Name: Przygotowanie wycinków ostrego rdzenia kręgowego do zapisu całokomórkowego patch-clamp w neuronach istoty żelatynowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Poznaj metodę patch-clamp w wycinkach rdzenia kręgowego do badania neuronów istoty żelatynowej. Technika ta umożliwia analizę właściwości błonowych i transmisji synaptycznej kluczowej dla mechanizmów bólu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 81560198, 31660289).

Wszystkie opisane protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Uniwersytetu Nanchang (Nanchang, PR China, Ethical No.2017-010). Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować stres i ból zwierząt doświadczalnych. Wykonane tu zapisy elektrofizjologiczne prowadzono w temperaturze pokojowej (RT, 22–25 °C).
1. Zwierzęta
<ol>
	<li>Używaj szczurów Sprague-Dawley (w wieku 3-5 tygodni) dowolnej płci. Zwierzęta trzymane są w 12-godzinnym cyklu światło-ciemność i zapewniają im ad libitum dostęp do odpowiedniej ilości pożywienia i wody.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworów i materiałów
<ol>
	<li>Rozwiązania
	<ol>
		<li>Przygotować sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF) (w mM): 117 NaCl, 3,6 KCl, 1,2 NaH2PO4·2H2O, 2,5 CaCl2·2H2O, 1,2 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, 11 D-glukoza, 0,4 kwas askorbinowy i 2 pirogronian sodu. Patrz tabela 1.</li>
		<li>Przygotować sacharozę-ACSF (w mM): 240 Sacharoza, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4·2H2O, 0,5 CaCl2·2H2O, 3,5 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, 0,4 Kwas askorbinowy i 2 pirogronian sodu. Patrz tabela 2.</li>
		<li>Przygotuj roztwór wewnątrzkomórkowy na bazie K+ (w mM): 130 K-glukonian, 5 KCl, 10 Na 2-fosfokreatyna, 0,5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP i 0,3 Li-GTP. Patrz tabela 3.</li>
		<li>Przygotować roztwór wewnątrzkomórkowy na bazie Cs+ (w mM): 92 CsMeSO4, 43 CsCl, 10 Na 2-fosfokreatyna, 5 tetraetyloamonu (TEA)-Cl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP i 0,3 Li-GTP. Patrz tabela 4. 
		Uwaga: Wszystkie roztwory należy przygotować przy użyciu wody destylowanej. ACSF i sacharoza-ACSF powinny być karbonogenowane (mieszanina 95%O2 i 5% CO2 ) przed użyciem w celu utrzymania optymalnego pH około 7,4, a osmolalność tych dwóch roztworów należy dostosować do 300–310 mOsm. Ponieważ kwas askorbinowy może wpływać na kanały wapniowe, środek ten należy pominąć, jeśli chce się rejestrować prądy wapniowe. Osmolalność i pH roztworów wewnątrzkomórkowych należy zmierzyć i dostosować odpowiednio do 290–300 mOsm i 7,2–7,3. Zaleca się filtrowanie roztworów wewnątrzkomórkowych za pomocą filtrów 0,2 μm i przechowywanie roztworów w postaci 1 ml podwielokrotności w temperaturze -20 °C. Cs+ i TEA stosuje się w roztworze wewnątrzkomórkowym na bazie Cs+ w celu zablokowania kanału potasowego, co sprzyja wykorzystaniu wzmacniacza do utrzymywania potencjału błonowego na stałym poziomie 0 mV podczas rejestrowania hamujących prądów postsynaptycznych (IPSC).</li>
		<li>Przygotuj 0,05% roztwór neurobiotyny 488. Rozpuść 2 mg neurobiotyny 488 w 4 ml roztworu wewnątrzkomórkowego na bazie K+ i dostosuj osmolalność do 290–300 mOsm, używając wody destylowanej lub sacharozy, jeśli to konieczne. 
		Uwaga: 1 mM sacharozy zwiększa osmolarność o 1 mOsm.</li>
		<li>Przygotuj 3% agar jako blok na rdzeń kręgowy. Rozpuść 7,5 g agaru w 250 ml oczyszczonej wody w szklanej zlewce, a następnie podgrzej go w kuchence mikrofalowej, aż się zagotuje i będzie klarowny. Zamieszaj roztwór i wlej mieszaninę do plastikowego pudełka o wymiarach 17,5 cm x 10,5 cm x 1,8 cm w celu zestalenia. Przed użyciem należy przechowywać agar w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotować 4% paraformaldehydu (PFA) do przetwarzania immunohistochemicznego. Wymieszaj 40 g proszku PFA z ~800 ml podgrzanego (około 60 °C) 1x roztwór PBS (130 mM NaCl, 7 mM Na2HPO4, 3 mM NaH2PO4). Powoli dostosuj pH, dodając 1 N kropli NaOH, aż proszek PFA całkowicie się rozpuści. Gdy roztwór stanie się klarowny, dostosuj całkowitą objętość do 1 l za pomocą 1x PBS. W razie potrzeby ponownie dostosuj pH do 7,2–7,4 za pomocą 1 N HCl, a następnie przefiltruj 4% roztwór PFA i przechowuj go w temperaturze -20 °C do momentu użycia. 
		Uwaga: PFA jest toksyczny, dlatego należy nosić maski, rękawiczki, a także okulary ochronne. Przeprowadź proces przygotowania 4% PFA w wentylowanym kapturze. Proszek PFA można całkowicie rozpuścić przy pH około 9–10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instrumentów
	<ol>
		<li>W przypadku typowego systemu elektrofizjologicznego należy użyć mikroskopu pionowego wyposażonego w kontrast różnicowy interferencji w podczerwieni (IR-DIC) i obiektyw zanurzeniowy o wysokiej rozdzielczości, kamerę CCD/CMOS, wzmacniacz patch-clamp, uchwyt na mikropipety i mikromanipulator umożliwiający precyzyjną regulację pozycji pipety. Stolik XY jest również potrzebny do poruszania mikroskopem.</li>
		<li>Zamontuj wszystkie urządzenia na stole wibroizolacyjnym otoczonym klatką Faradaya. Podłącz monitor wideo do kamery wideo, aby obserwować neurony i wizualizować mikropipety.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mikropipety
	<ol>
		<li>Wykonaj elektrody rejestrujące z kapilar ze szkła borokrzemianowego za pomocą ściągacza do mikropipet. Typowa rezystancja pipety waha się od 3 do 6 MΩ po napełnieniu roztworem wewnątrzkomórkowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Blok agaru
	<ol>
		<li>Przygotuj blok agaru o wymiarach 1,2 cm x 1,5 cm x 2,0 cm. Przytnij blok do kształtów pokazanych w Rysunek 1 zgodnie z wymaganiami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie ostrego odcinka rdzenia kręgowego
Uwaga: Poprzeczne lub przystrzałkowe przekroje rdzenia kręgowego są przygotowywane zgodnie z wcześniejszym opisem18,19,20.
<ol>
	<li>Przed perfuzją przezsercową i ekstrakcją rdzenia kręgowego należy przygotować ~500 ml sacharozy-ACSF zrównoważonej 95%O2 i 5% CO2 i schłodzić roztwór do lodowatości (0–4 °C).</li>
	<li>Ostudzić wszystkie narzędzia preparacyjne (np. nożyczki preparacyjne, nożyczki do tęczówki, kleszcze zębate, kleszcze drobnoziarniste, kleszcze zakrzywione) na lodzie. Schemat przygotowania ostrego wycinka rdzenia kręgowego jest pokazany na Rysunek 1.</li>
	<li>Perfuzja przezsercowa
	<ol>
		<li>Po pojedynczym wstrzyknięciu (dootrzewnowym, i.p.) uretanu (1,5 g/kg) odczekaj 2-3 minuty i oceń głębokość znieczulenia szczurów, testując reakcje szczypania palców u nóg lub ogonów. Po utrzymaniu chirurgicznej płaszczyzny znieczulenia należy umieścić szczura na kruszonym lodzie w pozycji leżącej. 
		Uwaga: Aby uzyskać głębokie znieczulenie wystarczające do nieodczuwania bólu podczas torakotomii, postępuj zgodnie z lokalnymi wytycznymi IACUC.</li>
		<li>Wykonaj nacięcie (3–4 cm) przez skórę od wyrostka mieczykowatego do obojczyka, a następnie wykonaj poprzeczne nacięcie poniżej poziomu wyrostka mieczykowatego.</li>
		<li>Chwyć i podnieś wyrostek mieczykowaty za pomocą pary zakrzywionych kleszczy, aby całkowicie odsłonić przeponę. Wykonaj poprzeczne nacięcie przez przeponę, a następnie przeciąć klatkę piersiową między mostkiem a żebrami obustronnie, aby otworzyć jamę klatki piersiowej. Użyj zakrzywionych kleszczy, aby uchwycić wyrostek mieczykowaty, tak aby klatka piersiowa była zamocowana, a serce było wystarczająco odsłonięte.</li>
		<li>Delikatnie przytrzymaj serce za pomocą kolejnych zakrzywionych kleszczy, a następnie wprowadź igłę 22 G przez lewą komorę do podstawy łuku aorty.</li>
		<li>Natychmiast przetnij prawy przedsionek cienkimi nożyczkami, a następnie rozpocznij perfuzję lodowatego, natlenionego sacharozy-ACSF przez system grawitacyjny. 
		Uwaga: Szybka i wystarczająca perfuzja przezsercowa z lodowatą sacharozą-ACSF może ułatwić szybkie chłodzenie rdzenia kręgowego, podczas gdy niskie stężenie sodu i wapnia może pomóc złagodzić toksyczność pobudzającą i chronić funkcje neuronów. Ponadto usunięcie czerwonych krwinek byłoby korzystne dla zmniejszenia barwienia tła biocytyny podczas wykonywania badania morfologicznego. Perfuzja jest uważana za wystarczającą i zaspokojoną, o ile płyn wychodzący z prawego przedsionka jest przezroczysty, a kolor wątroby i łap szczura jest blady. Końcówka igły 22 G powinna być, aby uniknąć pęknięcia serca i łuku aorty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wypreparowanie i cięcie rdzenia kręgowego
	<ol>
		<li>Wykonaj podłużne nacięcie (5 cm) na skórze grzbietu od ogona do rostralu, a następnie przeciąć klatkę piersiową między kręgosłupem a żebrami po obu stronach w stanie perfuzji.</li>
		<li>Wykonaj cięcie na ogonowym końcu kręgosłupa, użyj nożyczek, aby odciąć otaczające tkanki i szybko odizoluj odcinek lędźwiowo-krzyżowy kręgosłupa.</li>
		<li>Przenieść odcinek lędźwiowo-krzyżowy do szklanego naczynia zawierającego lodowaty ACSF na bazie sacharozy. Trzymając brzuszną stronę do góry, użyj cienkich nożyczek, aby obustronnie przeciąć szypułkę kręgów i ostrożnie odsłonić rdzeń kręgowy. Wyizolować rdzeń kręgowy o długości 2 cm z powiększeniem lędźwiowo-krzyżowym (L1–S3) i przenieść odcinek kręgosłupa do innego szklanego naczynia wypełnionego zimną sacharozą-ACSF.</li>
		<li>Usuń opony mózgowe i błonę pajęczynówkowo-pajęczynówkową pod mikroskopem preparacyjnym. Odetnij wszystkie korzenie brzuszne i grzbietowe tak szybko, jak to możliwe.</li>
		<li>Umieść rdzeń kręgowy na wcześniej przyciętym bloku agaru. Aby przygotować poprzeczne plastry, przymocuj brzuszną stronę rdzenia kręgowego do agaru i pozwól stronie grzbietowej w kierunku ostrza. Aby przygotować plastry przystrzałkowe, przymocuj stronę brzuszną za pomocą superglue do agaru w kierunku pionowym, jak pokazano na Rysunek 1. Następnie zamontuj blok agaru na platformie wibratomu za pomocą superglue. Przygotuj plastry poprzeczne lub przystrzałkowe o grubości 300–500 μm z prędkością posuwu 0,025 mm/s i częstotliwością drgań 80 Hz.</li>
		<li>Użyj pipety z plastikowym wykończeniem, aby przenieść plastry na nylonową siatkę w komorze magazynowej zawierającej stale natleniony ACSF w temperaturze 32 °C przez co najmniej 30 minut przed zapisem. 
		Uwaga: Należy uważać, aby uniknąć uszkodzenia rdzenia kręgowego, zwłaszcza rogu grzbietowego, podczas usuwania opon mózgowych i korzeni rdzeniowych. Rdzeń kręgowy należy przeciąć grzbietowo-brzusznie. Aby uzyskać najlepsze rezultaty, plastry należy przygotować szybko (w ciągu 15–20 minut). Grubość wycinka kręgosłupa nie powinna przekraczać 600 μm, aby zapewnić widoczność komórek. Ponadto opisana powyżej technika może być wykorzystana do uzyskania poziomych wycinków kręgosłupa.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Nagrania z całego ogniwa
<ol>
	<li>Aby przeprowadzić zapisy całokomórkowe patch-clamp z neuronów SG, użyj roztworu wewnątrzkomórkowego opartego na K + w większości przypadków zapisu, podczas gdy roztwór na bazie Cs + stosuje się tylko do nagrywania hamujących prądów postsynaptycznych.</li>
	<li>Delikatnie przesuń plasterek rdzenia kręgowego do komory nagrywania, a następnie utrzymuj go za pomocą platynowego drutu w kształcie litery U, mocno przymocowanego nylonowymi gwintami, aby zapewnić optymalną stabilność cięcia. Równomiernie perfunduj plasterek z bąbelkowym ACSF w temperaturze RT przez system grawitacyjny i ustaw szybkość perfuzji na 2-4 ml / min, aby uzyskać wystarczające natlenienie.</li>
	<li>Zidentyfikuj obszar SG (półprzezroczyste pasmo) za pomocą soczewki mikroskopu o niskiej rozdzielczości, wybierz zdrowy neuron, używając obiektywu o wysokiej rozdzielczości jako komórki docelowej i dostosuj go do środka ekranu monitora wideo.</li>
	<li>W razie potrzeby napełnij mikropipetę odpowiednią objętością roztworu wewnątrzkomórkowego na bazie K+ lub Cs+, włóż mikropipetę do uchwytu elektrody i upewnij się, że roztwór wewnątrzkomórkowy styka się ze srebrnym drutem wewnątrz uchwytu.</li>
	<li>Ustaw ostrość mikropipety i zanurz ją w ACSF za pomocą mikromanipulatora, a następnie zastosuj łagodne nadciśnienie (~1 psi przy pomiarze manometrem), aby odsunąć mikropipetę od wszelkich zabrudzeń i zanieczyszczeń.</li>
	<li>Stopniowo przesuwaj mikropipetę w kierunku docelowego neuronu. Zwolnij dodatnie ciśnienie, gdy pipeta zbliży się do neuronu, a na błonie neuronalnej utworzy się bardzo mały wgłębienie, tworząc gigaseal.</li>
	<li>Zmień potencjał utrzymywania na -70 mV, który jest zbliżony do fizjologicznego spoczynkowego potencjału błonowego (RMP) komórki. Następnie zastosuj przejściowe i delikatne ssanie do mikropipety, aby rozerwać membranę i stworzyć dobrą konfigurację całych komórek. 
	Uwaga: Po przeniesieniu plastra do komory nagrywającej należy zapewnić stałą perfuzję przez co najmniej 5 minut, aby usunąć zanieczyszczenia z powierzchni plastra. Warto zauważyć, że zdolność do rozróżniania zdrowych i niezdrowych/martwych neuronów ma ogromne znaczenie dla dobrego uszczelnienia i stabilnego zapisu. Niezdrowy/martwy neuron ma spuchnięty lub skurczony wygląd, wraz z widocznym dużym jądrem, podczas gdy zdrowy neuron charakteryzuje się trójwymiarowym (3D) kształtem z jasną i gładką błoną, a jego jądro jest niewidoczne. Aby uzyskać konfigurację całego ogniwa, w razie potrzeby należy krok po kroku kompensować szybką lub wolną pojemność. W RT potencjał złącza cieczy oblicza się na 15,1–15,2 mV i 4,3–4,4 mV odpowiednio w roztworze wewnątrzkomórkowym opartym na K+ i Cs+. W naszych badaniach zarejestrowane dane nie zostały skorygowane o potencjał złącza cieczy.</li>
	<li>Zapisy wewnętrznych właściwości błony
	<ol>
		<li>Rejestruj pasywne właściwości membrany wewnętrznej: Rejestruj RMP natychmiast (w ciągu 20 s) po włamaniu. Określ rezystancję wejściową neuronów, mierząc odpowiedź napięciową na prąd depolaryzujący (10 pA, 500 ms) przy RMP w trybie cęgów prądowych.</li>
		<li>Zapisz właściwości wypalania: Przetestuj wzorzec wypalania każdego neuronu w cęgach prądowych za pomocą serii 1 s depolaryzujących impulsów prądu (25–150 pA z przyrostem 25 pA) przy RMP. Zmierz próg, amplitudę i połowę szerokości pojedynczego potencjału czynnościowego w trybie offline.</li>
		<li>Rejestruj prąd podprogowy: Aby ocenić somatyczne prądy podprogowe, utrzymuj potencjał membrany na poziomie -50 mV w trybie cęgów napięciowych. Następnie zastosuj serię hiperpolaryzujących impulsów napięcia o czasie trwania 1 s od -60 mV do -120 mV, z redukcją o 10 mV.</li>
		<li>Rejestruj pobudzające prądy postsynaptyczne (EPSC): Rejestruj EPSC za pomocą roztworu wewnątrzkomórkowego na bazie K+ w trybie zacisku napięcia przy potencjale podtrzymania -70 mV.</li>
		<li>Nagrywaj IPSC: Zastosuj rozwiązanie wewnątrzkomórkowe oparte na Cs+ do rejestrowania IPSC. Po ustaleniu konfiguracji całego ogniwa utrzymuj potencjał błony na poziomie -70 mV przez ~5 minut, a następnie stopniowo zmieniaj potencjał utrzymywania na 0 mV. Poczekaj kilka minut na stabilizację, a następnie rozpocznij nagrywanie zdarzeń IPSC. 
		Uwaga: Do dalszych badań powinny być wybierane tylko neurony o RMP mniejszym niż -50 mV i wykazujące przeregulowanie. Rezystancje szeregowe w naszym badaniu wynoszą zazwyczaj 10-30 MΩ i zapis powinien zostać wykluczony, gdy rezystancja szeregowa zmieni się o więcej niż 20%. EPSC można potwierdzić za pomocą kąpieli 50 μM APV i 20 μM CNQX, podczas gdy IPSC można potwierdzić za pomocą 10 μM bicukuliny i 1 μM strychniny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Badanie morfologiczne
<ol>
	<li>Do eksperymentów morfologicznych należy użyć roztworu wewnątrzkomórkowego na bazie K+ zawierającego 0,05% neurobiotyny 488.</li>
	<li>Po utrzymaniu stabilnego zapisu elektrofizjologicznego przez co najmniej 20 minut, powoli wyjmij mikropipetę w kierunku do góry, aby umożliwić ponowne uszczelnienie błony komórkowej i przeniesienie wycinka rdzenia kręgowego do pojemnika wypełnionego 4% PFA. Utrwal plastry w 4% PFA w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a następnie w temperaturze 4°C przez noc.</li>
	<li>Opłucz plastry w PBS, a następnie zanurz je w 50% etanolu na 30 minut. Po kolejnych trzech myciach w PBS zamontuj plastry w ich pierwotnej grubości na szkiełkach z podłożem montażowym.</li>
	<li>Użyj mikroskopu konfokalnego (patrz tabela materiałów) do akwizycji obrazu i neuronalnej rekonstrukcji 3D. Skanuj neurony przez soczewkę 20X ze stosem z osią Z 1,5 μm.</li>
</ol>

<ol><li>Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+circuitry+for+pain+processing+in+the+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).</li>
<li>Yoshimura, M., Nishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blind+patch-clamp+recordings+from+substantia+gelatinosa+neurons+in+adult+rat+spinal+cord+slices%3A+pharmacological+properties+of+synaptic+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Blind patch-clamp recordings from substantia gelatinosa neurons in adult rat spinal cord slices: pharmacological properties of synaptic currents.</a> Neuroscience. 53 (2), 519-526 (1993).</li>
<li>Maxwell, D. J., Belle, M. D., Cheunsuang, O., Stewart, A., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+inhibitory+and+excitatory+interneurons+in+superficial+laminae+of+the+rat+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology.+584+%28Pt%22%5BJournal%5D)">Morphology of inhibitory and excitatory interneurons in superficial laminae of the rat dorsal horn.</a> The Journal of Physiology. 584 (Pt. 2, 521-533 (2007).</li>
<li>Grudt, T. J., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlations+between+neuronal+morphology+and+electrophysiological+features+in+the+rodent+superficial+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Correlations between neuronal morphology and electrophysiological features in the rodent superficial dorsal horn.</a> The Journal of Physiology. 540 (Pt 1), 189-207 (2002).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+feed-forward+spinal+cord+glycinergic+neural+circuit+gates+mechanical+allodynia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">A feed-forward spinal cord glycinergic neural circuit gates mechanical allodynia.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (9), 4050-4062 (2013).</li>
<li>Zheng, J., Lu, Y., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+neurones+of+the+spinal+substantia+gelatinosa+mediate+interaction+of+signals+from+primary+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Inhibitory neurones of the spinal substantia gelatinosa mediate interaction of signals from primary afferents.</a> The Journal of Physiology. 588 (Pt 12), 2065-2075 (2010).</li>
<li>Balasubramanyan, S., Stemkowski, P. L., Stebbing, M. J., Smith, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sciatic+chronic+constriction+injury+produces+cell-type-specific+changes+in+the+electrophysiological+properties+of+rat+substantia+gelatinosa+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Sciatic chronic constriction injury produces cell-type-specific changes in the electrophysiological properties of rat substantia gelatinosa neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96 (2), 579-590 (2006).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+signal-regulated+kinase+%28ERK%29+activation+is+required+for+itch+sensation+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Extracellular signal-regulated kinase (ERK) activation is required for itch sensation in the spinal cord.</a> Molecular Brain. 7, 25(2014).</li>
<li>Kopach, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+alters+trafficking+of+extrasynaptic+AMPA+receptors+in+tonically+firing+lamina+II+neurons+of+the+rat+spinal+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Inflammation alters trafficking of extrasynaptic AMPA receptors in tonically firing lamina II neurons of the rat spinal dorsal horn.</a> Pain. 152 (4), 912-923 (2011).</li>
<li>Takasu, K., Ono, H., Tanabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+cation+channels+at+primary+afferent+terminals+contribute+to+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Spinal hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channels at primary afferent terminals contribute to chronic pain.</a> Pain. 151 (1), 87-96 (2010).</li>
<li>Iura, A., Takahashi, A., Hakata, S., Mashimo, T., Fujino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductions+in+tonic+GABAergic+current+in+substantia+gelatinosa+neurons+and+GABAA+receptor+delta+subunit+expression+after+chronic+constriction+injury+of+the+sciatic+nerve+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Reductions in tonic GABAergic current in substantia gelatinosa neurons and GABAA receptor delta subunit expression after chronic constriction injury of the sciatic nerve in mice.</a> European Journal of Pain. 20 (10), 1678-1688 (2016).</li>
<li>Alles, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve+injury+increases+contribution+of+L-type+calcium+channels+to+synaptic+transmission+in+spinal+lamina+II%3A+Role+of+alpha2delta-1+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pain%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve injury increases contribution of L-type calcium channels to synaptic transmission in spinal lamina II: Role of alpha2delta-1 subunits.</a> Molecular Pain. 14, 1-12 (2018).</li>
<li>Santos, S. F., Rebelo, S., Derkach, V. A., Safronov, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+interneurons+dominate+sensory+processing+in+the+spinal+substantia+gelatinosa+of+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Excitatory interneurons dominate sensory processing in the spinal substantia gelatinosa of rat.</a> The Journal of Physiology. 581 (Pt 1), 241-254 (2007).</li>
<li>Lu, Y., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+organization+of+excitatory+circuits+between+neurons+of+the+spinal+superficial+dorsal+horn+%28laminae+I+and+II%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modular organization of excitatory circuits between neurons of the spinal superficial dorsal horn (laminae I and II).</a> The Journal of Neuroscience. 25 (15), 3900-3907 (2005).</li>
<li>Hantman, A. W., van den Pol, A. N., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+physiological+features+of+a+set+of+spinal+substantia+gelatinosa+neurons+defined+by+green+fluorescent+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Morphological and physiological features of a set of spinal substantia gelatinosa neurons defined by green fluorescent protein expression.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (4), 836-842 (2004).</li>
<li>Yasaka, T., Tiong, S. Y., Hughes, D. I., Riddell, J. S., Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Populations+of+inhibitory+and+excitatory+interneurons+in+lamina+II+of+the+adult+rat+spinal+dorsal+horn+revealed+by+a+combined+electrophysiological+and+anatomical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Populations of inhibitory and excitatory interneurons in lamina II of the adult rat spinal dorsal horn revealed by a combined electrophysiological and anatomical approach.</a> Pain. 151 (2), 475-488 (2010).</li>
<li>Yin, H., Park, S. A., Han, S. K., Park, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+5-hydroxytryptamine+on+substantia+gelatinosa+neurons+of+the+trigeminal+subnucleus+caudalis+in+immature+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of 5-hydroxytryptamine on substantia gelatinosa neurons of the trigeminal subnucleus caudalis in immature mice.</a> Brain Research. 1368, 91-101 (2011).</li>
<li>Hu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lidocaine+Inhibits+HCN+Currents+in+Rat+Spinal+Substantia+Gelatinosa+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesia+and+Analgesia%22%5BJournal%5D)">Lidocaine Inhibits HCN Currents in Rat Spinal Substantia Gelatinosa Neurons.</a> Anesthesia and Analgesia. 122 (4), 1048-1059 (2016).</li>
<li>Peng, H. Z., Ma, L. X., Lv, M. H., Hu, T., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minocycline+enhances+inhibitory+transmission+to+substantia+gelatinosa+neurons+of+the+rat+spinal+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Minocycline enhances inhibitory transmission to substantia gelatinosa neurons of the rat spinal dorsal horn.</a> Neuroscience. 319, 183-193 (2016).</li>
<li>Peng, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+presynaptic+HCN+channels+to+excitatory+inputs+of+spinal+substantia+gelatinosa+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Contribution of presynaptic HCN channels to excitatory inputs of spinal substantia gelatinosa neurons.</a> Neuroscience. 358, 146-157 (2017).</li>
<li>Liu, N., Zhang, D., Zhu, M., Luo, S., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minocycline+inhibits+hyperpolarization-activated+currents+in+rat+substantia+gelatinosa+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Minocycline inhibits hyperpolarization-activated currents in rat substantia gelatinosa neurons.</a> Neuropharmacology. 95, 110-120 (2015).</li>
<li>Brown, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+whole-cell+recording+from+visually+preselected+neurons+of+perirhinal+cortex+in+brain+slices+from+young+and+aging+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats.</a> Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).</li>
<li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> The Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li>
<li>Rice, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+ascorbate+in+the+preparation+and+maintenance+of+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of ascorbate in the preparation and maintenance of brain slices.</a> Methods. 18 (2), 144-149 (1999).</li>
<li>Takasu, K., Ogawa, K., Minami, K., Shinohara, S., Kato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury-specific+functional+alteration+of+N-type+voltage-gated+calcium+channels+in+synaptic+transmission+of+primary+afferent+C-fibers+in+the+rat+spinal+superficial+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Injury-specific functional alteration of N-type voltage-gated calcium channels in synaptic transmission of primary afferent C-fibers in the rat spinal superficial dorsal horn.</a> European Journal of Pharmacology. 772, 11-21 (2016).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+synaptic+transmission+in+the+spinal+substantia+gelatinosa+is+under+an+inhibitory+tone+of+endogenous+adenosine%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Excitatory synaptic transmission in the spinal substantia gelatinosa is under an inhibitory tone of endogenous adenosine.</a> Neuroscience Letters. 477 (1), 28-32 (2010).</li>
<li>Funai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+dexmedetomidine+augments+inhibitory+synaptic+transmission+in+the+superficial+dorsal+horn+through+activation+of+descending+noradrenergic+control%3A+an+in+vivo+patch-clamp+analysis+of+analgesic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Systemic dexmedetomidine augments inhibitory synaptic transmission in the superficial dorsal horn through activation of descending noradrenergic control: an in vivo patch-clamp analysis of analgesic mechanisms.</a> Pain. 155 (3), 617-628 (2014).</li>
<li>Yamasaki, H., Funai, Y., Funao, T., Mori, T., Nishikawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+tramadol+on+substantia+gelatinosa+neurons+in+the+rat+spinal+cord%3A+an+in+vivo+patch-clamp+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effects of tramadol on substantia gelatinosa neurons in the rat spinal cord: an in vivo patch-clamp analysis.</a> PLoS One. 10 (5), e0125147(2015).</li>
<li>Furue, H., Narikawa, K., Kumamoto, E., Yoshimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsiveness+of+rat+substantia+gelatinosa+neurones+to+mechanical+but+not+thermal+stimuli+revealed+by+in+vivo+patch-clamp+recording%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Responsiveness of rat substantia gelatinosa neurones to mechanical but not thermal stimuli revealed by in vivo patch-clamp recording.</a> The Journal of Physiology. 521 (Pt 2), 529-535 (1999).</li>
<li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+brain+slice+methods+for+adult+and+aging+animals%3A+application+of+targeted+patch+clamp+analysis+and+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics.</a> Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).</li>
<li>Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Acute+Brain+Slices+Using+an+Optimized+N-Methyl-D-glucamine+Protective+Recovery+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e53825(2018).</li>
<li>Li, J., Baccei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+Tissue+Damage+Promotes+Spike+Timing-Dependent+Synaptic+Long-Term+Potentiation+in+Adult+Spinal+Projection+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neonatal Tissue Damage Promotes Spike Timing-Dependent Synaptic Long-Term Potentiation in Adult Spinal Projection Neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (19), 5405-5416 (2016).</li>
<li>Ford, N. C., Ren, D., Baccei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NALCN+channels+enhance+the+intrinsic+excitability+of+spinal+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">NALCN channels enhance the intrinsic excitability of spinal projection neurons.</a> Pain. , (2018).</li>
<li>Cui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+synaptic+transmission+from+primary+afferents+to+spinal+substantia+gelatinosa+neurons+by+group+III+mGluRs+in+GAD65-EGFP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Modulation of synaptic transmission from primary afferents to spinal substantia gelatinosa neurons by group III mGluRs in GAD65-EGFP transgenic mice.</a> Journal of Neurophysiology. 105 (3), 1102-1111 (2011).</li>
<li>Yang, K., Ma, R., Wang, Q., Jiang, P., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optoactivation+of+parvalbumin+neurons+in+the+spinal+dorsal+horn+evokes+GABA+release+that+is+regulated+by+presynaptic+GABAB+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Optoactivation of parvalbumin neurons in the spinal dorsal horn evokes GABA release that is regulated by presynaptic GABAB receptors.</a> Neuroscience Letters. , 55-59 (2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Protokół ten szczegółowo opisuje etapy przygotowania wycinków rdzenia kręgowego, które z powodzeniem zastosowaliśmy podczas wykonywania eksperymentów z klamrą całokomórkową na neuronach SG 18,19,20,21. Wdrażając tę metodę, niedawno informowaliśmy, że minocyklina, druga generacja tetracykliny, może znacznie zwiększyć hamujące przekaźnictwo synaptyczne poprzez mechanizm presynaptyczny w neuronach...

Substantia gelatinosa (SG, blaszka II rogu grzbietowego kręgosłupa) jest bezsprzecznie ważnym centrum przekaźnikowym do przekazywania i regulowania informacji sensorycznych. Składa się z interneuronów pobudzających i hamujących, które otrzymują dane wejściowe z pierwotnych włókien doprowadzających, lokalnych interneuronów i endogennego zstępującego układu hamującego1. W ostatnich dziesięcioleciach rozwój ostrego preparatu do cięcia rdzenia kręgowego i pojawienie się zapisu całokomórkowego patch-clamp umożliwiły różne badania nad wewnętrznymi właściwościami elektrofizjologicznymi i morfologicznymi neuronów SG2,3,4, a także badania obwodów lokalnych w SG5,6. Ponadto, korzystając z preparatu do badania rdzenia kręgowego in vitro, naukowcy mogą interpretować zmiany w pobudliwości neuronów7,8, funkcja kanałów jonowych9,10, oraz aktywności synaptyczne11,12 w różnych stanach patologicznych. Badania te pogłębiły naszą wiedzę na temat roli, jaką neurony SG odgrywają w rozwoju i utrzymywaniu przewlekłego bólu i swędzenia neuropatycznego.
Zasadniczo, kluczowym warunkiem uzyskania przejrzystej wizualizacji somy neuronalnej i idealnego łatania całych komórek za pomocą ostrych wycinków rdzenia kręgowego jest zapewnienie doskonałej jakości wycinków, dzięki czemu można uzyskać zdrowe i łatane neurony. Jednak przygotowanie wycinków rdzenia kręgowego obejmuje kilka etapów, takich jak wykonanie laminektomii brzusznej i usunięcie błony pajęczynówki, które mogą stanowić przeszkodę w uzyskaniu zdrowych plastrów. Chociaż przygotowanie wycinków rdzenia kręgowego nie jest łatwe, wykonywanie nagrań in vitro na wycinkach rdzenia kręgowego ma kilka zalet. W porównaniu z preparatami do hodowli komórkowych, wycinki rdzenia kręgowego mogą częściowo zachować nieodłączne połączenia synaptyczne, które są w fizjologicznie istotnym stanie. Ponadto zapis całej komórki patch-clamp za pomocą wycinków rdzenia kręgowego można połączyć z innymi technikami, takimi jak double patch clamp13,14, badania morfologiczne15,16 i jednokomórkowy RT-PCR17. Dlatego technika ta dostarcza więcej informacji na temat charakterystyki anatomicznej i genetycznej różnorodności w określonym regionie i pozwala na badanie składu obwodów lokalnych.
Tutaj podajemy podstawowy i szczegółowy opis naszej metody przygotowania ostrych wycinków rdzenia kręgowego i pozyskiwania zapisów całokomórkowych krostek z neuronów SG.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>Służy do przygotowania ACSF i PBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>60130</td><td>Służy do przygotowania wewnątrzkomórkowego roztworu na bazie ACSF, sacharozy-ACSF i K+</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; 2H2O</td><td>Sigma</td><td>71500</td><td>Służy do przygotowania ACSF, sacharozy-ACSF i PBS</td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td>Stosowany do przygotowania ACSF i sacharozy-ACSF</td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td>Używany do wytwarzania ACSF i sacharozy-ACSF</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Używany do wytwarzania ACSF i sacharozy-ACSF</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>Używany do wytwarzania ACSF</td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma</td><td>P5280</td><td>Używany do wytwarzania ACSF i sacharozy-ACSF</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma</td><td>A7631</td><td>Stosowany do wytwarzania ACSF i sacharozy-ACSF</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td>Używany do przygotowania sacharozy-ACSF</td></tr><tr><td>K-glukonian</td><td>Wako</td><td>169-11835</td><td>Używany do przygotowania roztworu wewnątrzkomórkowego na bazie K+</td></tr><tr><td>Na2-Fosfokreatyna</td><td>Sigma</td><td>P1937</td><td>Służy do przygotowania roztworu wewnątrzkomórkowego</td></tr><tr><td>EGTA</td><td></td><td>Sigma E3889</td><td>Służy do przygotowania roztworu wewnątrzkomórkowego</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>Służy do przygotowania roztworu wewnątrzkomórkowego</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td>Służy do przygotowania roztworu wewnątrzkomórkowego</td></tr><tr><td>Li-GTP</td><td>Sigma</td><td>G5884</td><td>Służy do przygotowania roztwór wewnątrzkomórkowy</td></tr><tr><td>CsMeSO4</td><td>Sigma</td><td>C1426</td><td>Służy do przygotowania roztworu wewnątrzkomórkowego na bazie Cs+</td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Sigma</td><td>C3011</td><td>Służy do przygotowania roztworu wewnątrzkomórkowego na bazie Cs+</td></tr><tr><td>TEA-Cl</td><td>Sigma</td><td>T2265</td><td>Służy do przygotowania wewnątrzkomórkowego roztworu na bazie Cs+ roztwór</td></tr><tr><td>Neurobiotyna 488</td><td>Wektor</td><td>SP-1145</td><td>0,05% neurobiotyna 488 może być stosowana do badań morfologicznych</td></tr><tr><td>W naszym protokole zastosowano 3% blok agarowy</td><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A7002</td> 3%</tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>4% paraformaldehydu zastosowano do przetwarzania immunohistochemicznego</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Hengxing Chemical Odczynniki</td><td></td><td>używane do przygotowania PBS</td></tr><tr><td>Mount Coverslipping Medium</td><td>Polyscience</td><td>18606</td><td></td></tr><tr><td>Urethan</td><td>National Institute for Food and Drug Control</td><td>30191228</td><td>1,5 g/kg, i.p.</td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-4</td><td>1,5 mm OD, 1,12 mm ID</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td>Służy do przygotowania mikropipet</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>Stół do izolacji drgań</td><td>Technical Manufacturing Corporation</td><td>63544</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td> <td>CCD na podczerwieńDage-MIT</td><td>IR-1000</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz krosowy</td><td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Stolik X-Y</td><td>Burleigh</td><td>GIBRALTAR X-Y</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop pionowy</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Osmometr</td><td>Zaawansowany</td> miernik PH <td>FISKE 210</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mettler Mikroskop Toledo</td><td>FE20</td><td></td></tr><tr><td>Confocol</td><td>Zeiss</td><td>LSM 700</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie wycinków ostrego rdzenia kręgowego do zapisu całokomórkowego patch-clamp w neuronach istoty żelatynowej

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Ostatnie badania nad klamrami całokomórkowymi z neuronów istoty żelowej (SG) dostarczyły dużej ilości informacji na temat mechanizmów rdzeniowych leżących u podstaw transmisji czuciowej, regulacji nocyceptywnej oraz rozwoju przewlekłego bólu lub swędzenia. Implementacja zapisów elektrofizjologicznych wraz z badaniami morfologicznymi opartymi na użyteczności ostrych wycinków rdzenia kręgowego jeszcze bardziej pogłębiła naszą wiedzę na temat właściwości neuronów i składu obwodów lokalnych w SG. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy i praktyczny przewodnik dotyczący przygotowania wycinków rdzenia kręgowego oraz pokazujemy reprezentatywne wyniki zapisu całych komórek i morfologii. Protokół ten pozwala na idealne zachowanie neuronów i może do pewnego stopnia naśladować warunki in vivo. Podsumowując, możliwość uzyskania preparatu in vitro wycinków rdzenia kręgowego umożliwia stabilne zapisy cęgów prądowych i napięciowych, a tym samym może ułatwić szczegółowe badania wewnętrznych właściwości błony, obwodów lokalnych i struktury neuronalnej przy użyciu różnych podejść eksperymentalnych.

Ostre skrawki rdzenia kręgowego przygotowano zgodnie ze schematem przedstawionym na Rysunku 1. Po pocięciu i regeneracji skrawki rdzenia kręgowego przeniesiono do komory rejestracyjnej. Zdrowe neurony zidentyfikowano na podstawie wyglądu somy, wykorzystując mikroskopię IR-DIC. Następnie potencjały czynnościowe neuronów SG wywoływano za pomocą serii depolaryzujących impulsów prądowych (trwających 1 s), utrzymując neurony w potencjale spoczynkowym (RMP). Jak po...

Tutaj opisujemy podstawowe kroki dla zapisów całokomórkowych krosówek z neuronów istoty żelowej (SG) w przekroju rdzenia kręgowego in vitro. Metoda ta pozwala na badanie wewnętrznych właściwości błony, przekaźnictwa synaptycznego i charakterystyki morfologicznej neuronów SG.

Przygotowanie wycinków ostrego rdzenia kręgowego do zapisu całokomórkowego patch-clamp w neuronach istoty żelatynowej

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Metoda ta może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów rdzeniowych leżących u podstaw transmisji sensorycznej, regulacji nocyceptywnej i rozwoju przewlekłego bólu lub bólu. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona umożliwić idealne zachowanie neuronów i do pewnego stopnia naśladować warunki in vivo. Zacznij od wyciągnięcia elektrod rejestrujących z mikrokapilar ze szkła borokrzemianowego za pomocą ściągacza kapilarnego. Następnie napełnij formę stopionym agarem, aby przygotować blok agaru o wymiarach 1,2 centymetra na 1,5 centymetra na 2,0 centymetra.Przytnij blok tak, aby miał kanał centralny, jeśli planujesz przekroje poprzeczne. Lub miąższ kanału z krawędzią bloku dla odcinków przystrzałkowych. Przed profuzją przezsercową i ekstrakcją rdzenia kręgowego przygotuj 500 mililitrów ACSF na bazie sacharozy.Schłodzić roztwór do lodowatości i zrównoważyć z 95% O2 i 5% CO2. Ostudzić wszystkie narzędzia do preparowania na lodzie. Wykonaj podłużne pięciocentymetrowe nacięcie na skórze pleców od ogona do rostralu.Następnie przetnij klatkę piersiową między kręgosłupem a żebrami po obu stronach. Użyj nożyczek, aby wykonać cięcie na ogonowym końcu kręgosłupa. Następnie odetnij otaczające tkanki i szybko odizoluj odcinek lędźwiowo-krzyżowy kręgosłupa.Przenieś segment lędźwiowo-krzyżowy do szklanego naczynia zawierającego ACSF na bazie lodowatej sacharozy. Trzymając brzuszną stronę do góry, użyj cienkich nożyczek, aby obustronnie przeciąć szypułkę kręgów i ostrożnie odsłonić rdzeń kręgowy. Wyizoluj dwucentymetrowy odcinek rdzenia kręgowego z powiększeniem lędźwiowo-krzyżowym i przenieś odcinek kręgosłupa do innego szklanego naczynia wypełnionego zimną sacharozą ACSF.Pracuj pod mikroskopem preparacyjnym, aby usunąć opony mózgowe i błonę pajęczynówkową pia. Odetnij wszystkie korzenie brzuszne i grzbietowe tak szybko, jak to możliwe. Należy uważać, aby uniknąć uszkodzenia rdzenia kręgowego, zwłaszcza rogu grzbietowego podczas usuwania opon mózgowo-rdzeniowych i korzeni rdzeniowych.Umieść rdzeń kręgowy na wcześniej przyciętym bloku agaru. Aby przygotować plastry poprzeczne, przymocuj brzuszną stronę rdzenia kręgowego do agaru stroną grzbietową w kierunku ostrza. Aby przygotować plastry przystrzałkowe, przymocuj stronę brzuszną za pomocą superglue do agaru w kierunku pionowym.Następnie zamontuj blok agaru na platformie wibratomu za pomocą superglue. I przygotuj plastry poprzeczne lub przystrzałkowe o grubości od 300 do 500 mikronów z zaawansowaną prędkością 0,025 milimetra na sekundę i częstotliwością wibracji 80 Hz. Rdzeń kręgowy należy przeciąć grzbietowo-brzusznie.Aby uzyskać najlepsze rezultaty, plasterek należy przygotować w ciągu 15 do 20 minut. Grubość wycinka kręgosłupa nie powinna przekraczać 600 mikronów, aby zapewnić widoczność komórki. Użyj plastikowej pipety, aby przenieść plastry na nylonową siatkę w komorze do przechowywania zawierającej stale natleniony ACSF w temperaturze 32 stopni Celsjusza.Aby przeprowadzić zapisy klamrów łatek całokomórkowych z istoty żelowej lub neuronów SG, należy użyć roztworów wewnątrzkomórkowych na bazie jonów potasu do zapisu, stosując roztwór na bazie kationu cezu tylko do rejestracji hamujących prądów postsynaptycznych. Delikatnie przesuń wycinek rdzenia kręgowego do komory nagrywania. A następnie mocno ustabilizuj go za pomocą platynowego drutu w kształcie litery U z nylonowymi gwintami, aby uzyskać optymalną stabilność plastrów.Równomiernie obficie plasterek z bąbelkowym ACSF w temperaturze pokojowej i ustaw szybkość obfitości na dwa do czterech mililitrów na minutę, aby uzyskać wystarczające natlenienie. Następnie, używając soczewki mikroskopu o niskiej rozdzielczości, zidentyfikuj obszar neuronów SG jako półprzezroczyste pasmo. Wybierz zdrowy neuron, charakteryzujący się trójwymiarowym kształtem z jasną i gładką błoną jako komórkę docelową za pomocą obiektywu o wysokiej rozdzielczości i dostosuj go do środka ekranu monitora wideo.Napełnij mikropipetę odpowiednią objętością roztworu wewnątrzkomórkowego na bazie jonów potasu lub jonów cezu. Następnie włóż mikropipetę do uchwytu elektrody i upewnij się, że roztwór wewnątrzkomórkowy styka się ze srebrnym drutem wewnątrz uchwytu. Ustaw ostrość mikropipety i użyj mikromanipulatora, aby zanurzyć ją w ACSF.Zastosuj łagodne nadciśnienie, aby usunąć wszelkie zabrudzenia i zanieczyszczenia. Stopniowo przesuwaj mikropipetę w kierunku docelowego neuronu. Gdy pipeta zbliży się do neuronu i na błonie neuronalnej utworzy się bardzo mały wgłębienie, zwolnij dodatnie ciśnienie, aby utworzyć gigaseal.Zmień potencjał utrzymywania na minus 70 miliwoltów, co jest bliskie fizjologicznemu potencjałowi spoczynkowemu błony komórki. Następnie zastosuj przejściowe i delikatne ssanie do mikropipety, aby rozerwać membranę i stworzyć dobrą konfigurację całych komórek. Rejestruj właściwości wypalania, testując wzorzec wyzwalania każdego neuronu w cęgach prądowych za pomocą serii jednosekundowych impulsów prądu depolaryzującego o natężeniu od 25 do 150 pikoamperów z przyrostem 25 pikoamperów przy spoczynkowym potencjale błonowym.Aby zarejestrować somatyczne prądy podprogowe, należy utrzymać potencjał błony na poziomie minus 50 miliwoltów w trybie cęgów napięciowych, a następnie zastosować serię hiperpolaryzujących impulsów napięciowych o czasie trwania jednej sekundy od minus 60 miliwoltów do minus 120 miliwoltów ze spadkiem o 10 miliwoltów. Rejestruj pobudzające prądy postsynaptyczne za pomocą wewnątrzkomórkowego roztworu na bazie jonów potasu w trybie cęgów napięciowych przy potencjale podtrzymania minus 70 miliwoltów. Rejestruj IPSC przy użyciu wewnątrzkomórkowego roztworu na bazie jonów cezu do rejestrowania IPSC.Po utrzymaniu potencjału błonowego na poziomie minus 70 miliwoltów przez około pięć minut, stopniowo zmieniaj potencjał utrzymywania na zero miliwoltów. Poczekaj kilka minut na stabilizację, a następnie rozpocznij nagrywanie zdarzeń IPSC. Wzorce wypalania określone przez wstrzyknięcie serii jednosekundowych impulsów prądu depolaryzującego do neuronu SG o spoczynkowym potencjale błonowym można sklasyfikować jako wystrzeliwanie toniczne, odpalanie opóźnione, strzelanie szczelinowe, początkowe pękanie, fazowe pękanie, pojedyncze kolce i niechętne strzelanie.Ten obraz przedstawia protokół wywoływania dla prądów podprogowych w cęgach napięciowych. Te reprezentatywne ślady pokazują odpowiedź na wtrysk prądu hiperpolaryzacyjnego sklasyfikowanego jako IH, IA i IT. Jest to reprezentatywny ślad SEPSC zarejestrowany z neuronów SG przy napięciu minus 70 miliwoltów przy braku i obecności 50 mikromolowych APV i 20 mikromolowych CNQX. Ten ślad pokazuje zarejestrowane SEPC przed dodaniem APV i CNQX w rozszerzonej skali czasowej.Po tej procedurze można zastosować metody, takie jak nagrania sparowanych klamer lub optogenetyka, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak charakterystyka określonych mikroobwodów neuronalnych w istocie gelatinosa.

preparation-acute-spinal-cord-slices-for-whole-cell-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje technikę nagrywania za pomocą zacisku krosowego z powierzchni membrany dendrytycznej. Pomaga to bezpośrednio badać właściwości elektryczne dendrytów i leżących u ich podstaw kanałów jonowych bramkowanych napięciem w neuronach dopaminergicznych.

Nagrania patch-clamp z dendrytu neuronu dopaminergicznego w wycinku mózgu

Ten film demonstruje procedurę wykonywania zapisów elektrofizjologicznych w neuronach istoty żelowej (SG) wycinków rdzenia kręgowego, przy użyciu technik całokomórkowych kropek do analizy wzorców uruchamiania neuronów. Metoda ta pozwala na badanie reakcji neuronalnych na bodźce w neuronach SG rdzenia kręgowego.

Zapis klamry krosowej całej komórki w neuronie istoty żelatynowej wycinka rdzenia kręgowego

Rejestrowanie prądów Ca2+ na błonie czołowej uwalniania presynaptycznego jest kluczem do precyzyjnego zrozumienia wejścia Ca2+ i uwalniania neuroprzekaźników. Przedstawiamy ostrą dysocjację rdzenia kręgowego minoga, która daje funkcjonalne izolowane aksony siateczkowo-rdzeniowe, umożliwiające zapis bezpośrednio z błony czołowej uwalniającej poszczególne zakończenia presynaptyczne.

Ostra dysocjacja aksonów siateczkowo-rdzeniowych minoga w celu umożliwienia rejestracji z błony czołowej uwalniającej poszczególnych funkcjonalnych zakończeń presynaptycznych

Zapisy patch-clamp i jednoczesne wewnątrzkomórkowe wypełnianie biocytyną synaptycznie sprzężonych neuronów w ostrych wycinkach mózgu pozwalają na skorelowaną analizę ich strukturalnych i funkcjonalnych właściwości. Celem niniejszego protokołu jest opisanie podstawowych etapów technicznych zapisu elektrofizjologicznego z mikroukładów neuronalnych i ich późniejszej analizy morfologicznej.

Elektrofizjologiczna i morfologiczna charakterystyka mikroobwodów neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu przy użyciu sparowanych nagrań patch-clamp

Tutaj przedstawiono procedurę selektywnej aktywacji białka neuronalnego za pomocą krótkiego impulsu światła poprzez genetyczne kodowanie fotoreaktywnego nienaturalnego aminokwasu do docelowego białka neuronalnego wyrażanego w neuronach w hodowli lub in vivo.

Optyczna kontrola białka neuronalnego za pomocą genetycznie kodowanego nienaturalnego aminokwasu w neuronach

Ten protokół demonstruje implementację zoptymalizowanej metody ochronnego odzyskiwania N-metylo-D-glukaminy (NMDG) do przygotowania wycinków mózgu. Pojedynczy preparat podłoża jest używany do niezawodnego uzyskiwania zdrowych wycinków mózgu od zwierząt w każdym wieku i do różnych zastosowań eksperymentalnych.

Przygotowanie ostrych wycinków mózgu przy użyciu zoptymalizowanej metody odzysku ochronnego N-metylo-D-glukaminy

Ten protokół opisuje podstawowe kroki proceduralne do wykonywania nagrań z użyciem krosówek dla całej komórki. Technika ta pozwala na badanie zachowania elektrycznego neuronów, a gdy jest wykonywana w wycinkach mózgu, pozwala na ocenę różnych funkcji neuronalnych z neuronów, które są nadal zintegrowane w stosunkowo dobrze zachowanych obwodach mózgowych.

Nagrania z użyciem zacisku krosowego całych komórek w wycinkach mózgu

Pokazujemy, jak przygotować ukośne wycinki rdzenia kręgowego u młodych myszy. Preparat ten pozwala na stymulację korzeni brzusznych.

Przygotowanie skośnych wycinków rdzenia kręgowego do stymulacji korzeni brzusznych

Subcellular patch-clamp recordings dają możliwość zbadania funkcjonalnych właściwości dendrytów. Jednak te drobne struktury nie są łatwo dostępne ze względu na ich małą średnicę. Opisany tutaj protokół ma na celu ułatwienie zbierania stabilnych i wiarygodnych zapisów z dendrytów neuronów dopaminowych w wycinkach in vitro.

Subkomórkowe nagrania patch-clamp z domeny somatodendrycznej neuronów dopaminowych nigralnych

Przedstawiamy protokół przygotowania ostrych plastrów z grzbietowo-pośredniego hipokampa myszy. Porównujemy ten preparat poprzeczny z cięciem koronalnym pod względem jakości zapisów i zachowania cech morfologicznych zarejestrowanych neuronów.

Przygotowanie ostrych wycinków z grzbietowego hipokampa do zapisu całych komórek i rekonstrukcji neuronów w zakręcie zębatym dorosłych myszy

Ten protokół opisuje metodę wykorzystującą patch-clamp do badania elektrycznych reakcji neuronów ruchowych na stymulację rdzenia kręgowego (SCS) z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną, co może pomóc badaczom poprawić ich umiejętności w rozdzielaniu rdzenia kręgowego i jednoczesnym utrzymywaniu żywotności komórek.

Przygotowanie ex vivo wycinka rdzenia kręgowego do zapisu całokomórkowego patch-clamp w neuronach ruchowych podczas stymulacji rdzenia kręgowego

Poznaj metodę patch-clamp w wycinkach rdzenia kręgowego do badania neuronów istoty żelatynowej. Technika ta umożliwia analizę właściwości błonowych i transmisji synaptycznej kluczowej dla mechanizmów bólu.

Przygotowanie wycinków ostrego rdzenia kręgowego do zapisu całokomórkowego patch-clamp w neuronach istoty żelatynowej

Przeglądaj więcej filmów