Analiza nieprawidłowości w strukturze skrzepu fibryny wywołanych przez β-amyloid za pomocą spektroskopii i skaningowej mikroskopii elektronowej
30 listopada 2018
Przedstawione tutaj są dwie metody, które mogą być używane indywidualnie lub w połączeniu do analizy wpływu beta-amyloidu na strukturę skrzepu fibryny. W zestawie znajduje się protokół tworzenia skrzepu fibrynowego in vitro, a następnie metody zmętnienia skrzepu i skaningowej mikroskopii elektronowej.
Główną zaletą tego testu mętności na płytce jest to, że jest szybki i pozwala na jednoczesne badanie przesiewowe kilku inhibitorów interakcji amyloid-beta fibrynogen bez skomplikowanej konfiguracji lub wymagań. Związki główne, które znajdują się w teście zmętnienia fibryny, mogą być dalej oceniane pod kątem ich zdolności do przywracania nieprawidłowości strukturalnych wywołanych przez A-beta w skrzepach fibryny analizowanych za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. Wizualna demonstracja przygotowania skrzepu do analizy za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej ma kluczowe znaczenie, ponieważ wszelkie zmiany w przygotowaniu mogą przyczynić się do zmian w wynikach eksperymentalnych.
Ta demonstracja skupia się tutaj na oddziaływaniach A-beta fibrynogenu. Protokół ten można łatwo zmodyfikować w celu analizy innych interakcji z innymi białkami i związkami z skrzepem fibryny. Rozpocząć od dodania 1,5 mikromola świeżo przygotowanego fibrynogenu w 200 mikrolitrach buforu do tworzenia skrzepów do każdej studzienki A-beta ujemnej 42 i kontrolnej i inkubować płytkę na obrotowej platformie w temperaturze pokojowej.
Po 30 minutach jednocześnie dodać 30 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu trombiny bezpośrednio do środka studzienki zawierającej fibrynogen, aby zainicjować tworzenie skrzepów i natychmiast odczytać absorbancję skrzepów in vitro przy 350 nanometrach, powtarzając pomiar co 30 do 60 sekund w ciągu 10 minut. Aby ocenić wpływ inhibitorów interakcji fibrynogenu A-beta na strukturę skrzepu fibryny, najpierw użyj kleszczy, aby umieścić czyste, 12-milimetrowe szkiełka nakrywkowe z silikonizowanego szkła w poszczególnych dołkach 12-dołkowej płytki i dodaj 80 mikrolitrów fibrynogenu na każdą szkiełko nakrywkowe, delikatnie rozprowadzając roztwór, aby były równomiernie rozprowadzone. Dodaj 20 mikrolitrów roztworu trombiny do każdej studzienki, aby zainicjować tworzenie się skrzepu.
Przykryć płytkę na 30 do 60 minut inkubacji w temperaturze pokojowej, a następnie delikatnie zanurzyć każdy skrzep w dwóch mililitrach lodowatego buforu kakodylanu sodu na dwie minuty, pod przykryciem, w temperaturze pokojowej dwa razy, używając pipety o pojemności jednego mililitra, aby ostrożnie usunąć bufor po każdym przemyciu. Po ostatnim praniu sprawdź stan tworzenia się skrzepów na szkiełku nakrywkowym i utrwal skrzepy w dwóch do trzech mililitrach lodowatego 2% aldehydu glutarowego na lodzie przez 30 minut. Pod koniec inkubacji delikatnie usunąć aldehyd glutarowy z każdej studzienki i przemyć skrzepy świeżym buforem kakodylanu sodu, jak pokazano na lodzie.
Aby uwodnić utrwalone skrzepy w stopniowanej serii pięciominutowych, lodowato zimne płukanie etanolem na lodzie bez całkowitego usuwania etanolu między płukaniami, aby chronić skrzepy przed dostępem powietrza. Podczas ostatniego prania ze 100% etanolem przenieś szkiełka nakrywkowe do uchwytu na próbki suszarki w punkcie krytycznym, umieszczając co najmniej 1 podkładkę między każdym szkiełkiem nakrywkowym i umieść uchwyt w komorze suszarki w punkcie krytycznym wypełnionej etanolem. Po 30-minutowym cyklu suszenia za pomocą taśmy węglowej zamontuj szkiełka nakrywkowe na poszczególnych klockach skaningowej mikroskopii elektronowej i przenieś próbki do komory powlekania napylaniem próżniowego.
Następnie napylaj próbki na mniej niż 20 nanometrów złota, palladu lub innych materiałów przewodzących przez 25 sekund z prędkością czterech angstremów na sekundę i zobrazuj próbki na skaningowym mikroskopie elektronowym wyposażonym w detektor elektronów wtórnych typu dwa o napięciu czterech kilowoltów. Tworzenie się skrzepów fibryny powoduje rozpraszanie światła przechodzącego przez roztwór, co skutkuje zwiększonym zmętnieniem, które utrzymuje się pod koniec okresu odczytu. Gdy fibrynogen jest inkubowany w obecności A-beta 42, zmętnienie roztworu zmniejsza się, a krzywa osiąga maksymalną wysokość około połowy wysokości samego fibrynogenu.
W obecności blokera interakcji A-beta 42 działanie beta-amyloidu ulega złagodzeniu, a zmętnienie jest wyższe niż w przypadku samego A-beta. Działanie blokera nie pojawia się ze względu na zmętnienie tła, ponieważ związek nie zmienia zmętnienia skrzepu fibryny, gdy A-beta jest nieobecny. Co więcej, tworzenie skrzepów w obecności GPRP, peptydu, o którym wiadomo, że zakłóca polimeryzację fibryny, wykazuje znacznie zmniejszone zmętnienie w porównaniu z tworzeniem skrzepów fibryny przy braku inhibitora.
Fibrynogen powstający w obecności trombiny i chlorku wapnia tworzy jedynie siatkę fibrynową z wydłużonymi i interkalowanymi nitkami fibryny, a także większymi wiązkami. Gdy A-beta jest obecny, nici fibryny stają się cieńsze z kilkoma lepkimi grudkami w agregatach, co wskazuje na nieprawidłowości strukturalne wywołane przez A-beta. Zgodnie z wynikami testu zmętnienia, tworzenie się skrzepów w obecności blokera interakcji A-beta fibrynogenu częściowo przywraca strukturę skrzepu fibryny w wyniku zmian wywołanych przez A-beta, ponieważ przy tym leczeniu obserwuje się mniej grudek.
Protokoły analizy zmętnienia skrzepów i skaningowego mikroskopu elektronowego zostały zoptymalizowane pod kątem oceny kilku inhibitorów interakcji A-beta fibrynogenu w szybki i powtarzalny sposób. Wkrótce dane dostarczą cennych informacji na temat tworzenia się skrzepów fibryny, które będzie można zastosować w dalszych badaniach zarówno in vitro, jak i in vivo.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono metody analizy wpływu beta-amyloidu na strukturę skrzepu fibrynowego, w tym protokół tworzenia skrzepu fibrynowego in vitro oraz metody pomiaru mętności skrzepu i skaningową mikroskopię elektronową.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biochemia
- Biologia komórki
Wstęp
- Beta-amyloid jest zaangażowany w procesy chorób neurodegeneracyjnych.
- Skrzepy fibryny odgrywają rolę w różnych procesach biologicznych.
- Zrozumienie struktury skrzepu fibryny może dostarczyć wiedzy na temat mechanizmów chorobowych.
- Poprzednie badania wykazały nieprawidłowości strukturalne w skrzepach fibryny wywołane przez A-beta.
Cel badania
- Ocena wpływu beta-amyloidu na strukturę skrzepu fibryny.
- Przesiewowe badanie inhibitorów oddziaływań między amyloidem-beta a fibrynogenem.
- Prezentacja metody przygotowania skrzepów do analizy za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej.
Zastosowane metody
- Test mętności na płytkach do szybkiego przesiewania.
- Przygotowanie skrzepów fibryny in vitro z wykorzystaniem fibrynogenu.
- Skaningowa mikroskopia elektronowa do analizy struktury skrzepu.
- Modyfikacja protokołów w celu badania innych oddziaływań białkowych.
Główne wyniki
- Identyfikacja związków wiodących przywracających integralność strukturalną.
- Wizualna prezentacja przygotowania skrzepu jest kluczowa dla zapewnienia powtarzalności.
- Różnice w przygotowaniu mogą wpływać na wyniki eksperymentów.
- Potencjał do szerszego zastosowania w badaniu oddziaływań białkowych.
Wnioski
- Przedstawione metody są skuteczne w analizie struktury skrzepu fibryny.
- Przesiewowe badanie inhibitorów może dostarczyć wiedzy na temat strategii terapeutycznych.
- Dalsze badania mogą rozszerzyć wiedzę na temat oddziaływań innych białek.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia szybki i powtarzalny screening inhibitorów interakcji między amyloidem-beta a fibrynogenem z wykorzystaniem płytkowego testu mętności, co wspiera wczesny etap walidacji celu w opracowywaniu terapii choroby Alzheimera. Metoda dostarcza ilościowych danych dotyczących tworzenia się skrzepu oraz potwierdzenia strukturalnego za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej, co ułatwia przejście z etapu hit-to-lead dla związków łagodzących nieprawidłowości skrzepów fibrynowych indukowanych przez A-beta. Dzięki integracji odczytów mętności z obrazowaniem SEM, podejście to zapewnia redukcję ryzyka mechanistycznego oraz pewność prognostyczną dla programów odkrywania leków ukierunkowanych na układ naczyniowo-mózgowy.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezę terapeutyczną, według której oddziaływanie A-beta-fibrynogenu napędza patologiczne tworzenie się skrzepów w chorobie Alzheimera.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez pomiar mętności skrzepu jako bezpośredniego odczytu zahamowania wiązania A-beta-fibrynogenu.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję portfolio poprzez identyfikację związków przywracających prawidłową strukturę skrzepu fibrynowego, co wskazuje na zaangażowanie celu i biologiczną redukcję ryzyka.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość testu: Zoptymalizowany test mętności jest szybki, wysoce powtarzalny i kompatybilny z formatami płytek wielodołkowych, co umożliwia przesiewanie dużych bibliotek związków.
- Wynik ilościowy: Pomiar absorbancji przy 350 nm w czasie dostarcza danych kinetycznych dotyczących tworzenia skrzepu, co pozwala odróżnić skuteczność inhibitora od efektów tła.
- Potwierdzenie strukturalne: Związki wyłonione w przesiewie mętności są walidowane za pomocą SEM w celu wizualizacji przywrócenia architektury skrzepu fibryny, co zapewnia, że wyniki nie są artefaktami testowymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Modeluje naczyniowo-mózgowy mechanizm patologii choroby Alzheimera, łącząc A-beta z nieprawidłowościami skrzepów fibryny związanych z mikrozawałami i amyloidową angiopatią mózgu.
- Ciągłość translacyjna: Łączy oddziaływanie z celem in vitro (mętność) z fenotypową strukturą skrzepu (SEM), co wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego przed walidacją in vivo.
- Postęp dostosowany do ryzyka: Umożliwia podejmowanie decyzji go/no-go w oparciu o podwójne kryteria: hamowanie opóźnienia tworzenia skrzepów oraz odwracanie nieprawidłowości strukturalnych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesny etap procesu odkrywania leków, umożliwiając testowanie hipotezy dotyczącej interakcji A-beta-fibrynogenu jako celu terapeutycznego, a uzyskane wyniki stanowią wkład w procesy identyfikacji związków wiodących oraz walidacji przedklinicznej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez ilościowe określenie, w jaki sposób A-beta zmienia mętność i strukturę skrzepu fibryny, wyjaśniając udział konkretnych szlaków w dysfunkcji naczyniowo-nerwowej.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość i powtarzalność testu do wysokoprzepustowej oceny inhibitorów oddziaływania A-beta-fibrynogen w formacie płytki 96-dołkowej.
- Analityka: Dostarcza kinetyki mętności oraz parametrów strukturalnych opartych na SEM, co umożliwia analizę porównawczą wpływu związków na tworzenie i architekturę skrzepu.
- Badania translacyjne: Łączy inhibicję celu z fenotypową regeneracją skrzepu, co jest zgodne z ciągłością badań przedklinicznych dla modeli naczyniowo-nerwowych choroby Alzheimera.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Procedura oparta na mętności i SEM stanowi platformę wielokrotnego użytku, którą można zastosować do innych oddziaływań białko-fibrynogen poza A-beta, wspierając szerokie wysiłki w zakresie walidacji celów terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną poprzez powiązanie inhibicji biochemicznej z strukturalnym odzyskaniem skrzepu, co zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki zoptymalizowanym protokołom przygotowania, przemywania, utrwalania i obrazowania skrzepów.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji go/no-go poprzez wymaganie zarówno funkcjonalnej (mętność) jak i strukturalnej (SEM) walidacji, co redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację inhibitorów z uwzględnieniem ryzyka, które wykazują podwójną korekcję opóźnienia tworzenia skrzepu oraz patologii strukturalnej.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w przygotowaniu białek, testach tworzenia skrzepów oraz przygotowaniu próbek do skaningowej mikroskopii elektronowej.
- Zależne od dostępu do czytnika płytek umożliwiającego kinetyczne pomiary absorbancji przy 350 nm oraz próżniowej napylarki z możliwością obrazowania SEM.
- Konieczna jest standaryzacja etapów utrwalania, odwadniania i suszenia skrzepu, aby uniknąć artefaktów strukturalnych, które mogłyby zakłócić interpretację obrazów SEM.
- W przypadku rozszerzenia protokołu na inne oddziaływania białek z fibrynogenem, należy uwzględnić adaptacje, szczególnie w zakresie składu buforu i czasu inkubacji.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak konieczność świeżego przygotowania odczynników oraz ostrożnego obchodzenia się z próbkami, aby zapobiec zmienności skrzepów wynikającej z kontaktu z powietrzem lub niespójnego przemywania.
