Name: Analiza ekspresji genów komórek śródbłonka narażonych na naprężenia ścinające przy użyciu wielu komór przepływowych z równoległą płytką (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Poznaj metodę analizy ekspresji genów komórek śródbłonka pod wpływem naprężeń ścinających przy użyciu wielu komór przepływowych. System umożliwia jednoczesne badanie różnych warunków przepływu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez CIHR MOP 142307 P.A.M. H.S.J.M. jest laureatem Programu Szkoleniowego Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem w zakresie Medycyny Regeneracyjnej. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. i M.K.D. są laureatami stypendiów dla absolwentów Queen Elizabeth II w dziedzinie nauki i technologii.

<ol><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell heterogeneity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), (2012).</li>
<li>Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+fluid+shear+stress+sensing+in+vascular+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).</li>
<li>Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+activation+of+vascular+endothelium+as+a+determinant+of+its+functional+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4478-4485 (2001).</li>
<li>Cybulsky, M. I., Marsden, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+disturbed+blood+flow+on+endothelial+cell+gene+expression%3A+a+role+for+changes+in+RNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Effect of disturbed blood flow on endothelial cell gene expression: a role for changes in RNA processing.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (9), 1806-1808 (2014).</li>
<li>Man, H. S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+patterning+by+STEEL%2C+an+endothelial-enriched+long+noncoding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Angiogenic patterning by STEEL, an endothelial-enriched long noncoding RNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2401-2406 (2018).</li>
<li>Won, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+reduction+of+endothelial+nitric-oxide+synthase+expression+and+transcription+in+atherosclerosis-prone+regions+of+the+mouse+aorta+and+in+an+in+vitro+model+of+disturbed+flow%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow.</a> The American Journal of Pathology. 171 (5), 1691-1704 (2007).</li>
<li>Baeyens, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+remodeling+is+governed+by+a+VEGFR3-dependent+fluid+shear+stress+set+point%5BTitle%5D)+AND+%22eLIFE%22%5BJournal%5D)">Vascular remodeling is governed by a VEGFR3-dependent fluid shear stress set point.</a> eLIFE. 4, 04645(2015).</li>
<li>Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+atherosusceptible+endothelium%3A+endothelial+phenotypes+in+complex+haemodynamic+shear+stress+regions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">The atherosusceptible endothelium: endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo.</a> Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).</li>
<li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), 3349(2012).</li>
<li>Gray, K. M., Stroka, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+cell+mechanosensing%3A+New+insights+gained+from+biomimetic+microfluidic+models%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial cell mechanosensing: New insights gained from biomimetic microfluidic models.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 71, 106-117 (2017).</li>
<li>Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apparatus+for+subjecting+living+cells+to+fluid+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress.</a> Review of Scientific Instruments. 53 (12), 1851-1854 (1982).</li>
<li>Resnick, N., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamic+forces+are+complex+regulators+of+endothelial+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression.</a> The FASEB Journal. 9 (10), 874-882 (1995).</li>
<li>Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamic+shear+stress+and+its+role+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis.</a> The Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).</li>
<li>DeStefano, J. G., Xu, Z. S., Williams, A. J., Yimam, N., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+shear+stress+on+iPSC-derived+human+brain+microvascular+endothelial+cells+%28dhBMECs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">Effect of shear stress on iPSC-derived human brain microvascular endothelial cells (dhBMECs).</a> Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 20(2017).</li>
<li>Thormar, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+the+efficiency+of+double-stranded+DNA+formation+in+cDNA+synthesis+for+the+imprecision+of+microarray+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis.</a> Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).</li>
<li>Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+reference+gene+normalization+for+real-time+reverse+transcription-polymerase+chain+reaction+analysis+under+dynamic+endogenous+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regenation+Research%22%5BJournal%5D)">Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription.</a> Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).</li>
<li>Vaughan-Shaw, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+overcome+the+inhibitory+effect+of+heparin+on+DNA+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Oncology+%28Dordrecht%29%22%5BJournal%5D)">A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification.</a> Cellular Oncology (Dordrecht). 38 (6), 493-495 (2015).</li>
<li>Collins, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemodynamic+and+extracellular+matrix+cues+regulate+the+mechanical+phenotype+and+stiffness+of+aortic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Haemodynamic and extracellular matrix cues regulate the mechanical phenotype and stiffness of aortic endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, 3984(2014).</li>
<li>Fichtlscherer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+in+patients+with+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease.</a> Circulation Research. 107 (5), 677-684 (2010).</li>
<li>Smith, R. D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+reference+RNA+for+normalization+of+real-time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR.</a> Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).</li>
<li>Kohn, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+effects+of+matrix+stiffness+and+fluid+shear+stress+on+endothelial+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior.</a> Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Naprężenie ścinające jest stanem fizjologicznym, który moduluje funkcję śródbłonka, częściowo wpływając na ekspresję genów w stanie ustalonym 2,5. Modele regulacji genów w różnych warunkach naprężeń ścinających przyczynią się do lepszego zrozumienia funkcji śródbłonka. Ten pragmatyczny przepływ pracy obejmuje obwód przepływu wykorzystujący komorę przepływową z równoległą płytą, zaadaptowaną z Lane i wsp.9 i reprezentuje laminarny,...

Komórki śródbłonka naczyń krwionośnych tworzą wewnętrzną wyściółkę naczyń krwionośnych w zamkniętym układzie sercowo-naczyniowym wyższych gatunków. Tworzą one granicę między krwią a tkankami i charakteryzują się powierzchniami świetlnymi i abluminalnymi. Śródbłonek jest zróżnicowanym, aktywnym i adaptacyjnym systemem, który reguluje przepływ krwi, transport składników odżywczych, odporność i wzrost nowych naczyń krwionośnych1. W organizmie komórki śródbłonka normalnie istnieją w środowisku, w którym są narażone na siłę tarcia krążenia, naprężenie ścinające2. Naprężenie ścinające jest ważnym regulatorem ekspresji genów komórek śródbłonka3, a komórki śródbłonka próbują utrzymać naprężenie ścinające w danym zakresie2,4. Komórki śródbłonka wykazują wzorce angiogenne przy braku naprężeń ścinających5, które mogą poprawić perfuzję tkanek. Regionalne wzorce zaburzonego przepływu i zmienionego stresu ścinającego są związane z ekspresją genów zapalnych6 i rozwojem miażdżycy7,8. Tak więc modele, które obejmują naprężenie ścinające, są głównym elementem zrozumienia regulacji genów śródbłonka.
Opisujemy metodę badania regulacji genów w komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych pod wpływem stresu ścinającego. System ten wykorzystuje przepływ niepulsacyjny i naśladuje poziomy naprężeń ścinających płynu oraz stężenie tlenu, które modelują warunki dla komórek śródbłonka tętnic. Protokół ten zawiera szczegółowe informacje na temat metod knockdownu genu za pomocą interferencji RNA (RNAi), ustawień do zastosowania naprężeń ścinających przy użyciu aparatu przepływu z równoległą płytką oraz metod zwiększania egzogennego referencyjnego RNA przed analizą za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-qPCR). Rurociąg ten służy do badania regulacji genów w komórkach śródbłonka w obecności i bez laminarnego naprężenia ścinającego i obejmuje adaptację aparatu przepływu z równoległą płytką opisaną przez Lane'a i wsp.9. Ten konkretny układ został zaprojektowany, aby ułatwić jednoczesną ocenę wielu warunków eksperymentalnych, co pozwala na bezpośrednie porównanie warunków naprężeń ścinających, jak również normalizację analizy RNA. Duża jednostka grzewcza o kontrolowanej wilgotności jest wykorzystywana, aby umożliwić jednoczesną pracę wielu oddzielnych komór przepływowych i pomp z natężeniem przepływu monitorowanym dla każdego zespołu komory przepływowej w czasie rzeczywistym. Zastosowanie tej konfiguracji jest wykorzystywane do knockdownu genów przy użyciu RNAi w ustawieniu przepływu laminarnego/naprężenia ścinającego, ale aspekty tego protokołu można zastosować do dowolnej oceny ekspresji RNA.
Typowe podejścia do stosowania naprężeń ścinających dla komórek śródbłonka obejmują systemy mikroprzepływowe10, lepkościomierz stożkowo-płytkowy11, oraz komorę przepływu z płytką równoległą12. Systemy mikroprzepływowe różnych producentów okazały się przydatne w badaniu mechanobiologii i mechanotransdukcji w wielu typach komórek i tkanek oraz różnych bodźcach biofizycznych. W przypadku komórek śródbłonka zostały one wykorzystane do badania komórek śródbłonka w izolacji, a także interakcji komórek śródbłonka i transportu komórek immunologicznych lub nowotworowych10. Jednak systemy te są mniej odpowiednie do odzyskiwania dużej liczby komórek9. Zarówno lepkościomierz stożkowo-płytkowy, jak i komory przepływowe z płytką równoległą umożliwiają odzyskiwanie dużej liczby komórek w konfluentnych monowarstwach12. Systemy te mogą generować szereg sił tnących i wzorców12. Komora przepływu równoległego z płytą assembly9 ma tę zaletę, że obrazowanie w czasie rzeczywistym może być wykonywane przez szklane okno w celu oceny morfologii komórki w dowolnym punkcie czasowym. Ponadto perfuzat może być zbierany w sterylnych warunkach. W przypadku prezentowanego tutaj systemu przepływ może być również monitorowany w czasie rzeczywistym i w konfiguracji wielokomorowej, co ułatwia utrzymanie warunków ścinania między komorami.
Dla reprezentatywnych eksperymentów, używane są ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), które reprezentują typ komórek śródbłonka makronaczyniowego, a warunki naprężenia ścinającego, których używamy (1 Pa), odzwierciedlają warunki tętnicze (0,1 - 0,7 Pa). Jednak protokół ten może być stosowany z innymi typami komórek śródbłonka, a warunki naprężeń ścinających można dostosować zgodnie z pytaniem eksperymentalnym. Na przykład ocena ludzkich komórek śródbłonka w warunkach, które modelują krążenie żylne, wymagałaby niższych poziomów naprężeń ścinających (1 - 6 Pa), a badania modelujące krążenie mikronaczyniowe wykorzystały poziomy naprężeń ścinających 0,4 - 1,2 Pa13,14. Ponadto naprężenie ścinające może się różnić nawet między komórkami śródbłonka w tym samym naczyniu krwionośnym6. W obecnej konfiguracji stosowany jest pojedynczy system monitorowania, który może jednocześnie monitorować cztery oddzielne pętle przepływu. W przypadku laboratoriów, które potrzebują więcej pętli przepływu, w dedykowanym środowisku jest miejsce na dodatkowy system monitorowania.
RT-qPCR służy do bezwzględnego oznaczania ilościowego ekspresji genów w warunkach naprężenia ścinającego. Względna ekspresja genów docelowych jest często wykorzystywana do porównywania ekspresji RNA w różnych warunkach. Niektóre gatunki RNA mogą występować w bardzo małych ilościach lub być nieobecne, co komplikuje względne pomiary. Na przykład, długie niekodujące RNA w komórkach śródbłonka mogą wywierać silne efekty przy stosunkowo niskiej liczbie kopii na komórkę5. Ponadto różnice w wydajności startera mogą prowadzić do niedokładnej interpretacji wynikającej z zastosowania metody progu cyklu delta-delta (Ct) do analizy danych. Aby rozwiązać ten problem, przeprowadzamy bezwzględną ocenę ilościową, generując krzywą wzorcową przy użyciu znanej ilości plazmidowego DNA. Co więcej, komplementarna synteza DNA (cDNA) jest procesem nieefektywnym, a różnice w wydajności cDNA mogą odpowiadać za różnice w ekspresji RNA między warunkami i między próbkami15. Zastosowanie odczynników do naprężeń ścinających i/lub transfekcji może wpływać na proliferację, apoptozę i żywotność komórek lub dodawać składniki, które mogą zakłócać izolację RNA i/lub syntezę cDNA. Aby uwzględnić możliwość błędu systematycznego wynikającego z izolacji RNA i syntezy cDNA, używamy kontroli impulsowego RNA zsyntetyzowanego w laboratorium, dodanego w czasie ekstrakcji RNA i mierzonego przy każdej syntezie cDNA za pomocą RT-qPCR. Pozwala to nie tylko na dostosowanie się do różnic technicznych w ekstrakcji RNA i syntezie cDNA, ale także na obliczenie bezwzględnych ilości na komórkę, gdy znana jest liczba komórek.
Ten system wykorzystuje dodatkowe kroki, aby zachować podobieństwo lub uwzględnić techniczne różnice między warunkami. Kładziemy szczególny nacisk na te etapy ze względu na złożony charakter tych eksperymentów, które obejmują wiele układów fizycznych i warunków eksperymentalnych, które mogą prowadzić do zmienności eksperymentalnej.

<table><tbody><tr><td>0,05% Trypsin-EDTA</td><td>gibco</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Strzykawka</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>10 mm2 Naczynie hodowlane</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>30 mL Strzykawka</td><td>BD</td><td>302832</td><td></td></tr><tr><td>4-drogowe kurki</td><td>Discofix</td><td>D500</td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLAŻA</td><td>Darwin Chambers Company</td><td>MN: HO85, SN:</td> Skrobaki do komórek 4947549 <td></td></tr><tr><td>Miernik</td> CO2 BioSphenix, Ltd.<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>MN: P120, SN: 0342</td><td></td></tr><tr><td>Czujnik CO2</td><td>BioSphenix, Ltd.</td><td>MN: C700, SN: 52852</td><td></td></tr><tr><td>Woda destylowana</td><td>gibco</td><td>15230-170</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS) -/-</td><td>gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka 2</td><td>Promo Cell</td><td>C-22011</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka 2 Mieszanka suplementów</td><td>Promo Cell</td><td>C-39216</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna (czysta)</td><td>Filtr</td><td>11051407001</td><td></td>Sigma-Aldrich</tr><tr><td>(0,20 um)</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>Tłumik przepływu i nasadka</td><td>U z T, dmuchalnia</td><td></td><td></td>szkła</tr><tr><td>Przepływomierz: Konsola serii 400</td><td>Transonic Scisense Inc.</td>Przepływomierz <td>T402</td><td></td></tr><tr><td>: Rurki serii 400</td><td>Transonic Scisense Inc.</td><td>TS410</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik przepływu i nasadka</td><td>U dmuchalni</td><td></td><td></td>szkła</tr><tr><td>T Czujnik przepływu</td><td>Transonic Scisense Inc.</td><td>ME4PXL</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 737F Piekarnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>FI-737F</td><td></td></tr><tr><td>J Ściereczka</td><td>J Szkiełko</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikroskopowe (25 x 75 x 1 mm)</td><td>Fisherfinest</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>Papierowa torba do sterylizacji</td><td>Cardinal Health</td><td>92713</td><td></td></tr><tr><td>Pompa (Masterflex L/S Economy Drive)</td><td>Cole-Parmer</td><td>7554-90</td><td></td></tr><tr><td>Głowica pompy (Masterflex L/S Easy Load)</td><td>Cole-Parmer</td><td>7518-00</td><td></td></tr><tr><td>Prostokątna 4-dołkowa</td><td></td><td></td> pęseta <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> do 267061 Thermo Scientific <tr><td><mocna>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</strong</td></tr><tr><td>>Rurki</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Masterflex C-Flex L/S 25 Miękki przewód</td><td>Cole-Parmer</td><td>06424-25</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex C-Flex L/S 14 Miękki przewód</td><td>Cole-Parmer</td><td>06424-14</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex C-Flex L/S 16 Miękki przewód</td><td>Cole-Parmer</td><td>06424-16</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex PharMed BPT L/S 13 Twardy</td> przewód <td>Cole-Parmer</td><td>06508-13</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex PharMed BPT L/S 14 Twarde dętki</td><td>Cole-Parmer</td><td>06508-14</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Luer </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3/16" Męski Luer</td><td>Cole-Parmer</td><td>45518-08</td><td>Do węży #25</td></tr><tr><td>1/8" męski Luer</td><td>Cole-Parmer</td><td>30800-24</td><td>Do rurki #16</td></tr><tr><td>1/8" żeński Luer</td><td>Cole-Parmer</td><td>30800-08</td><td>Do rurki #16</td></tr><tr><td>1/16" męski Luer</td><td>Cole-Parmer</td><td>45518-00</td><td>Do rurki #14</td></tr> 1<tr><td>/16" żeński Luer</td><td>Cole-Parmer</td><td>45508-00</td><td>Do rurki #14</td></tr> <tr><td><mocny>Nazwa</mocny></td><td><mocny>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Knockdown odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oligofectamina</td><td>Invitrogen</td><td>12252-011</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Zredukowana surowica</td><td>średnia gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</strong</td></tr><tr><td>>In vitro transkrypcja </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Generuler 1kb+ drabinka DNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM1331</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>mMESSSEGE mMACHINE SP6 Zestaw do transkrypcji</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>pSP-luc+</td><td>Promega</td><td>E4471</td><td></td></tr><tr><td>Supercoiled DNA Ladder</td><td>New England BioLabs Inc.</td><td>N0472S</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Ethidium Bromek</td><td>Invitrogen</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>XhoI enzym restrykcyjny</td><td>New England BioLabs Inc.</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>RNA ekstrakcja </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beta-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148-100mL</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza ekspresji genów komórek śródbłonka narażonych na naprężenia ścinające przy użyciu wielu komór przepływowych z równoległą płytką

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

Opisujemy proces analizy ekspresji genów z komórek śródbłonka poddanych stałemu przepływowi laminarnemu przy użyciu wielu monitorowanych komór przepływu na równoległych płytkach. Komórki śródbłonka tworzą wewnętrzną wyściółkę komórkową naczyń krwionośnych i są przewlekle narażone na siłę tarcia przepływu krwi zwaną naprężeniem ścinającym. W warunkach fizjologicznych komórki śródbłonka funkcjonują w różnych warunkach naprężenia ścinającego. W związku z tym zastosowanie warunków naprężeń ścinających w modelach in vitro może zapewnić lepszy wgląd w reakcje śródbłonka in vivo. Komora przepływowa z płytką równoległą opublikowana wcześniej przez Lane'a i wsp.9 jest przystosowany do badania regulacji genów śródbłonka w obecności i bez stałego (niepullarnego) przepływu laminarnego. Kluczowe adaptacje w konfiguracji przepływu laminarnego, jak przedstawiono tutaj, obejmują duże, dedykowane środowisko do przechowywania równoległych obwodów przepływu, monitorowanie natężeń przepływu w czasie rzeczywistym oraz włączenie egzogennego referencyjnego RNA do normalizacji ilościowych danych PCR w czasie rzeczywistym. Aby ocenić wiele zabiegów/warunków z zastosowaniem naprężeń ścinających, w tym samym ogrzewanym i nawilżanym inkubatorze stosuje się jednocześnie wiele obwodów przepływowych i pomp. Natężenie przepływu każdego obwodu przepływu jest mierzone w sposób ciągły w czasie rzeczywistym w celu standaryzacji warunków naprężeń ścinających podczas eksperymentów. Ponieważ eksperymenty te mają wiele warunków, używamy również egzogennego referencyjnego RNA, który jest wzbogacany w czasie ekstrakcji RNA w celu normalizacji ekstrakcji RNA i wydajności syntezy pierwszej nici cDNA. Te kroki minimalizują zmienność między próbkami. Strategia ta jest stosowana w naszym rurociągu do analizy ekspresji genów z eksperymentami z naprężeniem ścinającym przy użyciu komory przepływowej z równoległą płytką, ale części tej strategii, takie jak egzogenny referencyjny skok RNA, można łatwo i tanio wykorzystać do innych zastosowań.

Prawidłową linearyzację plazmidu lucyferazy za pomocą enzymów restrykcyjnych potwierdzono, przeprowadzając elektroforezę produktów trawienia na żelu agarozowym (Rysunek 1). Wielkość zlinearyzowanego produktu potwierdzono przy użyciu markerów DNA oraz poprzez porównanie z nieprzeciętym plazmidem.
Zaadaptowaliśmy układ komory przepływowej z równoległymi płytkami opracowany przez Lane et al.<s...

Tutaj przedstawiono przebieg pracy dla hodowli i analizy ekspresji genów komórek śródbłonka pod wpływem naprężeń ścinających. Uwzględniono fizyczny układ do jednoczesnego przechowywania i monitorowania wielu komór przepływowych w kontrolowanym środowisku oraz zastosowanie egzogennego referencyjnego RNA do ilościowej reakcji PCR.

Analiza ekspresji genów komórek śródbłonka narażonych na naprężenia ścinające przy użyciu wielu komór przepływowych z równoległą płytką

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii śródbłonka, takie jak: dlaczego naczynia krwionośne mają regionalne różnice w rozwoju miażdżycy? Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona jednoczesne badanie wielu warunków w warunkach naprężenia ścinającego lub wielokrotnego naprężenia ścinającego. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku zrozumienia regulacji genów śródbłonka zarówno w układzie tętniczym, jak i żylnym, ponieważ można stosować różne prędkości i wzorce przepływu.Cóż, tutaj demonstrujemy system, który wykorzystuje stały przepływ laminarny. Konfigurację można dostosować do innych wzorców przepływu, w tym przepływu zakłóconego. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności z utrzymaniem ciągłej monowarstwy komórek przez cały czas trwania eksperymentu i uzyskaniem spójnych wyników między eksperymentami.24 godziny przed analizą należy policzyć ludzkie komórki śródbłonka we wczesnym okresie pasażu i wysiać około 10 do szóstych komórek w jednym mililitrze pożywki na jednym szkiełku szklanym pokrytym fibronektyną na dołek czterodołkowej płytki do hodowli komórek. Pozwól komórkom przylegać do szkiełka przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie przykryj każde szkiełko trzema mililitrami pożywki i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 na 24 godziny.W dniu eksperymentu napełnij tacę na wodę w dużym, ogrzewanym, wbudowanym środowisku regulowanym CO2 i ogrzewaniem lub inkubatorze plażowym z wieloma półkami, wewnętrznym dostępem do energii elektrycznej i szklanymi drzwiami oraz potwierdź, że dostępna jest odpowiednia ilość dwutlenku węgla do eksperymentu i że monitor CO2 jest sprawny. Aby ustawić komorę przepływową, włóż żeńską przynętę 1/8 cala do jednego końca miękkiej rurki o numerze 16 i przymocuj czterokierunkowy kran do przynęty. Przymocuj wolny koniec rurki do strony dopływu górnej płyty i włóż męską przynętę 1/8 cala do jednego końca drugiej miękkiej rurki o numerze 16.Przymocuj czterokierunkowy kran do męskiej przynęty i przymocuj wolny koniec rurki do strony odpływowej górnej płyty. Włóż męską przynętę 1/8 cala i żeńską przynętę 1/8 cala do każdego końca trzeciej miękkiej rurki o numerze 16 i przymocuj rurkę do pułapki bąbelkowej za pomocą męskiej przynęty 1/8 cala. Następnie przymocuj czterokierunkowy kran do drugiego końca rurki za pomocą żeńskiej przynęty.Za pomocą sterylnej pęsety przenieś jedno szkiełko nasienne komórkami do wgłębienia na dolnej płytce, stroną z ziarnami komórek do góry. Użyj strzykawki o pojemności 10 mililitrów, aby dodać 10 mililitrów ciepłego podłoża do dolnej płytki w czerwonej linii uszczelki wokół płytki. Umożliwienie przepływu medium przez szkiełko i zakrycie komórek.Delikatnie umieść górną płytę na dolnej płycie, uważając, aby wyrównać boki i mocno przykręć płytki. Aby usunąć pęcherzyki powietrza z pułapki bąbelkowej, należy najpierw otworzyć kran dopływu i pułapki bąbelkowej, a następnie zamknąć zawór odcinający odpływ. Następnie użyj 30-mililitrowej strzykawki, aby delikatnie przepłukać 20 mililitrów ciepłego podłoża przez płytkę.Aby usunąć pęcherzyki z komory, należy zamknąć zawór odcinający pułapkę bąbelkową i otworzyć zawór odpływowy. Podnieś stronę odpływową komory pod kątem 45 stopni i za pomocą 30-mililitrowej strzykawki delikatnie przepłucz 20 mililitrów ciepłego medium od strony dopływu komory. Ważne jest, aby spłukiwać z odpowiednią szybkością w kierunku przepływu i używać mikroskopu w celu potwierdzenia, że przed wystawieniem komórek na działanie przepływu laminarnego pozostaje zlewająca się monowarstwa komórek.Następnie zamknij kurki po obu stronach komory i nakrętki i upewnij się, że komórki są nadal przymocowane do szkiełka pod mikroskopem świetlnym. Umieść komorę przepływową i wcześniej zmontowany system pętli przepływu na plaży i powoli zmniejszaj prędkość pompy zespołu pętli przepływu przed całkowitym wstrzymaniem pompy. Zamknij kurki w systemie pętli przepływu, aby zapobiec wyciekom i połącz ze sobą komorę i system pętli za pomocą kurków.Gdy wszystkie pętle zostaną połączone, ponownie otwórz wszystkie zawory odcinające i powoli zwiększaj prędkość pompy, jednocześnie monitorując konfigurację pod kątem wycieków lub blokad. Umieść czujnik przepływu na rurce mostka komory po stronie dopływu studzienki z czujnikiem zorientowanym w kierunku przepływu i wyreguluj prędkość pompy, aby uzyskać natężenie przepływu dla interesującego nas współczynnika naprężenia ścinającego. Następnie włącz zbiornik CO2, aby osiągnąć stężenie 5%C02.Po zakończeniu eksperymentalnego okresu przepływu powoli zmniejsz prędkość pompy perystaltycznej do zera i wyłącz zasilanie. Szybko zamknij wszystkie otwarte kurki i przenieś komorę i dołączoną rurkę z kranem z każdej strony na czysty blat stołu. Ostrożnie odkręć wszystkie, aby wyjąć górną płytkę i użyj pęsety igłowej, aby przenieść szklane szkiełko z dolnej płyty na naczynie o średnicy 100 milimetrów.Umyj szkiełko w 10 mililitrach zimnego PBS i sprawdź komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić przyleganie komórek i wyrównanie w kierunku przepływu. Po zassaniu PBS przenieś szkiełko do czystego naczynia o średnicy 100 milimetrów i dodaj 350 mikrolitrów buforu do lizy uzupełnionego 1/100 beta-merkaptoetanolu z zestawu do ekstrakcji RNA do szkiełka. Użyj skrobaka do komórek z polietylenowym ostrzem, aby zeskrobać komórki ze szkiełka i przechylić naczynie do hodowli tkankowych, aby bufor zebrał się na dnie.Za pomocą kleszczyków usuń szkiełko i odpipetuj lizat komórkowy do 1.5 mililitrowej probówki na lodzie. Następnie dodaj 10 mikrolitrów rozcieńczonego RNA lucyferazy do lizatu komórkowego w celu dalszej izolacji RNA i analizy zgodnie ze standardowymi protokołami. Pomyślną linearyzację plazmidu lucyferazy przy użyciu enzymów restrykcyjnych można potwierdzić, uruchamiając strawione produkty na żelu agarozowym, a wielkość zlinearyzowanego produktu można potwierdzić za pomocą drabinek DNA i porównania z nieoszlifowanym plazmidem.Procesy produkcyjne mogą prowadzić do niewielkich zmian wysokości komory, dlatego natężenie przepływu musi być obliczane dla każdej komory, aby osiągnąć takie samo naprężenie ścinające. W eksperymentach obejmujących laminarne naprężenie ścinające w komórkach śródbłonka ssaków, RNA lucyferazy świetlika może być używane jako egzogenny impuls RNA. Normalizacja endogennego genu referencyjnego, egzogennego genu referencyjnego oraz endogennych i egzogennych genów referencyjnych daje podobne wyniki.Warto zauważyć, że w tych reprezentatywnych eksperymentach wykorzystujących dwie jednocześnie pracujące komory przepływowe z naprężeniem ścinającym o wartości jednego pascala dla każdego eksperymentu, knockdown podobny do drugiego czynnika Kruppela za pośrednictwem SI-RNA dał podobną skuteczność knockdown między badanymi próbkami biologicznymi. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o ustaleniu równej warstwy komórek na szkiełku i obfitym zalaniu systemu pętli przepływu przed założeniem komory przepływowej. Zgodnie z tą procedurą, inne metody, takie jak sekwencjonowanie RNA, mogą być stosowane do oceny ekspresji RNA w całym genomie, a inne odczyty, takie jak DNA i białko, mogą być wykorzystywane do dalszej analizy molekularnej.Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią śródbłonka do zbadania związku między naprężeniem ścinającym a potencjałem angiogennym w ludzkich komórkach śródbłonka.

gene-expression-analysis-endothelial-cells-exposed-to-shear-stress

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niniejszy raport przedstawia wizualizację analizy w komorze przepływowej z równoległymi płytkami, służącej do badania oddziaływań leukocytów z śródbłonkiem w warunkach fizjologicznego naprężenia ścinającego. Metoda ta jest szczególnie użyteczna w badaniu roli selektyny E (E-selectin) oraz ligandów selektyny E na leukocytach, które inicjują toczenie się leukocytów po powierzchniach komórek śródbłonka.

Analiza fizjologicznego toczkowania leukocytów zapśredniczonego przez E-selektynę na śródbłonku mikrokrążenia

Opisujemy metodę poddawania przylegających komórek naprężeniom ścinającym w przepływie laminarnym w sterylnym obwodzie przepływu ciągłego. Poprzez przezroczystą komorę można badać adhezję i morfologię komórek, a z obwodu można pobierać próbki do analizy metabolitów oraz zbierać komórki po ekspozycji na siły ścinające do dalszych eksperymentów lub hodowli.

Komora przepływowa z równoległymi płytkami i obwód przepływu ciągłego do oceny komórek progenitorowych śródbłonka pod wpływem naprężenia ścinającego w przepływie laminarnym

Mikrofluidyczne komory przepływowe, wytrawione metodą fotolitografii i wykonane z PDMS, są stosowane do badania wyników funkcjonalnych związanych z dysfunkcją EC i stanem zapalnym. W reprezentatywnym eksperymencie wykazano zdolność różnicowego naprężenia ścinającego do modulowania adhezji komórek monocytarnych do monowarstw EC aktywowanych cytokinami.

Fenotypowanie zapalne śródbłonka na chipie

To badanie wykorzystało wielodołkowy system mikroprzepływowy, znacznie zwiększając przepustowość badań toczenia komórek pod fizjologicznie istotnym przepływem ścinającym. Biorąc pod uwagę znaczenie zwijania komórek w wieloetapowej kaskadzie naprowadzania komórek oraz znaczenie naprowadzania komórek po ogólnoustrojowym dostarczeniu egzogennych populacji komórek u pacjentów, system ten oferuje potencjał jako platforma przesiewowa w celu ulepszenia terapii opartej na komórkach.

Systematyczna analiza walcowania komórek in vitro przy użyciu systemu mikroprzepływowego z wielodołkową płytką

Różne poziomy i wzorce ścinania płynu są znane z modulowania ekspresji genów śródbłonka, fenotypu i podatności na choroby. Omawiamy montaż i zastosowanie "pierścieni ścinających": modelu, który wytwarza jednokierunkowe, okresowe wzorce naprężeń ścinających. Pierścienie ścinane są proste w montażu, ekonomiczne i mogą wytwarzać wysoką wydajność ogniw.

Montaż i zastosowanie "pierścieni ścinających": nowy model śródbłonka dla orbitalnego, jednokierunkowego i okresowego przepływu płynów oraz naprężeń ścinających

Celem tego protokołu jest opisanie zmodyfikowanej równoległej komory przepływowej do wykorzystania w badaniu w czasie rzeczywistym aktywacji mechanowrażliwych kanałów jonowych przez naprężenie ścinające.

Elektrofizjologiczne zapisy prądów jonowych pojedynczych ogniw pod wpływem dobrze zdefiniowanego naprężenia ścinającego

Ten protokół opisuje metodę powlekania w celu ograniczenia wzrostu komórek śródbłonka do określonego obszaru 6-dołkowej płytki w celu przyłożenia naprężeń ścinających przy użyciu modelu wytrząsarki orbitalnej.

Segmentacja wzrostu komórek śródbłonka w 6-dołkowych płytkach na wytrząsarce orbitalnej do badań mechanobiologicznych

Tutaj ustalamy protokół jednoczesnej wizualizacji i analizy wielu kompleksów SMAD za pomocą testu ligacji zbliżeniowej (PLA) w komórkach śródbłonka narażonych na patologiczne i fizjologiczne warunki stresu ścinającego płyny.

Wizualizacja i kwantyfikacja sygnalizacji TGFβ/BMP/SMAD w różnych warunkach naprężeń ścinających płyn przy użyciu testu podligowania zbliżeniowego

Opisujemy protokół izolacji i hodowli ludzkich komórek śródbłonka żyły odpiszczelowej (hSVECs). Udostępniamy również szczegółowe metody wytwarzania naprężeń ścinających i rozciągania w celu zbadania naprężeń mechanicznych w hSVEC.

Izolacja komórek śródbłonka żyły odpiszczelowej człowieka i narażenie na kontrolowane poziomy naprężeń ścinających i rozciągania

Przedstawiamy tutaj protokół do wytworzenia i obsługi układu mikrofluidalnego, który naraża komórki śródbłonka na zsynchronizowany oscylatorny hiperglikemię i pulsujące naprężenia ścinające. Takie podejście zapewnia fizjologicznie istotny in vitro model do badania cukrzycowej dysfunkcji śródbłonka. Ten protokół umożliwia ilościowe pomiary stresu oksydacyjnego i reakcji komórek śródbłonka.

System mikrofluidyczny do modelowania dysfunkcji endotelialnych w warunkach połączonego fizjologicznego pulsującego stresu ścinającego i oscylacyjnej hiperglikemii

Poznaj metodę analizy ekspresji genów komórek śródbłonka pod wpływem naprężeń ścinających przy użyciu wielu komór przepływowych. System umożliwia jednoczesne badanie różnych warunków przepływu.

Analiza ekspresji genów komórek śródbłonka narażonych na naprężenia ścinające przy użyciu wielu komór przepływowych z równoległą płytką (Wideo) | JoVE Journal

Analiza ekspresji genów komórek śródbłonka narażonych na naprężenia ścinające przy użyciu wielu komór przepływowych z równoległą płytką

Przeglądaj więcej filmów