Przygotowanie wycinków ostrego rdzenia kręgowego do zapisu całokomórkowego patch-clamp w neuronach istoty żelatynowej
18 stycznia 2019
Tutaj opisujemy podstawowe kroki dla zapisów całokomórkowych krosówek z neuronów istoty żelowej (SG) w przekroju rdzenia kręgowego in vitro. Metoda ta pozwala na badanie wewnętrznych właściwości błony, przekaźnictwa synaptycznego i charakterystyki morfologicznej neuronów SG.
Metoda ta może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów rdzeniowych leżących u podstaw transmisji sensorycznej, regulacji nocyceptywnej i rozwoju przewlekłego bólu lub bólu. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona umożliwić idealne zachowanie neuronów i do pewnego stopnia naśladować warunki in vivo. Zacznij od wyciągnięcia elektrod rejestrujących z mikrokapilar ze szkła borokrzemianowego za pomocą ściągacza kapilarnego. Następnie napełnij formę stopionym agarem, aby przygotować blok agaru o wymiarach 1,2 centymetra na 1,5 centymetra na 2,0 centymetra.
Przytnij blok tak, aby miał kanał centralny, jeśli planujesz przekroje poprzeczne. Lub miąższ kanału z krawędzią bloku dla odcinków przystrzałkowych. Przed profuzją przezsercową i ekstrakcją rdzenia kręgowego przygotuj 500 mililitrów ACSF na bazie sacharozy.
Schłodzić roztwór do lodowatości i zrównoważyć z 95% O2 i 5% CO2. Ostudzić wszystkie narzędzia do preparowania na lodzie. Wykonaj podłużne pięciocentymetrowe nacięcie na skórze pleców od ogona do rostralu.
Następnie przetnij klatkę piersiową między kręgosłupem a żebrami po obu stronach. Użyj nożyczek, aby wykonać cięcie na ogonowym końcu kręgosłupa. Następnie odetnij otaczające tkanki i szybko odizoluj odcinek lędźwiowo-krzyżowy kręgosłupa.
Przenieś segment lędźwiowo-krzyżowy do szklanego naczynia zawierającego ACSF na bazie lodowatej sacharozy. Trzymając brzuszną stronę do góry, użyj cienkich nożyczek, aby obustronnie przeciąć szypułkę kręgów i ostrożnie odsłonić rdzeń kręgowy. Wyizoluj dwucentymetrowy odcinek rdzenia kręgowego z powiększeniem lędźwiowo-krzyżowym i przenieś odcinek kręgosłupa do innego szklanego naczynia wypełnionego zimną sacharozą ACSF.
Pracuj pod mikroskopem preparacyjnym, aby usunąć opony mózgowe i błonę pajęczynówkową pia. Odetnij wszystkie korzenie brzuszne i grzbietowe tak szybko, jak to możliwe. Należy uważać, aby uniknąć uszkodzenia rdzenia kręgowego, zwłaszcza rogu grzbietowego podczas usuwania opon mózgowo-rdzeniowych i korzeni rdzeniowych.
Umieść rdzeń kręgowy na wcześniej przyciętym bloku agaru. Aby przygotować plastry poprzeczne, przymocuj brzuszną stronę rdzenia kręgowego do agaru stroną grzbietową w kierunku ostrza. Aby przygotować plastry przystrzałkowe, przymocuj stronę brzuszną za pomocą superglue do agaru w kierunku pionowym.
Następnie zamontuj blok agaru na platformie wibratomu za pomocą superglue. I przygotuj plastry poprzeczne lub przystrzałkowe o grubości od 300 do 500 mikronów z zaawansowaną prędkością 0,025 milimetra na sekundę i częstotliwością wibracji 80 Hz. Rdzeń kręgowy należy przeciąć grzbietowo-brzusznie.
Aby uzyskać najlepsze rezultaty, plasterek należy przygotować w ciągu 15 do 20 minut. Grubość wycinka kręgosłupa nie powinna przekraczać 600 mikronów, aby zapewnić widoczność komórki. Użyj plastikowej pipety, aby przenieść plastry na nylonową siatkę w komorze do przechowywania zawierającej stale natleniony ACSF w temperaturze 32 stopni Celsjusza.
Aby przeprowadzić zapisy klamrów łatek całokomórkowych z istoty żelowej lub neuronów SG, należy użyć roztworów wewnątrzkomórkowych na bazie jonów potasu do zapisu, stosując roztwór na bazie kationu cezu tylko do rejestracji hamujących prądów postsynaptycznych. Delikatnie przesuń wycinek rdzenia kręgowego do komory nagrywania. A następnie mocno ustabilizuj go za pomocą platynowego drutu w kształcie litery U z nylonowymi gwintami, aby uzyskać optymalną stabilność plastrów.
Równomiernie obficie plasterek z bąbelkowym ACSF w temperaturze pokojowej i ustaw szybkość obfitości na dwa do czterech mililitrów na minutę, aby uzyskać wystarczające natlenienie. Następnie, używając soczewki mikroskopu o niskiej rozdzielczości, zidentyfikuj obszar neuronów SG jako półprzezroczyste pasmo. Wybierz zdrowy neuron, charakteryzujący się trójwymiarowym kształtem z jasną i gładką błoną jako komórkę docelową za pomocą obiektywu o wysokiej rozdzielczości i dostosuj go do środka ekranu monitora wideo.
Napełnij mikropipetę odpowiednią objętością roztworu wewnątrzkomórkowego na bazie jonów potasu lub jonów cezu. Następnie włóż mikropipetę do uchwytu elektrody i upewnij się, że roztwór wewnątrzkomórkowy styka się ze srebrnym drutem wewnątrz uchwytu. Ustaw ostrość mikropipety i użyj mikromanipulatora, aby zanurzyć ją w ACSF.
Zastosuj łagodne nadciśnienie, aby usunąć wszelkie zabrudzenia i zanieczyszczenia. Stopniowo przesuwaj mikropipetę w kierunku docelowego neuronu. Gdy pipeta zbliży się do neuronu i na błonie neuronalnej utworzy się bardzo mały wgłębienie, zwolnij dodatnie ciśnienie, aby utworzyć gigaseal.
Zmień potencjał utrzymywania na minus 70 miliwoltów, co jest bliskie fizjologicznemu potencjałowi spoczynkowemu błony komórki. Następnie zastosuj przejściowe i delikatne ssanie do mikropipety, aby rozerwać membranę i stworzyć dobrą konfigurację całych komórek. Rejestruj właściwości wypalania, testując wzorzec wyzwalania każdego neuronu w cęgach prądowych za pomocą serii jednosekundowych impulsów prądu depolaryzującego o natężeniu od 25 do 150 pikoamperów z przyrostem 25 pikoamperów przy spoczynkowym potencjale błonowym.
Aby zarejestrować somatyczne prądy podprogowe, należy utrzymać potencjał błony na poziomie minus 50 miliwoltów w trybie cęgów napięciowych, a następnie zastosować serię hiperpolaryzujących impulsów napięciowych o czasie trwania jednej sekundy od minus 60 miliwoltów do minus 120 miliwoltów ze spadkiem o 10 miliwoltów. Rejestruj pobudzające prądy postsynaptyczne za pomocą wewnątrzkomórkowego roztworu na bazie jonów potasu w trybie cęgów napięciowych przy potencjale podtrzymania minus 70 miliwoltów. Rejestruj IPSC przy użyciu wewnątrzkomórkowego roztworu na bazie jonów cezu do rejestrowania IPSC.
Po utrzymaniu potencjału błonowego na poziomie minus 70 miliwoltów przez około pięć minut, stopniowo zmieniaj potencjał utrzymywania na zero miliwoltów. Poczekaj kilka minut na stabilizację, a następnie rozpocznij nagrywanie zdarzeń IPSC. Wzorce wypalania określone przez wstrzyknięcie serii jednosekundowych impulsów prądu depolaryzującego do neuronu SG o spoczynkowym potencjale błonowym można sklasyfikować jako wystrzeliwanie toniczne, odpalanie opóźnione, strzelanie szczelinowe, początkowe pękanie, fazowe pękanie, pojedyncze kolce i niechętne strzelanie.
Ten obraz przedstawia protokół wywoływania dla prądów podprogowych w cęgach napięciowych. Te reprezentatywne ślady pokazują odpowiedź na wtrysk prądu hiperpolaryzacyjnego sklasyfikowanego jako IH, IA i IT. Jest to reprezentatywny ślad SEPSC zarejestrowany z neuronów SG przy napięciu minus 70 miliwoltów przy braku i obecności 50 mikromolowych APV i 20 mikromolowych CNQX. Ten ślad pokazuje zarejestrowane SEPC przed dodaniem APV i CNQX w rozszerzonej skali czasowej.
Po tej procedurze można zastosować metody, takie jak nagrania sparowanych klamer lub optogenetyka, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak charakterystyka określonych mikroobwodów neuronalnych w istocie gelatinosa.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie opisuje procedury przeprowadzania rejestracji metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell z neuronów substancji żelatynowej (SG) wyizolowanych z przekrojów rdzenia kręgowego in vitro. Dzięki zastosowaniu tej metody badacze mogą analizować wewnętrzne właściwości błonowe, transmisję synaptyczną oraz cechy morfologiczne neuronów SG.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
- Biologia komórki
Wstęp
- Substantia gelatinosa ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia przetwarzania sensorycznego i regulacji bólu.
- Metoda patch-clamp w konfiguracji whole-cell pozwala wyjaśnić właściwości elektrofizjologiczne tych neuronów.
- Metoda ta poprawia zachowanie neuronów i symuluje warunki in vivo.
- Zrozumienie neuronów SG może dostarczyć wiedzy na temat mechanizmów bólu przewlekłego.
Cel badania
- Opisanie metodologii rejestracji techniką patch-clamp w przekrojach rdzenia kręgowego.
- Zbadanie właściwości inherentnych neuronów SG.
- Analiza przekazywania synaptycznego w kontekście mechanizmów bólu.
Zastosowane metody
- Rejestracje patch-clamp w konfiguracji whole-cell przeprowadzone na skrawkach rdzenia kręgowego in vitro.
- Model biologiczny skupia się na neuronach substantia gelatinosa.
- W tekście nie wspomniano o żadnym przepływie pracy multiomicznej.
- Krytyczne kroki obejmują przygotowanie ACSF na bazie sacharozy, izolację segmentu rdzenia kręgowego oraz krojenie tkanki w określonych ramach czasowych.
- Techniki rejestracji obejmują dostosowanie potencjałów podtrzymujących oraz identyfikację właściwości neuronów pod mikroskopem.
Główne wyniki
- Niniejsze badanie przedstawia protokół identyfikacji i rejestracji aktywności neuronów z zwojów SG, umożliwiający szczególną charakterystykę ich właściwości elektrofizjologicznych.
- Analiza zmian elektrofizjologicznych i wzorców wyładowań pozwala na uzyskanie informacji na temat pobudliwości neuronalnej oraz dynamiki synaptycznej.
- Kluczowe odpowiedzi biologiczne obejmują charakterystykę wyładowań tonicznych oraz innych wzorców aktywności w zależności od warunków eksperymentalnych.
- Metoda ta ułatwia badanie mechanizmów modulacji bólu w oparciu o aktywność synaptyczną.
Wnioski
- Opisana metodologia umożliwia badanie funkcjonalności neuronów SG i jest kluczowa dla zrozumienia szlaków bólowych.
- Precyzja metody oraz zachowanie neuronów zwiększają jej przydatność w badaniach z zakresu neuronauki.
- Wyniki przyczyniają się do lepszego zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw chronicznego bólu i przewodzenia sensorycznego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia szczególną charakterystykę elektrofizjologiczną neuronów substantia gelatinosa, wspierając walidację celów w badaniach nad szlakami bólowymi. Poprzez zachowanie integralności neuronalnej i naśladowanie warunków in vivo, zwiększa on wiarygodność prognostyczną w badaniach mechanistycznych nad przewodzeniem nocyceptywnym oraz rozwojem chronicznego bólu. Metoda ta ułatwia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków, co jest kluczowe na wczesnych etapach odkrywania leków w obszarze neuronauki.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez terapeutycznych związanych z mechanizmami przekazywania bodźców sensorycznych i regulacji bólu.
- Wartość naukowa: Wspiera walidację funkcjonalną celów poprzez charakteryzację pobudliwości neuronalnej i właściwości synaptycznych w obwodach istotnych dla przebiegu choroby.
- Wartość naukowa: Przyczynia się do ograniczania ryzyka mechanistycznego poprzez ilościową ocenę wewnętrznych właściwości błony oraz wzorców wyładowań.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przedstawia powtarzalną metodę przygotowania skrawków rdzenia kręgowego, umożliwiając stworzenie zestandaryzowanych systemów badawczych do przesiewania związków.
- Wartość operacyjna: Zapewnia żywotność i stabilność skrawków w określonych ramach czasowych i temperaturowych, co pozwala na uzyskanie spójnych odczytów elektrofizjologicznych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia ilościowy pomiar prądów postsynaptycznych i wzorców wyładowań neuronów jako punktów końcowych analizy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Oferuje modelowanie systemów istotnych dla przebiegu chorób w celu badania mechanizmów rdzeniowych leżących u podstaw rozwoju przewlekłego bólu i świądu.
- Wartość naukowa: Wspiera dopasowanie translacyjnych biomarkerów poprzez powiązanie fenotypów elektrofizjologicznych ze szlakami regulacji nocyceptywnej.
- Wartość operacyjna: Umożliwia zachowanie ciągłości od etapu odkryć po walidację przedkliniczną dzięki stabilnym rejestracjom w konfiguracji clampingu prądowego i napięciowego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania leków, od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, dostarczając danych elektrofizjologicznych, które służą do wczesnej oceny związków w badaniach nad bólem.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków w nocyceptywnych obwodach rdzenia kręgowego poprzez bezpośrednią rejestrację neuronową.
- Przesiewanie: Dostarcza wyników ilościowych, takich jak pobudzające i hamujące prądy postsynaptyczne, w celu oceny działania związków.
- Analityka: Umożliwia analizę statystyczną wzorców wyładowań i prądów podprogowych w celu porównania warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez modelowanie istotnych dla ludzi procesów przetwarzania sygnałów bólowych w rdzeniu kręgowym.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę do badania wielu celów w szlaku bólowym przy zastosowaniu spójnej metody przygotowania skrawków.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w zakresie oddziaływania na cel dzięki szczegółowej charakterystyce właściwości neuronalnych i transmisji synaptycznej.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność dzięki zdefiniowanym parametrom cięcia, protokołom natleniania oraz kontroli temperatury.
- Wartość strategiczna: Wsparcie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w modulacji szlaków bólowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwienie priorytetyzacji związków z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o efekty wywierane na funkcje neuronalne warstwy gelatinosa (substantia gelatinosa).
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza z zakresu elektrofizjologii, sekcji tkanek oraz wizualizacji mikroskopowej w celu poprawnego przygotowania skrawków i rejestracji.
- Metoda jest zależna od oprzyrządowania, w tym wibratomu, mikromanipulatora, wzmacniacza patch-clamp oraz systemów natleniania ACSF.
- Niezbędna jest międzyzespołowa standaryzacja orientacji cięcia, składu roztworów oraz protokołów czasowych we wszystkich laboratoriach.
- Stosowanie metody w odniesieniu do różnych segmentów rdzenia kręgowego lub gatunków innych niż modele gryzoni wiąże się z koniecznością dostosowania procedury.
- Ograniczenia praktyczne obejmują 15–20 minutowe okno czasowe na przygotowanie skrawków oraz wymóg grubości 600 µm dla optymalnej widoczności komórek.
