Name: Produkcja na dużą skalę rekombinowanych RNA na okrągłym rusztowaniu przy użyciu systemu pochodzącego z wiroidu w Escherichia coli (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Poznaj metodę produkcji rekombinowanych RNA na dużą skalę w Escherichia coli przy użyciu okrągłego rusztowania pochodzącego z wiroidu. Technika ta umożliwia łatwe oczyszczanie i skalowanie procesu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty BIO2017-83184-R i BIO2017-91865-EXP od hiszpańskiego Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (współfinansowane fundusze FEDER).

1. Budowa plazmidu
<ol>
	<li>Amplifikować przez PCR (lub PCR z odwrotną transkrypcją, jeśli zaczyna się od matrycy RNA) cDNA odpowiadające RNA będącemu przedmiotem zainteresowania, używając starterów z przedłużeniem 5', aby umożliwić złożenie się w plazmidzie ekspresyjnym. Aby uniknąć niepożądanych mutacji, użyj polimerazy DNA o wysokiej wierności.
	<ol>
		<li>Aby wprowadzić cDNA do plazmidu ekspresji za pomocą Gibson assembly20, dodaj następujące rozszerzenia 5' do starterów PCR: do przodu, 5'-tctccccctcccccaggtactatccccttXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; rewers, 5'-ccctcctagggaacacatccttgaXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; X reprezentuje nukleotydy homologiczne do końcowych końców interesującego RNA.</li>
		<li>Inkubować przez 30 s w temperaturze 98 °C, następnie 30 cykli po 10 s w temperaturze 98 °C, 30 s w temperaturze 55 °C i 30 s w temperaturze 72 °C, a na koniec przedłużyć o 10 minut w temperaturze 72 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trawić 100 ng plazmidu pLELVd-BZB za pomocą 10 U enzymu restrykcyjnego typu IIS Bpi I przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w reakcji 20 μl w probówce o pojemności 0,5 ml w buforze G (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 0,1 mg/ml BSA). 
	nuta: Wszystkie plazmidy są dostępne na życzenie u autora korespondencyjnego. Bpi I jest odpowiednikiem Bbs I.</li>
	<li>Oddzielić produkty PCR i trawienia przez elektroforezę w 1% żelu agarozowym w buforze TAE (40 mM Tris, 20 mM kwas octowy, 1 mM EDTA, pH 7,2). Barwić żel przez 15 minut, wstrząsając 200 ml 0,5 μg/ml bromku etydyny. Wizualizuj DNA za pomocą transiluminatora UV i przetnij pasma odpowiadające amplifikowanemu cDNA i plazmidowi trawionemu przez Bpi I (2046 pz) za pomocą ostrza skalpela. 
	UWAGA: Trawienie Bpi I pLELVd-BZB uwalnia również produkt o stężeniu 528 pz odpowiadający niebiesko-białemu reporterowi LacZ.</li>
	<li>Eluować DNA z fragmentów żelu za pomocą kolumn z żelem krzemionkowym (zestaw do odzyskiwania DNA żelu w tabeli materiałów) i określić ilościowo stężenie DNA za pomocą analizy spektrofotometrycznej.</li>
	<li>Przygotuj reakcję montażu Gibsona, używając amplifikowanego cDNA i strawionego plazmidu. Użyj 3-krotnego nadmiaru molowego insert w porównaniu z vector20. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 50 °C i oczyszczać produkty reakcji za pomocą kolumny z żelem krzemionkowym (zestaw do czyszczenia i koncentratora DNA w tabeli materiałów).</li>
	<li>Użyj oczyszczonych produktów reakcji montażu Gibsona do elektroportowania kompetentnych komórek E. coli DH5α. Używając kuwet do elektroporacji 1 mm, zastosuj następujące ustawienia: 1 500 V i 5 ms. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w super zoptymalizowanym bulionie z represją katabolityczną (SOC; 20 g/L trypton, 5 g/L ekstraktu drożdżowego, 0,5 g/L NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM glukozy, pH 7,0) płynnym podłożu, a następnie rozprowadzić na Luria-Bertani (LB; 10 g/L trypton, 5 g/L ekstraktu drożdżowego), 10 g/L NaCl) agar (1,5%) zawierające 50 μg/ml ampicyliny.
	<ol>
		<li>W celu zbadania kolonii odpowiadających przekształconym klonom E. coli, które prawdopodobnie zawierały insert, 15 minut przed posiewem elektroporowanych komórek rozprowadź 30 μl 50 mg / ml 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopiranozydu (X-gal) w dimetyloformamidzie. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbierz kilka białych kolonii i hoduj przez noc w temperaturze 37 °C w płynnym podłożu LB. Oczyść plazmidy za pomocą zestawu miniprep (patrz tabela materiałów) i przeanalizuj ich rozmiary za pomocą elektroforezy w 1% żelu agarozowym w buforze TAE.</li>
	<li>Wybierz najbardziej prawdopodobny rekombinowany plazmid na podstawie migracji elektroforetycznej w porównaniu z kontrolą pLELVd-BZB. Potwierdź sekwencję wybranego plazmidu przez sekwencjonowanie za pomocą starterów 5'-CCTTTTTCAATATTATTGAAGC-3' i 5'-GATGCTCGTCAGGGGGGGGGGAG-3', które otaczają całą kasetę ekspresyjną w pLELVd-BZB. 
	nuta: Pamiętaj, że ten plazmid zawiera polilinker o długości 528 pz z markerem LacZ, który jest zastąpiony przez interesujące nas cDNA. Mapowanie restrykcji może pomóc w doborze odpowiednich rekombinowanych plazmidów.</li>
</ol>
2. Ekspresja RNA
<ol>
	<li>Koelektroporować (patrz warunki w ppkt 1.6) wybrany szczep E. coli (E. coli BL21 lub pochodną BL21) z pochodną pLELVd-BZB, która zawiera cDNA odpowiadające RNA będącemu przedmiotem zainteresowania i plazmidowi p15LtRnlSm w celu koekspresji ligazy tRNA bakłażana. Użyj E. coli HT115(DE3), który nie ma RNazy III21, do ekspresji RNA z długimi dwuniciowymi regionami. 
	Uwaga: Zarówno RNA, które są przedmiotem zainteresowania, jak i mRNA ligazy tRNA są transkrybowane przez polimerazę RNA E. coli. W szczepie E. coli nie jest wymagany lizogen DE3 do ekspresji polimerazy RNA T7, chociaż obecność tego lizogenu nie ma szkodliwych skutków.</li>
	<li>Po 1 godzinie inkubacji w temperaturze 37 °C w ciekłym podłożu SOC, bakterie elektroporowane na płytce w pożywce stałej LB zawierającej 50 μg/ml ampicyliny i 34 μg/ml chloramfenikolu. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wybierz kolonię i zaszczep 1 l kolby Erlenmeyera z przegrodami 250 ml płynnego podłoża Terrific Bulth (TB) (12 g/l tryptonu, 24 g/l ekstraktu drożdżowego, 0,4% glicerolu, 0,17 M KH2PO4 i 0,72 M K2HPO4), zawierającej 50 μg/ml ampicyliny i 34 μg/ml chloramfenikolu. Inkubować w temperaturze 37 °C z energicznym wytrząsaniem przy 180 obrotach na minutę (obr./min). Zbierz bakterie między 12 a 16 godzinami po inokulacji hodowli.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja i oczyszczanie RNA
<ol>
	<li>Do celów analitycznych pobrać 2 ml porcji kultury w żądanych punktach czasowych i odwirować przy 14 000 x g przez 2 minuty. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 50 μl buforu TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0 i 1 mM EDTA) przez wirowanie.
	<ol>
		<li>Dodać jedną objętość (50 μl) mieszaniny fenolu (nasyconego wodą i zrównoważonego w pH 8,0 z Tris-HCl, pH 8,0) i chloroformu. Rozbij komórki przez energiczne wirowanie i oddziel fazę wodną i organiczną przez wirowanie przez 5 minut przy 14 000 x g.</li>
		<li>Ostrożnie odzyskaj fazy wodne (górne), które zawierają całkowite bakteryjne RNA. 
		Uwaga: Preparaty można przechowywać w temperaturze -20 °C w celu późniejszej analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celach przygotowawczych wlać kulturę do butelki wirówkowej o pojemności 250 ml i odwirowywać komórki o sile 14 000 x g przez 10 minut. Odrzucić supernatant. Umyj komórki, ponownie zawieszając je w 30 ml wody. Przenieść do probówki wirówkowej i ponownie odwirować komórki w tych samych warunkach.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml buforu chromatograficznego (50 mM Tris-HCl, pH 6,5, 150 mM NaCl, 0,2 mM EDTA) przez wirowanie. 
	nuta: W tym czasie komórki można zamrozić w temperaturze -20 °C, aby kontynuować oczyszczanie w dowolnym innym momencie.</li>
	<li>Używając świeżego lub rozmrożonego preparatu bakteryjnego, rozbij komórki, dodając 1 objętość (10 ml) fenolu:chloroformu (patrz krok 3.2) i energicznie wirując.</li>
	<li>Wirować przez 10 minut przy 12 000 x g, odzyskać fazę wodną i ponownie ekstrahować 1 objętością (10 ml) chloroformu w tych samych warunkach. 
	nuta: W tym momencie preparat RNA może być przechowywany w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Dalsze oczyszczanie całkowitego bakteryjnego RNA za pomocą chromatografii anionowymiennej. Przefiltrować preparat RNA przez filtr strzykawkowy 45 μm i załadować na 1 ml kolumny dietyloetanoloaminy (DEAE).
	<ol>
		<li>Do oczyszczania chromatograficznego należy użyć systemu chromatografii cieczowej o natężeniu przepływu 1 ml/min. Przed załadowaniem próbki należy zrównoważyć kolumnę z 10 ml buforu chromatograficznego (patrz krok 3.3 w celu zapoznania się ze składem).</li>
		<li>Załadować próbkę i przemyć kolumnę 10 ml buforu chromatograficznego. Eluować RNA za pomocą 20 ml buforu elucyjnego (50 mM Tris-HCl, pH 6,5, 1 M NaCl, 0,2 mM EDTA) i zebrać 1 ml podwielokrotności. 
		Uwaga: RNA szybko eluuje się we wstępnych frakcjach. Kolumna może być ponownie wykorzystana do dalszego oczyszczania. W tym celu należy przemyć kolumnę 10 ml wody i przechowywać w temperaturze 4 °C w 20% etanolu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponieważ większa część rekombinowanego RNA gromadzi się w E. coli w postaci kolistej, właściwość ta może być wykorzystana do oczyszczenia do jednorodności12. Oddziel koliste RNA od liniowych odpowiedników za pomocą dwuwymiarowej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (2D PAGE) łączącej warunki niedenaturacyjne i denaturujące (8 M mocznika)12,22.</li>
</ol>
4. Analiza RNA
<ol>
	<li>Przygotować 5% żel poliakryloamidowy (37,5:1 akryloamid:N,N'-metylenobisakrylamid, stosunek masowy) w buforze TBE (89 mM Tris, 89 mM kwas borowy, 2 mM EDTA) zawierającym 8 M mocznika.</li>
	<li>Wymieszać 20 μl preparatów RNA z 1 objętością (20 μl) buforu ładującego (98% formamidu, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,0025% błękitu bromofenolowego i 0,0025% cyjanolu ksylenowego), inkubować przez 1,5 minuty w temperaturze 95 °C w bloku grzewczym i schłodzić na lodzie.</li>
	<li>Załadować próbki do żelu poliakryloamidowego i uruchomić elektroforezę w odpowiednich warunkach w zależności od wymiarów żelu (np. uruchomić żele 140 x 130 x 2 mm przez 2,5 godziny przy napięciu 200 V). Barwić żel przez 15 minut w 0,5 μg/ml bromku etydyny, zmyć wodą i uwidocznić RNA w świetle UV.</li>
</ol>

<ol><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Research+on+Non-Coding+Ribonucleic+Acid+%28RNA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Current Research on Non-Coding Ribonucleic Acid (RNA).</a> Genes. 8 (12), (2017).</li>
<li>Hamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+approaches+to+RNA+aptamer+design%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">In silico approaches to RNA aptamer design.</a> Biochimie. 145, 8-14 (2018).</li>
<li>Bobbin, M. L., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Interference+%28RNAi%29-Based+Therapeutics%3A+Delivering+on+the+Promise%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">RNA Interference (RNAi)-Based Therapeutics: Delivering on the Promise?</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 103-122 (2016).</li>
<li>Airs, P. M., Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Interference+for+Mosquito+and+Mosquito-Borne+Disease+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">RNA Interference for Mosquito and Mosquito-Borne Disease Control.</a> Insects. 8 (1), 4(2017).</li>
<li>Ponchon, L., Dardel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+expression+and+purification+of+recombinant+RNA+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Large scale expression and purification of recombinant RNA in Escherichia coli.</a> Methods. 54 (2), 267-273 (2011).</li>
<li>Kikuchi, Y., Umekage, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+nucleic+acids+of+the+marine+bacterium+Rhodovulum+sulfidophilum+and+recombinant+RNA+production+technology+using+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Extracellular nucleic acids of the marine bacterium Rhodovulum sulfidophilum and recombinant RNA production technology using bacteria.</a> FEMS Microbiology Letters. 365 (3), fnx268(2018).</li>
<li>Ponchon, L., Dardel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+RNA+technology%3A+the+tRNA+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Recombinant RNA technology: the tRNA scaffold.</a> Nature Methods. 4 (7), 571-576 (2007).</li>
<li>Batey, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+methods+for+native+expression+and+purification+of+RNA+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Advances in methods for native expression and purification of RNA for structural studies.</a> Current Opinion in Structural Biology. 26, 1-8 (2014).</li>
<li>El Khouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+Purification+of+RNA-Protein+Complexes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Expression and Purification of RNA-Protein Complexes in Escherichia coli.</a> Methods in Molecular Biology. 1316, 25-31 (2015).</li>
<li>Ponchon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-expression+of+RNA-protein+complexes+in+Escherichia+coli+and+applications+to+RNA+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Co-expression of RNA-protein complexes in Escherichia coli and applications to RNA biology.</a> Nucleic Acids Research. 41 (15), e150(2013).</li>
<li>Umekage, S., Kikuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+production+and+purification+of+circular+RNA+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo production and purification of circular RNA aptamer.</a> Journal of Biotechnology. 139 (4), 265-272 (2009).</li>
<li>Daròs, J. -A., Aragonés, V., Cordero, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+viroid-derived+system+to+produce+large+amounts+of+recombinant+RNA+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A viroid-derived system to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1904(1904).</li>
<li>Daròs, J. A. Viroids: small noncoding infectious RNAs with the remakable ability of autonomous replication. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDar%C3%B2s%2C+JA+%22Current+Research+Topics+in+Plant+Virology%22">Current Research Topics in Plant Virology</a>. , Springer International Publishing Switzerland. 295-322 (2016).</li>
<li>Flores, R., Hernández, C., Martínez de Alba, A. E., Daròs, J. A., Di Serio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viroids+and+viroid-host+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Viroids and viroid-host interactions.</a> Annual Review of Phytopathology. 43, 117-139 (2005).</li>
<li>Di Serio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICTV+Virus+Taxonomy+Profile%3A+Avsunviroidae%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">ICTV Virus Taxonomy Profile: Avsunviroidae.</a> The Journal of General Virology. 99 (5), 611-612 (2018).</li>
<li>Nohales, M. A., Flores, R., Daròs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viroid+RNA+redirects+host+DNA+ligase+1+to+act+as+an+RNA+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Viroid RNA redirects host DNA ligase 1 to act as an RNA ligase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13805-13810 (2012).</li>
<li>Nohales, M. A., Molina-Serrano, D., Flores, R., Daròs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+chloroplastic+isoform+of+tRNA+ligase+in+the+replication+of+viroids+belonging+to+the+family+Avsunviroidae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Involvement of the chloroplastic isoform of tRNA ligase in the replication of viroids belonging to the family Avsunviroidae.</a> Journal of Virology. 86 (15), 8269-8276 (2012).</li>
<li>Daròs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eggplant+latent+viroid%3A+a+friendly+experimental+system+in+the+family+Avsunviroidae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Eggplant latent viroid: a friendly experimental system in the family Avsunviroidae.</a> Molecular Plant Pathology. 17 (8), 1170-1177 (2016).</li>
<li>Cordero, T., Ortolà, B., Daròs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+Analysis+of+Eggplant+Latent+Viroid+RNA+Circularization+by+the+Eggplant+tRNA+Ligase+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mutational Analysis of Eggplant Latent Viroid RNA Circularization by the Eggplant tRNA Ligase in Escherichia coli.</a> Frontiers in Microbiology. 9 (635), (2018).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).</li>
<li>Schumacher, J., Randles, J. W., Riesner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-dimensional+electrophoretic+technique+for+the+detection+of+circular+viroids+and+virusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A two-dimensional electrophoretic technique for the detection of circular viroids and virusoids.</a> Analytical Biochemistry. 135 (2), 288-295 (1983).</li>
<li>Hansen, J. N., Pheiffer, B. H., Boehnert, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+electrophoretic+properties+of+solubilizable+disulfide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chemical and electrophoretic properties of solubilizable disulfide gels.</a> Analytical Biochemistry. 105 (1), 192-201 (1980).</li>
<li>Giguère, T., Adkar-Purushothama, C. R., Bolduc, F., Perreault, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+the+structures+of+all+members+of+the+Avsunviroidae+family%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Elucidation of the structures of all members of the Avsunviroidae family.</a> Molecular Plant Pathology. 15 (8), 767-779 (2014).</li>
<li>López-Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+initiation+sites+of+eggplant+latent+viroid+strands+map+within+distinct+motifs+in+their+in+vivo+RNA+conformations%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">The transcription initiation sites of eggplant latent viroid strands map within distinct motifs in their in vivo RNA conformations.</a> RNA Biology. 13 (1), 83-97 (2016).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że technologia opisana w niniejszym protokole została opatentowana (US Patent No. EP14382177.5, PCT/EP2015/060912).

Podczas badań nad wymaganiami dotyczącymi sekwencji i struktury ELVd związanymi z rozpoznawaniem ligazy tRNA bakłażana, zauważyliśmy, że koekspresja obu cząsteczek w E. coli niebędącej gospodarzem doprowadziła do nieoczekiwanej dużej akumulacji wiroidowych form kołowych w komórkach bakteryjnych19. Zrozumieliśmy, że duża akumulacja wiroidowego RNA w E. coli najprawdopodobniej była konsekwencją koekspresji wysoce stabilnej cząsteczki RNA, takiej jak stosunkowo mały (333 nt), silnie...

W przeciwieństwie do DNA i białek, protokoły łatwej, wydajnej i opłacalnej produkcji dużych ilości RNA nie są obfite. Jednak badania i przemysł wymagają coraz większych ilości tych biomolekuł do zbadania ich unikalnych właściwości biologicznych1, lub do wykorzystania w zaawansowanych zastosowaniach biotechnologicznych, w tym jako wysoce specyficznych aptamerów2, środki terapeutyczne3, lub selektywne pestycydy4. Transkrypcja in vitro i synteza chemiczna są powszechnie stosowane w badaniach do produkcji RNA. Metody te wiążą się jednak z istotnymi ograniczeniami, gdy wymagane są duże ilości produktów. Logiczną alternatywą jest wykorzystanie endogennej maszynerii transkrypcyjnej żywych komórek, a następnie proces oczyszczania w celu oddzielenia interesujących RNA od komórkowych towarzyszy. Podążając za tą strategią, opracowano metody wytwarzania rekombinowanych RNA w komórkach bakteryjnych, takie jak przyjazny dla laboratorium Escherichia coli5 lub morsko-fioletowy fototroficzny alfa-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum6. Większość metod wytwarzania rekombinowanego RNA u bakterii opiera się na ekspresji natywnego, wysoce stabilnego rusztowania RNA, takiego jak tRNA lub rRNA, w którym wstawiany jest interesujący RNA7. Nakłada to konieczność uwolnienia interesującego RNA z cząsteczki chimerycznej, jeśli obecność dodatkowego RNA stanowi problem dla dalszych aplikacji8. Inną koncepcją w biotechnologii rekombinacji RNA jest produkcja rekombinowanych kompleksów rybonukleoproteinowych, które same w sobie mogą być pożądanym produktem lub być stosowane jako strategia ochronna w celu zwiększenia stabilności interesującego RNA9,10. Podobnie, produkcja cyrkularnych RNA została również zasugerowana jako strategia generowania bardziej stabilnych produktów11.
Niedawno opracowaliśmy nową metodę produkcji dużych ilości rekombinowanego RNA u E. coli, która uczestniczy w trzech z powyższych koncepcji: wstawieniu interesującego RNA do wysoce stabilnego okrągłego rusztowania RNA i koekspresji rekombinowanego RNA z białkiem oddziałującym, aby prawdopodobnie wytworzyć stabilny kompleks rybonukleoproteinowy, który gromadzi się w znacznych ilościach w komórkach bakteryjnych12. W przeciwieństwie do poprzednich opracowań, użyliśmy rusztowania RNA całkowicie obcego dla E. coli, a mianowicie wiroidu. Wiroidy są bardzo szczególnym rodzajem czynników zakaźnych roślin wyższych, które składają się wyłącznie ze stosunkowo małego (246-401 nt) wysoce sparowanego z zasadami kolistego RNA13. Co ciekawe, wiroidy są niekodującymi RNA i bez pomocy własnych białek są w stanie wykonywać złożone cykle zakaźne w zakażonych gospodarzach14. Cykle te obejmują replikację RNA do RNA w jądrach lub chloroplastach, w zależności od rodziny wiroidów - odpowiednio Pospiviroidae lub Avsunviroidae - przemieszczanie się przez zakażoną roślinę i unikanie odpowiedzi obronnej gospodarza. Wiroidy muszą być zaliczane do najbardziej stabilnych RNA w przyrodzie, w konsekwencji bycia nagim okrągłym RNA i konieczności przetrwania w nieprzyjaznym środowisku komórek zakażonych roślinami. Ta właściwość może sprawić, że wiroidy będą szczególnie przydatne jako rusztowania do stabilizacji rekombinowanego RNA w podejściach biotechnologicznych. Ponadto nowa metoda opiera się na koekspresji rusztowania wiroidowego z oddziałującym białkiem roślinnym. Wiroidy replikują się w mechanizmie toczącego się koła, w którym enzymy gospodarza są rekrutowane w celu katalizowania różnych etapów procesu. Warto zauważyć, że niektóre wiroidy, a dokładniej te, które należą do rodziny Avsunviroidae15, zawierają rybozymy, które są również zaangażowane w replikację. W zależności od gatunku wiroidu, w transkrypcji wiroidalnych RNA pośredniczy polimeraza RNA gospodarza II lub polimeraza RNA kodowana jądrowo (NEP) w postaci chloroplastu. Przetwarzanie wiroidalnego RNA wydaje się być katalizowane przez RNazę typu III gospodarza, chociaż w wiroidach z rybozymami oligomeryczne RNA pośrednie ulegają samorozszczepieniu podczas replikacji. Wreszcie, powstałe monomery wiroidowe są cyrkularyzowane, w zależności od rodziny wiroidów, przez ligazę DNA gospodarza 1 lub izoformę chloroplastyczną ligazy tRNA16,17. Ten ostatni enzym bierze udział w ligacji monomerycznych form wiroidów z rodziny Avsunviroidae, takich jak utajony wiroid bakłażana (ELVd)18.
W trakcie pracy nad analizą sekwencji i wymagań strukturalnych ELVd, które decydują o rozpoznaniu przez ligazę tRNA bakłażana (Solanum melongena L.), stworzyliśmy eksperymentalny system oparty na koekspresji obu cząsteczek w E. coli19. Zauważyliśmy, że dłuższe niż jednostka transkrypty ELVd skutecznie rozszczepiają się w komórkach E. coli przez osadzone rybozymy młota i że powstałe monomery wiroidowe z końcami 5'-hydroksylowymi i 2',3'-fosfodiestrowymi były skutecznie krążone przez współeksprymowaną ligazę tRNA bakłażana. Co więcej, powstały w ten sposób kolisty wiroidowy RNA osiągnął nieoczekiwanie wysokie stężenie w E. coli, przewyższając stężenie endogennych rRNAs12. Brak produktów pośrednich replikacji wskazywał na brak amplifikacji RNA do RNA ELVd w tych komórkach bakteryjnych. Co ciekawe, insercja heterologicznych RNA w określonej pozycji cząsteczki wiroidu miała umiarkowany wpływ na akumulację kolistych RNA pochodzących z wiroidów12. Te obserwacje skłoniły nas do wyobrażenia sobie metody wytwarzania dużych ilości rekombinowanych RNA u bakterii. W tej metodzie cDNA odpowiadające interesującym RNA są wprowadzane do cDNA ELVd, a powstały chimeryczny RNA ulega ekspresji w E. coli przez silny konstytutywny promotor. Aby system działał, E. coli musi zostać przekształcona z plazmidem w celu ekspresji ligazy tRNA bakłażana. Transkrypt pochodzący z ELVd dłuższy niż jednostka jest przetwarzany przez osadzone rybozymy młota, a powstałe monomery z odpowiednimi końcami są rozpoznawane i cyrkularyzowane przez współeksprymowaną ligazę tRNA. W ten sposób interesujący RNA jest wprowadzany do bardzo stabilnego okrągłego rusztowania składającego się z wiroidalnej cząsteczki kolistej. Ten rekombinowany chimeryczny RNA jest najprawdopodobniej dalej stabilizowany wewnątrz komórek E. coli poprzez tworzenie kompleksu rybonukleoproteinowego poprzez interakcję z ligazą tRNA. Korzystając z tej metody (patrz protokół poniżej), aptamery RNA, RNA spinki do włosów i inne ustrukturyzowane RNA zostały łatwo wyprodukowane w ilościach kilkudziesięciu miligramów na litr kultury E. coli w normalnych warunkach laboratoryjnych i oczyszczone do jednorodności z wykorzystaniem cyrkularności12.

<table><tbody><tr><td>Polimeraza DNA Phusion High-Fidelity</td><td>Thermo Scientific</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>Bpi I</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER1011</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Conda</td><td>8010</td><td>D1 niska EEO</td></tr><tr><td>Tris</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1086,1000</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>PanReac AppliChem</td><td>131008.1214</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134-500G</td><td></td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1152,0025</td><td>1%</td></tr><tr><td>Zymoclean Żel do odzyskiwania DNA</td><td>Zymo Research</td><td>D4001</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-3300</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>E2621S</td><td></td></tr><tr><td>DNA Clean & Koncentrator</td><td>Zymo Research</td><td>D4003</td><td></td></tr><tr><td>Eporator</td><td>Eppendorf</td><td>4309000019</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli DH5&alpha;</td><td>Invitrogen</td><td>18265-017</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Intron Biotechnology</td><td>Ba2014</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Intron Biotechnology</td><td>48045</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>PanReac AppliChem</td><td>131659.1211</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Intron Biotechnology</td><td>25999</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A0839,0010</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Duchefa</td><td>X1402.1000</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetyloformamid</td><td>PanReac AppliChem</td><td>131785.1611</td><td></td></tr><tr><td>NucloSpin Plasmid</td><td>Macherey-Nagel</td><td>22740588.250</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli BL21(DE3)</td><td>Novagen</td><td>69387-3</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli HT115(DE3)</td><td></td><td></td><td>Ref. Timmons et al., 2001</td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Duchefa</td><td>C 0113.0025</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>PanReac AppliChem</td><td>122329.1211</td><td>87%</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>PanReac AppliChem</td><td>131509.1210</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>PanReac AppliChem</td><td>122333.1211</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>PanReac AppliChem</td><td>131020.1211</td><td></td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Scharlau</td><td>FE04791000</td><td>90%</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3691,1000</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S 0.2</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap DEAE Sepharose FF kolumna</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5055-01</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; System chromatografii cieczowej KTAprime plus</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>11001313</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamyde</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1089,1000</td><td>2K</td></tr><tr><td>N,N' -metylenobisakryloamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7279-100G</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>PanReac AppliChem</td><td>146392.1211</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A2940,1000</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A0937,2500</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8026-5G</td><td></td></tr><tr><td>Cyjanol ksylenowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4126-10G</td><td></td></tr><tr><td>N,N&prime;-Bis(akryl)cystamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4929-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

produkcja na dużą skalę rekombinowanych rna na okrągłym rusztowaniu przy użyciu systemu pochodzącego z wiroidu w escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Wraz z rosnącym zainteresowaniem biologią RNA i wykorzystaniem cząsteczek RNA w zaawansowanych zastosowaniach biotechnologicznych, metody produkcji dużych ilości rekombinowanych RNA są ograniczone. W tym miejscu opisujemy protokół wytwarzania dużych ilości rekombinowanego RNA w Escherichia coli w oparciu o koekspresję chimerycznej cząsteczki, która zawiera interesujące RNA w rusztowaniu wiroidowym i roślinnej ligazie tRNA. Wiroidy to stosunkowo małe, niekodujące, wysoce sparowane koliste RNA, które są zakaźne dla roślin wyższych. Ligaza tRNA rośliny żywicielskiej jest enzymem rekrutowanym przez wiroidy należące do rodziny Avsunviroidae, takie jak utajony wiroid bakłażana (ELVd), w celu pośredniczenia w krążeniu RNA podczas replikacji wiroidu. Chociaż ELVd nie replikuje się w E. coli, prekursor ELVd jest skutecznie transkrybowany przez polimerazę RNA E. coli i przetwarzany przez rybozymy młotkowate osadzone w komórkach bakteryjnych, a powstałe monomery są krążone przez współeksprymowaną ligazę tRNA, osiągając niezwykłe stężenie. Wprowadzenie interesującego RNA do rusztowania ELVd umożliwia produkcję dziesiątek miligramów rekombinowanego RNA na litr kultury bakteryjnej w normalnych warunkach laboratoryjnych. Główna frakcja produktu RNA jest okrągła, co ułatwia oczyszczanie rekombinowanego RNA do wirtualnej jednorodności. W tym protokole komplementarny DNA (cDNA) odpowiadający interesującemu RNA jest wstawiany w określonej pozycji cDNA ELVd w plazmidzie ekspresyjnym, który jest używany wzdłuż plazmidu do koekspresji ligazy tRNA bakłażana do transformacji E. coli. Koekspresja obu cząsteczek pod kontrolą silnych promotorów konstytutywnych prowadzi do produkcji dużych ilości rekombinowanego RNA. Rekombinowany RNA można wyekstrahować z komórek bakteryjnych i oddzielić od większości bakteryjnych RNA, wykorzystując jego okrągłość.

Aby wytworzyć rekombinowane RNA w E. coli z wykorzystaniem systemu pochodzącego od ELVd12, analizowane RNA zostaje wszczepione do rusztowania RNA ELVd. To chimeryczne RNA jest koekspresowane wraz z ligazą tRNA z bakłażana w E. coli. Po przetworzeniu, przecięciu i cyrkularyzacji, chimeryczne koliste RNA, z którego wystaje analizowany fragment RNA, prawdopodobnie tworzy kompleks rybonukleoproteinowy z koekspresowanym enzymem z bakłażana, który osiąg...

Tutaj prezentujemy protokół do produkcji dużych ilości rekombinowanego RNA w Escherichia coli poprzez współekspresję chimerycznego RNA, który zawiera interesujące RNA w rusztowaniu wiroidowym i roślinnej ligazie tRNA. Głównym produktem jest okrągła cząsteczka, która ułatwia oczyszczanie do jednorodności.

Produkcja na dużą skalę rekombinowanych RNA na okrągłym rusztowaniu przy użyciu systemu pochodzącego z wiroidu w Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Metoda ta może pomóc w wytwarzaniu dużych ilości rekombinowanych RNA, które mogą być stosowane w badaniach naukowych lub przemyśle. Główną zaletą jest to, że rekombinowane RNA jest wytwarzane w Escherichia coli w tanim procesie, który można łatwo zwiększyć. Co ważne, RNA jest wytwarzane na okrągłym rusztowaniu RNA, co ułatwia oczyszczanie do jednorodności.W przeciwieństwie do DNA lub białek, interesujące RNA nie są łatwo wytwarzane w dużych ilościach w systemach biofabrycznych, takich jak hodowla Escherichia coli. Nasza metoda opiera się na koekspresji interesującego RNA umieszczonego w wysoce stabilnym okrągłym rusztowaniu i zastosowaniu ligazy, która pośredniczy w cyrkularyzacji RNA. Okrągłe rusztowanie RNA wywodzi się z opatentowanego wiroidu.Wiroidy to stosunkowo małe, niezwijające się, wysoce sparowane koliste RNA, które są zakaźne dla niektórych wyższych roślin. W normalnych warunkach laboratoryjnych jesteśmy w stanie wyprodukować dziesiątki miligramów rekombinowanego RNA na litr kultury bakteryjnej. Aby rozpocząć tę procedurę, amplifikuj cDNA metodą PCR, jak opisano w protokole tekstowym.Następnie dodaj 100 nanogramów plazmidu pLELVd-BZB do probówki o pojemności 0,5 mililitra. Dodać 10 U enzymu restrykcyjnego typu IIS BpiI i tyle buforu G, aby uzyskać reakcję o objętości 20 mikrolitrów. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, aby strawić plazmid.Następnie oddzielić produkty PCR i trawienia przez elektroforezę w jednoprocentowym żelu agarozowym w buforze TAE. Zabarwić żel, wstrząsając nim w 200 mililitrach bromku etydyny o stężeniu 0,5 mikrograma na mililitr. Za pomocą transiluminatora UV zwizualizuj DNA.Użyj skalpela, aby wyciąć prążki odpowiadające amplifikowanemu cDNA i plazmidowi strawionemu przez BpiI. Za pomocą kolumn z żelem krzemionkowym wymyj DNA z fragmentów żelu. Określić ilościowo stężenie DNA za pomocą analizy spektrofotometrycznej.Przygotuj reakcję montażu Gibsona, używając amplifikowanego cDNA i strawionego plazmidu. Inkubować w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie użyj kolumny z żelem krzemionkowym, aby oczyścić reakcję.Po elektroporowaniu kompetentnych komórek DH5-alfa E.coli, wybierz kilka białych kolonii i przenieś je do ciekłego podłoża LB. Hoduj kolonie przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie użyj zestawu miniprep do oczyszczenia plazmidów i przeanalizuj ich rozmiary za pomocą elektroforezy w jednoprocentowym żelu agarozowym w buforze TAE.Najpierw należy poddać elektropostacji wybranego szczepu E. coli zarówno pochodną pLELVd-BZB, która zawiera cDNA odpowiadające interesującemu RNA, jak i plazmidowi P15LTRNISM do koekspresji ligazy tRNA bakłażana. Przenieś ciekłe medium SOC do kuwety elektroporacyjnej w celu odzyskania komórek i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie ułóż bakterie na stałym podłożu LB zawierającym 50 mikrogramów na mililitr ampicyliny i 34 mikrogramy na mililitr chloramfenikolu.Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia dodać 250 mililitrów płynnej pożywki gruźliczej, zawierającej 50 mikrogramów na mililitr ampicyliny i 34 mikrogramy na mililitr chloramfenikolu, do litrowej kolby Erlenmeyera z przegrodą. Pobrać inkubowaną E. Coli, a następnie wybrać kolonię i zaszczepić pożywkę w kolbie.Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z energicznym wytrząsaniem przy 180 obr./min przez 12 do 16 godzin przed zbiorem bakterii. Wlej zebraną kulturę E. Coli do 250-mililitrowej butelki wirówki i wiruj komórki w temperaturze 14 000 G przez 10 minut. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w 30 mililitrach wody.Przenieść tę zawiesinę do probówki wirówkowej i ponownie odwirować komórki, stosując poprzednie warunki. Odrzucić supernatant i dodać 10 mililitrów buforu chromatograficznego do osadu komórkowego. Wir, aby ponownie zawiesić komórki w buforze.Dodaj jedną objętość fenolu: chloroform i energicznie wiruj, aby rozbić komórki. Następnie odwirować przy 12 000 G przez 10 minut. Odzyskać fazę wodną, dodać jedną objętość chloroformu i energicznie wirować.Wirować przy 12 000 g przez 10 minut. Następnie przefiltrować preparat RNA przez filtr strzykawkowy o średnicy 45 mikrometrów. Oczyść RNA za pomocą jednomililitrowej kolumny aminowo-etanolowej dietylu podłączonej do systemu chromatografii cieczowej.Dostosuj natężenie przepływu do jednego mililitra na minutę i zrównoważ kolumnę 10 mililitrami buforu chromatograficznego. Następnie załadować próbkę i przemyć kolumnę 10 mililitrami buforu chromatograficznego. Eluuj RNA za pomocą 20 mililitrów buforu elucyjnego i zbierz jedną mililitrową porcję.Za pomocą dwuwymiarowej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym oddziel koliste RNA od ich liniowych odpowiedników. Najpierw należy przygotować pięcioprocentowy żel poliakryloamidowy w buforze TBE i zawierający osiem molowych moczników, jak opisano w protokole tekstowym. Wymieszać 20 mikrolitrów preparatów RNA z jedną objętością buforu ładującego.Inkubować w temperaturze 95 stopni Celsjusza w bloku grzewczym przez 1,5 minuty, a następnie schłodzić na lodzie. Załadować próbki do żelu poliakrylamidowego i przeprowadzić elektroforezę w warunkach odpowiednich dla wymiaru żelu. Następnie zabarwić żel w 0,5 mikrograma na mililitr bromku etydyny przez 15 minut.Umyj poplamiony żel wodą, a następnie uwidocznij RNA w świetle UV. Analiza elektroforetyczna kilku rekombinowanych plazmidów, w których wprowadzane są różne cDNA, wykazuje różne migracje w porównaniu z pLELVd-BZB. Należy zauważyć, że pLELVd-BZB zawiera marker lacZ, który jest zastępowany przez cDNA odpowiadające interesującemu RNA, więc chociaż migracja zależy od wielkości wstawionego cDNA, rekombinowane plazmidy zwykle migrują szybciej niż plazmid kontrolny.Produkcja rekombinowanego RNA w koelektroporowanych kulturach bakteryjnych jest monitorowana poprzez rozbijanie komórek i analizę RNA przez denaturację PAGE. Można zaobserwować silne prążki, które odpowiadają pustym formom ELVd i chimerycznym ELVd, w które wstawiono różne interesujące RNA. Co ciekawe, znaczna część rekombinowanego RNA jest postrzegana jako forma kolista.Okrągłość głównej frakcji obserwuje się poprzez zastosowanie kombinacji dwóch PAGE w warunkach denaturacji przy wysokiej i niskiej sile jonowej. Preparat RNA można dodatkowo oczyścić za pomocą chromatografii anionowymiennej. Jak widać tutaj, RNA E. Coli jest skutecznie zatrzymywane przy niskiej sile jonowej, a następnie eluowane przy wysokiej sile jonowej, przy czym większość RNA jest zbierana we frakcjach drugiej i trzeciej.Rekombinowany RNA może być dalej oczyszczany do jednorodności za pomocą elektroforezy 2D. Protokół ten umożliwia łatwą produkcję dużych ilości rekombinowanego RNA w Escherichia coli i oczyszczanie do jednorodności dzięki cyrkularności produktu końcowego. Pamiętaj, że interesujące nas RNA jest osadzone w okrągłym rusztowaniu RNA pochodzącym z wiroidu roślin.Jeśli chcesz oddzielić obie części, musisz użyć standardowej strategii, takiej jak rybozymy, DNAzymy lub RNaza H. Wydajność tego protokołu zależy od konkretnego RNA będącego przedmiotem zainteresowania, ponieważ małe RNA prawdopodobnie będą wytwarzane w większych ilościach niż większe. W przypadku ekspresji na większą skalę należy wziąć pod uwagę, że optymalny czas zbierania bakterii zależy od wielu czynników, w tym szczepu E.Coli, pożywki hodowlanej i warunków wzrostu. Zalecamy wstępny test przebiegu czasowego w celu znalezienia optymalnego okna produkcyjnego w konkretnych warunkach.Pamiętaj, że rekombinowane RNA gromadzą się w komórkach bakteryjnych przejściowo i całkowicie zanikają w późnej fazie wzrostu.

large-scale-production-recombinant-rnas-on-circular-scaffold-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W erze genomiki post-humanistycznej dostępność białek rekombinowanych w natywnych konformacjach jest kluczowa dla badań i rozwoju w obszarze strukturalnym, funkcjonalnym oraz terapeutycznym. W niniejszej pracy opisujemy system ekspresji białek w skali testowej i przemysłowej z wykorzystaniem ludzkich komórek embrionalnej nerki 293T, który może być stosowany do produkcji różnorodnych białek rekombinowanych.

Wygodna i uniwersalna platforma ekspresyjna do produkcji białek wydzielanych z komórek ludzkich

Kompleksy białkowe katalizują kluczowe funkcje komórkowe. Szczegółowa charakterystyka funkcjonalna i strukturalna wielu istotnych kompleksów wymaga produkcji rekombinowanej. MultiBac to system komórkowy bakulowirusa/owadów specjalnie przystosowany do ekspresji białek eukariotycznych i ich kompleksów. MultiBac został wdrożony jako platforma o otwartym dostępie, a standardowe procedury operacyjne zostały opracowane w celu maksymalizacji jego użyteczności.

Platforma do produkcji kompleksu białkowego MultiBac w EMBL

Tutaj przedstawiono protokół tworzenia zakaźnego bakteryjnego sztucznego chromosomu zawierającego pełnowymiarowe cDNA pozytywnej nici genomowego RNA wirusa japońskiego zapalenia mózgu. Protokół ten może być wykorzystany do skonstruowania funkcjonalnego cDNA innych wirusów o dodatniej nici RNA, co czyni go potężnym narzędziem genomicznym do badania biologii wirusów.

Sztuczne chromosomy bakteryjne: funkcjonalne narzędzie genomiczne do badania wirusów o dodatniej nici RNA

Liniowy kowalencyjnie zamknięty (LCC) miniwektor DNA (zarządzanie DNA) jest niewirusowym wektorem dostarczania genów, oferującym wysoką wydajność transfekcji i jest odpowiedni dla każdej aplikacji dostarczania DNA. System produkcyjny jest prosty, szybki i skalowalny in vivo. Poniższy protokół zawiera wizualne instrukcje krok po kroku dotyczące produkcji ministringów DNA.

Produkcja dwuniciowych ministringów DNA

Opisujemy metodę generowania i amplifikacji genetycznie modyfikowanych syncytialnych wirusów oddechowych (RSV) oraz zoptymalizowany test płytki nazębnej dla RSV. Ilustrujemy ten protokół, tworząc dwa rekombinowane wirusy, które odpowiednio umożliwiają ilościowe określenie replikacji RSV i analizę na żywo ciał inkluzyjnych RSV i dynamiki granulek związanych z ciałami inkluzyjnymi.

Wytwarzanie, amplifikacja i miareczkowanie rekombinowanych syncytialnych wirusów oddechowych

To jest metoda generowania "bezbliznowatych" rekombinowanych wirusów krowianki przy użyciu wyboru zakresu gospodarzy i wizualnej identyfikacji rekombinowanych wirusów.

Szybkie, bezproblemowe generowanie rekombinowanych pokswirusów przy użyciu zakresu gospodarzy i selekcji wizualnej

Obecny protokół opisuje szczegółową metodę produkcji przez bakterie białek rekombinowanych, w tym zazwyczaj nierozpuszczalnych lub zawierających wiązania dwusiarczkowe, upakowanych wewnątrz pęcherzyków związanych z błoną zewnątrzkomórkową. Ma to potencjał do zastosowania w różnych obszarach badań naukowych, w tym w biotechnologii stosowanej i medycynie.

Zoptymalizowana produkcja i analiza rekombinowanych pęcherzyków wypełnionych białkiem E. coli

Tutaj prezentujemy protokół do uzyskania wektora wyrażenia pVAX1-PRRSV poprzez wprowadzenie odpowiednich miejsc restrykcyjnych na końcu 3' wstawek. Możemy linearyzować wektor i łączyć fragmenty DNA z wektorem jeden po drugim za pomocą technologii rekombinacji homologicznej.

Bezproblemowe podejście do klonowania konstrukcji wektora ekspresji wirusa zespołu rozrodczo-oddechowego świń

Ten protokół opisuje system Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) używany do budowy syntetycznych komórek. Przedstawiono w nim kluczowe etapy z reprezentatywnymi wynikami w różnych mikrokompartmentach. Protokół ma na celu ustanowienie najlepszych praktyk dla różnych laboratoriów w społeczności komórek syntetycznych, przyspieszając postęp w rozwoju komórek syntetycznych.

Bezkomórkowy system syntezy białek do budowy komórek syntetycznych

Przedstawiono protokół produkcji, oczyszczania i stosowania pęcherzyków z zewnętrzną błoną upakowaną enzymem (OMV), zapewniający zwiększoną stabilność enzymów do zastosowania w różnych zastosowaniach.

Ukierunkowane pakowanie białka w pęcherzykach błony zewnętrznej z Escherichia coli: projektowanie, produkcja i oczyszczanie

Poznaj metodę produkcji rekombinowanych RNA na dużą skalę w Escherichia coli przy użyciu okrągłego rusztowania pochodzącego z wiroidu. Technika ta umożliwia łatwe oczyszczanie i skalowanie procesu.

Produkcja na dużą skalę rekombinowanych RNA na okrągłym rusztowaniu przy użyciu systemu pochodzącego z wiroidu w Escherichia coli (Wideo) | JoVE Journal

Produkcja na dużą skalę rekombinowanych RNA na okrągłym rusztowaniu przy użyciu systemu pochodzącego z wiroidu w Escherichia coli

Przeglądaj więcej filmów