Identyfikacja zdarzeń rekombinacji homologicznej w embrionalnych komórkach macierzystych myszy przy użyciu Southern blotting i reakcji łańcuchowej polimerazy
20 listopada 2018
Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół identyfikacji zdarzeń rekombinacji homologicznej, które wystąpiły w embrionalnych komórkach macierzystych myszy za pomocą Southern blotting i/lub PCR. Przykładem tej metody jest generowanie modeli myszy zastępujących genetyczną miozynę II bez mięśni przy użyciu tradycyjnej technologii celowania opartej na embrionalnych komórkach macierzystych opartej na rekombinacji homologicznej.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii molekularnej i komórkowej, takie jak identyfikacja zdarzeń rekombinacji homologicznej w embrionalnych komórkach macierzystych myszy. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest dokładna, niezawodna i szeroko stosowana. Tak więc ta metoda może dostarczyć informacji na temat identyfikacji zdarzeń rekombinacji homologicznej w embrionalnej komórce macierzystej myszy.
Może być również stosowany do innych systemów, takich jak genetycznie modyfikowane komórki lub zwierzęta. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały problemy, ponieważ zajmuje to dużo czasu i obejmuje wiele kroków. Dla każdego gDNA wymieszaj 30 mikrolitrów 10 x bufor dla DRA jeden, trzy mikrolitry DRA jeden i 10 mikrogramów gDNA na próbkę.
Dodaj wodę, aż ostateczna objętość wyniesie 30 mikrolitrów i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, aby strawić gDNA. Przygotować 1% żel do elektroforezy agarozowej z bromkiem etydyny. Załaduj wcześniej pobrane próbki wraz z drabinką o pojemności jednego KB na żel i uruchom go pod napięciem od 30 do 40 woltów przez noc.
Następnego dnia namocz żel w tacce zawierającej roztwór kwasu solnego o stężeniu 0,2 niutona. Użyj shakera, aby delikatnie potrząsnąć tacą przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść żel na tackę zawierającą roztwór denaturujący DNA.
Wstrząsaj delikatnie przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś żel do tacki zawierającej roztwór neutralizujący DNA. I delikatnie potrząsaj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
Korzystając z systemu szybkiego transferu w dół, przenieś DNA z żelu do błony. Następnie zmontuj bibułę turble i stos bibuły zgodnie z instrukcją dostarczoną przez producenta. Następnie wyjmij membranę i przemyj ją dwoma X soli fizjologicznej cytrynianu sodu przez jedną minutę.
Wchłoń płyn za pomocą tkanek, a następnie użyj środka sieciującego UV, aby połączyć DNA z błoną. Aby rozpocząć znakowanie sond DNA radioaktywnością, dodaj zdenaturowane termicznie DNA sondy do probówki zawierającej gotowe do użycia kulki do znakowania DNA. Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać.
I dodaj pięć mikrolitrów radioaktywnie znakowanego trifosforanu deoksycytodyny. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Oczyść oznakowane sondy za pomocą mikrokolumn G 50 zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez producenta.
Użyj licznika scyntylacyjnego, aby zmierzyć radioaktywność. Aby rozpocząć hybrydyzację membran za pomocą oznakowanych sond, umieść membranę w probówce hybrydyzacyjnej. Dodaj mieszany roztwór przed hybrydyzacją.
Umieść probówkę w piecu do hybrydyzacji i pozwól wstępnej hybrydyzacji postępować w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie wyjmij rurkę z piekarnika i wlej roztwór przed hybrydyzacją do 50-mililitrowej probówki. Dodaj denaturowaną sondę i delikatnie wymieszaj.
Aby usunąć niehybrydyzowane sondy, umieść membranę na tacy zawierającej jeden X cytrynian sodu z solą fizjologiczną o zawartości 0,1% SDS i delikatnie wstrząsaj w temperaturze od 55 do 60 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie owiń membranę folią spożywczą i zamocuj ją w kasecie ekspozycyjnej. W ciemnym pomieszczeniu wystaw membranę na dwa arkusze filmu rentgenowskiego.
Wywołaj film, aby zwizualizować wyniki. Określ, czy odpowiedni klon ES jest pożądany, z celem rekombinacji, czy nie, zgodnie z rozmiarami prążków DNA wykrytych przez sondy. W tym badaniu southern blotting i PCR są wykorzystywane do identyfikacji zdarzeń HR, które występują w mysich komórkach ES w celu wygenerowania NM dwóch genetycznych zastępczych modeli myszy przy użyciu technologii celowania za pośrednictwem HR opartej na komórkach ES.
Ponieważ genomowe DNA są pocięte na wiele fragmentów o różnej długości, wykazują one status podobny do rozmazu na żelu DNA. Sugeruje to całkowite trawienie genomowego DNA. Jako ostatni etap southern blotting, sygnały sondy oznaczonej radioaktywnością, hybrydyzującej z docelowym fragmentem DNA, są pokazane na filmie.
Pojawienie się oczekiwanych pasm odzwierciedla występowanie zdarzeń HR w klonach ES. Zgodnie z wstępnym projektem w badaniu, klony ES ze zmutowanym allelem mają dwa różne zakresy wielkości. Podczas gdy klony ES typu dzikiego mają tylko jedno pasmo, co sugeruje, że pożądane klony ES są heterozygotyczne.
Po reakcji PCR produkty PCR można analizować na żelu DNA. Jeśli zaobserwuje się określone prążki NPCR o odpowiednim rozmiarze, sugeruje to wystąpienie zdarzeń HR, które można dodatkowo potwierdzić przez sekwencjonowanie tego pasma PCR. Implikacje tej techniki rozszerzyły się na terapię polegającą na identyfikacji mutacji punktowej, ponieważ podstawa jest identyczna.
Podczas próby wykonania tej procedury należy pamiętać o cierpliwości i ostrożności. Po tej procedurze można zastosować inną metodę, taką jak mikroiniekcja komórek ES do blastocyst, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytanie, takie jak powstawanie chimerycznych zwierząt. Wraz z jej rozwojem, technika ta utorowała drogę badaczom w swojej dziedzinie biologii molekularnej i komórkowej do zbadania funkcji określonego genu lub konsekwencji zmutowanego genu u myszy lub innych.
Nie zapominaj, że praca z etykieciarką radioaktywną P32 DCTB może być bardzo niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak ekranowanie płytą ochronną.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono szczegółowy protokół identyfikacji zdarzeń rekombinacji homologicznej w embrionalnych komórkach macierzystych myszy z wykorzystaniem techniki Southern blotting oraz PCR. Metodę tę zilustrowano na przykładzie generowania mysich modeli z zastąpieniem genetycznym miozyny II niemięśniowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia molekularna
- Biologia komórki
- Genetyka
Wstęp
- Rekombinacja homologiczna jest kluczowym procesem w inżynierii genetycznej.
- Embrionalne komórki macierzyste myszy są szeroko stosowane w badaniach genetycznych.
- Southern blotting oraz PCR są uznanymi technikami analizy modyfikacji genetycznych.
- Metodę tę można zastosować w różnych systemach zmodyfikowanych genetycznie.
Cel badania
- Zapewnienie niezawodnego protokołu identyfikacji zdarzeń rekombinacji homologicznej.
- Zaprezentowanie zastosowania tej metody w tworzeniu modeli genetycznych.
- Pogłębienie zrozumienia technik manipulacji genetycznych w komórkach macierzystych.
Zastosowane metody
- Southern blotting w celu wykrywania specyficznych sekwencji DNA.
- PCR w celu amplifikacji docelowych regionów DNA.
- Przygotowanie próbek gDNA do analizy.
- Protokół krok po kroku w celu wykonania metody.
Główne wyniki
- Pomyślna identyfikacja zdarzeń rekombinacji homologicznej.
- Generowanie mysich modeli genetycznego zastąpienia miozyny II poza mięśniowej.
- Walidacja dokładności i niezawodności metody.
- Wgląd w zastosowanie tej techniki w innych systemach.
Wnioski
- Protokół ten stanowi cenne narzędzie dla badaczy w dziedzinie biologii molekularnej.
- Wykazuje on skuteczność tradycyjnych technik w nowoczesnych badaniach genetycznych.
- Przyszłe zastosowania mogą zostać rozszerzone na różne organizmy modyfikowane genetycznie.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Dokładna identyfikacja zdarzeń rekombinacji homologicznej (HR) w embrionalnych komórkach macierzystych myszy ma kluczowe znaczenie dla tworzenia precyzyjnych modeli genetycznych i minimalizowania ryzyka w programach wczesnego etapu odkrywania leków. Southern blotting oraz PCR stanowią komplementarne, zwalidowane podejścia do potwierdzania celowanych modyfikacji genomu, co wspiera wysoką wiarygodność walidacji celu oraz późniejsze badania translacyjne. Metody te umożliwiają niezawodną selekcję klonów komórek ES do inżynierii genetycznej, bezpośrednio wpływając na efektywność i przewidywalność generowania modeli przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biopharmaceutyków
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjne potwierdzenie zdarzeń celowania genowego, zmniejszając ryzyko efektów poza docelowych w modelach inżynieryjnych.
- Wspiera walidację funkcjonalną modyfikacji genetycznych w celu ograniczenia ryzyka mechanistycznego.
- Ułatwia pewny wybór klonów ES do dalszych badań, zwiększając wartość prognostyczną.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia ustandaryzowane, ilościowe odczyty do weryfikacji genotypu w populacjach komórek ES.
- Umożliwia szybki screening oparty na metodzie PCR w celu wstępnej selekcji dużej liczby klonów przed potwierdzającym blottingiem Southern.
- Wspiera powtarzalne procesy generowania zwalidowanych systemów biologicznych do opracowywania testów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia niezawodne potwierdzenie genotypu dla genetycznie zmodyfikowanych modeli zwierzęcych, wspierając ciągłość translacyjną.
- Jest zgodne ze strategiami opartymi na biomarkerach poprzez zapewnienie wierności genetycznej w systemach przedklinicznych.
- Zmniejsza ryzyko wystąpienia zmiennych zakłócających podczas opracowywania modeli istotnych dla danej choroby.
Integracja potoku i procesu pracy
Metody Southern blotting oraz identyfikacja HR oparta na PCR znajdują się na styku wczesnych odkryć i tworzenia modeli przedklinicznych, łącząc walidację celu z badaniami translacyjnymi.
- Biologia odkrywcza: Potwierdza celowane modyfikacje genetyczne, wspierając badania oparte na hipotezach oraz analizę szlaków sygnałowych.
- Przesiewanie: Umożliwia wysokoprzepustową selekcję metodą PCR oraz rygorystyczne potwierdzenie za pomocą Southern blot dla powtarzalnej oceny genotypu.
- Analityka: Zapewnia ilościowe wzorce prążków i rozróżnianie wielkości w celu odróżnienia alleli typu dzikiego, heterozygotycznych oraz celowanych.
- Badania translacyjne: Gwarantuje dokładność genetyczną w modelach zwierzęcych, wspierając testowanie hipotez dotyczących biomarkerów i terapii.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje szeroko stosowany, zwalidowany schemat postępowania w celu identyfikacji genotypu w różnorodnych projektach inżynierii genetycznej.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w zakresie wierności modelu genetycznego i walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje identyfikację genotypu, umożliwiając powtarzalność i skalowalność w różnych projektach.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez zmniejszenie niepewności przy generowaniu modeli.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację inicjatyw inżynierii genetycznej i alokację zasobów z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w technikach biologii molekularnej oraz starannego projektu sond i starterów.
- Wymaga dostępu do infrastruktury do elektroforezy, blottingu oraz obsługi materiałów radioaktywnych.
- Niezbędna jest rygorystyczna standaryzacja między zespołami w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Możliwa może być konieczność adaptacji metody dla różnych genów docelowych lub systemów modelowych.
- Southern blotting jest pracochłonny i czasochłonny, natomiast PCR może dawać wyniki fałszywie dodatnie, co wymaga analizy potwierdzającej.
