Separacja kompleksów białek tylakoidów szpinaku za pomocą natywnej elektroforezy zielonego żelu i charakterystyki pasma przy użyciu skorelowanego w czasie zliczania pojedynczych fotonów

Metoda ta jest przydatna do udzielenia odpowiedzi na niektóre kluczowe pytania w dziedzinie badań nad fotosyntezą, takie jak: czy domniemane kompleksy tylakoidów są fizjologicznie rzeczywistymi kompleksami z energetycznie połączonymi składnikami? Główną zaletą opisanego tutaj zielonego żelu i protokołu TCSPC jest to, że jest szybki i solidny. Próbki można łatwo przetwarzać i analizować w ciągu jednego dnia, dzięki czemu problemy z przechowywaniem i stabilnością są mniejszym problemem.

Chociaż TCSPC może zapewnić wgląd w systemy fotosyntetyczne, które tutaj badaliśmy, można go również zastosować do innych systemów, od chemicznych po fizyczne i biologiczne, takie jak badania fluorescencyjnego ruchu molekularnego w cieczach, komórkach lub nowatorskich motywach strukturalnych, takich jak warstwy monomolekularne i ciecze jonowe. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować potrzebne roztwory podstawowe i zielone mini żele zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie zaopatrz się w lód i przyciemnij światła.

Używając szklanego homogenizatora Dounce, całkowicie zhomogenizuj liście szpinaku w około jednym do dwóch mililitrów buforu TMK. Aby stworzyć proste urządzenie filtrujące, przetnij delikatną chusteczkę zadaniową na pół i złóż ją na ćwiartki. Wyjąć tłok ze strzykawki, a następnie zapakować złożoną chusteczkę zadaniową w spoiwo strzykawki.

Odpipetować homogenat liściowy do środka filtra do wycierania zadaniowego, a następnie użyć tłoka, aby przepuścić homogenat przez filtr i zebrać go w 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej. Odwirować homogenat w temperaturze 5 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut, aby osadzać nierozpuszczalny materiał, w tym błony tylakoidów. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze buforu TMK.

Aby wyekstrahować chlorofil z każdej próbki, weź 50-mikrolitrową porcję i przenieś ją do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Dodaj 950 mikrolitrów metanolu, zakryj probówkę i wymieszaj, kilkakrotnie ją odwracając. Wirować przy 10 000 g przez 10 minut w celu osadzenia wytrąconych białek.

Korzystając z pomiarów stężenia chlorofilu jako wskazówki, w razie potrzeby usuń i wyrzuć pewną objętość z każdej próbki, aż każda probówka będzie zawierała taką samą całkowitą ilość chlorofilu. Wirować przy 5 000 g przez 10 minut, aby ponownie zagnieździć błony tylakoidów. Usunąć i wyrzucić supernatant, uważając, aby usunąć cały supernatant bez naruszania osadu.

Najpierw rozmrozić porcję roztworu detergentu TMK 30% glicerolu. Odwróć kilka razy, aby wymieszać i utrzymać roztwór na lodzie. Dodać odpowiednią objętość roztworu detergentu, aby rozpuścić osad i uzyskać końcowe stężenie chlorofilu wynoszące jeden miligram na mililitr.

Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, uważając, aby nie spienić próbki. Następnie trzymaj próbkę na lodzie, aby umożliwić sorozpuszczenie próbek tylakoidów. Po zakończeniu soludylizacji odwirować próbkę w temperaturze 10 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut, aby osadzać nierozpuszczalny materiał, dając klarowny, ciemnozielony supernatant.

Następnie załaduj 15 mikrolitrów rozpuszczonego supernatantu tylakoidów bezpośrednio do każdej studzienki wcześniej przygotowanego 1,5-milimetrowego natywnego żelu. Korzystając z bufora 1X działającego, rozpocznij uruchamianie natywnego zielonego żelu przy napięciu 100 woltów. Umieść cały zbiornik żelu na mokrym lodzie na czas biegu, aby złagodzić nagrzewanie rezystancyjne.

Gdy żel skończy działać, wyjmij go z komory elektroforetycznej i spłucz bieżący bufor z płytek żelowych wodą destylowaną. Zdejmij górną płytkę z żelu, a następnie spłucz żel wodą destylowaną. Umieść żel, który nadal znajduje się na dolnej szklanej płytce, na lodzie; Gdy żel nie jest używany, przykryj go folią spożywczą i trzymaj w ciemności, aby nie wysechł.

Następnie użyj ostrego skalpela lub żyletki, aby wyciąć każdy interesujący nas prążk, gdy będzie gotowy do kontynuowania analizy TCSPC. Upewnij się, że wycięta taśma nie zawiera zanieczyszczającego materiału taśmy. Dla każdego analizowanego kompleksu użyj spektrometru fluorescencyjnego, aby uzyskać widmo fluorescencyjne w temperaturze pokojowej od 600 do 800 nanometrów.

Umieść taśmę maskującą na obu końcach szkiełek i złóż ją kilka razy, aby utworzyć przekładki, które pozwolą na mocne trzymanie szkiełek bez ściskania przestrzeni między nimi, a następnie umieść plasterek żelu między dwoma szklanymi szkiełkami mikroskopowymi. Dodaj niewielką ilość wody do plastra żelu na krawędzi szkiełek, aby stworzyć gładki interfejs, który zmniejszy rozpraszanie sygnału. Następnie zaciśnij kanapkę z żelem na ścieżce wiązki tak, aby wiązka uderzyła w plasterek żelu przez otwartą krawędź płytek.

Dla każdego kompleksu zbierz łącznie 10 000 punktów danych w regularnych odstępach czasu w całym spektrum emisji fluorescencji. Aby przeanalizować dane dla danego kompleksu, najpierw znormalizuj wysokość piku każdej krzywej rozpadu dla wszystkich zebranych długości fal, a następnie dopasuj ogon każdej krzywej rozpadu do widma fluorescencji w stanie ustalonym kompleksu, jak opisano w protokole tekstowym. Reprezentatywne wyniki dla elektroforezy w zielonym żelu stanowią przykład idealnego wyniku do analizy tylakoidów szpinaku, gdzie widoczne są wyraźne i ostre zielone paski.

Pasy 2 i 3 przedstawiają bardziej typowe wyniki prostej izolacji tylakoidów i elektroforezy na niegradientowym żelu 5% akrylamidowym. Pasy 4, 5 i 6 stanowią przykład słabych wyników spowodowanych rosnącym stopniem niedostatecznej rozpuszczalności próbki tylakoidów, podczas gdy tor 7 pokazuje wyniki, które można osiągnąć, gdy zamiast szpinaku stosuje się tylakoidy Arabidopsis. Po ustawieniu krzywych danych TCSPC na ten sam rejestr czasu, można je znormalizować do tej samej wysokości piku, co pozwala na porównanie krzywych jako pierwszej analizy danych.

Znormalizowane pod względem pików krzywe rozpadu z różnych kompleksów mogą być następnie nakładane na siebie na danej długości fali, co pozwala na wizualizację różnic w zachowaniu między kompleksami. Dopasowanie ogona do krzywych rozpadu pozwala na konstruowanie widm związanych z rozpadem. Jak widać tutaj, widma związane z rozpadem LHCII są godne uwagi ze względu na brak cech dynamicznych, a kształt widma fluorescencji LHCII pozostaje taki sam, ponieważ sygnał zanika w czasie.

Zanik widma fluorescencji jest również opóźniony, wymagając 100 pikosekund, aby osiągnąć maksymalną fluorescencję. Sugeruje to, że energia nie jest przenoszona między energetycznie odrębnymi pigmentami w kompleksie, gdy fluorescencja zanika. Widma związane z rozpadem są następnie konstruowane dla kompleksu Band 5.

W porównaniu z LHCII, fluorescencja z pasma 5 zanika znacznie szybciej, osiągając maksymalną intensywność w zaledwie 30 pikosekundach, a następnie zanika do mniej niż 20% początkowej intensywności po 500 pikosekundach. Podejmując próbę wykonania tej procedury, należy pamiętać, że interpretacja danych TCSPC będzie opierać się na dodatkowych informacjach biochemicznych identyfikujących składniki badanych kompleksów, na przykład za pomocą 2 DSDS-PAGE i Western Blotting lub spektrometrii mas.