Name: Zastosowanie elektronowego rezonansu paramagnetycznego w próbkach biologicznych w temperaturze otoczenia i temperaturze 77 K (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Poznaj metodę przygotowania próbek biologicznych do spektroskopii EPR w temperaturze otoczenia i 77 K. Technika ta umożliwia niejednoznaczne wykrywanie wolnych rodników w biologii redoks.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez University of Colorado School of Medicine's Dean's Strategic Research Infrastructure award, R01 HL086680-09 i 1R35HL139726-01, do nagrody stypendialnej E.N.G. i UCD CFReT fellowship award (HE). Autorzy dziękują dr Sandrze Eaton i dr Garethowi Eatonowi (University of Denver), dr Geraldowi Rosenowi i dr Josephowi P. Kao (University of Maryland) oraz dr Sujatha Venkataraman (University of Colorado Denver) za pomocne dyskusje, a także Joanne Maltzahn, Ashley Trumpie i Ivy McDermott (University of Colorado Denver) za wsparcie techniczne.

Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Kolorado w Denver.
1. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>Zapas kwasu dietylenotriaminopentaoctowego (DTPA) (150 mM)
	<ol>
		<li>Dodaj 2,95 g DTPA (393,35 g/mol) do 10 ml wody dejonizowanej.</li>
		<li>Aby rozpuścić DTPA, dodaj kroplami 1 M NaOH i doprowadź do pH 7,0.</li>
		<li>Doprowadzić objętość do 50 ml wodą, aby uzyskać końcowe stężenie DTPA 150 mM i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bufor fosforanowy solany (PBS) (50 mM, pH 7,4)
	<ol>
		<li>Przygotować 5 M chlorku sodu (NaCl) (58,44 g/mol; 29,22 g/100 ml).</li>
		<li>Przygotować 1 M dwuzasadowego fosforanu potasu HK2PO4 (174,18 g/mol; 17,42 g/100 ml)</li>
		<li>Przygotować 1 M jednozasadowego fosforanu potasu KH2PO4 (136,1 g/mol; 13,61 g/100 ml). Zmieszać 3 ml 5 M NaCl z 4,24 ml 1 M dwuzasadowego fosforanu potasu i 0,760 ml 1 M fosforanu potasu jednozasadowego. Sprawdź pH.</li>
		<li>Doprowadzić objętość do 100 ml wodą dejonizowaną.</li>
		<li>Przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) przez krótki okres (dni) i w temperaturze 4 °C przez długi czas (tygodnie).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bufor Krebsa-Henseleita (KHB) zawierający 100 μM DTPA 
	<ol>
		<li>Do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml dodać 33,3 μl 150 mM roztworu podstawowego DTPA.</li>
		<li>Doprowadzić do objętości 50 ml za pomocą buforu Krebs-Henseleit (KHB).</li>
		<li>Codziennie przygotowuj świeży bufor z DTPA i utrzymuj go w temperaturze RT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bufor tris-EDTA zawierający sacharozę
	<ol>
		<li>Przygotować 0,5 M bulionu Tris: rozpuścić 15,14 g zasady Tris (121,14 g/mol) w 150 ml wody dejonizowanej. Za pomocą HCl dostosuj pH do 7,8 i doprowadź do końcowej objętości 250 ml.</li>
		<li>Rozpuścić 21,4 g sacharozy (342,29 g/mol; stężenie końcowe = 0,25 mM) w 150 ml wody dejonizowanej.</li>
		<li>Dodać 5 ml bulionu Tris do sacharozy, aby uzyskać końcowe stężenie Tris 10 mM.</li>
		<li>Dodać 0,5 ml 0,5 M bulionu EDTA do tris-sacharozy, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mM.</li>
		<li>Sprawdź pH i dostosuj je do 7,4.</li>
		<li>Doprowadzić do końcowej objętości 250 ml wodą dejonizowaną i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bydlęca dysmutaza ponadtlenkowa Cu/Zn (SOD) (30 000 U/ml) bydła
	<ol>
		<li>Rozpuść 30 000 j. SOD w 1 ml PBS (około 5,7 mg, w zależności od aktywności partii SOD).</li>
		<li>Dobrze wymieszać, podaszkować i przechowywać w temperaturze -20°C przez krótki okres (6-12 miesięcy) i w temperaturze -80°C przez długi czas.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór roboczy SOD (1000 U/ml)
	<ol>
		<li>Przenieść 30 μl podwielokrotności 30 000 U/ml bulionu SOD do 870 μl sterylnego PBS.</li>
		<li>Trzymaj roztwór na lodzie i używaj go świeżego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kolba 12-mirystynianu 13-octanu forbolu (PMA) (5 mM)
	<ol>
		<li>Rozpuścić 1 mg PMA (616,83 g/mol) w 325 μl DMSO (stężenie końcowe = 5 mM).</li>
		<li>Porcjować roztwór PMA o stężeniu 5 mM i przechowywać go w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór roboczy PMA (125 μM)
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 10 μl podwielokrotności 5 mM PMA w 390 μl sterylnego PBS.</li>
		<li>Trzymaj roztwór na lodzie i używaj go świeżego.</li>
		<li>Do kontroli pojazdu pod kątem PMA należy użyć 10 μl DMSO w 390 μl PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Chlorek difenyliodoniowy (DIP) (2,5 mM)
	<ol>
		<li>Rozpuścić 3,2 mg DIP (316,57 g/mol) w 4 ml, aby uzyskać 2,5 mM zapasu.</li>
		<li>Przygotuj roztwór i użyj go na świeżo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sól metylanu deferoksaminy (DFO) (20 mM)
	<ol>
		<li>Rozpuścić 4,5 mg DFO (656,79 g/mol) w 340 μl, aby uzyskać 20 mM zapasu.</li>
		<li>Przygotuj roztwór i użyj go na świeżo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie zapasu antymycyny A (AA) (5 mM)
	<ol>
		<li>Rozpuścić 5,4 mg AA (532 g/mol) w 2 ml etanolu (stężenie końcowe = 5 mM).</li>
		<li>Porcjować zapas do szklanych fiolek i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie sond wirowych 
	<ol>
		<li>Bufor fosforanowy 50 mM zawierający 100 μM DTPA z azotem przez 30 minut w celu usunięcia rozpuszczonego tlenu z buforu.</li>
		<li>Wyjmij sondę wirowania z zamrażarki -20 °C i pozwól pojemnikowi dojść do temperatury rynkowej (10-15 min).</li>
		<li>Odważyć 2,4 mg 1-hydroksy-3-metoksykarbonylo-2,2,5,5-tetrametylopirolidyny·HCl (CMH) (237,8 g/mol)</li>
		<li>Rozpuścić CMH w 1 ml odtlenionego buforu fosforanowego do uzyskania końcowego stężenia 10 mM.</li>
		<li>Odważyć 5 mg dichlorku 1-hydroksy-4-[2-trifenylofosfonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetrametylopirydyny,1-hydroksy-2,2,6,6-tetrametylo-4-[2-(trifenylofosfonio)acetamido]piperidinium dichlorku (mito-TEMPO-H) (529,1 g/mol).</li>
		<li>Rozpuścić mito-TEMPO-H w 1 ml odtlenionego buforu fosforanowego do uzyskania końcowego stężenia 9,5 mM.</li>
		<li>Odważyć 4,9 mg 1-hydroksy-3-karboksyl-2,2,5,5-tetrametylopirolidyny·HCl (CPH) (223,7 g/mol).</li>
		<li>Rozpuścić CPH w 1 ml odtlenionego buforu fosforanowego do uzyskania końcowego stężenia 22 mM.</li>
		<li>Porcjować i przechowywać w temperaturze -80 °C (zamrażanie i rozmrażanie nie jest zalecane).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wykrywanie ponadtlenku in vitro
<ol>
	<li>Wykrywanie całkowitego, zewnątrzkomórkowego i wewnątrzkomórkowego ponadtlenku w stymulowanych PMA komórkach RAW 264.7 w RT
	<ol>
		<li>Stosując odpowiednią technikę aseptyczną, rozmrozić komórki RAW 264.7 i przejść je w pożywce DMEM uzupełnionej 10% FBS (low endototoksyn-free) i 1% antygrzybikiem/ampicyliną w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 .</li>
		<li>Wysiewaj RAW 264,7 komórek w 1 x 106 komórek/studzienkę do płytek 6-dołkowych na jeden dzień przed zabiegiem.</li>
		<li>Delikatnie usuń pożywkę i umyj komórki raz 1 ml buforu KHB.</li>
		<li>Dodać KHB zawierający 100 μM DTPA do każdej studzienki i potraktować w całkowitej objętości 500 μl następującymi środkami:</li>
		<li>W przypadku studzienek wstępnie potraktowanych SOD dodać 15 μl/studzienkę roztworu roboczego SOD (1000 U/ml; końcowe stężenie SOD = 30 U/ml) i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C przed dodaniem CMH i PMA.</li>
		<li>Dodać 12,5 μl / studzienkę 10 mM zapasu CMH (stężenie końcowe = 0,25 mM).</li>
		<li>Dodać 40 μl/basenik 125 μM roztworu roboczego PMA (stężenie końcowe = 10 μM) lub 40 μl nośnika (zapas 10 μl DMSO w 390 μl PBS).</li>
		<li>Inkubować przez 50 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze z użyciem CO2 .</li>
		<li>Wyjąć płytki z inkubatora i natychmiast umieścić je na lodzie.</li>
		<li>Zebrać bufor z każdej studzienki w oddzielnych 1,5 ml, oznakowanych probówkach. Trzymaj się lodu przez cały czas.</li>
		<li>Dodać 100 μl świeżego buforu KHB zawierającego 100 μM DTPA, delikatnie zeskrobać komórki i ponownie zawiesić, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Przechowywać na lodzie przez cały czas podwieszania komórek.</li>
		<li>Pobrać próbkę pobraną w krokach 2.1.10 i 2.1.11 (50 μl) do każdej z probówek kapilarnych. Uszczelnij oba końce i uruchom EPR. 
		UWAGA: Zawsze testuj probówkę lub studzienkę (bez komórek) zawierającą sondę w buforze (to samo stężenie = 0,25 mM), traktowaną w tych samych warunkach, co komórki (ten sam czas inkubacji i temperatura) jako kontrola, ponieważ intensywność tła sondy jest zależna od temperatury i czasu.</li>
		<li>Ustaw parametry akwizycji EPR na następujące: częstotliwość mikrofal = 9,65 GHz; pole środkowe = 3432 G; amplituda modulacji = 2,0 G; szerokość przemiatania = 80 G; moc mikrofal = 19,9 mW; całkowita liczba skanów = 10; czas przemiatania = 12,11 s; i stała czasowa = 20,48 ms.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykrywanie mitochondrialnego ponadtlenku w komórkach RAW 264.7
	<ol>
		<li>Wykonaj kroki 2.1.1 i 2.1.2, aby zasiać komórki RAW 264.7 na dzień przed eksperymentem.</li>
		<li>Usuń pożywkę i przemyj komórki raz 1 ml buforu KHB.</li>
		<li>Do każdego dołka dodać 200 μl KHB zawierającego 100 μM DTPA.</li>
		<li>Dodać 5,3 μl/studzienkę 9,5 mM mito-TEMPO-H (stężenie końcowe = 0,25 mM)</li>
		<li>Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodać 1 μl/studzienkę antymycyny A (AA), 5 mM roztworu podstawowego w etanolu (stężenie końcowe = 25 μM).</li>
		<li>Inkubować przez 50 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze z użyciem CO2 .</li>
		<li>Wyjąć płytki z inkubatora i natychmiast umieścić je na lodzie.</li>
		<li>Delikatnie zeskrobać komórki i ponownie zawiesić, pipetując w górę i w dół. Trzymaj na lodzie.</li>
		<li>Załaduj próbkę do rurki kapilarnej. Uszczelnij oba końce.</li>
		<li>Patrz poprzednia sekcja, aby zapoznać się z ustawieniami EPR.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykrywanie ponadtlenku w komórkach RAW 264,7 w temperaturze 77 K
	<ol>
		<li>Umieść bufor zebrany w kroku 1.1.10 we wstępnie przygotowanych rurkach PTFE o długości 1-2 cali (3/16" OD x 1/8" ID). Upewnij się, że rurka PTFE jest prosta, aby można ją było łatwo wkładać i wyjmować z palca dewara. Za pomocą gumowego korka zamknąć jeden koniec rurki PTFE, odpipetować bufor lub zawiesinę komórek (100 do 150 μl) do rurki PTFE i uszczelnić rurkę drugim korkiem.</li>
		<li>Błyskawiczne zamrożenie próbki w ciekłym azocie. Próbkę można przenieść do oznakowanej probówki do krioprezerwacji w celu przechowywania w temperaturze -80 °C lub natychmiast uruchomić.</li>
		<li>Napełnij palec dewara ciekłym azotem i włóż rurkę PTFE zawierającą próbkę do palca dewara. Upewnij się, że próbka jest wyśrodkowana w przestrzeni czynnej rezonatora i uruchom EPR przy 77 K. 
		UWAGA: Rozpocznij przepływ azotu gazowego do spektrometru 15-30 minut przed pomiarami i kontynuuj ten przepływ przez cały czas pomiarów, aby zapobiec kondensacji wody w rezonatorze.</li>
		<li>Ustaw parametry akwizycji EPR na następujące: częstotliwość mikrofal = 9,65 GHz; pole środkowe = 3438 G; amplituda modulacji = 4,0 G; szerokość przemiatania = 150 G; moc mikrofal = 0,316 mW; całkowita liczba skanów = 10; czas przemiatania = 60 s; i stała czasowa = 1,28 ms.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Pomiary EPR w płynach
<ol>
	<li>Krew pełna 
	<ol>
		<li>Potraktuj myszy (w wieku 8-12 tygodni) pojedynczą dawką dotchawniczej bleomycyny (Bleo; 100 μL przy 1 U/ml) rozpuszczoną w PBS lub samym PBS, jak opisano wcześniej16,17.</li>
		<li>Eutanazja myszy polega na podawaniu wziewnego izofluranu (1,5-4%), a następnie wykrwawieniu i zwichnięciu szyjki macicy. Odessać krew przez prawą komorę do strzykawki pokrytej heparyną (1000 USP/ml) zawierającej 100 μM DTPA i przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>W oddzielnej probówce o pojemności 1,5 ml dodaj 15 μl PBS zawierającego 100 μM DTPA i 3 μl CMH (10 mM) do 132 μl krwi, uzyskując całkowitą objętość 150 μl i końcowe stężenie CMH 0,2 mM.</li>
		<li>Inkubować krew przez 10 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.</li>
		<li>Wyjmij rurki z łaźni wodnej.</li>
		<li>Pobrać podwielokrotność, ładując krew do rurki kapilarnej i uruchomić EPR w temperaturze pokojowej z następującymi parametrami akwizycji EPR: częstotliwość mikrofal = 9,65 GHz; pole środkowe = 3432 G; amplituda modulacji = 1,0 G; szerokość przemiatania = 80 G; moc mikrofal = 19,9 mW; całkowita liczba skanów = 3; czas przemiatania = 12,11 s; i stała czasowa = 20,48 ms. Alternatywnie, próbki można błyskawicznie zamrażać zgodnie z opisem w kroku 2.3 dla pomiarów w temperaturze 77 K. Parametry akwizycji EPR są następujące: częstotliwość mikrofal = 9,65 GHz; pole środkowe = 3438 G; amplituda modulacji = 4,0 G; szerokość zamiatania = 150 G; moc mikrofal = 0,316 mW; łączna liczba skanów = 2; czas przemiatania = 60 s; i stała czasowa = 1,28 ms.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF)
	<ol>
		<li>Po eutanazji (patrz krok 3.1.2) należy pobrać BALF, powoli wkraplając i pobierając 1 ml PBS zawierającego 100 μM DTPA trzykrotnie do strzykawki za pomocą kaniuli umieszczonej w tchawicy.</li>
		<li>W probówce o pojemności 1,5 ml potraktuj 200 μl BALF 4 μl CMH (10 mM), aby uzyskać końcowe stężenie 0,2 mM.</li>
		<li>Inkubować BALF przez 50 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.</li>
		<li>Wyjmij rurki z łaźni wodnej i umieść je na lodzie.</li>
		<li>Załadować BALF do rurki kapilarnej i uruchomić EPR w temperaturze pokojowej z tymi samymi ustawieniami EPR, jakie użyto w kroku 1.1.13, lub błyskawicznym zamrożeniem w ciekłym azocie, jak opisano w kroku 2.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiary EPR we krwi i BALF w 77 K
	<ol>
		<li>Postępuj zgodnie z powyższym protokołem, aby pobrać krew (kroki 3.1.1 do 3.1.4) i BALF (kroki 3.2.1 do 3.2.4).</li>
		<li>Umieść 150 μl leczonej krwi lub BALF w rurkach PTFE (1-2 cale). Użyj gumowego korka, aby zamknąć jeden koniec rurki PTFE przed dodaniem próbki, a drugi korek, aby uszczelnić rurkę.</li>
		<li>Błyskawiczne zamrożenie próbki w ciekłym azocie.</li>
		<li>Patrz sekcja 2.3 w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat uruchamiania EPR w zamrożonych próbkach w rurkach PTFE za pomocą palca dewara w temperaturze 77 K. Uruchom Frozen CMH traktowane próbki krwi w ciągu tygodnia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Pomiary EPR na tkance płucnej
<ol>
	<li>Błyskawiczne zamrożenie tkanki płucnej 
	<ol>
		<li>Po pobraniu BALF w kroku 3.2.1 klatka piersiowa jest otwierana, a płuca przepłukiwane 10 ml zimnego PBS przez prawą komorę w celu usunięcia krwi. Błyskawiczne zamrożenie tkanki płucnej w ciekłym azocie. Zamrożoną tkankę płucną można przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 6 miesięcy, aż do wykorzystania do pomiarów EPR.</li>
		<li>Ustabilizuj tkankę płucną na suchym lodzie za pomocą pęsety i wytnij wiele małych kawałków (5-15 mg) tkanki płucnej za pomocą ostrza o jednym ostrzu.</li>
		<li>Zważ tkankę w probówce o pojemności 1,5 ml, umieść probówkę na wadze i wytaruj wagę, a następnie dodaj kawałki tkanki i zapisz wagę.</li>
		<li>Do tkanki w probówce o pojemności 1,5 ml dodaj 196 μl KHB zawierającego DTPA i 4 μl CMH (0,2 mM), aby uzyskać całkowitą objętość 200 μl.</li>
		<li>Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.</li>
		<li>Odwirować (przez kilka sekund) w mikrowirówce o sile 3 884 x g.</li>
		<li>Umieścić na lodzie i odpipetować 150 μl supernatantu do rurki PTFE i zamrozić w celu wykonania pomiarów 77 K, jak opisano w sekcji 2.3. 
		UWAGA: W przypadku tej metody należy wziąć pod uwagę niejednorodność urazu. W przypadku uszkodzenia płuc wywołanego bleomycyną, biorąc pod uwagę, że jest to uraz wysoce niejednorodny, zaleca się wycięcie kilku kawałków tkanki z różnych części płuc od każdej myszy. Alternatywnie, większy fragment tkanki można homogenizować w buforze KHB zawierającym 100 μM DTPA w stosunku wagowym do objętościowym 1:6 (mg/μL), jak opisano poniżej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Świeża tkanka płucna zakonserwowana w buforze sacharozy 
	<ol>
		<li>Przepłukać płukane płuca zimnym PBS, aby usunąć krew, jak to zrobiono w kroku 3.1.2.</li>
		<li>Homogenizować świeżą tkankę płucną w buforze Tris-EDTA zawierającym 0,25 M sacharozy w stosunku 1:6 płuco/bufor (mg/μl) za pomocą młynka do tkanek Dounce ze szkłem lub tłuczkiem PTFE.</li>
		<li>Dodać 50 μl homogenatu płucnego do 450 μl KHB zawierającego 100 μM DTPA.</li>
		<li>W probówce o pojemności 1,5 ml (o całkowitej objętości 100 μl) do 98 μl homogenatu płucnego w KHB dodać 2 μl CMH o zawartości 10 mM, aby uzyskać końcowe stężenie 0,2 mM.</li>
		<li>Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.</li>
		<li>Umieść próbki na lodzie i załaduj je do rurki kapilarnej. Uruchom EPR w RT (ustawienia używane w kroku 2.1.13).</li>
		<li>Aby przetestować udział określonych gatunków i źródeł przy użyciu różnych inhibitorów, należy wstępnie potraktować 88 μl homogenatu płucnego +/- inhibitora, dostosowując go za pomocą KHB, aby uzyskać końcową objętość 98 μl. W tym eksperymencie inhibitory zawierały 10 μl SOD (100 U/ml), 4 μl deferoksaminy (DFO; stężenie końcowe = 800 μM) lub 4 μl chlorku difenylodonium (DIP; stężenie końcowe = 100 μM). Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.</li>
		<li>Dodać 2 μl CMH i inkubować przez kolejne 20 minut w temperaturze 37 °C, a następnie wykonać pomiary EPR, jak opisano powyżej. Dołączyć jednorazowo dopasowaną próbkę ślepą z CMH KHB zawierającą bufor sacharozy. Alternatywnie, należy przechowywać podwielokrotności pozostałych homogenatów płuc (etap 3.1.2) w temperaturze -80 °C do przyszłych pomiarów. 
		UWAGA: Całkowitą objętość można skalować w zależności od potrzeb.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiary EPR na tkance płucnej myszy, którym wstrzyknięto sondy spinowe in vivo (w RT z wykorzystaniem komórek tkankowych)
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy CPH, rozpuszczając 4,9 mg CPH w 1 ml przefiltrowanego i odtlenionego 50 mM buforu fosforanowego.</li>
		<li>Znieczulaj myszy wziewnym izofluranem (1,5-4%) przez 20-30 sekund, aż przestaną reagować na szczypanie palców. Wstrzyknąć myszom drogą zadoczodołową 100 μl sondy spinowej CPH na masę ciała myszy 25 g (dawka końcowa = 20 mg/kg) i pozwolić sondzie krążyć przez 1 godzinę. Natychmiast po wstrzyknięciu zaoczodołowym dodaj jedną kroplę 0,5% proparakainy HCl na okolicę oczu, aby zapobiec bólowi i suchości oka. Monitoruj myszy przez 1 godzinę i przystąp do pobierania tkanek.</li>
		<li>Zbierz tkankę płucną zgodnie z powyższym opisem i błyskawicznie zamroź płuca.</li>
		<li>Pokrój 20-30 mg zamrożonej tkanki na suchym lodzie i zapisz dokładną wagę.</li>
		<li>Delikatnie przetrzyj chusteczkę chusteczkami czyszczącymi, aby wchłonąć wodę powierzchniową.</li>
		<li>Umieść tkankę w okienku komórki tkankowej (akcesorium umożliwia pomiary EPR dla próbek tkanek) i uruchom EPR w celu określenia całkowitych spinów. Dane można wyrazić jako całkowitą liczbę spinów na mg tkanki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Symuluj widma EPR za pomocą modułu SpinFit wbudowanego w oprogramowanie ksenonowe stacjonarnego spektrometru EMXnano EPR. Określ stężenie azotoksydu za pomocą modułu SpinCount. Alternatywnie można wykonać krzywą kalibracyjną stabilnego nitrolokdu, takiego jak 4-hydroksy-TEMPO lub TEMPOL, a stężenie można uzyskać, porównując intensywność sygnału z próbką i wzorcem.</li>
	<li>W przypadku danych zebranych w temperaturze 77 K należy użyć podwójnej integracji, a następnie funkcji SpinCount.</li>
</ol>

<ol><li>Kalyanaraman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+with+fluorescent+probes%3A+challenges+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations.</a> Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).</li>
<li>Bobko, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+monitoring+of+pH%2C+redox+status%2C+and+glutathione+using+L-band+EPR+for+assessment+of+therapeutic+effectiveness+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+Resonance+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 67 (6), 1827-1836 (2012).</li>
<li>Elajaili, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+spin+relaxation+times+and+rapid+scan+EPR+imaging+of+pH-sensitive+amino-substituted+trityl+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+Resonance+in+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals.</a> Magnetic Resonance in Chemistry. 53 (4), 280-284 (2015).</li>
<li>Elajaili, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+disulfide+dinitroxides+at+250+MHz+to+monitor+thiol+redox+status%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">Imaging disulfide dinitroxides at 250 MHz to monitor thiol redox status.</a> Journal of Magnetic Resonance. 260, 77-82 (2015).</li>
<li>Halpern, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxymetry+Deep+in+Tissues+with+Low-Frequency+Electron-Paramagnetic-Resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic-Resonance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 13047-13051 (1994).</li>
<li>Epel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+thiol+redox+status+in+murine+tumors+in+vivo+with+rapid-scan+electron+paramagnetic+resonanc%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">Imaging thiol redox status in murine tumors in vivo with rapid-scan electron paramagnetic resonanc.</a> Journal of Magnetic Resonance. 276, 31-36 (2017).</li>
<li>Legenzov, E. A., Sims, S. J., Dirda, N. D. A., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disulfide-Linked+Dinitroxides+for+Monitoring+Cellular+Thiol+Redox+Status+through+Electron+Paramagnetic+Resonance+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Disulfide-Linked Dinitroxides for Monitoring Cellular Thiol Redox Status through Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy.</a> Biochemistry. 54 (47), 6973-6982 (2015).</li>
<li>Abbas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium-throughput+ESR+detection+of+superoxide+production+in+undetached+adherent+cells+using+cyclic+nitrone+spin+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Research%22%5BJournal%5D)">Medium-throughput ESR detection of superoxide production in undetached adherent cells using cyclic nitrone spin traps.</a> Free Radical Research. 49 (9), 1122-1128 (2015).</li>
<li>Dikalov, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+of+Nox1+and+Nox4+in+basal+and+angiotensin+II-stimulated+superoxide+and+hydrogen+peroxide+production%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Distinct roles of Nox1 and Nox4 in basal and angiotensin II-stimulated superoxide and hydrogen peroxide production.</a> Free Radical Biology and Medicine. 45 (9), 1340-1351 (2008).</li>
<li>Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor'ev, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EPR+detection+of+cellular+and+mitochondrial+superoxide+using+cyclic+hydroxylamines%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Research%22%5BJournal%5D)">EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines.</a> Free Radical Research. 45 (4), 417-430 (2011).</li>
<li>Dikalova, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+Targeting+of+Mitochondrial+Superoxide+in+Hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Therapeutic Targeting of Mitochondrial Superoxide in Hypertension.</a> Circulation Research. 107 (1), 106-116 (2010).</li>
<li>Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Paramagnetic+Resonance+Measurements+of+Reactive+Oxygen+Species+by+Cyclic+Hydroxylamine+Spin+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Electron Paramagnetic Resonance Measurements of Reactive Oxygen Species by Cyclic Hydroxylamine Spin Probes.</a> Antioxidants & Redox Signaling. , (2017).</li>
<li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-Carnitine+preserves+endothelial+function+in+a+lamb+model+of+increased+pulmonary+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">L-Carnitine preserves endothelial function in a lamb model of increased pulmonary blood flow.</a> Pediatric Research. 74 (1), 39-47 (2013).</li>
<li>Berg, K., Ericsson, M., Lindgren, M., Gustafsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High+Precision+Method+for+Quantitative+Measurements+of+Reactive+Oxygen+Species+in+Frozen+Biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A High Precision Method for Quantitative Measurements of Reactive Oxygen Species in Frozen Biopsies.</a> PloS One. 9 (3), (2014).</li>
<li>Kozlov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EPR+analysis+reveals+three+tissues+responding+to+endotoxin+by+increased+formation+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">EPR analysis reveals three tissues responding to endotoxin by increased formation of reactive oxygen and nitrogen species.</a> Free Radical Biology and Medicine. 34 (12), 1555-1562 (2003).</li>
<li>Van Rheen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+Extracellular+Superoxide+Dismutase+Overexpression+Lessens+Bleomycin-Induced+Pulmonary+Hypertension+and+Vascular+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Lung Extracellular Superoxide Dismutase Overexpression Lessens Bleomycin-Induced Pulmonary Hypertension and Vascular Remodeling.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 500-508 (2011).</li>
<li>Mouradian, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+Dismutase+3+R213G+Single-Nucleotide+Polymorphism+Blocks+Murine+Bleomycin-Induced+Fibrosis+and+Promotes+Resolution+of+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Superoxide Dismutase 3 R213G Single-Nucleotide Polymorphism Blocks Murine Bleomycin-Induced Fibrosis and Promotes Resolution of Inflammation.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (3), 362-371 (2017).</li>
<li>Dikalov, S. I., Li, W., Mehranpour, P., Wang, S. S., Zafari, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+extracellular+superoxide+by+human+lymphoblast+cell+lines%3A+comparison+of+electron+spin+resonance+techniques+and+cytochrome+C+reduction+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Production of extracellular superoxide by human lymphoblast cell lines: comparison of electron spin resonance techniques and cytochrome C reduction assay.</a> Biochem Pharmacol. 73 (7), 972-980 (2007).</li>
<li>Kozuleva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+superoxide+radical+production+in+thylakoid+membrane+using+cyclic+hydroxylamines%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Quantification of superoxide radical production in thylakoid membrane using cyclic hydroxylamines.</a> Free Radical Biology and Medicine. 89, 1014-1023 (2015).</li>
<li>Chen, K., Swartz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+of+Hydroxylamines+to+Nitroxide+Spin+Labels+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Oxidation of Hydroxylamines to Nitroxide Spin Labels in Living Cells.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 970 (3), 270-277 (1988).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ocena produkcji wolnych rodników w warunkach biologicznych jest ważna dla zrozumienia sygnalizacji regulowanej redoks w zdrowiu i chorobie, ale pomiar tych gatunków jest bardzo trudny ze względu na krótki okres półtrwania gatunków wolnych rodników i ograniczenia techniczne przy powszechnie stosowanych metodach. EPR jest cennym i potężnym narzędziem w biologii redoks, ponieważ jest to jedyna jednoznaczna metoda wykrywania wolnych rodników. W tym projekcie demonstrujemy praktyczne metody EPR do projektowania eksperymentów ...

Podczas gdy pomiary stresu oksydacyjnego i reaktywnych form tlenu są ważne dla badania różnorodnych chorób we wszystkich układach narządów, wykrywanie reaktywnych form tlenu (ROS) jest trudne ze względu na krótki okres półtrwania i wysoką reaktywność. Technika elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) jest najbardziej jednoznaczną metodą wykrywania wolnych rodników. Sondy wirowe mają przewagę nad częściej stosowanymi sondami fluorescencyjnymi. Chociaż sondy fluorescencyjne są stosunkowo niedrogie i łatwe w użyciu oraz zapewniają szybkie, czułe wykrywanie ROS, mają poważne ograniczenia ze względu na fałszywe sygnały, niemożność obliczenia stężeń ROS i ogólny brak specyficzności1.
Aby ułatwić korzystanie z EPR do badań biologicznych, zsyntetyzowano różne sondy spinowe, które mogą mierzyć szereg biologicznie istotnych gatunków wolnych rodników, a także pO2, pH i stany redoks2,3,4,5,6,7. Pułapki spinowe zostały również opracowane w celu wychwytywania krótkotrwałych rodników i tworzenia długotrwałych adduktów, co ułatwia wykrywanie przez EPR8. Obie klasy (sondy spinowe i pułapki spinowe) mają swoje zalety i ograniczenia. Jedną z powszechnie stosowanych klas sond spinowych są cykliczne hydroksyloaminy, które są ciche EPR i reagują z krótkotrwałymi rodnikami, tworząc stabilny nitroksyl. Cykliczne hydroksyloaminy reagują z ponadtlenkiem 100 razy szybciej niż pułapki spinowe, co pozwala im konkurować z przeciwutleniaczami komórkowymi, ale brakuje im swoistości i wymagają zastosowania odpowiednich kontroli i inhibitorów w celu identyfikacji rodnika lub źródła odpowiedzialnego za sygnał nitroksydowy. Podczas gdy pułapki spinowe wykazują specyficzność, z wyraźnymi wzorcami widmowymi w zależności od uwięzionych gatunków, mają powolną kinetykę pułapki spinowej ponadtlenkowej i są podatne na biodegradację adduktów rodnikowych. Zastosowania pułapek spinowych zostały dobrze udokumentowane w badaniach biomedycznych9,10,11,12,13.
Celem tego projektu jest zademonstrowanie praktycznych metod EPR do projektowania eksperymentów i przygotowywania próbek do wykrywania ponadtlenku za pomocą sond spinowych w różnych przedziałach komórkowych in vitro i w różnych przedziałach tkankowych in vivo. W kilku manuskryptach opublikowano protokoły związane z tymi celami, wykorzystujące przepuszczalne dla komórek, nieprzepuszczalne dla komórek i mitochondrialne sondy spinowe do celowania w różne przedziały komórkowe in vitro i przetwarzanie tkanki do analizy w modelach mysich14,15. Opieramy się na tej literaturze, walidując podejście do pomiaru ponadtlenku za pomocą sondy spinowej 1-hydroksy-3-metoksykarbonylo-2,2,5,5-tetrametylopirolidyny (CMH) w różnych przedziałach komórkowych in vitro, aby zapewnić dokładne pomiary, podkreślając potencjalne problemy techniczne, które mogą zniekształcić wyniki. Udostępniamy również metody do wykonywania pomiarów EPR we krwi, płynie z popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych oraz tkance płucnej za pomocą sondy spinowej CMH. W badaniach tych porównano różne metody przetwarzania tkanek, a także przedstawiono metodę wstrzykiwania myszom innej sondy spinowej, CPH, przed pobraniem tkanki. Na koniec opracowujemy praktyczną metodę przechowywania próbek w rurkach z politetrafluoroetylenu (PTFE), aby umożliwić przechowywanie i przenoszenie próbek przed pomiarami EPR w temperaturze 77 K.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>LifeTech</td><td>10566-016</td><td>pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Kwas dietylenotriaminopentaoctowy (DTPA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6518-5G</td><td></td></tr><tr><td>chlorek sodu (NaCl)&nbsp;</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>&nbsp; BP358-212</td><td>służy do przygotowania 50 mM buforu soli fosforanowej &nbsp; wg Sigma aldrish&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>fosforan potasu dwuzasadowy (HK2PO4 )</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>&nbsp; BP363-500</td><td>służy do przygotowania 50 mM buforu soli fosforanowej &nbsp; wg Sigma aldrish&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4 )</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-5379</td><td>służy do przygotowania 50 mM fosforanowego buforu solnego&nbsp; według Sigma aldrish&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Bufor Krebsa-Henseleita (KHB)&nbsp;</td><td>(Alfa Aesar, Hill)</td><td>J67820</td><td></td></tr><tr><td>Dysmutaza ponadtlenkowa erytrocytów bydła (SOD)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&nbsp; S7571-30KU</td><td></td></tr><tr><td>12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1585-1MG</td><td>Rozpuszcza się w DMSO</td></tr><tr><td>Antymycyna A (AA)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>A8674-25MG</td><td>Rozpuszcza się w etanolu i przechowuje w szklanych fiolkach (MW stosuje się uśrednioną masę cząsteczkową dla czterech partii)</td></tr> <tr><td>1-hydroksy-3-metoksykarbonylo-2,2,5,5-tetrametylopirolidyna. HCl (CMH)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-430-117-M050</td><td></td></tr><tr><td>1-hydroksy-3-karboksyl-2,2,5,5-tetrametylopirolidyna . HCl (CPH)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-430-078-M250</td><td></td></tr><tr><td>1-hydroksy-4-[2-trifenylofosfonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetrametylopiperydyna, 1-hydroksy-2,2,6,6-tetrametylo-4-[2-(trifenylofosfonio)acetamido]dichlorek piperydyny ( mito-TEMPO-H)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-430-171-M005</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek 1-hydroksy-2,2,6,6-tetrametylopirydyno-4-ylotrimetyloamoniowy . HCl (CAT1H)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-430-131-M250</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna&nbsp;</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>NDC 25021-400-10</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek difenyliodoniowy&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43088</td><td></td></tr><tr><td>Sól mezylanowa deferoksaminy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9533-1G</td><td></td></tr><tr><td>Critoseal</td><td>Leica</td><td>39215003</td><td></td></tr><tr><td>MARKA jednorazowe BLAUBRAND&nbsp; Mikropipety intraMark</td><td>Sigma Aldrich</td><td>708733</td><td>Kapilary</td></tr><tr><td>RURKI FLUOROPOLIMEROWE FRAKCYJNE PTFE 3/16" Średnica zewnętrzna x 1/8" Identyfikator</td><td>NORELL</td><td>1598774A Rurki</td><td>teflonowe&nbsp;</td></tr><tr><td>KORKI Z GUMY SILIKONOWEJ DO PROBÓWEK NMR&nbsp; DO RUR CIENKOŚCIENNYCH O ŚREDNICY ZEWNĘTRZNEJ 4 mm-5 mm (ŚREDNICA WEWNĘTRZNA 3,2 mm DO 4,2 MM) TS-4-5-SR</td><td>NORELL</td><td>94987</td><td></td></tr><tr><td>EMXnano Stacjonarny spektrometr EPR&nbsp;</td><td>Bruker BioSpin GmbH</td><td>E7004002</td><td></td></tr><tr><td>EMX NANO TISSUE CELL</td><td>Bruker BioSpin GmbH</td><td>E7004542</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie elektronowego rezonansu paramagnetycznego w próbkach biologicznych w temperaturze otoczenia i temperaturze 77 k

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

Dokładne i specyficzne wykrywanie reaktywnych form tlenu (ROS) w różnych komórkach i tkankach jest niezbędne do badania sygnalizacji regulowanej przez redoks w warunkach biologicznych. Spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) jest jedyną bezpośrednią metodą jednoznacznej oceny wolnych rodników. Jego zaletą jest to, że wykrywa poziomy fizjologiczne określonych gatunków z dużą swoistością, ale wymaga specjalistycznej technologii, starannego przygotowania próbki i odpowiednich kontroli, aby zapewnić dokładną interpretację danych. Cykliczne sondy spinowe hydroksyloaminy reagują selektywnie z ponadtlenkiem lub innymi rodnikami, generując sygnał nitrooksydowy, który można określić ilościowo za pomocą spektroskopii EPR. Przepuszczające komórki sondy spinowe i sondy spinowe zaprojektowane do szybkiej akumulacji w mitochondriach pozwalają na określenie stężenia ponadtlenkowego w różnych przedziałach komórkowych.
W hodowanych komórkach, użycie przepuszczalnej dla komórek 1-hydroksy-3-metoksykarbonylo-2,2,5,5-tetrametylopirolidyny (CMH) wraz z i bez niej, lub bez wstępnej obróbki dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), lub użycie przepuszczalnego dla komórek PEG-SOD, pozwala na odróżnienie zewnątrzkomórkowego od cytozolowego ponadtlenku. Mitochondrialny dichlorek 1-hydroksy-4-[2-trifenylofosfonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetrametylopiperydyny,1-hydroksy-2,2,6,6-tetrametylo-4-[2-(trifenylofosfonio)acetamido] piperydyniowego (mito-TEMPO-H) pozwala na pomiar mitochondrialnych ROS (z przewagą ponadtlenku).
Sondy spinowe i spektroskopia EPR mogą być również stosowane do modeli in vivo. Ponadtlenek można wykryć w płynach pozakomórkowych, takich jak krew i płyn pęcherzykowy zębodoł, a także w tkankach, takich jak tkanka płucna. Przedstawiono kilka metod przetwarzania i przechowywania tkanek do pomiarów EPR oraz dostarczania dożylnej sondy spinowej 1-hydroksy-3-karboksyl-2,2,5,5-tetrametylopirolidyny (CPH) in vivo. Podczas gdy pomiary można wykonywać w temperaturze pokojowej, próbki uzyskane z modeli in vitro i in vivo mogą być również przechowywane w temperaturze -80 °C i analizowane za pomocą EPR w temperaturze 77 K. Próbki mogą być przechowywane w specjalistycznych rurkach stabilnych w temperaturze -80 °C i pracujących w temperaturze 77 K, co umożliwia praktyczną, wydajną i powtarzalną metodę, która ułatwia przechowywanie i przenoszenie próbek.

Wykrywanie anionorodnika ponadtlenkowego za pomocą CMH zostało zwalidowane przy użyciu układu generującego supertlenek X/XO, aby wykazać, że sygnał nitroksylowy (CM.) był całkowicie hamowany przez SOD, podczas gdy katalaza nie wywierała żadnego wpływu (Rysunek 1A). Następnie oceniono całkowitą ilość zewnątrzkomórkowego anionorodnika ponadtlenkowego w komórkach RAW 264.7 poprzez inkubację komórek z przenikającą przez błony komórkowe sondą spinową CM...

Spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) jest jednoznaczną metodą pomiaru wolnych rodników. Zastosowanie selektywnych sond spinowych pozwala na wykrywanie wolnych rodników w różnych przedziałach komórkowych. Przedstawiamy praktyczną, efektywną metodę pobierania próbek biologicznych, która ułatwia obróbkę, przechowywanie i przenoszenie próbek do pomiarów EPR.

Zastosowanie elektronowego rezonansu paramagnetycznego w próbkach biologicznych w temperaturze otoczenia i temperaturze 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Rozregulowana sygnalizacja redoks jest zaangażowana w patogenezę różnych chorób. Badanie biologii redoks wymaga dokładnego wykrywania reaktywnych form tlenu w różnych przedziałach komórkowych i tkankowych. Spektroskopia EPR jest jedyną metodą, która jednoznacznie mierzy wolne rodniki.Protokół ten przedstawia praktyczną metodę postępowania z próbkami biologicznymi do spektroskopii EPR i ich przechowywania. Protokoły te ilustrują zastosowanie sond EPR i spinowych w dwóch reprezentatywnych modelach. Chociaż można je przystosować do oceny gatunków aktywnych w innych warunkach biologicznych.Projekt eksperymentu i obchodzenie się z próbką mają kluczowe znaczenie dla jej odtwarzalności. Zalecamy rozważenie gęstości komórek i zapewnienie odpowiednich kontroli dopasowanych w czasie. Zacznij od delikatnego przemycia surowych komórek 264,7 jednym mililitrem buforu Krebs-Henseleit lub KHB na dołek.I potraktuj komórki 500 mikrolitrami KHB, uzupełnionymi 100 mikromilami DTPA na studzienkę. Aby wstępnie poddać obróbce dysmutazę ponadtlenkową, dodaj 15 mikrolitrów bulionu lub nośnika dysmutazy ponadtlenkowej do każdego dołka i umieść płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 minut. Pod koniec wstępnej obróbki dysmutazy ponadtlenkowej dodać 12,5 mikrolitra 10 milimolowych CMH i 40 mikrolitrów 125 mikromolowego roztworu roboczego PMA do odpowiednich studzienek i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 50 minut.Natychmiast umieść płytki na lodzie i zbierz bufor z każdej studzienki do pojedynczych 1,5 mililitrowych probówek na lodzie. Następnie dodaj 100 mikrolitrów świeżego KHB plus DTPA do każdej studzienki i delikatnie zeskrob komórki z dna każdej studzienki. Następnie ponownie zawiesić zawiesiny komórek za pomocą pipetowania i przenieść komórki do pojedynczych probówek o pojemności 1,5 mililitra na lodzie.W celu wykrycia ponadtlenkowego w temperaturze pokojowej należy najpierw załadować 50 mikrolitrów jednego buforu lub próbki komórki do rurki kapilarnej i uszczelnić probówkę. Natychmiast umieść rurkę w spektrometrze elektronowego rezonansu paramagnetycznego lub EPR i ustaw parametry akwizycji EPR dla pomiarów temperatury pokojowej. Zawsze badać ślepą próbkę buforu zawierającą to samo stężenie sondy traktowanej w tych samych warunkach doświadczalnych co kontrola.W celu wykrycia ponadtlenków w temperaturze 77 stopni Kelvina, załaduj 150 mikrolitrów jednej próbki do jedno- lub dwucalowego kawałka prostej rurki z politetrafluoroetylenu lub PTFE, z gumowym korkiem na jednym końcu. Uszczelnić drugi koniec probówki drugim korkiem i błyskawicznie zamrozić próbkę w ciekłym azocie. Następnie szybko wyjmij korki i umieść rurkę PTFE w oznakowanej kriorurze do przechowywania ciekłego azotu.W przypadku pomiarów EPR napełnij palec dewara spektrometru EPR ciekłym azotem i umieść rurkę PTFE zawierającą próbkę w ciekłym azocie. Umieść palec dewara w spektrometrze EPR i ustaw parametry akwizycji EPR dla pomiarów na 77 stopni Kelvina. W celu wykrycia ROS w zamrożonej tkance płucnej umieść tkankę na suchym lodzie i użyj pęsety, aby ustabilizować zamrożoną tkankę na suchym lodzie.Pokrój próbkę na pięć 15-miligramowych kawałków i zważ je w wytarowanej probówce o pojemności 1,5 mililitra. Dodać 196 mikrolitrów KHB plus DTPA i cztery mikrolitry CMH do próbki i inkubować próbkę płuc przez godzinę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przed granulowaniem fragmentów tkanek przez krótkie odwirowanie. Następnie umieść próbkę na lodzie przed przeniesieniem 150 mikrolitrów supernatantu do kawałka rurki PTFE w celu błyskawicznego zamrożenia w ramach przygotowań do pomiaru EPR, jak właśnie pokazano.Ocena całkowitej produkcji ponadtlenkowej w surowych komórkach 264,7 stymulowanych PMA, jak wykazano, ujawnia, że stężenie nitrooksydu zarówno w zawiesinie komórki, jak i buforze komórek traktowanych PMA jest podobne, ze względu na przepuszczalny charakter i szybką równowagę sondy spinowej. Rodniki nitroksydowe sygnalizują wzrost w surowych komórkach 264,7 stymulowanych PMA, w porównaniu z komórkami kontrolnymi, ale nie w komórkach wstępnie potraktowanych nieprzepuszczalną dla komórek dysmutazą ponadtlenkową. Stężenie nitrosydu uzyskane w niskich temperaturach w surowych komórkach 264,7 po stymulacji PMA jest również osłabione w obecności dysmutazy ponadtlenkowej zgodnej z danymi dotyczącymi temperatury pokojowej.Stężenie nitrooksydu jest zwiększone we krwi i płynie popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych myszy bleo i myszy leczonych, a także w supernatantach pobranych fragmentów tkanki płucnej od myszy bleo i rannych zwierząt, w porównaniu z kontrolami traktowanymi PBS. Ponadto, po wstrzyknięciu sondy spinowej po orbicie, myszy bleo i leczone zwierzęta wykazują wyższy sygnał sondy spinowej w porównaniu z kontrolą. Te praktyczne protokoły umożliwią naukowcom testowanie produkcji wolnych rodników w różnych przedziałach komórkowych i próbkach biologicznych za pomocą EPR, w tym pomiary niskiej temperatury.

use-electron-paramagnetic-resonance-biological-samples-at-ambient

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejszy protokół opisuje metodę trójwymiarowego obrazowania stężenia tlenu w skali mikronowej w bezpośrednim otoczeniu żywych komórek z wykorzystaniem mikroskopii rezonansu spinowego elektronów.

Mikroobrazowanie za pomocą rezonansu spin-elektronowego żywych organizmów do mapowania tlenu

Ten film opisuje technikę spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego do badania interakcji białko-białko pomiędzy 15znakowanymi N dzikimi i zmutowanymi białkami envoplakiny a nieznakowanym białkiem wimentyny. Udana interakcja między envoplakiną typu dzikiego a wimentyną prowadzi do rozległego poszerzenia linii i zaniku pików w widmach NMR, podczas gdy brak interakcji między zmutowaną envoplakiną a wimentyną skutkuje dobrze rozdzielonymi pikami w widmach NMR.

Magnetyczny rezonans jądrowy do badania oddziaływań białko-białko na poziomie atomowym

Neurochemia mózgu ssaków ulega zmianie w wielu chorobach neurologicznych i ogólnoustrojowych. Profile charakterystyczne metabolitów mózgowych można skutecznie uzyskać na podstawie surowych ekstraktów tkanki mózgowej. W tym celu stosuje się wysokorozdzielczą spektroskopię NMR, umożliwiającą szczegółową analizę ilościową stężeń metabolitów (metabolomika).

Analiza metabolomiczna mózgu szczura za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego o wysokiej rozdzielczości ekstraktów tkankowych

Nowa metoda elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR), rapid scan EPR (RS-EPR), została zademonstrowana do przestrzennego obrazowania spektralnego 2D, która jest lepsza od tradycyjnej techniki ciągłej fali (CW) i otwiera nowe możliwości obrazowania in vivo. Wyniki są demonstrowane na częstotliwości 250 MHz, ale technika ta ma zastosowanie na dowolnej częstotliwości.

Szybki skan elektronowy rezonansu paramagnetycznego otwiera nowe możliwości obrazowania fizjologicznie ważnych parametrów in vivo

Przedstawiono protokół monitorowania in situ dyfuzji cząsteczek gości w porowatych ośrodkach za pomocą obrazowania elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR).

In Situ Monitorowanie dyfuzji cząsteczek gościnnych w ośrodkach porowatych za pomocą obrazowania elektronowego rezonansu paramagnetycznego

Przedstawiono technikę wykorzystującą długości fal 1150 i 1412 nm do pomiaru temperatury wody otaczającej małą kulę magnetyczną ogrzewaną indukcyjnie.

Technika pomiaru temperatury w bliskiej podczerwieni dla wody otaczającej małą kulę magnetyczną ogrzewaną indukcyjnie

Ten protokół przedstawia szczegółową procedurę przygotowania biologicznych próbek kriogenicznych do eksperymentów z synchrotronową spektroskopią absorpcyjną promieniowania rentgenowskiego. Opisujemy wszystkie kroki wymagane do optymalizacji przygotowania próbek i kriokonserwacji wraz z przykładami protokołu z komórkami nowotworowymi i fitoplanktonem. Metoda ta zapewnia uniwersalny standard krioprzygotowania próbek.

Przygotowanie próbek biologicznych do specjacji w temperaturze kriogenicznej przy użyciu absorpcyjnej spektroskopii rentgenowskiej o wysokiej rozdzielczości

Prezentowany tutaj jest protokół kriogenicznego transferu zamrożonych próbek do sondy dynamicznego rezonansu magnetycznego (NMR) dynamicznej polaryzacji jądrowej (DNP) z magicznym kątem wirowania (MAS). Protokół zawiera wskazówki dotyczące przechowywania wirnika przed eksperymentem oraz wskazówki dotyczące pomiarów żywotności przed i po eksperymencie.

Ładowanie próbki kriogenicznej do wirującego spektrometru magnetycznego rezonansu jądrowego pod magicznym kątem, który zachowuje żywotność komórek

Struktury molekularne i dynamika ciał stałych, cieczy, gazów i mieszanin są niezwykle interesujące dla różnych dziedzin nauki. Wysokotemperaturowy, wysokociśnieniowy MAS NMR in situ umożliwia detekcję środowiska chemicznego składników w układach fazy mieszanej w ściśle kontrolowanym środowisku chemicznym.

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego in situ z magicznym kątem wirowania

Przedstawiono protokół zastosowania spektroskopii NMR wzmacniającej relaksację paramagnetyczną do wykrywania słabych i przejściowych interakcji między- i wewnątrzcząsteczkowych w białkach wewnętrznie nieuporządkowanych.

Wzmocnienie relaksacji paramagnetycznej do wykrywania i charakteryzowania samoasocjacji wewnętrznie nieuporządkowanych białek

Poznaj metodę przygotowania próbek biologicznych do spektroskopii EPR w temperaturze otoczenia i 77 K. Technika ta umożliwia niejednoznaczne wykrywanie wolnych rodników w biologii redoks.

Zastosowanie elektronowego rezonansu paramagnetycznego w próbkach biologicznych w temperaturze otoczenia i temperaturze 77 K

Przeglądaj więcej filmów