Zastosowanie elektronowego rezonansu paramagnetycznego w próbkach biologicznych w temperaturze otoczenia i temperaturze 77 K
11 stycznia 2019
Spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) jest jednoznaczną metodą pomiaru wolnych rodników. Zastosowanie selektywnych sond spinowych pozwala na wykrywanie wolnych rodników w różnych przedziałach komórkowych. Przedstawiamy praktyczną, efektywną metodę pobierania próbek biologicznych, która ułatwia obróbkę, przechowywanie i przenoszenie próbek do pomiarów EPR.
Rozregulowana sygnalizacja redoks jest zaangażowana w patogenezę różnych chorób. Badanie biologii redoks wymaga dokładnego wykrywania reaktywnych form tlenu w różnych przedziałach komórkowych i tkankowych. Spektroskopia EPR jest jedyną metodą, która jednoznacznie mierzy wolne rodniki.
Protokół ten przedstawia praktyczną metodę postępowania z próbkami biologicznymi do spektroskopii EPR i ich przechowywania. Protokoły te ilustrują zastosowanie sond EPR i spinowych w dwóch reprezentatywnych modelach. Chociaż można je przystosować do oceny gatunków aktywnych w innych warunkach biologicznych.
Projekt eksperymentu i obchodzenie się z próbką mają kluczowe znaczenie dla jej odtwarzalności. Zalecamy rozważenie gęstości komórek i zapewnienie odpowiednich kontroli dopasowanych w czasie. Zacznij od delikatnego przemycia surowych komórek 264,7 jednym mililitrem buforu Krebs-Henseleit lub KHB na dołek.
I potraktuj komórki 500 mikrolitrami KHB, uzupełnionymi 100 mikromilami DTPA na studzienkę. Aby wstępnie poddać obróbce dysmutazę ponadtlenkową, dodaj 15 mikrolitrów bulionu lub nośnika dysmutazy ponadtlenkowej do każdego dołka i umieść płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 minut. Pod koniec wstępnej obróbki dysmutazy ponadtlenkowej dodać 12,5 mikrolitra 10 milimolowych CMH i 40 mikrolitrów 125 mikromolowego roztworu roboczego PMA do odpowiednich studzienek i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 50 minut.
Natychmiast umieść płytki na lodzie i zbierz bufor z każdej studzienki do pojedynczych 1,5 mililitrowych probówek na lodzie. Następnie dodaj 100 mikrolitrów świeżego KHB plus DTPA do każdej studzienki i delikatnie zeskrob komórki z dna każdej studzienki. Następnie ponownie zawiesić zawiesiny komórek za pomocą pipetowania i przenieść komórki do pojedynczych probówek o pojemności 1,5 mililitra na lodzie.
W celu wykrycia ponadtlenkowego w temperaturze pokojowej należy najpierw załadować 50 mikrolitrów jednego buforu lub próbki komórki do rurki kapilarnej i uszczelnić probówkę. Natychmiast umieść rurkę w spektrometrze elektronowego rezonansu paramagnetycznego lub EPR i ustaw parametry akwizycji EPR dla pomiarów temperatury pokojowej. Zawsze badać ślepą próbkę buforu zawierającą to samo stężenie sondy traktowanej w tych samych warunkach doświadczalnych co kontrola.
W celu wykrycia ponadtlenków w temperaturze 77 stopni Kelvina, załaduj 150 mikrolitrów jednej próbki do jedno- lub dwucalowego kawałka prostej rurki z politetrafluoroetylenu lub PTFE, z gumowym korkiem na jednym końcu. Uszczelnić drugi koniec probówki drugim korkiem i błyskawicznie zamrozić próbkę w ciekłym azocie. Następnie szybko wyjmij korki i umieść rurkę PTFE w oznakowanej kriorurze do przechowywania ciekłego azotu.
W przypadku pomiarów EPR napełnij palec dewara spektrometru EPR ciekłym azotem i umieść rurkę PTFE zawierającą próbkę w ciekłym azocie. Umieść palec dewara w spektrometrze EPR i ustaw parametry akwizycji EPR dla pomiarów na 77 stopni Kelvina. W celu wykrycia ROS w zamrożonej tkance płucnej umieść tkankę na suchym lodzie i użyj pęsety, aby ustabilizować zamrożoną tkankę na suchym lodzie.
Pokrój próbkę na pięć 15-miligramowych kawałków i zważ je w wytarowanej probówce o pojemności 1,5 mililitra. Dodać 196 mikrolitrów KHB plus DTPA i cztery mikrolitry CMH do próbki i inkubować próbkę płuc przez godzinę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przed granulowaniem fragmentów tkanek przez krótkie odwirowanie. Następnie umieść próbkę na lodzie przed przeniesieniem 150 mikrolitrów supernatantu do kawałka rurki PTFE w celu błyskawicznego zamrożenia w ramach przygotowań do pomiaru EPR, jak właśnie pokazano.
Ocena całkowitej produkcji ponadtlenkowej w surowych komórkach 264,7 stymulowanych PMA, jak wykazano, ujawnia, że stężenie nitrooksydu zarówno w zawiesinie komórki, jak i buforze komórek traktowanych PMA jest podobne, ze względu na przepuszczalny charakter i szybką równowagę sondy spinowej. Rodniki nitroksydowe sygnalizują wzrost w surowych komórkach 264,7 stymulowanych PMA, w porównaniu z komórkami kontrolnymi, ale nie w komórkach wstępnie potraktowanych nieprzepuszczalną dla komórek dysmutazą ponadtlenkową. Stężenie nitrosydu uzyskane w niskich temperaturach w surowych komórkach 264,7 po stymulacji PMA jest również osłabione w obecności dysmutazy ponadtlenkowej zgodnej z danymi dotyczącymi temperatury pokojowej.
Stężenie nitrooksydu jest zwiększone we krwi i płynie popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych myszy bleo i myszy leczonych, a także w supernatantach pobranych fragmentów tkanki płucnej od myszy bleo i rannych zwierząt, w porównaniu z kontrolami traktowanymi PBS. Ponadto, po wstrzyknięciu sondy spinowej po orbicie, myszy bleo i leczone zwierzęta wykazują wyższy sygnał sondy spinowej w porównaniu z kontrolą. Te praktyczne protokoły umożliwią naukowcom testowanie produkcji wolnych rodników w różnych przedziałach komórkowych i próbkach biologicznych za pomocą EPR, w tym pomiary niskiej temperatury.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia praktyczną metodę pobierania i przygotowania próbek biologicznych do spektroskopii elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR). EPR jest wyjątkową techniką umożliwiającą jednoznaczny pomiar wolnych rodników, które odgrywają kluczową rolę w biologii redoks.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia redoks
- Spektroskopia rezonansu paramagnetycznego elektronów (EPR)
- Detekcja wolnych rodników
Wstęp
- Zaburzona sygnalizacja redox jest powiązana z różnymi chorobami.
- Dokładne wykrywanie reaktywnych form tlenu jest niezbędne w badaniach biologicznych.
- Spektroskopia EPR jest jedyną metodą umożliwiającą jednoznaczny pomiar wolnych rodników.
- Niniejsze badanie koncentruje się na protokołach postępowania i przechowywania próbek biologicznych.
Cel badania
- Zaprezentowanie praktycznej metody pobierania próbek do spektroskopii EPR.
- Zilustrowanie zastosowania selektywnych sond spinowych w układach biologicznych.
- Przedstawienie protokołów, które można dostosować do różnych modeli biologicznych.
Zastosowane metody
- Pobieranie próbek biologicznych do pomiarów EPR.
- Zastosowanie selektywnych sond spinowych do wykrywania wolnych rodników.
- Protokoły przygotowania i przechowywania próbek.
- Zastosowanie metod w reprezentatywnych modelach biologicznych.
Główne wyniki
- Protokoły te skutecznie ułatwiają obchodzenie się z próbkami oraz ich przechowywanie.
- Spektroskopia EPR zapewnia wiarygodne pomiary wolnych rodników.
- Sondy spinowe mogą być dostosowane do różnych kontekstów biologicznych.
- Badanie wykazuje wszechstronność EPR w biologii redox.
Wnioski
- Spektroskopia EPR jest cennym narzędziem do badania wolnych rodników.
- Właściwe przygotowanie próbek jest kluczowe dla uzyskania dokładnych pomiarów.
- Przedstawione metody mogą usprawnić badania w dziedzinie biologii redoks.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Dokładna detekcja reaktywnych form tlenu (ROS) ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia sygnalizacji redoks w mechanizmach chorobowych oraz walidacji celów terapeutycznych. Spektroskopia rezonansu paramagnetycznego elektronów (EPR) zapewnia jednoznaczny, bezpośredni pomiar wolnych rodników, umożliwiającB ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania leków. Metoda ta zwiększa wiarygodność predykcyjną, pozwalając na ilościowe oznaczenie ROS w konkretnych przedziałach komórkowych w modelach komórkowych i tkankowych, co dostarcza podstaw do decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań w programach przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wykrywanie fizjologicznych poziomów konkretnych gatunków ROS z wysoką specyficznością.
- Wartość operacyjna: Pozwala na rozróżnienie nadtlenku rozpływu zewnątrzkomórkowego od cytozolowego przy użyciu sond przenikających przez błony komórkowe oraz kontroli SOD, co pozwala wyjaśnić udział poszczególnych szlaków.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez ilościowe pomiary nadtlenku rozpływu z rozdzielczością kompartmentową w modelach istotnych dla danej choroby.
Przesiewy i rozwój testów
- Gotowość do analizy: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszych etapów pracy poprzez standaryzowane znakowanie sondami spinowymi i stabilizację próbek.
- Powtarzalność: Umożliwienie przechowywania próbek w temperaturze -80°C i analizy w 77 K, co zapewnia spójne pomiary EPR pomiędzy partiami i ośrodkami.
- Skalowalność: Ułatwienie wiarygodnej oceny związków poprzez możliwość transferu i ponownego wykorzystania zamrożonych próbek w badaniach wysokoprzepustowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie kliniczne: Wykrywa supertlenek w tkance płuc, krwi oraz płycie z płukania oskrzeli i pęcherzyków płucnych w modelach uszkodzeń, wspierając dopasowanie translacyjnych biomarkerów.
- Ciągłość przedkliniczna: Łączy wyniki in vitro z modelami in vivo poprzez identyczne strategie detekcji sond spinowych (np. CPH, mito-TEMPO-H).
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje o dalszym rozwoju poprzez potwierdzenie zaangażowania celu za pomocą modulacji ROS w odpowiednich kontekstach patofizjologicznych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Spektroskopia EPR wpisuje się w kontinuum odkryć – od walidacji celu po walidację przedkliniczną – zapewniając ortogonalne potwierdzenie efektów opartych na mechanizmie w obszarze sygnalizacji redoks.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez ilościowe oznaczanie nadtlenku w określonych przedziałach komórkowych przy użyciu selektywnych sond spinowych i kontroli enzymatycznych.
- Przesiewy: Zapewnia gotowość do analiz dzięki powtarzalnemu przygotowaniu próbek i krioprzzechowywaniu, co umożliwia spójne odczyty wolnych rodników w bibliotekach związków.
- Analityka: Generuje ilościowe sygnały nitroksydowe proporcjonalne do stężenia nadtlenku, co pozwala na porównanie warunków i ocenę odpowiedzi na dawkę.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez wykrywanie ROS w nadkrystalizatach tkanek i płynach biologicznych pobranych z modeli chorobowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę do profilowania redoks w różnych obszarach terapeutycznych, co ogranicza redundantne opracowywanie metod.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zapewnia jednoznaczną detekcję wolnych rodników, redukując niepewność mechanistyczną w walidacji szlaków redoks.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanej kinetyce sond spinowych, kontrolowanemu obchodzeniu się z próbkami oraz możliwości pomiarów w niskich temperaturach.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczanie bezpośrednich dowodów na modulację ROS pośredniczoną przez cel, co zmniejsza odsetek niepowodzeń biologicznych na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez potwierdzenie wierności mechanistycznej związków w systemach istotnych dla danej jednostki chorobowej.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie spektroskopii EPR oraz chemii sond spinowych w celu dokładnego doboru sondy i interpretacji danych.
- Zależy od dostępu do spektrometru EPR z możliwością pomiarów zarówno w temperaturze pokojowej, jak i w 77 K.
- Wymaga zastosowania zestandaryzowanych protokołów dotyczących gęstości komórek, czasów inkubacji oraz dopasowanych kontroli w celu zapewnienia porównywalności danych.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody do różnych systemów modelowych (np. hodowlanych komórek w porównaniu z tkanką płucną) w zakresie dostarczania sondy i obróbki tkanki.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, w tym konieczność stosowania specjalistycznych rurek stabilnych w temperaturach kriogenicznych oraz ostrożne obchodzenie się z próbkami, aby zapobiec degradacji sond spinowych.
