Name: Analiza nieprawidłowości w strukturze skrzepu fibryny wywołanych przez β-amyloid za pomocą spektroskopii i skaningowej mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Poznaj metody analizy wpływu beta-amyloidu na strukturę skrzepu fibryny przy użyciu spektroskopii turbidymetrycznej i skaningowej mikroskopii elektronowej. Techniki te umożliwiają szybkie przesiewanie inhibitorów interakcji amyloid-beta z fibrynogenem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Masanori Kawasaki, Kazuyoshi Aso i Michaelowi Foleyowi z Tri-Institutional Therapeutics Discovery Institute (TDI) w Nowym Jorku za syntezę inhibitorów interakcji Aβ-fibrynogen i ich cenne sugestie. Autorzy dziękują również członkom laboratorium Stricklanda za pomocną dyskusję. Praca ta była wspierana przez NS104386 grantów NIH, Alzheimer's Drug Discovery Foundation i Robertson Therapeutic Development Fund for H.A., NIH grant NS50537, Tri-Institutional Therapeutics Discovery Institute, Alzheimer's Drug Discovery Foundation, Rudin Family Foundation i John A. Herrmann for S.S.

1. Przygotowanie Aβ42 i Fibrynogenu do analizy
<ol>
	<li>Przygotuj monomeryczny Aβ42 z liofilizowanego proszku
	<ol>
		<li>Podgrzej proszek Aβ42 do temperatury pokojowej i wiruj w tempie 1,500 x g przez 30 s.</li>
		<li>Dodać 100 μl lodowatego heksafluoroizopropanolu (HFIP) na 0,5 mg proszku Aβ42 i inkubować przez 30 minut na lodzie. 
		UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z HFIP i wykonaj wszystkie czynności w okapie chemicznym.</li>
		<li>Przygotować 20 μl porcji i pozostawić folie do wyschnięcia na powietrzu w kapturze chemicznym przez 2-3 godziny. Folie można przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Rozpuść monomeryczną warstwę Aβ42 w 10 μl świeżego dimetylosulfotlenku (DMSO) przez mieszanie w sonikatorze kąpielowym przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodać 190 μl 50 mM buforu tris(hydroksymetylo)aminometanowego (Tris) (pH 7,4) i delikatnie pipetować w górę i w dół.</li>
		<li>Usunąć agregaty białkowe przez odwirowanie w temperaturze 20,817 x g w temperaturze 4 °C przez 20 minut.</li>
		<li>Inkubować supernatant w temperaturze 4 °C przez noc, a następnego dnia odwirowywać roztwór w temperaturze 20,817 x g w temperaturze 4 °C przez 20 minut, aby usunąć dalsze agregaty białkowe.</li>
		<li>Zmierzyć stężenie Aβ42 za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA). Seryjnie rozcieńczoną albuminę surowicy bydlęcej (BSA) od 1 mg/ml do 0,0625 mg/ml w celu wytworzenia wzorca białkowego, dodać 10 μl każdego wzorca do dołków płytki wielodołkowej w trzech powtórzeniach. Rozcieńczyć próbki Aβ w stosunku 1:4 i dodać 10 μl do studzienek w trzech egzemplarzach. Wymieszaj roztwory BCA A i B i dodaj 200 μl do każdego dołka. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C i czytać na płytce czytnika przy długości fali 562 nm. Pozostały roztwór Aβ należy przechowywać na lodzie i stosować ten preparat do oznaczania zmętnienia i SEM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj roztwór fibrynogenu
	<ol>
		<li>Odmierzyć 20 mg liofilizowanego proszku fibrynogenu do probówki o pojemności 15 ml i ponownie zawiesić we wstępnie podgrzanym 2 ml 20 mM buforu kwasu hydroksyetylopiperazyno-etanosulfonowego (HEPES) (pH 7,4).</li>
		<li>Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 10 minut.</li>
		<li>Przefiltrować roztwór przez filtr strzykawkowy 0,2 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Wyjąć roztwór z 4 °C i ponownie przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,1 μm w celu usunięcia agregatów fibrynogenu lub istniejącej wcześniej fibryny.</li>
		<li>Zmierz stężenie fibrynogenu za pomocą testu BCA. Postępuj zgodnie z instrukcjami z kroku 1.1.8. Pozostałą zawartość roztworu fibrynogenu należy przechowywać w temperaturze 4 °C i stosować ten preparat do oznaczania zmętnienia i SEM.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Test zmętnienia skrzepów
<ol>
	<li>Do każdej studzienki doświadczalnej z płytki 96-dołkowej dodać 20 μl 30 μM roztworu Aβ42 z etapu 1.1.8, tak aby jego końcowe stężenie wynosiło 3,0 μM w 200 μl buforu. Dodać tę samą objętość 5% DMSO w 50 mM buforze Tris (pH 7,4) do studzienek kontrolnych buforu w płytce 96-dołkowej. 
	UWAGA: Dokładna objętość Aβ42 na tym etapie nie jest ważna. W przypadku preparatów o niskim stężeniu można zastosować większą objętość i dostosować objętość buforu do tworzenia skrzepów. Ostateczna objętość powinna pozostać 200 μl.</li>
	<li>W przypadku badania związków hamujących, należy rozcieńczyć związek do stężenia roboczego jako DMSO. Dodaj sam związek lub DMSO do kontroli do studzienek za pomocą Aβ42 i dobrze wymieszaj. 
	UWAGA: Roztwór Aβ42 powinien tworzyć dyskretną kroplę na dnie studzienki, związek lub DMSO należy pipetować bezpośrednio do środka kropli.</li>
	<li>Rozcieńczyć podstawowy roztwór fibrynogenu z kroku 1.2.4 w buforze do tworzenia skrzepów (20 mM bufor HEPES (pH 7,4), 5 mM CaCl2 i 137 mM NaCl) i dodać go do Aβ42 zawierających i kontrolnych studzienek 96-dołkowej. Dostosuj objętość roztworu fibrynogenu tak, aby jego końcowe stężenie wynosiło 1,5 μM w sumie 200 μl objętości reakcyjnej. Powoli pipetować roztwór i unikać tworzenia się pęcherzyków. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut, wstrząsając na obrotowej platformie. 
	UWAGA: Objętość roztworu fibrynogenu może się różnić w zależności od jego stężenia podstawowego, ale całkowita objętość w każdym dołku powinna wynosić 170 μl podczas inkubacji.</li>
	<li>Przygotować roztwór trombiny, rozpuszczając komercyjnie oczyszczony proszek trombiny w ddH2O, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 50 U/ml. Rozcieńczyć do 5 m/ml roztworu roboczego w 20 mM buforze HEPES (pH 7,4) bezpośrednio przed użyciem.</li>
	<li>Po 30 minutach inkubacji jednocześnie dodać 30 μl roztworu trombiny (5 U/ml) do roztworów fibrynogenu w 96-dołkowej płytce z kroku 2.3 za pomocą pipety wielokanałowej. Dodanie trombiny natychmiast zainicjuje tworzenie się skrzepu. Dlatego należy dodać trombinę bezpośrednio do środka roztworu fibrynogenu, ostrożnie, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków. 
	UWAGA: Aktywność trombiny może się różnić w zależności od warunków eksperymentalnych, a także partii trombiny. Konieczne może być empiryczne określenie prawidłowego stężenia wymaganego do wytworzenia skrzepów.</li>
	<li>Odczytać absorbancję skrzepu in vitro na czytniku płytkowym bezpośrednio po dodaniu trombiny. Mierzyć absorbancję przy 350 nm w ciągu 10 minut, co 30-60 s. Wykonaj cały test w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Niektóre związki inhibitorowe mogą zmieniać absorbancję roztworu przy 350 nm, w którym to przypadku zmętnienie można zmierzyć przy 405 nm.</li>
</ol>
3. Skaningowa mikroskopia elektronowa
<ol>
	<li>Przygotowanie skrzepu, utrwalenie i mycie
	<ol>
		<li>Umieść czyste szkiełka pokrywowe ze szkła silikonowanego (12 mm) na płytce 12-dołkowej lub 24-dołkowej za pomocą kleszczy.</li>
		<li>Przygotować fibrynogen w buforze do tworzenia skrzepów. Szczegółowe informacje można znaleźć w kroku 1.2 protokołu.</li>
		<li>Aby ocenić wpływ inhibitorów interakcji Aβ-fibrynogenu na strukturę skrzepu fibryny, postępuj zgodnie z instrukcjami inkubacji opisanymi dla testu zmętnienia (krok 2). Zawsze dołączaj studzienki kontrolne, które zawierają fibrynogen pod nieobecność zarówno Aβ, jak i inhibitorów.</li>
		<li>Odpipetować 80 μl mieszaniny fibrynogenu z kroku 3.1.3 na szkiełkach podstawowych. Delikatnie rozprowadzić roztwór, tak aby był równomiernie rozprowadzony na szkiełku podstawowym.</li>
		<li>Rozcieńczyć trombinę (50 U/ml) w 20 mM buforowanej soli fizjologicznej HEPES do końcowego stężenia 2,5 U/ml i dodać 20 μl bezpośrednio do środka roztworu fibrynogenu bez mieszania. 
		UWAGA: W razie potrzeby można zastosować wyższe stężenie robocze trombiny (5 U/ml).</li>
		<li>Przykryj 12-dołkową płytkę plastikową pokrywką i pozostaw w temperaturze pokojowej na 30-60 minut.</li>
		<li>Podczas trwania reakcji krzepnięcia przygotuj roztwory odwadniające i utrwalające. Przygotować bufor kakodylanu sodu (0,1 M, pH 7,4). Rozcieńczyć 10% roztwór podstawowy aldehydu glutarowego w buforze kakodylanu sodu (0,1 M, pH 7,4), aby uzyskać 2% roztwór roboczy aldehydu glutarowego. Trzymaj wszystkie te roztwory na lodzie. Świeżo rozcieńczony aldehyd glutarowy (2%) należy zużyć w ciągu 1 tygodnia, jeśli jest prawidłowo przechowywany w lodówce w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Rozcieńczyć absolutny etanol (100%) w podwójnie destylowanej wodzie (80%, 50% i 20% etanolu). Roztwory etanolu i etanol absolutny (100%) należy przechowywać na lodzie. 
		UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z kakodylanem sodu i aldehydem glutarowym, wykonaj te czynności w kapturze chemicznym.</li>
		<li>Po 30 minutach delikatnie przemyć skrzepy dwukrotnie lodowatym buforem kakodylanu sodu (0,1 M). Dodać 2 ml buforu do każdej studzienki, tak aby skrzep był całkowicie zanurzony. Przykryj płytkę dołka pokrywką i pozostaw na 2 minuty w temperaturze pokojowej. Po 2 minutach delikatnie usunąć bufor za pomocą pipety o pojemności 1 ml lub pipety z wąskim trzpieniem. Powtórz raz.</li>
		<li>Napraw skrzepy lodowatym aldehydem glutarowym (2%). Trzymając płytkę studzienki na lodzie, dodaj około 2-3 ml 2% aldehydu glutarowego do każdej studzienki. Upewnij się, że skrzepy są całkowicie zanurzone. Przykryj i pozostaw talerz na lodzie na 30 minut.</li>
		<li>Po 30 minutach delikatnie usunąć aldehyd glutarowy z każdej studzienki i przemyć skrzepy za pomocą buforu kakodylanu sodu (0,1 M), jak opisano powyżej (2 min, dwukrotnie). Utrzymuj płytkę studzienki na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Seryjne odwadnianie skrzepów i suszenie w punkcie krytycznym
	<ol>
		<li>Odwodnić skrzepy w stopniowanej serii lodowatych płukań etanolem przygotowanych w kroku 3.1.8 (20%, 50%, 80%, 100% i ponownie 100%) przez 5 minut każde. Do każdej serii etanolu dodaj 2-3 ml, upewniając się, że skrzepy są zanurzone. Przykryj i inkubuj na lodzie.</li>
		<li>Po każdym etapie etanolu usuń roztwór etanolu za pomocą pipety o pojemności 1 ml lub jednorazowego zakraplacza do pipet. Nie usuwaj całkowicie etanolu. Upewnij się, że powierzchnia skrzepu nie jest wystawiona na działanie powietrza. 
		UWAGA: Odwodnienie w absolutnym etanolu (100%) należy wykonać dwukrotnie.</li>
		<li>Trzymając próbkę zanurzoną w końcowym 100% etanolu, przenieś ją do suszarki punktu krytycznego (CPD). Do przenoszenia szkiełek do komory CPD należy użyć uchwytu na próbkę CPD lub uchwytu szkiełka nakrywkowego z podkładką. Umieść co najmniej jedną podkładkę między każdym zjeżdżalnią.</li>
		<li>Wyjmij prowadnicę pokrywy z komory CPD i zamontuj ją na króćcu SEM za pomocą taśmy węglowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Napylanie i obrazowanie
	<ol>
		<li>Przenieść wszystkie próbki za pomocą króćca SEM do komory napylania.</li>
		<li>Napylanie warstwowe o grubości mniejszej niż 20 nm ze złota/palladu lub innych materiałów przewodzących, takich jak węgiel, za pomocą napylarki próżniowej. 
		UWAGA: Zastosowaliśmy powłokę złoto-palladową o długości 18 nm. Napylanie trwało 45 s, a prędkość powlekania wynosiła 4 Μ/s. Próbki pokryte napylaniem są stabilne, gdy są przechowywane w suchym środowisku w temperaturze pokojowej przez kilka tygodni. Analizę SEM można przeprowadzić w dowolnym momencie.</li>
		<li>Pozyskiwanie obrazów na skaningowym mikroskopie elektronowym wyposażonym w detektor SE2 przy napięciu 4 kV. 
		nuta: Rozmiar piksela obrazu w tym zestawie obrazów mieści się w zakresie od 13 nm do 31 nm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Selkoe, D. J., Schenk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease%3A+molecular+understanding+predicts+amyloid-based+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).</li>
<li>Kurz, A., Perneczky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+clearance+as+a+treatment+target+against+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Amyloid clearance as a treatment target against Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 24, 61-73 (2011).</li>
<li>Benilova, I., Karran, E., De Strooper, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+toxic+Abeta+oligomer+and+Alzheimer%27s+disease%3A+an+emperor+in+need+of+clothes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The toxic Abeta oligomer and Alzheimer's disease: an emperor in need of clothes.</a> Nature Neuroscience. 15 (3), 349-357 (2012).</li>
<li>Karran, E., Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critique+of+the+drug+discovery+and+phase+3+clinical+programs+targeting+the+amyloid+hypothesis+for+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">A critique of the drug discovery and phase 3 clinical programs targeting the amyloid hypothesis for Alzheimer disease.</a> Annals of Neurology. 76 (2), 185-205 (2014).</li>
<li>Yoshikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+cerebral+blood+flow+in+Alzheimer+disease+and+vascular+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22AJNR%2C+American+Journal+of+Neuroradiology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of cerebral blood flow in Alzheimer disease and vascular dementia.</a> AJNR, American Journal of Neuroradiology. 24 (7), 1341-1347 (2003).</li>
<li>Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+will+out%3A+vascular+contributions+to+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Blood will out: vascular contributions to Alzheimer's disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 556-563 (2018).</li>
<li>Ahn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease+peptide+beta-amyloid+interacts+with+fibrinogen+and+induces+its+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease peptide beta-amyloid interacts with fibrinogen and induces its oligomerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21812-21817 (2010).</li>
<li>Zamolodchikov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+structural+analysis+of+the+interaction+between+beta-amyloid+and+fibrinogen%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Biochemical and structural analysis of the interaction between beta-amyloid and fibrinogen.</a> Blood. 128 (8), 1144-1151 (2016).</li>
<li>Cortes-Canteli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen+and+beta-amyloid+association+alters+thrombosis+and+fibrinolysis%3A+a+possible+contributing+factor+to+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen and beta-amyloid association alters thrombosis and fibrinolysis: a possible contributing factor to Alzheimer's disease.</a> Neuron. 66 (5), 695-709 (2010).</li>
<li>Cortes-Canteli, M., Mattei, L., Richards, A. T., Norris, E. H., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+deposited+in+the+Alzheimer%27s+disease+brain+promotes+neuronal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Fibrin deposited in the Alzheimer's disease brain promotes neuronal degeneration.</a> Neurobiology of Aging. 36 (2), 608-617 (2015).</li>
<li>Liao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+postmortem+amyloid+plaques+isolated+by+laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of postmortem amyloid plaques isolated by laser capture microdissection.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 37061-37068 (2004).</li>
<li>Zamolodchikov, D., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abeta+delays+fibrin+clot+lysis+by+altering+fibrin+structure+and+attenuating+plasminogen+binding+to+fibrin%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Abeta delays fibrin clot lysis by altering fibrin structure and attenuating plasminogen binding to fibrin.</a> Blood. 119 (14), 3342-3351 (2012).</li>
<li>Ahn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Abeta-fibrinogen+interaction+inhibitor+rescues+altered+thrombosis+and+cognitive+decline+in+Alzheimer%27s+disease+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">A novel Abeta-fibrinogen interaction inhibitor rescues altered thrombosis and cognitive decline in Alzheimer's disease mice.</a> The Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1049-1062 (2014).</li>
<li>Singh, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aminopyrimidine+Class+Aggregation+Inhibitor+Effectively+Blocks+Abeta-Fibrinogen+Interaction+and+Abeta-Induced+Contact+System+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Aminopyrimidine Class Aggregation Inhibitor Effectively Blocks Abeta-Fibrinogen Interaction and Abeta-Induced Contact System Activation.</a> Biochemistry. 57 (8), 1399-1409 (2018).</li>
<li>Pretorius, E., Mbotwe, S., Bester, J., Robinson, C. J., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+induction+of+anomalous+and+amyloidogenic+blood+clotting+by+molecular+amplification+of+highly+substoichiometric+levels+of+bacterial+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Acute induction of anomalous and amyloidogenic blood clotting by molecular amplification of highly substoichiometric levels of bacterial lipopolysaccharide.</a> Journal of the Royal Society Interface. 13 (122), (2016).</li>
<li>Veklich, Y., Francis, C. W., White, J., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+studies+of+fibrinolysis+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy.</a> Blood. 92 (12), 4721-4729 (1998).</li>
<li>Weisel, J. W., Nagaswami, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+modeling+of+fibrin+polymerization+kinetics+correlated+with+electron+microscope+and+turbidity+observations%3A+clot+structure+and+assembly+are+kinetically+controlled%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled.</a> Biophysical Journal. 63 (1), 111-128 (1992).</li>
<li>Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+clots+are+equilibrium+polymers+that+can+be+remodeled+without+proteolytic+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion.</a> Scientific Reports. 2, 879(2012).</li>
<li>Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+amyloid+beta-peptide+%28Abeta%29+aggregation+using+the+Congo+red-Abeta+%28CR-abeta%29+spectrophotometric+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay.</a> Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).</li>
<li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+amyloid+formation+by+turbidity+assay-seeing+through+the+cloud%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Measurement of amyloid formation by turbidity assay-seeing through the cloud.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 445-471 (2016).</li>
<li>Bester, J., Soma, P., Kell, D. B., Pretorius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+and+ultrastructural+characteristics+of+whole+blood+and+plasma+in+Alzheimer-type+dementia%2C+and+the+possible+role+of+bacterial+lipopolysaccharides+%28LPS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic and ultrastructural characteristics of whole blood and plasma in Alzheimer-type dementia, and the possible role of bacterial lipopolysaccharides (LPS).</a> Oncotarget. 6 (34), 35284-35303 (2015).</li>
<li>Pretorius, E., Page, M. J., Mbotwe, S., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-binding+protein+%28LBP%29+can+reverse+the+amyloid+state+of+fibrin+seen+or+induced+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) can reverse the amyloid state of fibrin seen or induced in Parkinson's disease.</a> PLoS One. 13 (3), e0192121(2018).</li>
<li>Kell, D. B., Pretorius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteins+behaving+badly.+Substoichiometric+molecular+control+and+amplification+of+the+initiation+and+nature+of+amyloid+fibril+formation%3A+lessons+from+and+for+blood+clotting%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteins behaving badly. Substoichiometric molecular control and amplification of the initiation and nature of amyloid fibril formation: lessons from and for blood clotting.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 123, 16-41 (2017).</li>
<li>Wolberg, A. S., Campbell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombin+generation%2C+fibrin+clot+formation+and+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion+and+Apheresis+Science%22%5BJournal%5D)">Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis.</a> Transfusion and Apheresis Science. 38 (1), 15-23 (2008).</li>
<li>Soon, A. S., Lee, C. S., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+fibrin+matrix+properties+via+knob%3Ahole+affinity+interactions+using+peptide-PEG+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modulation of fibrin matrix properties via knob:hole affinity interactions using peptide-PEG conjugates.</a> Biomaterials. 32 (19), 4406-4414 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisane tutaj metody zapewniają powtarzalny i szybki sposób oceny tworzenia się skrzepów fibryny in vitro. Co więcej, prostota systemu sprawia, że interpretacja wpływu Aβ na tworzenie i strukturę skrzepów fibryny jest stosunkowo prosta. W poprzedniej publikacji tego laboratorium wykazano, że testy te mogą być wykorzystywane do testowania związków pod kątem ich zdolności do hamowania interakcji Aβ-fibrynogen13,14. Za pomocą tych dwóch testów przeanalizowa...

Choroba Alzheimera (AD), choroba neurodegeneracyjna prowadząca do pogorszenia funkcji poznawczych u starszych pacjentów, głównie wynika z nieprawidłowej ekspresji beta-amyloidu (Aβ), agregacji i upośledzonego klirensu, co prowadzi do neurotoksyczności1,2. Pomimo dobrze scharakteryzowanego związku między agregatami Aβ a AD3, dokładne mechanizmy leżące u podstaw patologii choroby nie są dobrze poznane4. Coraz więcej dowodów sugeruje, że deficyty nerwowo-naczyniowe odgrywają rolę w postępie i nasileniu AD5, ponieważ Aβ bezpośrednio oddziałuje ze składnikami układu krążenia6. Aβ ma wysoką interakcję powinowactwa z fibrynogenem7,8, który również lokalizuje się w złogach Aβ zarówno u pacjentów z AD, jak i w modelach mysich9,10,11. Ponadto oddziaływanie Aβ-fibrynogen indukuje nieprawidłowe tworzenie i strukturę fibryny-skrzepu, a także odporność na fibrynolizę9,12. Jedną z możliwości terapeutycznych w leczeniu AD jest łagodzenie deficytów krążenia poprzez hamowanie interakcji między Aβ a fibrynogenem13,14. W związku z tym zidentyfikowaliśmy kilka małych związków hamujących interakcję Aβ-fibrynogen przy użyciu wysokoprzepustowych badań przesiewowych i podejść chemii medycznej13,14. Aby przetestować skuteczność inhibitorów interakcji Aβ-fibrynogenu, zoptymalizowaliśmy dwie metody analizy tworzenia się skrzepów fibryny in vitro: test zmętnienia skrzepu i skaningową mikroskopię elektronową (SEM)14.
Test zmętnienia skrzepów to prosta i szybka metoda monitorowania powstawania skrzepów fibryny za pomocą spektroskopii widzialnej w promieniowaniu UV. W miarę tworzenia się skrzepu fibrynowego światło jest coraz bardziej rozpraszane, a zmętnienie roztworu wzrasta. I odwrotnie, gdy Aβ jest obecny, struktura skrzepu fibryny ulega zmianie, a zmętnienie mieszaniny ulega zmniejszeniu (ryc. 1). Wpływ związków hamujących można ocenić pod kątem potencjału przywrócenia zmętnienia skrzepu z powodu nieprawidłowości wywołanych przez Aβ. Chociaż test zmętnienia pozwala na szybką analizę wielu warunków, dostarcza ograniczonych informacji na temat kształtu i struktury skrzepu. SEM, w którym topografia ciał stałych jest ujawniana przez sondę elektronową, pozwala na analizę architektury 3D krzepu < klasy sup = 'xref'>15,16,17,18 oraz ocenę, w jaki sposób obecność Aβ i/lub związków hamujących zmienia tę strukturę9,14. Zarówno spektrometria, jak i SEM są klasycznymi technikami laboratoryjnymi, które były wykorzystywane do różnych celów, na przykład spektrofotometria służy do monitorowania agregacji amyloidu19,20. Podobnie, SEM jest również używany do analizy skrzepu fibryny utworzonego z osocza pacjentów z chorobą Alzheimera, Parkinsona i udarem zakrzepowo-zatorowym21,22,23. Przedstawione tutaj protokoły są zoptymalizowane pod kątem oceny tworzenia się fibryny w powtarzalny i szybki sposób. 
Poniższy protokół zawiera instrukcje dotyczące przygotowania fibryny in vitro zarówno z Aβ, jak i bez niego. Szczegółowo opisano również metody analizy wpływu Aβ na tworzenie i strukturę skrzepów fibryny. Skuteczność tych dwóch metod pomiaru hamowania interakcji Aβ-fibrynogen wykazano przy użyciu TDI-2760, małego związku hamującego14. Metody te, zarówno pojedynczo, jak i łącznie, pozwalają na szybką i prostą analizę powstawania skrzepów fibryny in vitro.

<table><tbody><tr><td>Fibriogen, zubożony w plazminogen, Plasma</td><td>EMD Millipore</td><td>341578</td><td>utrzymać parafilm pokrywy owinięty, aby uniknąć narażenia na wilgoć</td></tr><tr><td>Beta-amyloid (1-42), ludzka</td><td>Anaspec</td><td>AS-20276</td><td></td></tr><tr><td>Trombina z ludzkiego osocza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7009</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanol, większy lub równy 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>105228</td><td></td></tr><tr><td>DIMETYLOSULFOTLENEK (DMSO), STERYLNIE FILTROWANY</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Zestaw do oznaczania białek</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fischer Scientific</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fischer Scientific</td><td>C70</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka z filtrem, 0,2&mikro; M, 25mm</td><td>Pall</td><td>4612</td><td></td></tr><tr><td>Millex Sterylne filtry strzykawkowe, 0.1 um, PVDF, Ø 33 mm</td><td>Millipore</td><td>SLVV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Solid 96-dołkowe płytki o wysokim poziomie wiązania Certyfikowany płaski dno</td><td>Fischer Scientific</td><td>21377203</td><td></td></tr><tr><td>Spectramax Plus384</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>89212-396</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka, 5417R</td> Myjka ultradźwiękowa <td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Branson 200</td><td>Fischer Scientific</td><td>15-337-22</td><td></td></tr><tr><td>Rotator laboratoryjny</td><td>Thermo Scientific</td><td>2314-1CEQ</td><td></td></tr><tr><td>Zapasowe podkładki do uchwytu szkiełka nakrywkowego</td><td>Tousimis</td><td>8766-01</td><td></td></tr><tr><td>Pipety z wąskim trzpieniem - Sedi-Pet</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>70967-13</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na próbkę do CPD (uchwyt szkiełka nakrywkowego)</td><td>Tousimis</td><td>8766</td><td></td></tr><tr><td>Skrzynka uchwytu montażowego, typ pinowy</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences (EMS)</td><td>76610</td><td></td></tr><tr><td>Okrągłe szkiełka podstawowe (12 mm)</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-277</td><td></td></tr><tr><td>10% aldehyd glutarowy</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki (EMS)</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Labs</td><td>11652</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>Falcon</td><td>3047</td><td></td></tr><tr><td>Na Cacodylate</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>11652</td><td></td></tr><tr><td>SEM Stubs, Stożkowy koniec szpilka.</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki (EMS)</td><td>75192</td><td></td></tr><tr><td>Zakładki PELCO, Wypustki przewodzące węgiel, 12mm OD</td><td>Ted Pella</td><td>16084-1</td><td></td></tr><tr><td>Autosamdri-815 Suszarka do punktów krytycznych</td><td>Tousimis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Denton Desk IV Coater z tarczą złoto/palladową</td><td>Denton Vacuum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leo 1550 FE-SEM</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Smart SEM</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analiza nieprawidłowości w strukturze skrzepu fibryny wywołanych przez β-amyloid za pomocą spektroskopii i skaningowej mikroskopii elektronowej

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Ten artykuł przedstawia metody generowania skrzepów fibrynowych in vitro i analizy wpływu białka beta-amyloidu (Aβ) na tworzenie i strukturę skrzepów za pomocą spektrometrii i skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Wykazano, że Aβ, który tworzy neurotoksyczne agregaty amyloidu w chorobie Alzheimera (AD), wchodzi w interakcje z fibrynogenem. Ta interakcja Aβ-fibrynogen sprawia, że skrzep fibryny jest strukturalnie nieprawidłowy i odporny na fibrynolizę. Nieprawidłowości w krzepnięciu fibryny wywołane przez Aβ mogą również przyczyniać się do mózgowo-naczyniowych aspektów patologii AD, takich jak mikrozawały, stany zapalne, a także mózgowa angiopatia amyloidowa (CAA). Biorąc pod uwagę potencjalnie krytyczną rolę deficytów nerwowo-naczyniowych w patologii choroby Alzheimera, opracowanie związków, które mogą hamować lub zmniejszać interakcję Aβ-fibrynogen, ma obiecującą wartość terapeutyczną. Metody in vitro, za pomocą których można łatwo i systematycznie oceniać powstawanie skrzepów fibrynowych, są potencjalnie użytecznymi narzędziami do opracowywania związków terapeutycznych. Przedstawiono zoptymalizowany protokół wytwarzania skrzepu fibryny in vitro, a także analizę wpływu inhibitorów interakcji Aβ i Aβ-fibrynogenu. Test zmętnienia skrzepu jest szybki, wysoce powtarzalny i może być stosowany do jednoczesnego testowania wielu warunków, co pozwala na badanie przesiewowe dużej liczby inhibitorów Aβ-fibrynogenu. Związki trafione z tego badania przesiewowego mogą być dalej oceniane pod kątem ich zdolności do łagodzenia indukowanych przez Aβ nieprawidłowości strukturalnych architektury skrzepu fibryny za pomocą SEM. Skuteczność tych zoptymalizowanych protokołów została zademonstrowana przy użyciu TDI-2760, niedawno zidentyfikowanego inhibitora interakcji Aβ-fibrynogenu.

W teście krzepnięcia (mętności) in vitro enzym trombina rozszczepia fibrynogen, co prowadzi do powstania sieci fibryny24. Tworzenie skrzepu fibrynowego powoduje rozproszenie światła przechodzącego przez roztwór, co skutkuje zwiększoną mętnością (Rycina 1), która osiąga poziom plateau przed końcem okresu pomiaru (Rycina 2, kolor zielony). Podczas inkubacji fibrynogenu w obecności Aβ42 mętność roztw...

Przedstawione tutaj są dwie metody, które mogą być używane indywidualnie lub w połączeniu do analizy wpływu beta-amyloidu na strukturę skrzepu fibryny. W zestawie znajduje się protokół tworzenia skrzepu fibrynowego in vitro, a następnie metody zmętnienia skrzepu i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Analiza nieprawidłowości w strukturze skrzepu fibryny wywołanych przez β-amyloid za pomocą spektroskopii i skaningowej mikroskopii elektronowej

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Główną zaletą tego testu mętności na płytce jest to, że jest szybki i pozwala na jednoczesne badanie przesiewowe kilku inhibitorów interakcji amyloid-beta fibrynogen bez skomplikowanej konfiguracji lub wymagań. Związki główne, które znajdują się w teście zmętnienia fibryny, mogą być dalej oceniane pod kątem ich zdolności do przywracania nieprawidłowości strukturalnych wywołanych przez A-beta w skrzepach fibryny analizowanych za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. Wizualna demonstracja przygotowania skrzepu do analizy za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej ma kluczowe znaczenie, ponieważ wszelkie zmiany w przygotowaniu mogą przyczynić się do zmian w wynikach eksperymentalnych.Ta demonstracja skupia się tutaj na oddziaływaniach A-beta fibrynogenu. Protokół ten można łatwo zmodyfikować w celu analizy innych interakcji z innymi białkami i związkami z skrzepem fibryny. Rozpocząć od dodania 1,5 mikromola świeżo przygotowanego fibrynogenu w 200 mikrolitrach buforu do tworzenia skrzepów do każdej studzienki A-beta ujemnej 42 i kontrolnej i inkubować płytkę na obrotowej platformie w temperaturze pokojowej.Po 30 minutach jednocześnie dodać 30 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu trombiny bezpośrednio do środka studzienki zawierającej fibrynogen, aby zainicjować tworzenie skrzepów i natychmiast odczytać absorbancję skrzepów in vitro przy 350 nanometrach, powtarzając pomiar co 30 do 60 sekund w ciągu 10 minut. Aby ocenić wpływ inhibitorów interakcji fibrynogenu A-beta na strukturę skrzepu fibryny, najpierw użyj kleszczy, aby umieścić czyste, 12-milimetrowe szkiełka nakrywkowe z silikonizowanego szkła w poszczególnych dołkach 12-dołkowej płytki i dodaj 80 mikrolitrów fibrynogenu na każdą szkiełko nakrywkowe, delikatnie rozprowadzając roztwór, aby były równomiernie rozprowadzone. Dodaj 20 mikrolitrów roztworu trombiny do każdej studzienki, aby zainicjować tworzenie się skrzepu.Przykryć płytkę na 30 do 60 minut inkubacji w temperaturze pokojowej, a następnie delikatnie zanurzyć każdy skrzep w dwóch mililitrach lodowatego buforu kakodylanu sodu na dwie minuty, pod przykryciem, w temperaturze pokojowej dwa razy, używając pipety o pojemności jednego mililitra, aby ostrożnie usunąć bufor po każdym przemyciu. Po ostatnim praniu sprawdź stan tworzenia się skrzepów na szkiełku nakrywkowym i utrwal skrzepy w dwóch do trzech mililitrach lodowatego 2% aldehydu glutarowego na lodzie przez 30 minut. Pod koniec inkubacji delikatnie usunąć aldehyd glutarowy z każdej studzienki i przemyć skrzepy świeżym buforem kakodylanu sodu, jak pokazano na lodzie.Aby uwodnić utrwalone skrzepy w stopniowanej serii pięciominutowych, lodowato zimne płukanie etanolem na lodzie bez całkowitego usuwania etanolu między płukaniami, aby chronić skrzepy przed dostępem powietrza. Podczas ostatniego prania ze 100% etanolem przenieś szkiełka nakrywkowe do uchwytu na próbki suszarki w punkcie krytycznym, umieszczając co najmniej 1 podkładkę między każdym szkiełkiem nakrywkowym i umieść uchwyt w komorze suszarki w punkcie krytycznym wypełnionej etanolem. Po 30-minutowym cyklu suszenia za pomocą taśmy węglowej zamontuj szkiełka nakrywkowe na poszczególnych klockach skaningowej mikroskopii elektronowej i przenieś próbki do komory powlekania napylaniem próżniowego.Następnie napylaj próbki na mniej niż 20 nanometrów złota, palladu lub innych materiałów przewodzących przez 25 sekund z prędkością czterech angstremów na sekundę i zobrazuj próbki na skaningowym mikroskopie elektronowym wyposażonym w detektor elektronów wtórnych typu dwa o napięciu czterech kilowoltów. Tworzenie się skrzepów fibryny powoduje rozpraszanie światła przechodzącego przez roztwór, co skutkuje zwiększonym zmętnieniem, które utrzymuje się pod koniec okresu odczytu. Gdy fibrynogen jest inkubowany w obecności A-beta 42, zmętnienie roztworu zmniejsza się, a krzywa osiąga maksymalną wysokość około połowy wysokości samego fibrynogenu.W obecności blokera interakcji A-beta 42 działanie beta-amyloidu ulega złagodzeniu, a zmętnienie jest wyższe niż w przypadku samego A-beta. Działanie blokera nie pojawia się ze względu na zmętnienie tła, ponieważ związek nie zmienia zmętnienia skrzepu fibryny, gdy A-beta jest nieobecny. Co więcej, tworzenie skrzepów w obecności GPRP, peptydu, o którym wiadomo, że zakłóca polimeryzację fibryny, wykazuje znacznie zmniejszone zmętnienie w porównaniu z tworzeniem skrzepów fibryny przy braku inhibitora.Fibrynogen powstający w obecności trombiny i chlorku wapnia tworzy jedynie siatkę fibrynową z wydłużonymi i interkalowanymi nitkami fibryny, a także większymi wiązkami. Gdy A-beta jest obecny, nici fibryny stają się cieńsze z kilkoma lepkimi grudkami w agregatach, co wskazuje na nieprawidłowości strukturalne wywołane przez A-beta. Zgodnie z wynikami testu zmętnienia, tworzenie się skrzepów w obecności blokera interakcji A-beta fibrynogenu częściowo przywraca strukturę skrzepu fibryny w wyniku zmian wywołanych przez A-beta, ponieważ przy tym leczeniu obserwuje się mniej grudek.Protokoły analizy zmętnienia skrzepów i skaningowego mikroskopu elektronowego zostały zoptymalizowane pod kątem oceny kilku inhibitorów interakcji A-beta fibrynogenu w szybki i powtarzalny sposób. Wkrótce dane dostarczą cennych informacji na temat tworzenia się skrzepów fibryny, które będzie można zastosować w dalszych badaniach zarówno in vitro, jak i in vivo.

analysis-amyloid-induced-abnormalities-on-fibrin-clot-structure

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Źródło: Balczon, R., et al. Metody wykrywania cytotoksycznych amyloidów po zakażeniu komórek śródbłonka płuc przez Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2018)Ten film przedstawia protokół ilościowego oznaczania amyloidów w supernatantach z hodowli komórek śródbłonka płuc zakażonych zjadliwymi bakteriami, przy użyciu tioflawiny T, barwnika fluorescencyjnego, który wiąże się ze strukturami beta-arkuszy amyloidu. Wzrost fluorescencji w porównaniu z wartością wyjściową wskazuje na obecność...

Kwantyfikacja amyloidów wywołanych infekcjami bakteryjnymi za pomocą fluorescencji tioflawiny T

Ten film opisuje technikę barwienia amyloidów w skrawkach tkanek za pomocą luminescencyjnie sprzężonego barwnika oligotiofenowego - heptamer-formyl tiofenu octowego lub hFTAA - do obrazowania fluorescencyjnego. Amyloidy są bogatymi w β arkusze nieprawidłowymi agregatami białkowymi. Ich wykrywanie w próbkach tkanek jest pomocne w diagnostyce i leczeniu chorób związanych z amyloidem czy proteinopatii.

Barwienie złogów amyloidu hFTAA: technika wizualizacji włókienek amyloidowych przy użyciu barwnika na bazie oligotiofenu do obrazowania fluorescencyjnego w skrawkach tkanek

Ten film demonstruje użycie spektrofotometru UV do monitorowania powstawania nierozpuszczalnych skrzepów fibryny w funkcji zmiany zmętnienia roztworu. Spektrofotometr w zakresie widzialnym w promieniowaniu UV mierzy absorbancję roztworu w czasie, która reprezentuje zmianę zmętnienia spowodowaną tworzeniem się nierozpuszczalnych skrzepów fibryny.

Spektroskopia w zakresie widzialnym UV do monitorowania tworzenia się skrzepów fibryny

Źródło: Nyström, S., et al., Obrazowanie tkanek amyloidowych wybarwionych luminescencyjnymi sprzężonymi oligotiofenami za pomocą hiperspektralnej mikroskopii konfokalnej i obrazowania czasu życia fluorescencji. J. Vis. Exp. (2017). Ten film przedstawia analizę struktur amyloidowych za pomocą mikroskopii obrazowania fluorescencji (FLIM), przy użyciu barwnika hFTAA w celu ujawnienia zwartych rdzeni jako niebieskich/zielonych i niestabilnych peryferii jako czerwonych/żółtych na obrazach...

Analiza struktur amyloidowych w skrawku tkanki przy użyciu mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

W tym manuskrypcie przedstawiono techniki eksperymentalne, w tym przygotowanie krwi, mikroskopię konfokalną i analizę szybkości lizy, w celu zbadania różnic morfologicznych między normalnymi i nieprawidłowymi strukturami skrzepu spowodowanymi stanami chorobowymi.

Techniki eksperymentalne i obrazowe do badania struktur skrzepów fibryny w stanach prawidłowych i chorobowych

Odkładanie się amyloidu jest cechą charakterystyczną różnych chorób i dotyka wiele różnych narządów. W pracy opisano zastosowanie luminescencyjnego sprzężonego barwienia fluorescencyjnego oligotiofenem w połączeniu z technikami mikroskopii fluorescencyjnej. Ta metoda barwienia stanowi potężne narzędzie do wykrywania i eksploracji agregatów białkowych zarówno w warunkach klinicznych, jak i naukowych.

Obrazowanie tkanek amyloidowych barwionych luminescencyjnymi sprzężonymi oligotiofenami za pomocą hiperspektralnej mikroskopii konfokalnej i obrazowania fluorescencji

Opisano proste metody demonstrowania produkcji cytotoksycznych amyloidów po zakażeniu śródbłonka płuc przez Pseudomonas aeruginosa.

Metody wykrywania cytotoksycznych amyloidów po zakażeniu komórek śródbłonka płuc przez Pseudomonas aeruginosa

Obrazowanie molekularne z laserową desorpcją/jonizacją wspomaganą matrycą, spektrometria mas (MALDI-IMS) pozwala na jednoczesne mapowanie wielu analitów w próbkach biologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykrywania i wizualizacji białka β amyloidu w tkankach mózgowych choroby Alzheimera i próbkach mózgowej angiopatii amyloidowej za pomocą MALDI-IMS.

Wizualizacja złogów β amyloidu w ludzkim mózgu za pomocą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą

Opisujemy zastosowanie nanospektroskopii w podczerwieni i mikroskopii sił atomowych o wysokiej rozdzielczości do wizualizacji procesu samoorganizacji białek w agregaty oligomeryczne i fibryle amyloidowe, co jest ściśle związane z powstawaniem i rozwojem szerokiego zakresu ludzkich zaburzeń neurodegeneracyjnych.

Charakterystyka poszczególnych agregatów białkowych za pomocą nanospektroskopii w podczerwieni i mikroskopii sił atomowych

Ta metoda biochemicznego oczyszczania z analizą proteomiczną opartą na spektrometrii mas ułatwia solidną charakterystykę rdzeni włókienkowych amyloidu, co może przyspieszyć identyfikację celów zapobiegania chorobie Alzheimera.

Biochemiczne oczyszczanie i charakterystyka proteomiczna rdzeni fibryli amyloidowych z mózgu

Błony amyloidowe są formowane przez liczne białka, a powstałe włókna mają strukturę "krzyżowego arkusza β". Opisujemy tutaj, jak próbki włókien amyloidowych mogą być przygotowywane do dyfrakcji rentgenowskiej włókien i jak wzory mogą być analizowane.

Amyloid i architektura krzyżowa beta

Poznaj metody analizy wpływu beta-amyloidu na strukturę skrzepu fibryny przy użyciu spektroskopii turbidymetrycznej i skaningowej mikroskopii elektronowej. Techniki te umożliwiają szybkie przesiewanie inhibitorów interakcji amyloid-beta z fibrynogenem.

Analiza nieprawidłowości w strukturze skrzepu fibryny wywołanych przez β-amyloid za pomocą spektroskopii i skaningowej mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal

Analiza nieprawidłowości w strukturze skrzepu fibryny wywołanych przez β-amyloid za pomocą spektroskopii i skaningowej mikroskopii elektronowej

Przeglądaj więcej filmów