Analiza ekspresji genów komórek śródbłonka narażonych na naprężenia ścinające przy użyciu wielu komór przepływowych z równoległą płytką
21 października 2018
Tutaj przedstawiono przebieg pracy dla hodowli i analizy ekspresji genów komórek śródbłonka pod wpływem naprężeń ścinających. Uwzględniono fizyczny układ do jednoczesnego przechowywania i monitorowania wielu komór przepływowych w kontrolowanym środowisku oraz zastosowanie egzogennego referencyjnego RNA do ilościowej reakcji PCR.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii śródbłonka, takie jak: dlaczego naczynia krwionośne mają regionalne różnice w rozwoju miażdżycy? Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona jednoczesne badanie wielu warunków w warunkach naprężenia ścinającego lub wielokrotnego naprężenia ścinającego. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku zrozumienia regulacji genów śródbłonka zarówno w układzie tętniczym, jak i żylnym, ponieważ można stosować różne prędkości i wzorce przepływu.
Cóż, tutaj demonstrujemy system, który wykorzystuje stały przepływ laminarny. Konfigurację można dostosować do innych wzorców przepływu, w tym przepływu zakłóconego. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności z utrzymaniem ciągłej monowarstwy komórek przez cały czas trwania eksperymentu i uzyskaniem spójnych wyników między eksperymentami.
24 godziny przed analizą należy policzyć ludzkie komórki śródbłonka we wczesnym okresie pasażu i wysiać około 10 do szóstych komórek w jednym mililitrze pożywki na jednym szkiełku szklanym pokrytym fibronektyną na dołek czterodołkowej płytki do hodowli komórek. Pozwól komórkom przylegać do szkiełka przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie przykryj każde szkiełko trzema mililitrami pożywki i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 na 24 godziny.
W dniu eksperymentu napełnij tacę na wodę w dużym, ogrzewanym, wbudowanym środowisku regulowanym CO2 i ogrzewaniem lub inkubatorze plażowym z wieloma półkami, wewnętrznym dostępem do energii elektrycznej i szklanymi drzwiami oraz potwierdź, że dostępna jest odpowiednia ilość dwutlenku węgla do eksperymentu i że monitor CO2 jest sprawny. Aby ustawić komorę przepływową, włóż żeńską przynętę 1/8 cala do jednego końca miękkiej rurki o numerze 16 i przymocuj czterokierunkowy kran do przynęty. Przymocuj wolny koniec rurki do strony dopływu górnej płyty i włóż męską przynętę 1/8 cala do jednego końca drugiej miękkiej rurki o numerze 16.
Przymocuj czterokierunkowy kran do męskiej przynęty i przymocuj wolny koniec rurki do strony odpływowej górnej płyty. Włóż męską przynętę 1/8 cala i żeńską przynętę 1/8 cala do każdego końca trzeciej miękkiej rurki o numerze 16 i przymocuj rurkę do pułapki bąbelkowej za pomocą męskiej przynęty 1/8 cala. Następnie przymocuj czterokierunkowy kran do drugiego końca rurki za pomocą żeńskiej przynęty.
Za pomocą sterylnej pęsety przenieś jedno szkiełko nasienne komórkami do wgłębienia na dolnej płytce, stroną z ziarnami komórek do góry. Użyj strzykawki o pojemności 10 mililitrów, aby dodać 10 mililitrów ciepłego podłoża do dolnej płytki w czerwonej linii uszczelki wokół płytki. Umożliwienie przepływu medium przez szkiełko i zakrycie komórek.
Delikatnie umieść górną płytę na dolnej płycie, uważając, aby wyrównać boki i mocno przykręć płytki. Aby usunąć pęcherzyki powietrza z pułapki bąbelkowej, należy najpierw otworzyć kran dopływu i pułapki bąbelkowej, a następnie zamknąć zawór odcinający odpływ. Następnie użyj 30-mililitrowej strzykawki, aby delikatnie przepłukać 20 mililitrów ciepłego podłoża przez płytkę.
Aby usunąć pęcherzyki z komory, należy zamknąć zawór odcinający pułapkę bąbelkową i otworzyć zawór odpływowy. Podnieś stronę odpływową komory pod kątem 45 stopni i za pomocą 30-mililitrowej strzykawki delikatnie przepłucz 20 mililitrów ciepłego medium od strony dopływu komory. Ważne jest, aby spłukiwać z odpowiednią szybkością w kierunku przepływu i używać mikroskopu w celu potwierdzenia, że przed wystawieniem komórek na działanie przepływu laminarnego pozostaje zlewająca się monowarstwa komórek.
Następnie zamknij kurki po obu stronach komory i nakrętki i upewnij się, że komórki są nadal przymocowane do szkiełka pod mikroskopem świetlnym. Umieść komorę przepływową i wcześniej zmontowany system pętli przepływu na plaży i powoli zmniejszaj prędkość pompy zespołu pętli przepływu przed całkowitym wstrzymaniem pompy. Zamknij kurki w systemie pętli przepływu, aby zapobiec wyciekom i połącz ze sobą komorę i system pętli za pomocą kurków.
Gdy wszystkie pętle zostaną połączone, ponownie otwórz wszystkie zawory odcinające i powoli zwiększaj prędkość pompy, jednocześnie monitorując konfigurację pod kątem wycieków lub blokad. Umieść czujnik przepływu na rurce mostka komory po stronie dopływu studzienki z czujnikiem zorientowanym w kierunku przepływu i wyreguluj prędkość pompy, aby uzyskać natężenie przepływu dla interesującego nas współczynnika naprężenia ścinającego. Następnie włącz zbiornik CO2, aby osiągnąć stężenie 5%C02.
Po zakończeniu eksperymentalnego okresu przepływu powoli zmniejsz prędkość pompy perystaltycznej do zera i wyłącz zasilanie. Szybko zamknij wszystkie otwarte kurki i przenieś komorę i dołączoną rurkę z kranem z każdej strony na czysty blat stołu. Ostrożnie odkręć wszystkie, aby wyjąć górną płytkę i użyj pęsety igłowej, aby przenieść szklane szkiełko z dolnej płyty na naczynie o średnicy 100 milimetrów.
Umyj szkiełko w 10 mililitrach zimnego PBS i sprawdź komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić przyleganie komórek i wyrównanie w kierunku przepływu. Po zassaniu PBS przenieś szkiełko do czystego naczynia o średnicy 100 milimetrów i dodaj 350 mikrolitrów buforu do lizy uzupełnionego 1/100 beta-merkaptoetanolu z zestawu do ekstrakcji RNA do szkiełka. Użyj skrobaka do komórek z polietylenowym ostrzem, aby zeskrobać komórki ze szkiełka i przechylić naczynie do hodowli tkankowych, aby bufor zebrał się na dnie.
Za pomocą kleszczyków usuń szkiełko i odpipetuj lizat komórkowy do 1.5 mililitrowej probówki na lodzie. Następnie dodaj 10 mikrolitrów rozcieńczonego RNA lucyferazy do lizatu komórkowego w celu dalszej izolacji RNA i analizy zgodnie ze standardowymi protokołami. Pomyślną linearyzację plazmidu lucyferazy przy użyciu enzymów restrykcyjnych można potwierdzić, uruchamiając strawione produkty na żelu agarozowym, a wielkość zlinearyzowanego produktu można potwierdzić za pomocą drabinek DNA i porównania z nieoszlifowanym plazmidem.
Procesy produkcyjne mogą prowadzić do niewielkich zmian wysokości komory, dlatego natężenie przepływu musi być obliczane dla każdej komory, aby osiągnąć takie samo naprężenie ścinające. W eksperymentach obejmujących laminarne naprężenie ścinające w komórkach śródbłonka ssaków, RNA lucyferazy świetlika może być używane jako egzogenny impuls RNA. Normalizacja endogennego genu referencyjnego, egzogennego genu referencyjnego oraz endogennych i egzogennych genów referencyjnych daje podobne wyniki.
Warto zauważyć, że w tych reprezentatywnych eksperymentach wykorzystujących dwie jednocześnie pracujące komory przepływowe z naprężeniem ścinającym o wartości jednego pascala dla każdego eksperymentu, knockdown podobny do drugiego czynnika Kruppela za pośrednictwem SI-RNA dał podobną skuteczność knockdown między badanymi próbkami biologicznymi. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o ustaleniu równej warstwy komórek na szkiełku i obfitym zalaniu systemu pętli przepływu przed założeniem komory przepływowej. Zgodnie z tą procedurą, inne metody, takie jak sekwencjonowanie RNA, mogą być stosowane do oceny ekspresji RNA w całym genomie, a inne odczyty, takie jak DNA i białko, mogą być wykorzystywane do dalszej analizy molekularnej.
Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią śródbłonka do zbadania związku między naprężeniem ścinającym a potencjałem angiogennym w ludzkich komórkach śródbłonka.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia schemat pracy obejmujący hodowlę i analizę ekspresji genów komórek śródbłonka poddanym naprężeniu ścinającemu płynu. Obejmuje on układ fizyczny do monitorowania wielu komór przepływowych oraz zastosowanie egzogennego referencyjnego RNA do ilościowej PCR.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia śródbłonka
- Analiza ekspresji genów
- Wpływ naprężeń ścinających cieczy
Wprowadzenie
- Zrozumienie różnic regionalnych w rozwoju miażdżycy.
- Znaczenie badania regulacji genów śródbłonka.
- Zastosowanie różnych prędkości i wzorców przepływu.
- Wyzwania w utrzymaniu ciągłej warstwy monowarstwy komórek.
Cel badania
- Analiza reakcji komórek śródbłonka na naprężenie ścinające.
- Badanie ekspresji genów w różnych warunkach przepływu.
- Zapewnienie niezawodnej metody badania biologii śródbłonka.
Zastosowane metody
- Hodowla komórek śródbłonka w kontrolowanym naprężeniu ścinającym.
- Symultaniczne badanie wielu warunków.
- Wykorzystanie ustalonego przepływu laminarnego w eksperymentach.
- Adaptacja układu do różnych wzorców przepływu.
Główne wyniki
- Prezentacja systemu do badania komórek śródbłonka.
- Wgląd w regulację genów w układach tętniczym i żylnym.
- Opracowanie metody pozwalającej na uzyskanie powtarzalnych wyników doświadczalnych.
- Identyfikacja problemów, z którymi mierzą się nowi użytkownicy tej metody.
Wnioski
- Metoda ta pozwala na lepsze zrozumienie biologii śródbłonka.
- Stanowi ona podstawę dla przyszłych badań nad wpływem naprężeń ścinających.
- Posiada potencjał do opracowania strategii terapeutycznych w chorobach naczyniowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Standaryzowana analiza ekspresji genów w komórkach śródbłonka w kontrolowanych warunkach naprężenia ścinającego odpowiada na krytyczną potrzebę tworzenia predykcyjnych modeli biologii naczyniowej we wczesnych etapach odkryć. Zastosowanie komór przepływowych z równoległymi płytkami, monitorowanie przepływu w czasie rzeczywistym oraz normalizacja za pomocą egzogennego RNA zwiększają powtarzalność i pewność ilościową w procesie walidacji celów. Ten schemat postępowania wspiera rzetelną analizę mechanistyczną w celu minimalizacji ryzyka i dostarcza danych niezbędnych do podejmowania decyzji dotyczących portfolio w badaniach nad naczyniami i układem sercowo-naczyniowym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie regulacji genów śródbłonka w warunkach fizjologicznie istotnego naprężenia ścinającego.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez modelowanie warunków przepływu tętniczego i żylnego.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celu dzięki ilościowym wynikom ekspresji genów.
- Zwiększa pewność predykcyjną w zakresie wyboru i segregacji celów naczyniowych.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane systemy śródbłonka do późniejszego przesiewania związków.
- Standaryzuje warunki analizy z wykorzystaniem monitorowania przepływu w czasie rzeczywistym oraz egzogennych kontroli RNA.
- Umożliwia powtarzalne, ilościowe odczyty oparte na metodzie PCR w wielu różnych warunkach.
- Wspiera skalowalne, zrównoleglone przepływy pracy dla analiz wielowariantowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje modele naprężeń ścinających in vitro do naczyniowych środowisk in vivo w celu zapewnienia istotności translacyjnej.
- Zapewnia ciągłość przejścia od etapu odkrywania ekspresji genów do przedklinicznych badań nad biomarkerami.
- Zmniejsza ryzyko biologiczne poprzez modelowanie hemodynamicznych sił istotnych w przebiegu choroby.
- Umożliwia dostosowane do ryzyka opracowywanie celów naczyniowych w oparciu o solidne dane mechanistyczne.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z continuum od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając prowadzenie badań ekspresji genów opartych na hipotezach w warunkach kontrolowanego naprężenia ścinającego, co wspiera zarówno walidację celów, jak i translacyjne strategie biomarkerów.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia weryfikację hipotez dotyczących mechanotransdukcji śródbłonka i regulacji genów.
- Przesiewy: Zapewnia gotowe do analizy, powtarzalne modele śródbłonka do oceny związków chemicznych.
- Analityka: Dostarcza wyniki ilościwego PCR znormalizowane za pomocą egzogennego RNA w celu zapewnienia porównywalności między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia in vitro z biologią naczyniową in vivo poprzez modelowanie przepływu o znaczeniu fizjologicznym.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje modułową, skalowalną platformę, którą można dostosować do zróżnicowanych zagadnień badawczych w obszarze naczyń krwionośnych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów naczyniowych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność procesów analizy ekspresji genów.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne zarządzanie kapitałem w portfelu projektów.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację zasobów badawczych w obszarze naczyniowym i sercowo-naczyniowym z uwzględnieniem poziomu ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórek śródbłonka oraz obsłudze komory przepływowej.
- Wymaga aparatury do monitorowania przepływu w czasie rzeczywistym oraz infrastruktury do ilościowej PCR.
- Wymaga rygorystycznej standaryzacji międzyzespołowej w przypadku eksperymentów obejmujących wiele warunków.
- Możliwość adaptacji do różnych wzorców przepływu i systemów modelowych poprzez modyfikacje protokołu.
- Zależność od precyzyjnych strategii normalizacji w celu zminimalizowania zmienności próbek.
