 95%, zastąp pożywkę podtrzymującą dwumililitrową, 37 stopni Celsjusza, wstępnie podgrzaną pożywką różnicującą kardiomiocyty. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, w 5% CO2 przez okres do dwóch do trzech tygodni.

Zmieniaj pożywkę różnicującą co dwa do trzech dni. Podczas zmiany pożywki obserwuj morfologię komórek pod mikroskopem, aby zapewnić dobre warunki hodowli. Po 12 dniach zobrazuj komórki pod kątem markerów różnicowania zgodnie ze standardowym protokołem barwienia immunologicznego.

Dwu- do trzydniowych hodowlanych CSC wykazują wrzecionowatą morfologię, gdy obserwuje się je pod mikroskopem z kontrastem fazowym. Po siedmiu dniach hodowli wykazują zmianę morfologii, wydłużając się. Po barwieniu immunologicznym dla markerów pluripotencji, CSC wykazują ekspresję OCT4, SOX2 i Nanog.

Ponadto CSC namnażają się w pożywce hodowlanej i wyrażają marker proliferacji Ki67. Aby scharakteryzować sercowe pochodzenie CSC, zbadano ekspresję markerów sercowych, a komórki okazały się dodatnie dla markerów sercowych Sca-1, NKX2.5 i GATA4. Po 12 dniach hodowli w pożywce różnicującej kardiomiocyty, zróżnicowane CSC wykazują ekspresję markerów kardiomiocytów ACTININ i TROPONIN-I.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby nie dopuścić do zmieszania roztworu gradientowego z filtratem. Ważne jest również, aby ustawić przyspieszanie i zwalnianie na najniższą prędkość. Ktokolwiek je zanieczyści, zaleca się przeprowadzenie całego procesu izolacji komórek w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak separacja oparta na kulkach magnetycznych lub metody sortowania komórek oparte na cytomezie przepływowym, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: jak wyraźna jest jednorodna populacja sercowych komórek macierzystych? Promień pęknięcia w komórkach macierzystych serca jest dużym markerem i istnieją różnice w kierunku kardiomiocytów. Po jej opracowaniu, technika ta utoruje drogę naukowcom zajmującym się chorobami sercowo-naczyniowymi, którzy często uzyskują wysoką wydajność komórek macierzystych serca myszy, co może być ważne w terapii regeneracyjnej w niedokrwiennej niewydolności serca.

Nie zapominaj, że praca z ostrzem chirurgicznym, wybielaczem i DMSO może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak stosowanie środków ochrony personelu, środków ochrony osobistej.