Ilościowe analizy mikrobioty jelitowej myszy po doustnym leczeniu antybiotykami oparte na reakcji łańcuchowej polimerazy
17 listopada 2018
Tutaj udostępniamy szczegółowe protokoły doustnego podawania antybiotyków myszom, pobierania próbek kału, ekstrakcji DNA i kwantyfikacji bakterii kałowych metodą qPCR.
Protokół ten zapewnia wiarygodną metodę ilościowego określania zmian w mikrobiocie jelitowej myszy po podaniu doustnych antybiotyków. Może to pomóc w badaniach nad interakcjami między mikrobiotą, dostarczając informacji na temat patologii związanych z dysbiozą mikrobiologiczną, takich jak nieswoiste zapalenie jelit. Główną zaletą tych schematów leczenia antybiotykami jest to, że zapobiegają one charakterystycznej utracie masy ciała, która zwykle wiąże się z doustnym podawaniem antybiotyków myszom.
Aby przygotować antybiotykoterapię za pomocą zgłębnika doustnego, przygotuj koktajl antybiotyków, mieszając roztwory podstawowe, które zostały przygotowane zgodnie z opisem w protokole technicznym. Na objętość mililitra wymieszaj 50 mikrolitrów ampicyliny, 50 mikrolitrów gentamycyny, 50 mikrolitrów neomycyny, 500 mikrolitrów metronidazolu, 25 mikrolitrów wankomycyny i 325 mikrolitrów wody. Załaduj mieszaninę antybiotyków na jednomililitrową strzykawkę, eliminując wszelkie pęcherzyki i przymocuj odpowiednią igłębkę.
Chwyć mocno skórę nad ramieniem myszy i rozciągnij głowę i szyję, aby wyprostować przełyk. Skieruj końcówkę kulkową igły do karmienia wzdłuż podniebienia i w kierunku tylnej części gardła. Następnie delikatnie przepuść go do przełyku i wstrzyknij 200 mikrolitrów roztworu.
Podawaj koktajl antybiotykowy raz dziennie przez czas trwania eksperymentu. Alternatywnie, aby podawać antybiotyki przez wodę pitną, przygotuj koktajl antybiotyków zgodnie z opisem w protokole technicznym. Ważne jest, aby dodać słodzik do mieszanki antybiotyków, ponieważ jest to kluczowy czynnik zapobiegający odwodnieniu myszy.
Wlej koktajl antybiotykowy do butelki z wodą w ilości około 100 mililitrów na butelkę. Chroń butelkę przed światłem i umieść w klatce na mysz. Zastąp koktajl antybiotykowy świeżym bulionem dwa razy w tygodniu na czas trwania eksperymentu.
Dokładne monitorowanie masy ciała i ogólnego stanu zdrowia myszy powinno być prowadzone codziennie przez cały okres podawania antybiotyków. Zważ i oznacz dwie mililitrowe probówki autoklawu do pobrania próbki. W celu pobrania świeżych próbek kału umieść każdą mysz w ograniczniku.
Następnie zbierz granulki kału bezpośrednio z odbytu w probówce zbiorczej. Po przeprowadzeniu eutanazji zgodnie z opisem w protokole technicznym należy położyć tuszę myszy z całkowicie odsłoniętym brzuchem i spryskać okolice brzucha 70% etanolem. Za pomocą wysterylizowanych kleszczy i nożyczek wykonaj poprzeczne nacięcie w jamie brzusznej, aby odsłonić usztywnienie bez uszkadzania jakichkolwiek tkanek wewnętrznych.
Podnieś okołodoczną i wykonaj nacięcie, aby odsłonić jelita. Usuń jelita kleszczami i nożyczkami i umieść je na sterylnej szalce Petriego. Ostrożnie użyj kleszczy, aby oddzielić jelito cienkie od tętnic krezkowych i tłuszczu.
Rozszerz jelito i umieść je na czystej chusteczce laboratoryjnej. Za pomocą linijki zmierz i odetnij cztery centymetry dystalnego odcinka jelita krętego jelita cienkiego. Wytnij i wyrzuć jeden centymetr jelita proksymalnego do jelita ślepego.
Pozostanie trzycentymetrowa część jelita krętego, która zostanie wykorzystana do zebrania bakterii jelitowych. Przytrzymaj część jelita krętego nad sterylną probówką o pojemności dwóch mililitrów. Zebrać zawartość jelita, bezpośrednio wytłaczając jelito i pobierając próbkę do probówki.
Ta próbka będzie zawierała bakterie z zawartości jelita krętego. Przygotuj 20-mililitrową strzykawkę z zimną solą fizjologiczną buforowaną fosforanem i przepłucz część jelita krętego, odrzucając przepływ. Umieść porcję jelita krętego na sterylnej szalce Petriego i otwórz ją wzdłuż nożyczkami.
Zeskrob wnętrze ściany jelita krętego skalpelem. Zbierz wszelkie bakterie na skalpelu, myjąc go jednym mililitrem PBS nad czystą probówką wirówkową. Wiruj z prędkością ośmiu tysięcy razy G przez pięć minut, aby osadzać bakterie.
Po odwirowaniu odrzucić supernatant. Ta próbka będzie zawierała bakterie ze ściany jelita krętego. Zważyć probówki zawierające próbki kału i jelita krętego.
Odejmij masę od pustych probówek, aby uzyskać masę kału w każdej próbce. Ekstrahuj bakteryjne DNA z próbek kału, zawartości jelita krętego i ściany jelita krętego za pomocą dostępnych na rynku zestawów. Przechowuj próbki DNA w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu użycia.
Rozmrozić na lodzie wzorzec qPCR, próbkę kału DNA i odczynniki qPCR z dostępnego w handlu zestawu. Rozcieńczyć wzorzec w sterylnej wodzie wolnej od DNA w zakresie od 10 do siedmiu do 10 do dwóch kopii na mikrolitr. Rozcieńczyć DNA próbki kału do stężeń połowy, jednej piątej i jednej dziesiątej.
Następnie wykonaj reakcję mieszanki wzorcowej dla całkowitej liczby reakcji plus jeden. Zmieszać 30 mikrolitrów mieszanki wzorcowej i 5 mikrolitrów matrycy, która jest wzorcem, próbką lub wodą do kontroli ujemnej. Następnie dodaj 10 mikrolitrów tej mieszanki do każdego dołka w 384-dołkowej płytce optycznej qPCR.
Każdą reakcję należy przeprowadzić w trzech egzemplarzach. Uszczelnić płytkę qPCR i krótko odwirować. Następnie załaduj płytkę na maszynę qPCR, która jest zaprogramowana zgodnie z listą w protokole technicznym.
Na koniec uzyskaj wartości progowe cyklu dla wzorca i próbek przed obliczeniem liczby kopii 16S rDNA dla próbek kału. Reprezentatywne wyniki wskazują na utratę masy ciała u myszy po podaniu antybiotyków przez zgłębnik doustny lub przez wodę pitną. Nie wykryto zauważalnej utraty masy ciała u myszy, które otrzymują antybiotyki przez zgłębnik doustny.
Kiedy myszy są leczone antybiotykami w wodzie pitnej, tracą około 10% masy ciała w ciągu pierwszych kilku dni leczenia, ale następnie odzyskują normalny przyrost masy ciała. Kwantyfikacja bakterii w próbkach kału wymaga użycia krzywej wzorcowej uzyskanej przez wykreślenie logarytmu liczby kopii dla wzorca w porównaniu z wartościami C-T uzyskanymi w qPCR. W zakresie liniowym równanie analizy regresji umożliwia ilościowe określenie obfitości 16S rDNA w próbkach kału.
Jak pokazano tutaj dla próbek kału, treści z jelita cienkiego i ściany jelita cienkiego. Po pięciu lub 10 dniach doustnego podawania antybiotyków następuje silny spadek gęstości bakterii w próbkach kału myszy leczonych antybiotykiem. Jednak gęstość bakterii w kale powróciła do normalnego poziomu po tygodniu od zaprzestania podawania antybiotyku.
Zarówno doustne podawanie przez zgłębnik, jak i podawanie antybiotyków w wodzie pitnej na krótko zmniejszają obciążenie bakteriami kałowymi u leczonych myszy. Naukowcy, którzy wybierają indywidualną metodę, która lepiej odpowiada wymaganiom eksperymentalnym, biorąc pod uwagę takie czynniki, jak długość leczenia. Metoda qPCR do oznaczania ilościowego bakterii może być modyfikowana w celu ilościowego określenia poszczególnych taksonów bakteryjnych przy użyciu określonych starterów.
Dostarczy to zarówno ilościowych, jak i jakościowych informacji na temat wielkości i składu mikrobiomu.
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia niezawodną metodę ilościowego określania zmian w mikrobiocie jelitowej myszy po doustnym podaniu antybiotyków. Wspiera on badania nad oddziaływaniami mikrobioty oraz patologiami związanymi z dysbiozą mikrobiologiczną.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Neuronauka
- Farmakologia
Wstęp
- Zrozumienie wpływu antybiotyków na mikrobiotę jelitową jest kluczowe dla badania związanych z nią chorób.
- Leczenie antybiotykami może prowadzić do dysbiozy mikrobiologicznej, co wpływa na ogólny stan zdrowia.
- Utrata masy ciała jest częstym skutkiem ubocznym podawania antybiotyków u myszy.
- Protokoły skutecznego podawania i monitorowania są niezbędne dla uzyskania dokładnych wyników.
Cel badania
- Opracowanie metody podawania antybiotyków myszom bez powodowania znacznej utraty masy ciała.
- Zbiór i analiza próbek kału w celu kwantyfikacji bakteryjnego DNA.
- Zbadanie wpływu antybiotyków na skład mikrobioty jelitowej.
Zastosowane metody
- Przygotowanie koktajli antybiotyków do podawania doustnego lub do wody pitnej.
- Pobieranie próbek kału i treści jelitowej po eutanazji.
- Ekstrakcja DNA z próbek przy użyciu komercyjnych zestawów.
- Ilościowe oznaczenie bakterii za pomocą analizy qPCR.
Główne wyniki
- Myszy, którym podano antybiotyki drogą gavage, nie wykazały istotnej utraty masy ciała.
- Podanie antybiotyków z wodą pitną spowodowało początkowy spadek masy ciała, jednak zaobserwowano późniejszą regenerację.
- Ilościowe oznaczenie bakteryjnego DNA wykazało istotne zmiany w składzie mikrobioty.
- W celu dokładnego pomiaru liczebności 16S rDNA opracowano krzywe wzorcowe.
Wnioski
- Protokół ten skutecznie minimalizuje utratę masy ciała u myszy podczas leczenia antybiotykami.
- Zapewnia on niezawodną metodę badania wpływu antybiotyków na mikrobiotę jelitową.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia dysbiozy mikrobiologicznej i jej wpływu na zdrowie.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia wiarygodną kwantyfikację zmian w mikrobiocie jelitowej myszy po doustnej kuracji antybiotykowej, co wspiera badania przedkliniczne nad dysbiozą mikrobiologiczną powiązaną z immunopatologiami. Poprzez minimalizację artefaktów wynikających z utraty masy ciała, poprawia on interpretowalność danych w celu walidacji celów w modelach stanów zapalnych i chorób immunologicznych. Oparty na qPCR test gęstości bakterii dostarcza ilościowych i powtarzalnych wyników, które są niezbędne do ograniczania ryzyka mechanistycznego oraz zwiększania pewności predykcyjnej w wczesnych etapach procesów odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez dotyczących interakcji między mikrobiotą a układem odpornościowym w modelach nieswoistych zapaleń jelit oraz zapaleń stawów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia stabilne pod względem masy ciała schematy antybiotykoterapii, które ograniczają wpływ zmiennych zakłócających na ocenę docelowego fenotypu.
- Wartość prognostyczna: Wspiera funkcjonalną walidację celów terapeutycznych poprzez korelację zmian gęstości drobnoustrojów z odczytami funkcji komórek odpornościowych.
Przesiewy i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Zapewnia standaryzowane przygotowanie próbek kału i ekstrakcję DNA kompatybilną z platformami qPCR o wysokiej przepustowości.
- Wynik ilościowy: Generuje pomiary liczby kopii 16S rDNA za pomocą krzywych standardowych, co umożliwia spójność między partiami w badaniach nad modulacją mikrobiomu.
- Skalowalność: Obsługuje podłużne projekty pobierania próbek w kampaniach przesiewowych dotyczących zależności dawka-odpowiedź oraz przebiegu czasowego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie w kontekście chorób: Modeluje indukowaną antybiotykami dysbiozę obserwowaną u pacjentów, co zwiększa trafność translacyjną wyników przedklinicznych.
- Zmniejszenie ryzyka mechanistycznego: Łączy zmiany w społecznościach drobnoustrojów z funkcją komórek odpornościowych, co zmniejsza niejednoznaczność w relacjach między szlakami a celami terapeutycznymi.
- Ciągłość przedkliniczna: Umożliwia podłużne monitorowanie regeneracji mikrobioty po leczeniu, co dostarcza informacji do oceny bezpieczeństwa oraz ryzyka rozwoju oporności.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od testowania hipotez dotyczących celu terapeutycznego po optymalizację kandydata na lek – oferując modulację mikrobioty jako zmienną mechanistyczną w programach badawczych nad immunologią i chorobami zakaźnymi.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących fenotypów zależnych od mikrobioty w modelach chorób poprzez kontrolowane zaburzenia wywołane antybiotykami.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie próbek mikrobiomu gotowych do analizy w celu oceny wpływu związków na ładunek i skład bakterii.
- Analityka: Dostarcza ilościowe dane o liczebności 16S rDNA, które umożliwiają porównania między różnymi warunkami oraz obliczenie wielkości efektu.
- Badania translacyjne: Łączy zmiany w mikrobiocie mysiej z wzorcami dysbiozy istotnymi dla ludzi, wspierając projekty badań zorientowane na biomarkery.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia możliwość wielokrotnego wykorzystania kwantyfikacji mikrobioty, którą można zastosować w wielu obszarach terapeutycznych i systemach modelowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną poprzez redukcję czynników zakłócających związanych z utratą masy ciała w badaniach nad mikrobiotą i układem odpornościowym.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanym koktajlom antybiotyków i etapom walidacji za pomocą qPCR.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go, dostarczając mechanistycznych powiązań między zmianami mikrobiologicznymi a efektami immunologicznymi.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o istotność choroby zależną od mikrobioty.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w pracy z myszami, technice zgłębnika doustnego oraz przetwarzaniu próbek w warunkach anaerobowych.
- Zależy od aparatury do qPCR, generowania krzywej standardowej oraz kompatybilności zestawu do ekstrakcji DNA.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie czasu pobierania próbek, przechowywania oraz procedur normalizacji.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody przy rozszerzeniu badań na inne szczepy myszy, kombinacje antybiotyków lub odcinki jelit.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak konieczność eutanazji w celu uzyskania dostępu do tkanki jelitowej oraz potencjalna zmienność w uzysku pelletów kałowych.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące BioPharmy
Chapters in this video
0:04
Title
0:39
Administration of Antibiotics
2:29
Collection of Fecal Samples from Stool, Ileum Content and Ileum Wall
5:16
Quantification of Intestinal Microbiota by qPCR
6:33
Results: Quantification of Intestinal Microbiota by qPCR after Oral Antibiotic Treatment
7:51
Conclusion
