Izolacja, charakterystyka i różnicowanie sercowych komórek macierzystych z serca dorosłej myszy
January 7th, 2019
Ogólnym celem tego artykułu jest ujednolicenie protokołu izolacji, charakterystyki i różnicowania komórek macierzystych serca (CSC) od serca dorosłej myszy. W tym miejscu opisujemy metodę wirowania w gradimencie gęstości w celu wyizolowania mysich CSC oraz opracowane metody hodowli CSC, proliferacji i różnicowania do kardiomiocytów.
Ogólnym celem tego artykułu jest standaryzacja protokołu izolacji, charakterystyki i różnicowania sercowych komórek macierzystych, CSC z serca dorosłej myszy. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu chorób układu krążenia i terapii regionalnej, takich jak terapia komórkami macierzystymi serca i niewydolność serca. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest opłacalna, z dużą pomocą w krótkim czasie.
Rozpocznij ten eksperyment od przygotowania wszystkich niezbędnych materiałów, instrumentów i izolacyjnych w stanie wysterylizowanym, zgodnie z opisem w protokole. Po usunięciu skóry z brzucha myszy poddanej eutanazji, przeciąć klatkę piersiową wewnątrz sterylnego kaptura, aby otworzyć klatkę piersiową. Odsłoń serce, a następnie usuń krew w pobliżu serca za pomocą jednomililitrowej strzykawki.
Aby usunąć krew w pobliżu serca, przemyj okolice lodowatym PBS. Używając nożyczek chirurgicznych i pęsety do wypreparowania serca, umieść je na 100-milimetrowej szalce Petriego zawierającej 10 mililitrów lodowatego PBS. Użyj kleszczy z zakrzywionym trzonkiem, aby kołatać serce i usunąć resztki krwi z serca.
Przenieś cztery do pięciu izolowanych serc na 100-mililitrową szalkę Petriego zawierającą 10 mililitrów lodowatego roztworu soli szynki. Ponownie obmacuj serca, aby je umyć i usunąć resztki krwi z serca. Aby zapewnić całkowite usunięcie krwi, należy zmieniać roztwór HBSS po każdym praniu.
Przytrzymaj każde serce parą kleszczy i użyj ostrza chirurgicznego, aby pokroić każde serce na dwa do czterech milimetrowych kawałków na 100-milimetrowej szalce Petriego, zawierającej od pięciu do siedmiu mililitrów HBSS. Często zmieniaj roztwór, aby zapewnić całkowite usunięcie krwi. Na koniec zmiel serca w roztworze HBSS.
Odwirować zmielone serca umieszczone w 50-mililitrowej stożkowej probówce o temperaturze 500 razy G, w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie wyrzucić supernatant. Dodaj pięć do sześciu mililitrów, 0,2% roztworu kolagenazy II do granulki, aby strawić tkankę. Ponownie dokładnie zawiesić osad, kołysząc rurką na wytrząsarce pod ciśnieniem 75 razy G, w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 45 do 60 minut.
Co 20 do 30 minut energicznie potrząsaj probówką ręcznie, aby wzmocnić lizę. Rozetrzeć zmieloną mieszaninę tkanek za pomocą pięciomililitrowej pipety serologicznej i jednomililitrowej końcówki pipety, aby zdysocjować grudkę tkanki do zawiesiny pojedynczej komórki. Aby zatrzymać enzymatyczną lizę tkanki, dodaj dwa do trzech razy więcej dostępnego na rynku pożywki podtrzymującej CSC niż objętość lizowanej tkanki.
Przełóż strawioną zawiesinę komórkową przez sitko o średnicy 100 mikrometrów umieszczone na stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów, aby usunąć wszelkie niestrawione kawałki tkanki. Aby oddzielić komórki do wirowania w gradionym gradinie gęstości, dodaj 37 stopni Celsjusza, wstępnie podgrzany, polisacharozę i roztwór diatrizoinianu sodu do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Następnie delikatnie i powoli dodać równą objętość filtratu do roztworu, unikając mieszania się dwóch roztworów.
Bardzo ważne jest, aby powoli dodawać filtrat do roztworu polisacharozy i ditrizoinianu sodu, bez mieszania, przechylając probówkę pod kątem 45 stopni i przy ściance probówki. Nie dodawać roztworu polisacharozy i ditrizoinianu sodu do filtratu. Umieść probówkę bardzo powoli w wirówce z wiadrem obrotowym, uważając, aby nie naruszyć roztworów.
Wirować przy 500 razy G przez 20 minut w temperaturze pokojowej ustawionej na niższą prędkość przyspieszania i zwalniania, aby uniknąć mieszania się dwóch roztworów i w celu prawidłowego oddzielenia komórek macierzystych serca. Bardzo ważne jest, aby bardzo ostrożnie umieścić roztwór gradientowy bez zakłóceń w wirówce. Ustaw przyspieszenie i opóźnienie wirówki na najniższą prędkość, taką jak jeden lub zero.
Użyj pipety o długości jednego milimetra, aby przenieść kożuchową powłokę zawierającą CSC wraz z dodatkowym roztworem z górnej warstwy do 15-mililitrowej sterylizowanej probówki. Dodać równą objętość pożywki podtrzymującej CSC i odpowiednio wymieszać, aby zneutralizować pozostały roztwór polisacharozy i diatrizoinianu sodu. Odwirować tę zawiesinę w temperaturze 500 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Odrzucić supernatant. Powtórzyć mycie CSC niekompletnym roztworem DMEM co najmniej dwa razy. Wirować w temperaturze 500 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby pozbyć się pozostałości roztworu polisacharozy i diatrizoinianu sodu.
Po usunięciu supernatantu ponownie zawieś osad zawierający oczyszczone CSC w jednym mililitrowym podłożu konserwacyjnym CSC, a następnie policz komórki. Wysiewaj CSC na sześciodołkowej płytce hodowlanej pokrytej 0,02% roztworem żelatyny zawierającym 0,5% fibronektyny i dodaj dwa mililitry kompletnej pożywki konserwacyjnej. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% CO2.
Gdy hodowla CSC osiągnie zbieg, przenieś komórki na nową płytkę pokrytą żelatyną i fibronektyną, jak opisano w protokole tekstowym. Hoduj te przeniesione CSC P0 w kompletnej pożywce konserwacyjnej CSC w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze 5% CO2 aż do konfluacji. Powtórzyć transfer komórek na nową płytkę, aby wytworzyć CSC P1, które można wykorzystać do dalszych eksperymentów.
Aby utrzymać hodowlę CSC na początkowym etapie, należy wysiewać komórki dalej, jak opisano w protokole tekstowym. Aby scharakteryzować hodowane komórki, należy umieścić płytkę zawierającą CSC na obiektywie mikroskopu fluorescencyjnego. Użyj dziesięciokrotnego powiększenia, aby ustawić ostrość komórek.
Aby obserwować komórki, użyj apertury z kontrastem fazowym i zwiększ powiększenie do 20 razy, zmieniając soczewkę obiektywu, a następnie zobrazuj CSC. Po wykonaniu barwienia immunologicznego należy umieścić płytkę hodowlaną pod mikroskopem fluorescencyjnym. Ustaw ostrość komórki pod różnymi powiększeniami i obserwuj komórki pod wpływem kontrastu fazowego i różnych filtrów wzbudzenia, a następnie zapisz obrazy.
W celu różnicowania komórek hoduj CSC na sześciodołkowej płytce z dwoma mililitrami 37 stopni Celsjusza, wstępnie podgrzanym podłożem konserwacyjnym CSC. Gdy komórki osiągną zbieżność od 80 do 95%, zastąp pożywkę podtrzymującą dwumililitrową, 37 stopni Celsjusza, wstępnie podgrzaną pożywką różnicującą kardiomiocyty. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, w 5% CO2 przez okres do dwóch do trzech tygodni.
Zmieniaj pożywkę różnicującą co dwa do trzech dni. Podczas zmiany pożywki obserwuj morfologię komórek pod mikroskopem, aby zapewnić dobre warunki hodowli. Po 12 dniach zobrazuj komórki pod kątem markerów różnicowania zgodnie ze standardowym protokołem barwienia immunologicznego.
Dwu- do trzydniowych hodowlanych CSC wykazują wrzecionowatą morfologię, gdy obserwuje się je pod mikroskopem z kontrastem fazowym. Po siedmiu dniach hodowli wykazują zmianę morfologii, wydłużając się. Po barwieniu immunologicznym dla markerów pluripotencji, CSC wykazują ekspresję OCT4, SOX2 i Nanog.
Ponadto CSC namnażają się w pożywce hodowlanej i wyrażają marker proliferacji Ki67. Aby scharakteryzować sercowe pochodzenie CSC, zbadano ekspresję markerów sercowych, a komórki okazały się dodatnie dla markerów sercowych Sca-1, NKX2.5 i GATA4. Po 12 dniach hodowli w pożywce różnicującej kardiomiocyty, zróżnicowane CSC wykazują ekspresję markerów kardiomiocytów ACTININ i TROPONIN-I.
Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby nie dopuścić do zmieszania roztworu gradientowego z filtratem. Ważne jest również, aby ustawić przyspieszanie i zwalnianie na najniższą prędkość. Ktokolwiek je zanieczyści, zaleca się przeprowadzenie całego procesu izolacji komórek w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak separacja oparta na kulkach magnetycznych lub metody sortowania komórek oparte na cytomezie przepływowym, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: jak wyraźna jest jednorodna populacja sercowych komórek macierzystych? Promień pęknięcia w komórkach macierzystych serca jest dużym markerem i istnieją różnice w kierunku kardiomiocytów. Po jej opracowaniu, technika ta utoruje drogę naukowcom zajmującym się chorobami sercowo-naczyniowymi, którzy często uzyskują wysoką wydajność komórek macierzystych serca myszy, co może być ważne w terapii regeneracyjnej w niedokrwiennej niewydolności serca.
Nie zapominaj, że praca z ostrzem chirurgicznym, wybielaczem i DMSO może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak stosowanie środków ochrony personelu, środków ochrony osobistej.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Celem niniejszego badania jest ujednolicenie protokołu do izolacji, charakteryzacji i różnicowania komórek macierzystych serca (CSCs) z dorosłego mysiego serca. Protokół zapewnia opłacalne podejście do rozwiązywania kluczowych pytań w zakresie chorób układu krążenia, szczególnie dotyczących terapii komórkami macierzystymi serca i niewydolności serca.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Choroby układu krążenia
- Badania nad komórkami macierzystymi
- Terapia komórkami macierzystymi serca
Tło
- Komórki macierzyste serca mają potencjalne zastosowania w naprawie i regeneracji serca.
- Badanie zwraca uwagę na skuteczne metody ekstrakcji i pracy z CSC.
- Ulepszenie metodologii może przyczynić się do rozwoju terapii układu krążenia.
Zastosowane metody
- Centryfugacja gradientowa gęstości do izolacji CSC
- Techniki izolacji i hodowania tkanki dorosłego mysiego serca
- Zdjęcia fluorescencyjne do charakteryzacji komórek
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja CSC z określonym protokołem.
- Wykazane możliwości różnicowania się w komórki mięśniowe serca.
- Zweryfikowane techniki utrzymania i charakteryzacji CSC.
Wnioski
- Badanie ustanawia niezawodną metodę izolacji i hodowania CSC.
- To badanie wspiera przyszłe prace nad regeneracją serca i terapiami.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Isolation and functional validation of cardiac stem cells (CSCs) from adult mouse hearts supports early-stage target de-risking in cardiovascular regenerative medicine. This protocol enables reproducible generation of a stem cell source with cardiomyogenic potential, facilitating mechanistic studies of myocardial repair pathways. The approach provides a scalable in vitro system for evaluating therapeutic hypotheses prior to in vivo validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cardiac stem cell identity through co-expression of Sca-1, NKX2-5, GATA4, OCT4, SOX2, and Nanog markers.
- Operational Value: Provides a standardized isolation workflow using density gradient centrifugation to obtain purified CSC populations.
- Therapeutic Value: Supports target validation by demonstrating differentiation into cardiomyocytes expressing actinin and troponin I.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates proliferating CSCs validated by Ki-67 expression for use in compound screening platforms.
- Reproducibility: Defines differentiation conditions (cardiomyocyte medium, 12-day incubation, medium changes every 3 days) for consistent cardiomyocyte output.
- Scalability: Describes passaging (P0 to P1) and culture expansion on gelatin/fibronectin-coated surfaces for increased yield.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Establishes a mouse-derived CSC model aligned with ischemic heart failure pathophysiology.
- Translational Continuity: Bridges isolation to functional differentiation, enabling preclinical assessment of cardiomyogenic potential.
- Mechanistic De-risking: Allows evaluation of paracrine effects and proliferation capacity prior to in vivo engraftment studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing in cardiovascular regenerative programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on stemness and cardiac lineage commitment via marker analysis.
- Screening: Delivers standardized, proliferative CSC suspensions suitable for compound library screening.
- Analytics: Enables quantitative assessment of differentiation efficiency through actinin and troponin I immunostaining.
- Translational Research: Provides a disease-relevant system for evaluating cardiomyocyte maturation and functional maturation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation and differentiation platform for iterative cardiac regeneration target evaluation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of cardiac regeneration targets through validated stemness and differentiation capacity.
- Operational Value: Standardized isolation via density gradient centrifugation ensures reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by defining cardiomyocyte differentiation benchmarks.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cardiac stem cell therapies based on in vitro differentiation potential.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissociation, density gradient centrifugation, and sterile cell culture techniques.
- Dependent on access to centrifuge with low acceleration/deceleration settings and collagenase II for tissue digestion.
- Necessitates standardization of CSC maintenance and differentiation media formulations across teams.
- Adaptation to alternative model systems (e.g., human iPSC-derived cardiac progenitors) may require marker re-validation.
- Limited by murine source material; scalability to human tissue requires additional optimization.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:44
Isolation of Cardiac Stem Cells (CSCs)
7:08
Characterization of Cardiac Stem Cells
7:54
Differentiation of Cardiac Stem Cells into Cardiomyocytes
8:46
Results: Successful Isolation of the CSCs and Their Differentiation Toward Cardiomyocytes
9:58
Conclusion
