Obrazowanie w czasie rzeczywistym i kwantyfikacja rozwoju biofilmu grzybów przy użyciu dwufazowego systemu przepływu recyrkulacyjnego
18 października 2018
Opisujemy montaż, działanie i czyszczenie urządzenia przepływowego zaprojektowanego do obrazowania tworzenia się biofilmu grzybów w czasie rzeczywistym podczas przepływu. Dostarczamy również i omawiamy algorytmy ilościowe, które można zastosować na pozyskanych obrazach.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mikrobiologii, takie jak to, w jaki sposób przepływ płynów wpływa na wzrost i rozwój biofilmu grzybów. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala nam ona na ilościową ocenę wpływu przepływu na wzrost i rozwój biofilmu w czasie rzeczywistym. Rozpocznij ten eksperyment od montażu aparatury przepływowej, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
W dniu eksperymentu zamocuj pułapkę bąbelkową, sondę temperatury i wszystkie elementy jednorazowego użytku. Aby zmontować filtr, wyjmij tłok z jednomililitrowej strzykawki, aby uczynić go adapterem. Wciśnij rurkę z butelki filtrującej do tego końca i przymocuj filtr o grubości 2 mikronów do rurki prowadzącej do kolby wzrostowej.
Nałóż silikonowy smar próżniowy wokół zadzioru adaptera suwaka przed jego podłączeniem, ponieważ pomaga to zapobiec wyciekom powietrza do systemu. Napełnij kolbę mocującą 100 mililitrami YPD, a kolbę wzrostową napełnij 200 mililitrami YPD. Upewnij się, że rurka po zielonej stronie dociera do podłoża w każdej kolbie.
Upewnij się, że wszystkie zawory są otwarte. Podłącz pułapkę bąbelkową do próżni i podłącz pompę do zielonej rurki bocznej za pułapką bąbelkową. Pompuj płyn z natężeniem przepływu 3,3 mililitra na minutę, aby całkowicie napełnić zieloną stronę.
Następnie dozuj i wyrzuć około jednego do dwóch mililitrów pożywki, ponieważ pierwsze kilka mililitrów często zawiera martwe komórki lub przypadkowe zanieczyszczenia. Przed kontynuowaniem upewnij się, że zielona strona rurki jest wypełniona mediami i nie ma pęcherzyków powietrza za pułapką bąbelkową. Napełnij zjeżdżalnię kanałową i zbiornik YPD, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków.
Podłączyć szkiełko do aparatu przepływowego. Następnie pompuj więcej płynu, aby utworzyć bufor o długości około 5 metrów po pomarańczowej stronie. Ma to na celu zapobieżenie przypadkowemu uwięzieniu powietrza w zjeżdżalni w przypadku przepływu wstecznego.
Teraz przygotuj aparat przepływowy do transportu do mikroskopu, najpierw zamykając wlot i wylot pułapki bąbelkowej. Następnie zacisnąć zamknięte zawory kolby z zieloną i pomarańczową mocowaniem bocznym. Upewnij się, że nakrętki do tłumika pulsacji i butelki filtrującej są szczelne, ponieważ mogą się poluzować podczas automatycznego powlekania.
Odłącz pompę od rurki, aby ułatwić transport. Następnie przenieś wszystkie elementy, w tym mieszadło z płytą grzejną, do dodatkowego pojemnika w pobliżu mikroskopu. Podłącz sondę temperatury do mieszadła z płytą grzejną i rozpocznij podgrzewanie kolby nasadki do 37 stopni Celsjusza.
Mieszaj pożywkę z prędkością 300 obr./min i utrzymuj to przez cały eksperyment. Zamontuj szkiełko na mikroskopie i w razie potrzeby użyj taśmy, aby je szczelnie zabezpieczyć. Następnie przymocuj pułapkę bąbelkową do próżni
.Teraz podłącz pompę do aparatu przepływowego. Uruchom pompę przy natężeniu przepływu 3,3 mililitra na minutę i pozwól jej pracować przez około pięć do 10 sekund. Następnie wyjmij pułapkę bąbelkową w klapie wypuszczonej.
Pozwól pompie kontynuować pracę, podczas gdy kolba nasadkowa nagrzewa się. Gdy kolba przyłączająca i komora inkubacyjna osiągną temperaturę 37 stopni Celsjusza, dodaj wystarczającą ilość nocnej kultury komórek grzybów do kolby przyłączeniowej, aby osiągnąć milion komórek na mililitr. Odczekaj 15 minut, aby komórki mogły się zaaklimatyzować.
Otwórz zarówno zielone, jak i pomarańczowe zawory kolby bocznej, jednocześnie zamykając oba zawory kolby wzrostu, aby rozpocząć przepływ komórek. Odczekaj około pięciu minut, aby komórki mogły dotrzeć do szkiełka. W tym czasie należy ustawić ostrość mikroskopu i dostosować go do tych samych parametrów obrazowania, które były używane w poprzednich eksperymentach.
Rozpocznij akwizycję obrazu w fazie przywiązania. Sprawdź ponownie po około pięciu i 10 minutach, aby upewnić się, że ostrość została utrzymana. Jeśli nie, spróbuj ustawić ostrość natychmiast po uzyskaniu następnego obrazu.
Natychmiast po zakończeniu fazy dołączania zapisz plik. Następnie otwórz zawory kolby wzrostowej po stronie zielonej i pomarańczowej, jednocześnie zamykając oba zawory kolby nasadkowej. Uważaj, aby nie uderzyć w scenę, jeśli w komorze inkubacyjnej znajdują się jakiekolwiek zawory.
Odłączyć sondę termometru i zastąpić kolbę mocującą kolbą wzrostową. Teraz skonfiguruj oprogramowanie tak, aby pozyskiwało obraz co 15 minut przez 22 godziny i rozpocznij akwizycję obrazu w fazie wzrostu. Po zakończeniu akwizycji fazy wzrostu i zapisaniu pliku otwórz zawory kolby po zielonej i pomarańczowej stronie, które mogą wydawać dźwięki, gdy ciśnienie spada po stronie pomarańczowej.
Pociągnij do góry zieloną rurkę wychodzącą z obu kolb pożywki, aż znajdą się co najmniej kilka centymetrów nad pożywką. Następnie uruchom pompę z dużą prędkością, aby usunąć wszystkie media z rurki, co znacznie ułatwia czyszczenie. Na koniec określ ilościowo filmy zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Ten film z mikroskopii poklatkowej w ciemnym polu pokazuje przyczepienie się komórek Candida albican typu dzikiego do niedopełnienia substratu podczas fazy przyłączania, a następnie wzrost i rozwój w fazie wzrostu, co prowadzi do tworzenia biofilmu. Dane z tych filmów można analizować pod kątem szybkości przyłączania i odłączania komórek oraz biomasy w czasie, pokazano tutaj całkowitą biomasę w regionie obrazowania określoną za pomocą analizy densytometrycznej. Pokazano również skumulowaną szybkość przyłączania komórek i procentowe oderwanie biomasy w czasie.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby używać tych samych warunków obrazowania we wszystkich eksperymentach, ponieważ pozwala to na dokonanie porównań ilościowych między nimi.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje aparat przepływowy zaprojektowany do obrazowania w czasie rzeczywistym tworzenia się biofilmu grzybowego w warunkach przepływu. Omówiono w nim również algorytmy ilościowe służące do analizy uzyskanych obrazów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Badania nad biofilmem
- Dynamika płynów
Wstęp
- Biofilmy grzybowe są istotne w różnych kontekstach ekologicznych i klinicznych.
- Zrozumienie wpływu przepływu cieczy na rozwój biofilmu ma kluczowe znaczenie dla mikrobiologii.
- Techniki obrazowania w czasie rzeczywistym mogą dostarczyć wiedzy na temat dynamiki biofilmu.
- Ilościowa analiza obrazów może pogłębić zrozumienie wzorców wzrostu biofilmu.
Cel badania
- Ocena wpływu przepływu płynów na wzrost biofilmu grzybiczego.
- Przedstawienie metody obserwacji tworzenia się biofilmu w czasie rzeczywistym.
- Opracowanie algorytmów do ilościowej analizy danych obrazowych.
Zastosowane metody
- Montaż aparatury przepływowej do obrazowania.
- Mocowanie komponentów, takich jak pułapka pęcherzyków powietrza i sonda temperatury.
- Wykorzystanie systemu filtracyjnego do sterowania przepływem cieczy.
- Zastosowanie algorytmów ilościowych do analizy uzyskanych obrazów.
Główne wyniki
- Aparat przepływowy z powodzeniem zobrazował tworzenie się grzybiczego biofilmu.
- Dane w czasie rzeczywistym dostarczyły informacji na temat wzrostu biofilmu w zmiennych warunkach przepływu.
- Algorytmy ilościowe umożliwiły szczegółową analizę rozwoju biofilmu.
- Metoda ta wykazała przewagę nad tradycyjnymi technikami obrazowania.
Wnioski
- Aparat przepływowy jest skuteczny w badaniu biofilmów grzybiczych.
- Obrazowanie w czasie rzeczywistym może znacząco posunąć naprzód badania mikrobiologiczne.
- Analiza ilościowa jest niezbędna do zrozumienia dynamiki biofilmów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
System ten umożliwia ilościową ocenę dynamiki biofilmu grzybiczego w czasie rzeczywistym w warunkach kontrolowanego przepływu, wypełniając istotną lukę w modelowaniu oddziaływań między gospodarzem a patogenem w warunkach fizjologicznego naprężenia ścinającego. Poprzez dostarczenie pomiarów biomasy oraz kinetyki przylegania i odrywania, wspiera on mechanistyczną redukcję ryzyka w procesie walidacji celów przeciwgrzybiczych w badaniach przedklinicznych. Niskokosztowa konstrukcja, kompatybilna z mikroskopem, pozwala na szerokie zastosowanie w laboratoriach badawczych w celu reprodukowalnego fenotypowania biofilmu.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie wpływu przepływu płynów na adhezję grzybów i tworzenie biofilmu, co dostarcza informacji o istotności celów terapeutycznych w modelach infekcji błon śluzowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia mierzalne odczyty tempa przylegania i odrywania się komórek w czasie rzeczywistym pod wpływem sił ścinających, co wspiera przesiewowe badanie celów w oparciu o postawione hipotezy.
Przesiewanie i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Generuje dane dotyczące biomasy i odrywania w czasie za pomocą densytometrii, co umożliwia ilościowe porównanie szczepów typu dzikiego i mutantów w warunkach przepływu.
- Wartość operacyjna: Kompatybilność ze standardowymi mikroskopami świetlnymi pozwala na skalowalne i niskokosztowe wdrożenie w kampaniach przesiewowych związków przeciwgrzybiczych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Modeluje warunki przepływu istotne dla kandydozy jam ustno-gardłowej, łącząc wyniki in vitro z klinicznym zachowaniem biofilmu w warunkach ścinania przez ślinę.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podłużne obrazowanie biofilmu (do 22 godzin), co pozwala na analizę przebiegu w czasie skuteczności leków przeciwgrzybiczych oraz rozwoju oporności.
Integracja potoku i przepływu pracy
Aparat ten wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu po optymalizację związku wiodącego, dostarczając dostosowanych do przepływu danych fenotypowych w celu zmniejszenia ryzyka związanego z celami przed rozpoczęciem screeningu związków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera mechanistyczną analizę szlaków adhezji i regulatorów biofilmu w warunkach fizjologicznie istotnego przepływu, wyjaśniając funkcję celu w kontekście infekcji.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowanych, ilościowych wskaźników biofilmu (szybkość przywierania, procent odrywania, biomasa w czasie) do powtarzalnego przesiewania związków w warunkach dynamicznych.
- Analityka: Umożliwia ilościowe oznaczanie biomasy w oparciu o densytometrię oraz analizę kinetyczną przywierania/odrywania, co wspiera priorytetyzację trafień w oparciu o dane.
- Badania translacyjne: Modeluje istotne dla człowieka naprężenia ścinające w błonie śluzowej jamy ustnej, poprawiając wiarygodność prognostyczną przedklinicznych modeli biofilmu w opracowywaniu leków przeciwgrzybiczych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Zaprojektowane do wielokrotnego użytku dzięki modułowym komponentom, co pozwala na standaryzację w laboratoriach i projektach badających adhezję drobnoustrojów w warunkach przepływu.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów przeciwgrzybiczych poprzez powiązanie perturbacji genetycznych lub farmakologicznych z fenotypami biofilmu zależnymi od przepływu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki ustandaryzowanym prędkościom przepływu, warunkom obrazowania i protokołom analizy ilościowej we wszystkich eksperymentach.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczenie wczesnych danych o skuteczności przeciwbiofilmowej skorygowanych o przepływ, co zmniejsza ryzyko niepowodzenia na późnych etapach z powodu niskiej istotności celu w dynamicznym środowisku gospodarza.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów na leki przeciwgrzybicze z uwzględnieniem ryzyka na podstawie ich wydajności w warunkach naprężenia ścinającego, co odpowiada klinicznym niszom infekcyjnym.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie konfiguracji mikrofluidycznej, techniki sterylnej oraz mikroskopii poklatkowej w celu zapewnienia powtarzalności działania.
- Niezbędny jest mikroskop świetlny ze stabilizacją stolika, kontrolą temperatury (37°C) oraz pompą perystaltyczną zdolną do zapewnienia przepływu 3.3 mL/min.
- Wymagana jest standaryzacja parametrów obrazowania (ostrość, oświetlenie, odstępy między akwizycjami) pomiędzy zespołami, aby umożliwić ilościowe porównanie wyników z różnych serii.
- Adaptacja do gatunków innych niż Candida lub stosowanie alternatywnych pożywek może wymagać optymalizacji szybkości przepływu i chemii powierzchni w celu zapobiegania zatykaniu lub biofoulingowi.
- Ograniczenia praktyczne obejmują niską przepustowość wynikającą z ręcznego przygotowania preparatów oraz ograniczeń obszaru obrazowania, co sprawia, że metoda ta nie nadaje się do pierwotnego przesiewu wysokoprzepustowego, lecz jest idealna do pogłębionych badań mechanistycznych.
