Name: Ilościowe analizy mikrobioty jelitowej myszy po doustnym leczeniu antybiotykami oparte na reakcji łańcuchowej polimerazy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Poznaj metodę ilościowej analizy mikrobioty jelitowej myszy po doustnym podaniu antybiotyków opartą na qPCR. Protokół minimalizuje utratę masy ciała i umożliwia badanie dysbiozy mikrobiologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Brytyjską Radę Badań Medycznych (grant dla P.B. MR/L008157/1); R.J. był wspierany przez Marie Curie Intra-European Fellowship (H2020-MSCA-IF-2015-703639); P.M.B. było wspierane przez stypendium od UK Medical Research Council oraz King's College London Doctoral Training Partnership in Biomedical Sciences (MR/N013700/1).

Opisane tutaj eksperymenty zostały przeprowadzone przy użyciu 6-8 tygodniowych myszy typu dzikiego (C57BL6/J) utrzymywanych w obiekcie wolnym od patogenów (SPF). Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez King's College London i Francis Crick Institute, Animal Welfare and Ethical Review Body oraz brytyjskie Ministerstwo Spraw Wewnętrznych. Przed rozpoczęciem jakiejkolwiek procedury na zwierzętach upewnij się, że odpowiednie pozwolenia zostały uzyskane za pośrednictwem lokalnej instytucji/organizacji.
1. Podawanie antybiotyków
UWAGA: Dostępne są dwie alternatywne metody leczenia antybiotykami: doustne podawanie przez zgłębnik (krok 1.1) i podawanie antybiotyków przez wodę pitną (krok 1.2).
<ol>
	<li>Zgłębnik oralny
	<ol>
		<li>Przygotować zapasy poszczególnych antybiotyków, rozpuszczając je w autoklalawowanej wodzie w następujących stężeniach: ampicylina w stężeniu 100 mg/ml, gentamycyna w stężeniu 100 mg/ml, neomycyna w stężeniu 100 mg/ml, metronidazol w stężeniu 10 mg/ml i wankomycyna w stężeniu 100 mg/ml. Filtr sterylizować za pomocą filtra 0,45 μm. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przygotuj koktajl antybiotyków, mieszając przygotowane powyżej buliony. Na objętość 1 ml wymieszać 50 μl ampicyliny (5 mg/ml wersja ostateczna), 50 μl gentamycyny (5 mg/ml wersja ostateczna), 50 μl neomycyny (5 mg/ml wersja ostateczna), 500 μl metronidazolu (5 mg/ml wersja ostateczna), 25 μl wankomycyny (2,5 mg/ml wersja ostateczna) i 325 μl wody. Przygotuj koktajl na świeżo przed użyciem.</li>
		<li>Załaduj mieszaninę antybiotyków do sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml i zamocuj odpowiednią igłę do pomiaru (20 G dla myszy 15-20 g), eliminując wszelkie pęcherzyki.</li>
		<li>Myszy z głębnikiem z 200 μl mieszanki antybiotyków.
		<ol>
			<li>Chwyć mocno skórę nad ramieniem myszy, rozciągnij głowę i szyję, aby wyprostować przełyk. Skieruj końcówkę kulkową igły do karmienia wzdłuż podniebienia i w kierunku tylnej części gardła. Następnie delikatnie przełóż go do przełyku i wstrzyknij 200 μl roztworu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Podawaj koktajl antybiotykowy raz dziennie przez czas trwania eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Antybiotyki w wodzie pitnej 
	UWAGA: Uważnie monitoruj masę ciała myszy codziennie przez pierwsze dwa tygodnie podawania antybiotyku w wodzie do picia.
	<ol>
		<li>Przygotuj koktajl antybiotyków, rozpuszczając w 1 l autoklawowanej wody: 1 g ampicyliny (1 g/l końcowy), 1 g neomycyny (1 g/l końcowy), 1 g metronidazolu (1 g/l końcowy), 0,5 g wankomycyny (0,5 g/l końcowy) i 8 saszetek (0,75 g każda) sztucznego słodzika (60 g/l końcowy). Wstrząsaj aż do rozpuszczenia. Przechowywać w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Słodzik jest dodawany, aby ukryć smak antybiotyków i zapobiec odwodnieniu myszy. Chociaż kilka marek słodzików może działać, końcowe wymagane stężenie może być różne dla każdej konkretnej marki.</li>
		<li>Wlej koktajl antybiotykowy do butelki z wodą (~100 ml / butelkę) i umieść butelkę na klatce dla myszy. 
		UWAGA: Używaj brązowych butelek lub przykryj butelki folią, aby chronić antybiotyki przed światłem.</li>
		<li>Zastąp koktajl antybiotykowy świeżym bulionem dwa razy w tygodniu na czas trwania eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Pobieranie próbek kału z kału, zawartości jelita krętego i ściany jelita krętego
<ol>
	<li>Zważyć i oznaczyć autoklawowane probówki o pojemności 2 ml do pobrania próbki.</li>
	<li>W celu pobrania świeżych próbek kału umieść każdą mysz w ograniczniku i zbierz granulki kału bezpośrednio z odbytu do probówki zbiorczej. 
	UWAGA: Próbki można również uzyskać, umieszczając myszy w czystej autoklawowanej klatce i pobierając próbki kału za pomocą czystych, wysterylizowanych kleszczy.</li>
	<li>Poddaj myszy eutanazji z uduszeniem CO2, a następnie zwichnięciem szyjki macicy.</li>
	<li>Połóż tuszę myszy z całkowicie odsłoniętym brzuchem i spryskaj okolice brzucha 70% etanolem.</li>
	<li>Za pomocą wysterylizowanych kleszczy i nożyczek wykonaj poprzeczne nacięcie w jamie brzusznej, aby odsłonić otrzewną bez uszkadzania jakichkolwiek tkanek wewnętrznych. Podnieś otrzewną i wykonaj nacięcie, aby odsłonić jelita.</li>
	<li>Usuń jelita (od okrężnicy do żołądka) za pomocą kleszczy i nożyczek i umieść je na sterylnej szalce Petriego.</li>
	<li>Ostrożnie użyj kleszczy, aby odsunąć jelito cienkie (SI) od tętnic krezkowych i tłuszczu. Rozszerz jelito i umieść je na czystej chusteczce laboratoryjnej.</li>
	<li>Za pomocą linijki zmierz i odetnij 4 cm dystalnego odcinka jelita krętego SI (najbliższa część jelita ślepego). Odetnij i wyrzuć 1 cm jelita proksymalnego do jelita ślepego. Pozostanie 3 cm porcja jelita krętego, która posłuży do zebrania bakterii jelitowych.</li>
	<li>Przytrzymaj część jelita krętego (3 cm) nad sterylną probówką o pojemności 2 ml. Zebrać zawartość jelita, bezpośrednio wytłaczając jelito i umieszczając próbkę w probówce. Ta próbka będzie zawierała bakterie z zawartości jelita krętego.</li>
	<li>Przygotować strzykawkę o pojemności 20 ml z zimnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i przepłukać część jelita krętego (wyrzucić przepływ).</li>
	<li>Umieść część jelita krętego na czystym ręczniku papierowym i otwórz ją wzdłuż nożyczkami.</li>
	<li>Zeskrob wnętrze ściany jelita krętego skalpelem.</li>
	<li>Zbierz wszelkie bakterie na skalpelu, myjąc skalpel 1 ml PBS nad czystą probówką wirówkową. Wirować w temperaturze 8 000 × g przez 5 minut, aby osadzać bakterie i wyrzucić supernatant. Ta próbka będzie zawierać bakterie ze ściany jelita krętego. 
	UWAGA: Próbki kału z kału, jelita krętego i ściany można zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Zważyć probówki zawierające próbki na podstawie zawartości kału i jelita krętego i odjąć masę od pustych probówek (z kroku 2.1), aby uzyskać masę kału w każdej próbce.</li>
	<li>Ekstrakcja bakteryjnego DNA z kału, zawartości jelita krętego i ściany jelita krętego przy użyciu dostępnych na rynku zestawów. Próbki DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
</ol>
3. Kwantyfikacja mikrobioty jelitowej metodą qPCR
UWAGA: Ta procedura obejmuje generowanie wzorca (krok 3.1) oraz metodę konfiguracji qPCR dla próbek standardowych i kałowych (krok 3.2)
<ol>
	<li>Opracowanie wzorca do qPCR
	<ol>
		<li>Użyj reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) do amplifikacji genu 16S rRNA z genomowego DNA wyekstrahowanego z kultury bakteryjnej przy użyciu odczynników13 i warunków PCR wyszczególnionych w Tabeli 1.</li>
		<li>Uruchom produkt PCR na 1,5% żelu agarozowym i oczyść pasmo DNA za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji DNA.</li>
		<li>Związać oczyszczony fragment DNA za pomocą zestawu do klonowania (patrz tabela materiałów, użyć wektora zawierającego markery oporności na antybiotyki i fuzję genu β-galaktozydazy (LacZ) w celu selekcji niebiesko-białej kolonii) i przekształcić E. coli kompetentną dla DH10 zgodnie z instrukcjami producenta. Przemiana płytki na płytki agarowe Ampicillin (100 μg/ml), X-gal (20 μg/mL) Luria Bertani (LB) (10 g/L trypton, 5 g/L ekstraktu drożdżowego, 10 g/L NaCl, 15 g/L Agar). Inkubować przez noc (O/N) w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Wybierz pojedynczą dodatnią (białą) kolonię z tabliczki. Zaszczepić go w 5 ml bulionu LB zawierającego 100 μg/ml ampicyliny i inkubować O/N w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 250 obr./min.</li>
		<li>Z kultury O/N wyizolować i oczyścić plazmid za pomocą dostępnego w handlu zestawu do minipreparatu zgodnie z instrukcjami producenta. 
		UWAGA: Ważne jest, aby na tym etapie zsekwencjonować wstawkę plazmidu, aby upewnić się, że plazmid zawiera tylko jedną kopię genu 16S rRNA i określić jego długość w parach zasad (bp).</li>
		<li>Linearyzuj plazmid enzymem restrykcyjnym, który przecina plazmid tylko raz.</li>
		<li>Oczyść zlinearyzowany plazmid za pomocą dostępnego w handlu zestawu.</li>
		<li>Oznaczyć stężenie plazmidu, mierząc absorbancję przy 260 nm za pomocą spektrofotometru.</li>
		<li>Oblicz liczbę kopii plazmidu/μl próbki, korzystając z następującego wzoru14: 
		liczba kopii = (ilość * 6.022 × 1023) / (długość * 1 ×10 9 * 650) 
		gdzie ilość jest stężeniem DNA otrzymanym w kroku 3.1.8 (w ng/μl); a długość to całkowita długość plazmidu (z wstawką) w BP. Ilość egzemplarzy będzie uzyskiwana w egzemplarzach/μL. 
		UWAGA: Istnieją narzędzia online oparte na powyższym wzorze, które umożliwiają łatwe obliczenie liczby kopii plazmidu.</li>
		<li>Porcję i przechowywać wzorzec w razie potrzeby w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja qPCR dla próbek standardowych i kału
	<ol>
		<li>Rozmrozić na lodzie wzorzec qPCR (z kroku 3.1.10), próbki kału, DNA (z kroku 2.15) i odczynniki qPCR (z dostępnego na rynku zestawu). 
		UWAGA: odczynniki qPCR użyte w tym przykładzie obejmują mieszaninę reakcyjną SYBR Green qPCR oraz startery do przodu i do tyłu (Tabela 2).</li>
		<li>Rozcieńczyć wzorzec w sterylnej wodzie wolnej od DNA w zakresie od 107 do 102 kopii/μl (np. 1/5 seryjnych rozcieńczeń od 107 do 6,4 x 102 kopii/μL). Rozcieńczyć próbkę kału DNA do 1/2, 1/5, 1/10.</li>
		<li>Przeprowadzić reakcję mieszaniny wzorcowej dla całkowitej liczby reakcji plus 1 (tabela 2).</li>
		<li>Zmieszać 30 μl mieszanki wzorcowej i 5 μl matrycy (wzorcowej, próbki lub wody do kontroli ujemnej)</li>
		<li>Dodaj 10 μl tej mieszanki do każdego dołka w 384-dołkowej płytce optycznej qPCR. Każdą reakcję należy przeprowadzić w trzech egzemplarzach.</li>
		<li>Uszczelnić miejsce qPCR, krótko odwirować i załadować płytkę do maszyny qPCR zaprogramowanej w następujących warunkach cyklicznych: 95 °C przez 20 minut, a następnie 40 cykli po 95 °C przez 15 s i 60 °C przez 1 minutę.</li>
		<li>Uzyskaj wartości CT dla wzorca i próbek.</li>
		<li>Wygeneruj krzywą standardową, wykreślając wartości CT dla wzorców w funkcji logarytmu liczby kopii plazmidu (zgodnie z obliczeniami w kroku 3.1.9). Wykonaj regresję liniową krzywej standardowej.</li>
		<li>Obliczyć liczbę kopii 16S rDNA dla próbek kału poprzez interpolację wartości CT (uzyskanych w kroku 3.2.2) na krzywej standardowej. 
		UWAGA: Liczbę kopii 16S rDNA dla każdej próbki należy skorygować, biorąc pod uwagę współczynnik rozcieńczenia próbki (przygotowany w kroku 3.2.2), końcową objętość kwasów nukleinowych, które zostały wymyte (w kroku 2.15) oraz ilość próbki kału (obliczoną w kroku 2.14) w celu uzyskania kopii genów na gram kału.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Belkaid, Y., Hand, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+microbiota+in+immunity+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Role of the microbiota in immunity and inflammation.</a> Cell. 157 (1), 121-141 (2014).</li>
<li>Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+the+microbiota+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interactions between the microbiota and the immune system.</a> Science. 336 (6086), 1268-1273 (2012).</li>
<li>Ubeda, C., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotics%2C+microbiota%2C+and+immune+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antibiotics, microbiota, and immune defense.</a> Trends in Immunology. 33 (9), 459-466 (2012).</li>
<li>Dethlefsen, L., Huse, S., Sogin, M. L., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pervasive+effects+of+an+antibiotic+on+the+human+gut+microbiota%2C+as+revealed+by+deep+16S+rRNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">The pervasive effects of an antibiotic on the human gut microbiota, as revealed by deep 16S rRNA sequencing.</a> PLoS Biology. 6 (11), e280(2008).</li>
<li>Reikvam, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+murine+intestinal+microbiota%3A+effects+on+gut+mucosa+and+epithelial+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Depletion of murine intestinal microbiota: effects on gut mucosa and epithelial gene expression.</a> PLoS One. 6 (3), e17996(2011).</li>
<li>Hill, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+analyses+reveal+antibiotic-induced+temporal+and+spatial+changes+in+intestinal+microbiota+with+associated+alterations+in+immune+cell+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Metagenomic analyses reveal antibiotic-induced temporal and spatial changes in intestinal microbiota with associated alterations in immune cell homeostasis.</a> Mucosal Immunology. 3 (2), 148-158 (2010).</li>
<li>Fraher, M. H., O'Toole, P. W., Quigley, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+used+to+characterize+the+gut+microbiota%3A+a+guide+for+the+clinician%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Techniques used to characterize the gut microbiota: a guide for the clinician.</a> Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (6), 312-322 (2012).</li>
<li>Eckburg, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+the+human+intestinal+microbial+flora%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diversity of the human intestinal microbial flora.</a> Science. 308 (5728), 1635-1638 (2005).</li>
<li>Sokol, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+counts+of+Fecalibacterium+prausnitzii+in+colitis+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatiry+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">Low counts of Fecalibacterium prausnitzii in colitis microbiota.</a> Inflammatiry Bowel Diseases. 15 (8), 1183-1189 (2009).</li>
<li>Bartosch, S., Fite, A., Macfarlane, G. T., McMurdo, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+bacterial+communities+in+feces+from+healthy+elderly+volunteers+and+hospitalized+elderly+patients+by+using+real-time+PCR+and+effects+of+antibiotic+treatment+on+the+fecal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of bacterial communities in feces from healthy elderly volunteers and hospitalized elderly patients by using real-time PCR and effects of antibiotic treatment on the fecal microbiota.</a> Applied Environmental Microbiology. 70 (6), 3575-3581 (2004).</li>
<li>Ubeda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vancomycin-resistant+Enterococcus+domination+of+intestinal+microbiota+is+enabled+by+antibiotic+treatment+in+mice+and+precedes+bloodstream+invasion+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Vancomycin-resistant Enterococcus domination of intestinal microbiota is enabled by antibiotic treatment in mice and precedes bloodstream invasion in humans.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (12), 4332-4341 (2010).</li>
<li>Saez de Guinoa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1d-mediated+lipid+presentation+by+CD11c%28%2B%29+cells+regulates+intestinal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">CD1d-mediated lipid presentation by CD11c(+) cells regulates intestinal homeostasis.</a> EMBO Journal. 37 (5), (2018).</li>
<li>Kruglov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonredundant+function+of+soluble+LTalpha3+produced+by+innate+lymphoid+cells+in+intestinal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nonredundant function of soluble LTalpha3 produced by innate lymphoid cells in intestinal homeostasis.</a> Science. 342 (6163), 1243-1246 (2013).</li>
<li>Wilhelm, J., Pingoud, A., Hahn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR-based+method+for+the+estimation+of+genome+sizes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR-based method for the estimation of genome sizes.</a> Nucleic Acids Research. 31 (10), e56(2003).</li>
<li>Kembel, S. W., Wu, M., Eisen, J. A., Green, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+16S+gene+copy+number+information+improves+estimates+of+microbial+diversity+and+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Incorporating 16S gene copy number information improves estimates of microbial diversity and abundance.</a> PLoS Computational Biology. 8 (10), e1002743(2012).</li>
<li>Yang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+16S+rRNA+Gene-Targeted+Group-Specific+Primers+for+Real-Time+PCR+Analysis+of+Predominant+Bacteria+in+Mouse+Feces%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Use of 16S rRNA Gene-Targeted Group-Specific Primers for Real-Time PCR Analysis of Predominant Bacteria in Mouse Feces.</a> Applied Environmental Microbiology. 81 (19), 6749-6756 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj przedstawiamy eksperymentalne protokoły doustnego podawania antybiotyków myszom i oznaczania ilościowego bakterii kałowych za pomocą qPCR. Kombinacja antybiotyków stosowanych w tym protokole (zawierających ampicylinę, gentamycynę, neomycynę, metronidazol i wankomycynę) działa zarówno na bakterie Gram-dodatnie, jak i Gram-ujemne, oferując działanie bakteriobójcze wobec pełnego spektrum bakterii. Zarówno doustne zgłębniki, jak i podawanie antybiotyków w wodzie pitnej znacznie zmniejszają obciążenie bakteriami kałowymi 5,6,12. Co więcej, oba zabiegi mają głęboki wpływ na fenotyp myszy, ponieważ rozwijają one kilka cech typowych dla myszy wolnych od zarazków, w tym zmniejszony rozmiar śledziony i powiększone jelito ślepe. Wybór konkretnej metody podawania antybiotyków może zależeć od długości eksperymentu, ponieważ metoda doustnego podawania przez zgłębnik wymaga codziennego podawania antybiotyków, co jest bardziej pracochłonne i może powodować większy dyskomfort u zwierząt w dłuższej perspektywie.
W przypadku podawania antybiotyków w wodzie pitnej należy zachować ostrożność przy dodawaniu słodzika do mieszanki antybiotyków, ponieważ jest to kluczowy czynnik chroniący myszy przed odwodnieniem. Kilka grup wykazało, że podawanie antybiotyków w wodzie pitnej (bez dodatku substancji słodzącej) prowadzi do bardzo ciężkiej i szybkiej utraty wagi, przy czym wszystkie myszy straciły ponad 20% początkowej masy ciała w ciągu pierwszych kilku dni eksperymentu. W naszym protokole użycie słodzika na bazie sacharyny wydawało się wystarczające do zamaskowania smaku antybiotyku w wodzie, a myszy straciły na wadze w ciągu pierwszych kilku dni po podaniu antybiotyku, ale szybko odzyskały wagę po tym (ryc. 1). Niemniej jednak w naszych eksperymentach 5-10% myszy nadal osiąga ludzki punkt końcowy w postaci utraty >20% wyjściowej masy ciała i musiało zostać poddanych eutanazji. Przetestowaliśmy również słodziki na bazie sukralozy, które całkowicie nie zapobiegły odwodnieniu myszy (100% myszy straciło >20% wagi), podczas gdy inni autorzy opublikowali podobne niepowodzenia w przypadku słodzików na bazie aspartamu 5,6. Ponadto należy wziąć pod uwagę wiek, tło genetyczne i ogólny stan zdrowia myszy wykorzystanych do eksperymentów, ponieważ mogą one wpływać na utratę masy ciała i dobrostan zwierząt podczas leczenia antybiotykami. Dlatego przez pierwsze dwa tygodnie doustnego podawania antybiotyków należy codziennie monitorować masę ciała myszy i ogólny stan zdrowia.
Metody qPCR zapewniają szybkie i opłacalne podejście do oznaczania ilościowego 16S rRNA w próbkach kału. Należy jednak wziąć pod uwagę pewne ograniczenia dotyczące tej techniki, w tym: i) wymóg niezawodnego standardu wysokiej jakości; ii) konstrukcję i skuteczność starterów qPCR; iii) fakt, że mikroorganizmy mogą mieć różną liczbę kopii genu 16S rRNA, a zatem kopie genów mogą nie być bezpośrednio równe liczbie komórek15. Niemniej jednak qPCR jest solidną i czułą metodą, która umożliwia szybką analizę próbek kału. Metoda ta może być szczególnie przydatna do szybkiej walidacji wpływu różnych metod leczenia (w tym antybiotyków) na obciążenie bakteriami kałowymi, jak opisano tutaj. Co więcej, chociaż udostępniamy protokół kwantyfikacji całkowitego 16S rRNA, metodę tę można łatwo dostosować (poprzez zaprojektowanie specyficznych starterów16), aby umożliwić identyfikację poszczególnych taksonów bakteryjnych, dostarczając w ten sposób zarówno ilościowych, jak i jakościowych informacji o wielkości i składzie mikrobiomu.
Podsumowując, przedstawiliśmy dwa protokoły doustnego leczenia myszami antybiotykami oraz metodę opartą na qPCR do ilościowego określania zmian w bakteriach kałowych wywołanych antybiotykami. Chociaż protokoły te mogą być dalej optymalizowane i łączone z innymi podejściami zgodnie z indywidualnymi potrzebami eksperymentalnymi, mogą służyć jako szybkie, opłacalne i niezawodne narzędzia do manipulowania mysią mikrobiotą jelitową oraz do badania wpływu antybiotykoterapii na homeostazę jelitową i chorobę.

Błona śluzowa przewodu pokarmowego ssaków jest unikalnym środowiskiem skolonizowanym przez wysoce złożoną mieszaninę mikroorganizmów, które nawiązują wzajemną relację z gospodarzem. System obronny błony śluzowej jelit składa się z warstwy nabłonkowej i mnóstwa komórek odpornościowych, które ograniczają komensale w jelicie, zachowując jednocześnie ich liczbę i różnorodność. I odwrotnie, organizmy komensalne są niezbędne do rozwoju w pełni funkcjonalnego układu odpornościowego. Podczas gdy interakcje między bakteriami gospodarza i komensalnymi są zwykle korzystne, staje się coraz bardziej oczywiste, że rozregulowane wzajemne oddziaływanie układu odpornościowego i mikrobioty może sprzyjać rozwojowi przewlekłych chorób zapalnych, takich jak nieswoiste zapalenie jelit, zapalenie stawów lub astma1,2.
Mikrobiota jelitowa może być zmieniona przez różne czynniki, ale być może najbardziej drastyczne zmiany są wywoływane przez leczenie antybiotykami, które poważnie zmienia zarówno wielkość, jak i skład społeczności bakteryjnych3,4. Chociaż korzyści płynące ze stosowania antybiotyków w leczeniu zakażeń są niepodważalne, zmiany mikrobioty wywołane ekspozycją na antybiotyki u ludzi mogą również modyfikować obronę immunologiczną, co może prowadzić do szkodliwych skutków dla zdrowia. Na przykład antybiotykoterapia u ludzi wiąże się ze zwiększonym ryzykiem biegunki wywołanej przez Clostridium difficile, astmy i niektórych rodzajów raka3. Antybiotykoterapia u myszy podsumowuje wpływ i długoterminowe zmiany stwierdzone w społecznościach jelitowych pacjentów leczonych antybiotykami i umożliwiła zbadanie mechanistycznych powiązań między zmianami w społecznościach drobnoustrojów a funkcją komórek odpornościowych. Jednak kilka doniesień wykazało, że podawanie antybiotyków do wody pitnej ad libitum powoduje bardzo zauważalną utratę wagi, ponieważ myszy powstrzymują się od picia wody, prawdopodobnie z powodu jej nieprzyjemnego smaku5,6. Tak więc w tych modelach ciężkie odwodnienie towarzyszące doustnemu podawaniu antybiotyków może komplikować interpretację eksperymentów mających na celu określenie wpływu antybiotykoterapii na funkcjonowanie komórek odpornościowych.
Kilka podejść może być użytych do zbadania wielkości i składu społeczności mikrobiologicznych w przedziale jelitowym7. Technologie sekwencjonowania nowej generacji dostarczyły bezcennych danych na ten temat8, jednak metody te są stosunkowo drogie i wymagają specjalistycznych analiz bioinformatycznych w celu interpretacji danych. Z drugiej strony, tradycyjne metody hodowli mikrobiologicznej pozwalają na wykrycie gatunków bakterii, ale mają niską czułość, a duża część bakterii komensalnych (zwłaszcza beztlenowców) jest bardzo trudna lub niemożliwa do wyhodowania przy użyciu obecnie dostępnych metod8. Ilościowe techniki łańcuchowej reakcji polimerazy (qPCR) są coraz częściej stosowane do ilościowego oznaczania i identyfikacji gatunków bakterii kałowych, ponieważ zapewniają szybki i wiarygodny, niezależny od hodowli pomiar całkowitego obciążenia mikrobiologicznego. W związku z tym metody qPCR okazały się przydatne do badania zmian mikrobioty związanych z wiekiem lub progresją kilku chorób, w tym nieswoistego zapalenia jelit9,10. W związku z tym metody qPCR zapewniają szybkie i opłacalne podejście do walidacji wpływu różnych metod leczenia (w tym antybiotyków) na obciążenie bakteriami kałowymi i skład mikrobioty10,11,12.
Tutaj prezentujemy szczegółowy opis krok po kroku dwóch odrębnych protokołów doustnego podawania antybiotyków myszom, pobierania próbek kału, ekstrakcji DNA, przygotowywania standardów i kwantyfikacji bakterii w próbkach kału za pomocą qPCR. Protokoły te stanowią wiarygodną metodę manipulowania mikrobiotą jelitową u myszy oraz badania wpływu antybiotykoterapii na homeostazę jelitową i chorobę.

<table><tbody><tr><td>Sól sodowa ampicyliny</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat soli trisiarczanu neomycyny</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>N1876</td><td></td></tr><tr><td>Metronidazol</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>M3761</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek wankomycyny</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>V2002</td><td></td></tr><tr><td>Sól siarczanu gentamycyny</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>G3632</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>T7293</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>Y1625</td><td></td></tr><tr><td>NaCL</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Słodzik Sweet'n Low Sweet'n</td><td>Low</td><td></td><td>Dostępny w Wielkiej Brytanii od Amazon.co.uk</td></tr><tr><td>X-Gal (5-brom-4-chloro-3-indoyl B-D-galaktopiranozyd)</td><td>Fisher 10234923</td><td></td><td></td>naukowy</tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Ultraczysta agaroza</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy RT-PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>AM9935</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wierności</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>Deoksynukleotyd (dNTP) Mieszanina roztworów</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725124</td><td>z</td></tr><tr><td>klonowaniem ROX TOPO TA™ do sekwencjonowania</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>450030</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp szybki stołek DNA mini kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>51604</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep spin Zestaw do miniprzygotowania</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick gel&nbsp; zestaw ekstrakcyjny</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy 0,45 i mikro; m</td><td>Fisher scientific</td><td>10460031</td><td></td></tr><tr><td>Swann-MortonTM Sterylne ostrza skalpela ze stali węglowej</td><td>Fisher scientific</td><td>11792724</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka (1 ml)</td>Strzykawka <td>BD Plastipak</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>(20 ml)</td><td>BD Plastipak</td><td>300613</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Krystalicznie czysta probówka do mikrowirówek</td><td>StarLab</td><td>E1415-1500</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Ultra wysoka probówka do mikrowirówki do odzysku</td><td>StarLab</td><td>I1420-2600</td><td></td></tr><tr><td>Igły dozujące doustne 20 G x 38 mm zakrzywione (pk/3)</td><td>Vet-Tech</td><td>DE008A</td><td></td></tr><tr><td>Sterilin szalka Petriego 50 mm&nbsp;</td><td>Materiały laboratoryjne</td><td>PET2020</td><td></td></tr><tr><td>Absolutne uszczelki płytkowe qPCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB1170</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmpTM optyczna płytka 384-dołkowa&nbsp;</td>System do PCR w czasie rzeczywistym <td>Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)</td><td>4309849</td><td></td></tr><tr><td>ViiA7TM 7 z blokiem 384-dołkowym</td> Spektrofotometr <td>Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)</td><td>4453536</td><td></td></tr><tr><td>(Nanodrop 1000)</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Labnet Prism Mikrowirówka</td><td>Labnet</td><td>C2500</td><td></td></tr><tr><td>MultiGene Optimax Termocykler</td><td>Labnet</td><td>TC9610</td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowe analizy mikrobioty jelitowej myszy po doustnym leczeniu antybiotykami oparte na reakcji łańcuchowej polimerazy

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

Mikrobiota jelitowa ma decydujący wpływ na zdrowie człowieka. Dysbioza mikrobiologiczna jest związana z wieloma powszechnymi immunopatologiami, takimi jak nieswoiste zapalenie jelit, astma i zapalenie stawów. W związku z tym kluczowe znaczenie ma zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw wzajemnych oddziaływań między mikrobiotą a układem odpornościowym. Podawanie antybiotyków, wspomagając usuwanie patogenów, wywołuje również drastyczne zmiany w wielkości i składzie społeczności bakteryjnych jelit, co może mieć wpływ na zdrowie człowieka. Antybiotykoterapia u myszy podsumowuje wpływ i długoterminowe zmiany w mikrobiocie ludzkiej u pacjentów leczonych antybiotykami oraz umożliwia badanie mechanistycznych powiązań między zmianami w zbiorowiskach drobnoustrojów a funkcją komórek odpornościowych. Chociaż opisano kilka metod antybiotykoterapii myszy, niektóre z nich wywołują poważne odwodnienie i utratę wagi, co komplikuje interpretację danych. W tym miejscu udostępniamy dwa protokoły doustnego podawania antybiotyków, które można stosować do długotrwałego leczenia myszy bez wywoływania znacznej utraty wagi. Protokoły te wykorzystują kombinację antybiotyków, które są ukierunkowane zarówno na bakterie Gram-dodatnie, jak i Gram-ujemne i mogą być dostarczane ad libitum w wodzie pitnej lub przez zgłębnik doustny. Ponadto opisano metodę ilościowego oznaczania gęstości drobnoustrojów w próbkach kału metodą qPCR, która może być wykorzystana do walidacji skuteczności antybiotykoterapii. Połączenie tych podejść zapewnia wiarygodną metodologię manipulacji mikrobiotą jelitową i badania skutków antybiotykoterapii u myszy.

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy dwa alternatywne protokoły doustnej antybiotykoterapii myszy. Rysunek 1 przedstawia procent masy ciała (w odniesieniu do wyjściowej masy ciała każdego zwierzęcia) u myszy leczonych antybiotykami podanymi drogą gavage (kolor czerwony) lub w wodzie pitnej (kolor niebieski) przez 10 kolejnych dni. U myszy otrzymujących antybiotyki drogą gavage nie stwierdzono zauważalnej utraty masy ciała. Jednakże, gdy myszy są leczone antybiotykami ad libitum podając go w wodzie pitnej, tracą masę ciała (~10%) w ciągu pierwszych kilku dni podawania antybiotyku, lecz następnie odzyskują prawidłowe tempo przyrostu masy ciała (Rycina 1). Niemniej jednak, około 5–10% myszy otrzymujących antybiotyki w wodzie do picia może osiągnąć &gt;utrata 20% masy ciała w ciągu pierwszego tygodnia leczenia, w takim przypadku zwierzęta są poddawane eutanazji.
Ilościowe oznaczenie bakterii w próbkach kału wymaga zastosowania odpowiedniej krzywej wzorcowej, którą uzyskuje się poprzez wykreślenie logarytmu liczby kopii standardu (obliczonego w kroku 3.2.2) w funkcji wartości CT uzyskanych w qPCR (krok 3.2.7). Rycina 2A przedstawia reprezentatywny przykład krzywej wzorcowej spełniającej kryteria wydajności z wartością R2 wynoszącą 0,99827, nachyleniem -3,09 i wydajnością ((-1 + 10^(-1/slope))*100) na poziomie 110%. Preferowane są wartości R2 rzędu 0,99 oraz wydajność PCR w zakresie od 90 do 110%. W zakresie liniowym równanie analizy regresji umożliwia ilościowe oznaczenie liczby kopii 16S rDNA w próbkach kału. Rycina 2B przedstawia liczbę kopii 16S rDNA w kału, treści jelita cienkiego (SI) oraz ścianie SI. Na Rycynie 2B dane dla kału i treści SI przedstawiono jako liczba kopii 16S rDNA/g próbki. W przypadku ściany SI dane przedstawiono jako całkowitą liczbę kopii 16S rDNA uzyskanych z bakterii wyizolowanych z 3 cm ściany SI (ponieważ ilość materiału wyjściowego jest zbyt mała, aby uzyskać dokładną wagę).
Aby ocenić wpływ antybiotyków na gęstość bakterii w próbkach kału, myszy otrzymywały antybiotyki drogą gavage doustnie codziennie przez 10 dni (dni 1–10), a próbki kału pobierano przed rozpoczęciem (dzień 0), w różnych punktach czasowych podczas leczenia antybiotykiem (dni 5 i 10) oraz 7 dni po zaprzestaniu podawania antybiotyku (dzień 17; Rysunek 3A). Jak pokazano na Rysunku 3B, leczenie antybiotykiem wywołuje znaczny spadek liczby kopii 16S rDNA/g kału wykrytych w dniach 5 i 10, podczas gdy gęstość bakterii w kale powróciła do poziomu prawidłowego (porównywalnego z poziomem przed leczeniem) 1 tydzień po zaprzestaniu podawania antybiotyku (dzień 17).
<img alt="Trend masy ciała (%) w czasie (dni) dla podawania doustnego i wody pitnej; porównanie na wykresie liniowym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58481/58481fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Podawanie antybiotyków. Myszy otrzymywały antybiotyki drogą gavage (czerwony) lub w wodzie pitnej (niebieski) przez 10 kolejnych dni. Wykres przedstawia masę myszy w trakcie trwania eksperymentów w stosunku do masy początkowej przed podaniem antybiotyków (dzień 0). Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58481/58481fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Krzywa standardowa qPCR i liczba kopii 16S rDNA, wykres, analiza mikrobiomu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58481/58481fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Amplifikacja qPCR genu 16S rRNA dla standardów i próbek kału. (A) Regresja liniowa krzywej standardowej wraz z parametrami krzywej. (B) Obliczenie liczby kopii genów w próbkach kału. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58481/58481fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Oś czasu leczenia antybiotykami i wykres słupkowy liczby kopii 16S rDNA/g w ciągu 17 dni." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58481/58481fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Bakterie kałowe podczas leczenia antybiotykami. (A) Schemat harmonogramu podawania antybiotyków (Ab) drogą zgłębnika doustnego oraz pobierania próbek, oznaczonych symbolem *. (B) Liczba kopii 16S rDNA na gram kału w próbkach od myszy pobranych we wskazanych dniach. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58481/58481fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Objętość</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwas deoksyrybonukleinowy (DNA)</td>
			<td>8 µL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor 10X</td>
			<td>2 µL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP (10mM)</td>
			<td>0.4 µL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eubacteria - starter F (10 mM)</td>
			<td>1 µL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eubacteria - starter R (10 mM)</td>
			<td>1 µL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polimeraza Taq</td>
			<td>0.2 µL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>7.4 µL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objętość całkowita</td>
			<td>20 µL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sekwencje starterów</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eubacteria - starter F</td>
			<td>5' ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT 3'</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eubacteria - starter R</td>
			<td>5' ATTACCGCGGCTGCTGGC 3'</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warunki cykliczne</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperatura</td>
			<td>Czas</td>
			<td>Cykle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>94 °C</td>
			<td>5 min</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>94 °C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>30x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 °C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>30x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>72 °C</td>
			<td>1 min</td>
			<td>30x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>72 °C</td>
			<td>5 min</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 °C</td>
			<td>∞</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Odczynniki i warunki PCR. Tabela ta przedstawia odczynniki oraz warunki cykli PCR do amplifikacji genu 16S rRNA z hodowli bakteryjnej w celu wytworzenia standardu do zastosowania w analizach qPCR. Sekwencje starterów zostały pierwotnie opublikowane przez Kruglova et al.13.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Objętość</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gotowa mieszanina SYBR Green master mix (2x)</td>
			<td>17.5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eubacteria - starter F (10 mM)</td>
			<td>0.7 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eubacteria - starter R (10 mM)</td>
			<td>0.7 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>11.1 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Master mix do qPCR. Przedstawione objętości (objętość końcowa 35 µL) dotyczą pojedynczej próbki analizowanej w trzech powtórzeniach (po 10 µL każda) na 384-dołkowej płytce do qPCR (uwzględniając dodatkowe 5 µL na błędy pipetowania). Ilość tę można zwiększyć proporcjonalnie do liczby analizowanych próbek.

Tutaj udostępniamy szczegółowe protokoły doustnego podawania antybiotyków myszom, pobierania próbek kału, ekstrakcji DNA i kwantyfikacji bakterii kałowych metodą qPCR.

Ilościowe analizy mikrobioty jelitowej myszy po doustnym leczeniu antybiotykami oparte na reakcji łańcuchowej polimerazy

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

Protokół ten zapewnia wiarygodną metodę ilościowego określania zmian w mikrobiocie jelitowej myszy po podaniu doustnych antybiotyków. Może to pomóc w badaniach nad interakcjami między mikrobiotą, dostarczając informacji na temat patologii związanych z dysbiozą mikrobiologiczną, takich jak nieswoiste zapalenie jelit. Główną zaletą tych schematów leczenia antybiotykami jest to, że zapobiegają one charakterystycznej utracie masy ciała, która zwykle wiąże się z doustnym podawaniem antybiotyków myszom.Aby przygotować antybiotykoterapię za pomocą zgłębnika doustnego, przygotuj koktajl antybiotyków, mieszając roztwory podstawowe, które zostały przygotowane zgodnie z opisem w protokole technicznym. Na objętość mililitra wymieszaj 50 mikrolitrów ampicyliny, 50 mikrolitrów gentamycyny, 50 mikrolitrów neomycyny, 500 mikrolitrów metronidazolu, 25 mikrolitrów wankomycyny i 325 mikrolitrów wody. Załaduj mieszaninę antybiotyków na jednomililitrową strzykawkę, eliminując wszelkie pęcherzyki i przymocuj odpowiednią igłębkę.Chwyć mocno skórę nad ramieniem myszy i rozciągnij głowę i szyję, aby wyprostować przełyk. Skieruj końcówkę kulkową igły do karmienia wzdłuż podniebienia i w kierunku tylnej części gardła. Następnie delikatnie przepuść go do przełyku i wstrzyknij 200 mikrolitrów roztworu.Podawaj koktajl antybiotykowy raz dziennie przez czas trwania eksperymentu. Alternatywnie, aby podawać antybiotyki przez wodę pitną, przygotuj koktajl antybiotyków zgodnie z opisem w protokole technicznym. Ważne jest, aby dodać słodzik do mieszanki antybiotyków, ponieważ jest to kluczowy czynnik zapobiegający odwodnieniu myszy.Wlej koktajl antybiotykowy do butelki z wodą w ilości około 100 mililitrów na butelkę. Chroń butelkę przed światłem i umieść w klatce na mysz. Zastąp koktajl antybiotykowy świeżym bulionem dwa razy w tygodniu na czas trwania eksperymentu.Dokładne monitorowanie masy ciała i ogólnego stanu zdrowia myszy powinno być prowadzone codziennie przez cały okres podawania antybiotyków. Zważ i oznacz dwie mililitrowe probówki autoklawu do pobrania próbki. W celu pobrania świeżych próbek kału umieść każdą mysz w ograniczniku.Następnie zbierz granulki kału bezpośrednio z odbytu w probówce zbiorczej. Po przeprowadzeniu eutanazji zgodnie z opisem w protokole technicznym należy położyć tuszę myszy z całkowicie odsłoniętym brzuchem i spryskać okolice brzucha 70% etanolem. Za pomocą wysterylizowanych kleszczy i nożyczek wykonaj poprzeczne nacięcie w jamie brzusznej, aby odsłonić usztywnienie bez uszkadzania jakichkolwiek tkanek wewnętrznych.Podnieś okołodoczną i wykonaj nacięcie, aby odsłonić jelita. Usuń jelita kleszczami i nożyczkami i umieść je na sterylnej szalce Petriego. Ostrożnie użyj kleszczy, aby oddzielić jelito cienkie od tętnic krezkowych i tłuszczu.Rozszerz jelito i umieść je na czystej chusteczce laboratoryjnej. Za pomocą linijki zmierz i odetnij cztery centymetry dystalnego odcinka jelita krętego jelita cienkiego. Wytnij i wyrzuć jeden centymetr jelita proksymalnego do jelita ślepego.Pozostanie trzycentymetrowa część jelita krętego, która zostanie wykorzystana do zebrania bakterii jelitowych. Przytrzymaj część jelita krętego nad sterylną probówką o pojemności dwóch mililitrów. Zebrać zawartość jelita, bezpośrednio wytłaczając jelito i pobierając próbkę do probówki.Ta próbka będzie zawierała bakterie z zawartości jelita krętego. Przygotuj 20-mililitrową strzykawkę z zimną solą fizjologiczną buforowaną fosforanem i przepłucz część jelita krętego, odrzucając przepływ. Umieść porcję jelita krętego na sterylnej szalce Petriego i otwórz ją wzdłuż nożyczkami.Zeskrob wnętrze ściany jelita krętego skalpelem. Zbierz wszelkie bakterie na skalpelu, myjąc go jednym mililitrem PBS nad czystą probówką wirówkową. Wiruj z prędkością ośmiu tysięcy razy G przez pięć minut, aby osadzać bakterie.Po odwirowaniu odrzucić supernatant. Ta próbka będzie zawierała bakterie ze ściany jelita krętego. Zważyć probówki zawierające próbki kału i jelita krętego.Odejmij masę od pustych probówek, aby uzyskać masę kału w każdej próbce. Ekstrahuj bakteryjne DNA z próbek kału, zawartości jelita krętego i ściany jelita krętego za pomocą dostępnych na rynku zestawów. Przechowuj próbki DNA w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu użycia.Rozmrozić na lodzie wzorzec qPCR, próbkę kału DNA i odczynniki qPCR z dostępnego w handlu zestawu. Rozcieńczyć wzorzec w sterylnej wodzie wolnej od DNA w zakresie od 10 do siedmiu do 10 do dwóch kopii na mikrolitr. Rozcieńczyć DNA próbki kału do stężeń połowy, jednej piątej i jednej dziesiątej.Następnie wykonaj reakcję mieszanki wzorcowej dla całkowitej liczby reakcji plus jeden. Zmieszać 30 mikrolitrów mieszanki wzorcowej i 5 mikrolitrów matrycy, która jest wzorcem, próbką lub wodą do kontroli ujemnej. Następnie dodaj 10 mikrolitrów tej mieszanki do każdego dołka w 384-dołkowej płytce optycznej qPCR.Każdą reakcję należy przeprowadzić w trzech egzemplarzach. Uszczelnić płytkę qPCR i krótko odwirować. Następnie załaduj płytkę na maszynę qPCR, która jest zaprogramowana zgodnie z listą w protokole technicznym.Na koniec uzyskaj wartości progowe cyklu dla wzorca i próbek przed obliczeniem liczby kopii 16S rDNA dla próbek kału. Reprezentatywne wyniki wskazują na utratę masy ciała u myszy po podaniu antybiotyków przez zgłębnik doustny lub przez wodę pitną. Nie wykryto zauważalnej utraty masy ciała u myszy, które otrzymują antybiotyki przez zgłębnik doustny.Kiedy myszy są leczone antybiotykami w wodzie pitnej, tracą około 10% masy ciała w ciągu pierwszych kilku dni leczenia, ale następnie odzyskują normalny przyrost masy ciała. Kwantyfikacja bakterii w próbkach kału wymaga użycia krzywej wzorcowej uzyskanej przez wykreślenie logarytmu liczby kopii dla wzorca w porównaniu z wartościami C-T uzyskanymi w qPCR. W zakresie liniowym równanie analizy regresji umożliwia ilościowe określenie obfitości 16S rDNA w próbkach kału.Jak pokazano tutaj dla próbek kału, treści z jelita cienkiego i ściany jelita cienkiego. Po pięciu lub 10 dniach doustnego podawania antybiotyków następuje silny spadek gęstości bakterii w próbkach kału myszy leczonych antybiotykiem. Jednak gęstość bakterii w kale powróciła do normalnego poziomu po tygodniu od zaprzestania podawania antybiotyku.Zarówno doustne podawanie przez zgłębnik, jak i podawanie antybiotyków w wodzie pitnej na krótko zmniejszają obciążenie bakteriami kałowymi u leczonych myszy. Naukowcy, którzy wybierają indywidualną metodę, która lepiej odpowiada wymaganiom eksperymentalnym, biorąc pod uwagę takie czynniki, jak długość leczenia. Metoda qPCR do oznaczania ilościowego bakterii może być modyfikowana w celu ilościowego określenia poszczególnych taksonów bakteryjnych przy użyciu określonych starterów.Dostarczy to zarówno ilościowych, jak i jakościowych informacji na temat wielkości i składu mikrobiomu.

quantitative-polymerase-chain-reaction-based-analyses-murine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Lo, B. C. i in. Przewlekła infekcja salmonellą wywołana włóknieniem jelit. J. Vis. Exp. (2019)Film demonstruje ilościowe określenie obciążenia bakteryjnego w mysiim modelu przewlekłej infekcji streptomycynowooporną Salmonella typhimurium. Po eutanazji i sterylnej sekcji pobierane są tkanki cekalne i śledzionowe, ujednolicane stalowymi kulkami w celu uwalniania bakterii i seryjne rozcieńczane. Rozcieńczenia nakładane są na selektywnym agarze, a widoczne kolonie są liczone w celu...

Ilościowa ilościowa ilość obciążenia bakteryjnego tkanki w modelu myszy przewlekłej infekcji jelit

Skuteczność antybiotyku jest najczęściej określana poprzez przeprowadzanie badań kinetycznych zabijania i pomiar jednostek tworzących kolonie (CFU). Integrując skaningową mikroskopię elektronową (SEM) z tymi standardowymi metodami, możemy rozróżnić efekty farmakologiczne leczenia między różnymi antybiotykami.

Protokół charakteryzujący zmiany morfologiczne Clostridium difficile w odpowiedzi na leczenie antybiotykami

Uważa się, że bakteriocyny odgrywają kluczową rolę w definiowaniu różnorodności mikrobiologicznej w różnych niszach ekologicznych. W tym miejscu opisujemy skuteczną procedurę oceny wpływu bakteriocyny na skład mikrobioty jelitowej na modelu zwierzęcym.

Metoda oceny wpływu bakteriocyny na mikrobiotę jelitową myszy

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy, ustandaryzowany protokół wysokoprzepustowego sekwencjonowania 16S rRNA-amplikon. Protokół wprowadza zintegrowany, ujednolicony, wykonalny i niedrogi protokół, począwszy od pobierania próbek kału poprzez analizę danych. Protokół ten umożliwia analizę dużej liczby próbek z zachowaniem rygorystycznych norm i kilkoma kontrolami.

Protokół z przewodnikiem do charakterystyki drobnoustrojów kałowych za pomocą sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA

Wzbogacenie środowiska (EE) to środowisko przetrzymywania zwierząt, które służy do ujawniania mechanizmów leżących u podstaw powiązań między stylem życia, stresem i chorobami. Protokół ten opisuje procedurę, która wykorzystuje mysi model nowotworzenia jelita grubego i EE w celu szczegółowego zdefiniowania zmian w różnorodności biologicznej mikrobioty, które mogą mieć wpływ na śmiertelność zwierząt.

Metoda określania wpływu wzbogacania środowiska na bioróżnorodność biomu mikrobiomu jelita grubego w mysim modelu guza jelita grubego

Tutaj prezentujemy protokół hodowli mikrobioty jelitowej jelita grubego in vitro, przy użyciu szeregu bioreaktorów, które symulują warunki fizjologiczne przewodu pokarmowego.

Zastosowanie zaawansowanej technologii hodowli in vitro do badania mikrobioty jelitowej człowieka

Ten protokół zapewnia prostą, opłacalną metodę izolacji DNA do analizy zmian mikroflory jelitowej myszy podczas rozwoju choroby autoimmunologicznej.

Analiza dynamiki mikrobioty kałowej u myszy podatnych na toczeń przy użyciu prostej, opłacalnej metody izolacji DNA

Tutaj opisujemy podawanie leków za pomocą mikropipet (MDA) jako alternatywną metodę do doustnego podawania leków, która zachęca zwierzę badawcze do łatwego przyjmowania leków przy minimalnym stresie i dyskomforcie.

Stosowanie podawania leków pod kontrolą mikropipet jako metody alternatywnej dla doustnego podawania przez zgłębnik w modelach gryzoni

Protokół ten opisuje niezbędne kroki kolonizacji myszy z pks+ Escherichia coli w warunkach niezapalnych, a także nieinwazyjne metody walidacji kolonizacji i oceny ekspansji pks+ E. coli w kału.

Kolonizacja przez myszą pks+ Escherichia coli w warunkach niezapalnych

Rośnie zainteresowanie ilościową charakterystyką limfocytów jelitowych ze względu na coraz większą świadomość, że komórki te odgrywają kluczową rolę w różnych chorobach jelitowych i ogólnoustrojowych. W tym protokole opisujemy, jak izolować populacje pojedynczych komórek z różnych przedziałów jelita cienkiego w celu późniejszej charakterystyki cytometrii przepływowej.

Izolacja i charakterystyka cytometryczna mysich limfocytów jelita cienkiego

Poznaj metodę ilościowej analizy mikrobioty jelitowej myszy po doustnym podaniu antybiotyków opartą na qPCR. Protokół minimalizuje utratę masy ciała i umożliwia badanie dysbiozy mikrobiologicznej.

Ilościowe analizy mikrobioty jelitowej myszy po doustnym leczeniu antybiotykami oparte na reakcji łańcuchowej polimerazy

Przeglądaj więcej filmów