Produkcja na dużą skalę rekombinowanych RNA na okrągłym rusztowaniu przy użyciu systemu pochodzącego z wiroidu w Escherichia coli

Metoda ta może pomóc w wytwarzaniu dużych ilości rekombinowanych RNA, które mogą być stosowane w badaniach naukowych lub przemyśle. Główną zaletą jest to, że rekombinowane RNA jest wytwarzane w Escherichia coli w tanim procesie, który można łatwo zwiększyć. Co ważne, RNA jest wytwarzane na okrągłym rusztowaniu RNA, co ułatwia oczyszczanie do jednorodności.

W przeciwieństwie do DNA lub białek, interesujące RNA nie są łatwo wytwarzane w dużych ilościach w systemach biofabrycznych, takich jak hodowla Escherichia coli. Nasza metoda opiera się na koekspresji interesującego RNA umieszczonego w wysoce stabilnym okrągłym rusztowaniu i zastosowaniu ligazy, która pośredniczy w cyrkularyzacji RNA. Okrągłe rusztowanie RNA wywodzi się z opatentowanego wiroidu.

Wiroidy to stosunkowo małe, niezwijające się, wysoce sparowane koliste RNA, które są zakaźne dla niektórych wyższych roślin. W normalnych warunkach laboratoryjnych jesteśmy w stanie wyprodukować dziesiątki miligramów rekombinowanego RNA na litr kultury bakteryjnej. Aby rozpocząć tę procedurę, amplifikuj cDNA metodą PCR, jak opisano w protokole tekstowym.

Następnie dodaj 100 nanogramów plazmidu pLELVd-BZB do probówki o pojemności 0,5 mililitra. Dodać 10 U enzymu restrykcyjnego typu IIS BpiI i tyle buforu G, aby uzyskać reakcję o objętości 20 mikrolitrów. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, aby strawić plazmid.

Następnie oddzielić produkty PCR i trawienia przez elektroforezę w jednoprocentowym żelu agarozowym w buforze TAE. Zabarwić żel, wstrząsając nim w 200 mililitrach bromku etydyny o stężeniu 0,5 mikrograma na mililitr. Za pomocą transiluminatora UV zwizualizuj DNA.

Użyj skalpela, aby wyciąć prążki odpowiadające amplifikowanemu cDNA i plazmidowi strawionemu przez BpiI. Za pomocą kolumn z żelem krzemionkowym wymyj DNA z fragmentów żelu. Określić ilościowo stężenie DNA za pomocą analizy spektrofotometrycznej.

Przygotuj reakcję montażu Gibsona, używając amplifikowanego cDNA i strawionego plazmidu. Inkubować w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie użyj kolumny z żelem krzemionkowym, aby oczyścić reakcję.

Po elektroporowaniu kompetentnych komórek DH5-alfa E.coli, wybierz kilka białych kolonii i przenieś je do ciekłego podłoża LB. Hoduj kolonie przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie użyj zestawu miniprep do oczyszczenia plazmidów i przeanalizuj ich rozmiary za pomocą elektroforezy w jednoprocentowym żelu agarozowym w buforze TAE.

Najpierw należy poddać elektropostacji wybranego szczepu E. coli zarówno pochodną pLELVd-BZB, która zawiera cDNA odpowiadające interesującemu RNA, jak i plazmidowi P15LTRNISM do koekspresji ligazy tRNA bakłażana. Przenieś ciekłe medium SOC do kuwety elektroporacyjnej w celu odzyskania komórek i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie ułóż bakterie na stałym podłożu LB zawierającym 50 mikrogramów na mililitr ampicyliny i 34 mikrogramy na mililitr chloramfenikolu.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia dodać 250 mililitrów płynnej pożywki gruźliczej, zawierającej 50 mikrogramów na mililitr ampicyliny i 34 mikrogramy na mililitr chloramfenikolu, do litrowej kolby Erlenmeyera z przegrodą. Pobrać inkubowaną E. Coli, a następnie wybrać kolonię i zaszczepić pożywkę w kolbie.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z energicznym wytrząsaniem przy 180 obr./min przez 12 do 16 godzin przed zbiorem bakterii. Wlej zebraną kulturę E. Coli do 250-mililitrowej butelki wirówki i wiruj komórki w temperaturze 14 000 G przez 10 minut. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w 30 mililitrach wody.

Przenieść tę zawiesinę do probówki wirówkowej i ponownie odwirować komórki, stosując poprzednie warunki. Odrzucić supernatant i dodać 10 mililitrów buforu chromatograficznego do osadu komórkowego. Wir, aby ponownie zawiesić komórki w buforze.

Dodaj jedną objętość fenolu: chloroform i energicznie wiruj, aby rozbić komórki. Następnie odwirować przy 12 000 G przez 10 minut. Odzyskać fazę wodną, dodać jedną objętość chloroformu i energicznie wirować.

Wirować przy 12 000 g przez 10 minut. Następnie przefiltrować preparat RNA przez filtr strzykawkowy o średnicy 45 mikrometrów. Oczyść RNA za pomocą jednomililitrowej kolumny aminowo-etanolowej dietylu podłączonej do systemu chromatografii cieczowej.

Dostosuj natężenie przepływu do jednego mililitra na minutę i zrównoważ kolumnę 10 mililitrami buforu chromatograficznego. Następnie załadować próbkę i przemyć kolumnę 10 mililitrami buforu chromatograficznego. Eluuj RNA za pomocą 20 mililitrów buforu elucyjnego i zbierz jedną mililitrową porcję.

Za pomocą dwuwymiarowej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym oddziel koliste RNA od ich liniowych odpowiedników. Najpierw należy przygotować pięcioprocentowy żel poliakryloamidowy w buforze TBE i zawierający osiem molowych moczników, jak opisano w protokole tekstowym. Wymieszać 20 mikrolitrów preparatów RNA z jedną objętością buforu ładującego.

Inkubować w temperaturze 95 stopni Celsjusza w bloku grzewczym przez 1,5 minuty, a następnie schłodzić na lodzie. Załadować próbki do żelu poliakrylamidowego i przeprowadzić elektroforezę w warunkach odpowiednich dla wymiaru żelu. Następnie zabarwić żel w 0,5 mikrograma na mililitr bromku etydyny przez 15 minut.

Umyj poplamiony żel wodą, a następnie uwidocznij RNA w świetle UV. Analiza elektroforetyczna kilku rekombinowanych plazmidów, w których wprowadzane są różne cDNA, wykazuje różne migracje w porównaniu z pLELVd-BZB. Należy zauważyć, że pLELVd-BZB zawiera marker lacZ, który jest zastępowany przez cDNA odpowiadające interesującemu RNA, więc chociaż migracja zależy od wielkości wstawionego cDNA, rekombinowane plazmidy zwykle migrują szybciej niż plazmid kontrolny.

Produkcja rekombinowanego RNA w koelektroporowanych kulturach bakteryjnych jest monitorowana poprzez rozbijanie komórek i analizę RNA przez denaturację PAGE. Można zaobserwować silne prążki, które odpowiadają pustym formom ELVd i chimerycznym ELVd, w które wstawiono różne interesujące RNA. Co ciekawe, znaczna część rekombinowanego RNA jest postrzegana jako forma kolista.

Okrągłość głównej frakcji obserwuje się poprzez zastosowanie kombinacji dwóch PAGE w warunkach denaturacji przy wysokiej i niskiej sile jonowej. Preparat RNA można dodatkowo oczyścić za pomocą chromatografii anionowymiennej. Jak widać tutaj, RNA E. Coli jest skutecznie zatrzymywane przy niskiej sile jonowej, a następnie eluowane przy wysokiej sile jonowej, przy czym większość RNA jest zbierana we frakcjach drugiej i trzeciej.

Rekombinowany RNA może być dalej oczyszczany do jednorodności za pomocą elektroforezy 2D. Protokół ten umożliwia łatwą produkcję dużych ilości rekombinowanego RNA w Escherichia coli i oczyszczanie do jednorodności dzięki cyrkularności produktu końcowego. Pamiętaj, że interesujące nas RNA jest osadzone w okrągłym rusztowaniu RNA pochodzącym z wiroidu roślin.

Jeśli chcesz oddzielić obie części, musisz użyć standardowej strategii, takiej jak rybozymy, DNAzymy lub RNaza H. Wydajność tego protokołu zależy od konkretnego RNA będącego przedmiotem zainteresowania, ponieważ małe RNA prawdopodobnie będą wytwarzane w większych ilościach niż większe. W przypadku ekspresji na większą skalę należy wziąć pod uwagę, że optymalny czas zbierania bakterii zależy od wielu czynników, w tym szczepu E.Coli, pożywki hodowlanej i warunków wzrostu. Zalecamy wstępny test przebiegu czasowego w celu znalezienia optymalnego okna produkcyjnego w konkretnych warunkach.

Pamiętaj, że rekombinowane RNA gromadzą się w komórkach bakteryjnych przejściowo i całkowicie zanikają w późnej fazie wzrostu.