Analiza nieprawidłowości w strukturze skrzepu fibryny wywołanych przez β-amyloid za pomocą spektroskopii i skaningowej mikroskopii elektronowej

Przedstawione tutaj są dwie metody, które mogą być używane indywidualnie lub w połączeniu do analizy wpływu beta-amyloidu na strukturę skrzepu fibryny. W zestawie znajduje się protokół tworzenia skrzepu fibrynowego in vitro, a następnie metody zmętnienia skrzepu i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Główną zaletą tego testu mętności na płytce jest to, że jest szybki i pozwala na jednoczesne badanie przesiewowe kilku inhibitorów interakcji amyloid-beta fibrynogen bez skomplikowanej konfiguracji lub wymagań. Związki główne, które znajdują się w teście zmętnienia fibryny, mogą być dalej oceniane pod kątem ich zdolności do przywracania nieprawidłowości strukturalnych wywołanych przez A-beta w skrzepach fibryny analizowanych za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. Wizualna demonstracja przygotowania skrzepu do analizy za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej ma kluczowe znaczenie, ponieważ wszelkie zmiany w przygotowaniu mogą przyczynić się do zmian w wynikach eksperymentalnych.

Ta demonstracja skupia się tutaj na oddziaływaniach A-beta fibrynogenu. Protokół ten można łatwo zmodyfikować w celu analizy innych interakcji z innymi białkami i związkami z skrzepem fibryny. Rozpocząć od dodania 1,5 mikromola świeżo przygotowanego fibrynogenu w 200 mikrolitrach buforu do tworzenia skrzepów do każdej studzienki A-beta ujemnej 42 i kontrolnej i inkubować płytkę na obrotowej platformie w temperaturze pokojowej.

Po 30 minutach jednocześnie dodać 30 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu trombiny bezpośrednio do środka studzienki zawierającej fibrynogen, aby zainicjować tworzenie skrzepów i natychmiast odczytać absorbancję skrzepów in vitro przy 350 nanometrach, powtarzając pomiar co 30 do 60 sekund w ciągu 10 minut. Aby ocenić wpływ inhibitorów interakcji fibrynogenu A-beta na strukturę skrzepu fibryny, najpierw użyj kleszczy, aby umieścić czyste, 12-milimetrowe szkiełka nakrywkowe z silikonizowanego szkła w poszczególnych dołkach 12-dołkowej płytki i dodaj 80 mikrolitrów fibrynogenu na każdą szkiełko nakrywkowe, delikatnie rozprowadzając roztwór, aby były równomiernie rozprowadzone. Dodaj 20 mikrolitrów roztworu trombiny do każdej studzienki, aby zainicjować tworzenie się skrzepu.

Przykryć płytkę na 30 do 60 minut inkubacji w temperaturze pokojowej, a następnie delikatnie zanurzyć każdy skrzep w dwóch mililitrach lodowatego buforu kakodylanu sodu na dwie minuty, pod przykryciem, w temperaturze pokojowej dwa razy, używając pipety o pojemności jednego mililitra, aby ostrożnie usunąć bufor po każdym przemyciu. Po ostatnim praniu sprawdź stan tworzenia się skrzepów na szkiełku nakrywkowym i utrwal skrzepy w dwóch do trzech mililitrach lodowatego 2% aldehydu glutarowego na lodzie przez 30 minut. Pod koniec inkubacji delikatnie usunąć aldehyd glutarowy z każdej studzienki i przemyć skrzepy świeżym buforem kakodylanu sodu, jak pokazano na lodzie.

Aby uwodnić utrwalone skrzepy w stopniowanej serii pięciominutowych, lodowato zimne płukanie etanolem na lodzie bez całkowitego usuwania etanolu między płukaniami, aby chronić skrzepy przed dostępem powietrza. Podczas ostatniego prania ze 100% etanolem przenieś szkiełka nakrywkowe do uchwytu na próbki suszarki w punkcie krytycznym, umieszczając co najmniej 1 podkładkę między każdym szkiełkiem nakrywkowym i umieść uchwyt w komorze suszarki w punkcie krytycznym wypełnionej etanolem. Po 30-minutowym cyklu suszenia za pomocą taśmy węglowej zamontuj szkiełka nakrywkowe na poszczególnych klockach skaningowej mikroskopii elektronowej i przenieś próbki do komory powlekania napylaniem próżniowego.

Następnie napylaj próbki na mniej niż 20 nanometrów złota, palladu lub innych materiałów przewodzących przez 25 sekund z prędkością czterech angstremów na sekundę i zobrazuj próbki na skaningowym mikroskopie elektronowym wyposażonym w detektor elektronów wtórnych typu dwa o napięciu czterech kilowoltów. Tworzenie się skrzepów fibryny powoduje rozpraszanie światła przechodzącego przez roztwór, co skutkuje zwiększonym zmętnieniem, które utrzymuje się pod koniec okresu odczytu. Gdy fibrynogen jest inkubowany w obecności A-beta 42, zmętnienie roztworu zmniejsza się, a krzywa osiąga maksymalną wysokość około połowy wysokości samego fibrynogenu.

W obecności blokera interakcji A-beta 42 działanie beta-amyloidu ulega złagodzeniu, a zmętnienie jest wyższe niż w przypadku samego A-beta. Działanie blokera nie pojawia się ze względu na zmętnienie tła, ponieważ związek nie zmienia zmętnienia skrzepu fibryny, gdy A-beta jest nieobecny. Co więcej, tworzenie skrzepów w obecności GPRP, peptydu, o którym wiadomo, że zakłóca polimeryzację fibryny, wykazuje znacznie zmniejszone zmętnienie w porównaniu z tworzeniem skrzepów fibryny przy braku inhibitora.

Fibrynogen powstający w obecności trombiny i chlorku wapnia tworzy jedynie siatkę fibrynową z wydłużonymi i interkalowanymi nitkami fibryny, a także większymi wiązkami. Gdy A-beta jest obecny, nici fibryny stają się cieńsze z kilkoma lepkimi grudkami w agregatach, co wskazuje na nieprawidłowości strukturalne wywołane przez A-beta. Zgodnie z wynikami testu zmętnienia, tworzenie się skrzepów w obecności blokera interakcji A-beta fibrynogenu częściowo przywraca strukturę skrzepu fibryny w wyniku zmian wywołanych przez A-beta, ponieważ przy tym leczeniu obserwuje się mniej grudek.

Protokoły analizy zmętnienia skrzepów i skaningowego mikroskopu elektronowego zostały zoptymalizowane pod kątem oceny kilku inhibitorów interakcji A-beta fibrynogenu w szybki i powtarzalny sposób. Wkrótce dane dostarczą cennych informacji na temat tworzenia się skrzepów fibryny, które będzie można zastosować w dalszych badaniach zarówno in vitro, jak i in vivo.