Ilościowe analizy mikrobioty jelitowej myszy po doustnym leczeniu antybiotykami oparte na reakcji łańcuchowej polimerazy
November 17th, 2018
Tutaj udostępniamy szczegółowe protokoły doustnego podawania antybiotyków myszom, pobierania próbek kału, ekstrakcji DNA i kwantyfikacji bakterii kałowych metodą qPCR.
Protokół ten zapewnia wiarygodną metodę ilościowego określania zmian w mikrobiocie jelitowej myszy po podaniu doustnych antybiotyków. Może to pomóc w badaniach nad interakcjami między mikrobiotą, dostarczając informacji na temat patologii związanych z dysbiozą mikrobiologiczną, takich jak nieswoiste zapalenie jelit. Główną zaletą tych schematów leczenia antybiotykami jest to, że zapobiegają one charakterystycznej utracie masy ciała, która zwykle wiąże się z doustnym podawaniem antybiotyków myszom.
Aby przygotować antybiotykoterapię za pomocą zgłębnika doustnego, przygotuj koktajl antybiotyków, mieszając roztwory podstawowe, które zostały przygotowane zgodnie z opisem w protokole technicznym. Na objętość mililitra wymieszaj 50 mikrolitrów ampicyliny, 50 mikrolitrów gentamycyny, 50 mikrolitrów neomycyny, 500 mikrolitrów metronidazolu, 25 mikrolitrów wankomycyny i 325 mikrolitrów wody. Załaduj mieszaninę antybiotyków na jednomililitrową strzykawkę, eliminując wszelkie pęcherzyki i przymocuj odpowiednią igłębkę.
Chwyć mocno skórę nad ramieniem myszy i rozciągnij głowę i szyję, aby wyprostować przełyk. Skieruj końcówkę kulkową igły do karmienia wzdłuż podniebienia i w kierunku tylnej części gardła. Następnie delikatnie przepuść go do przełyku i wstrzyknij 200 mikrolitrów roztworu.
Podawaj koktajl antybiotykowy raz dziennie przez czas trwania eksperymentu. Alternatywnie, aby podawać antybiotyki przez wodę pitną, przygotuj koktajl antybiotyków zgodnie z opisem w protokole technicznym. Ważne jest, aby dodać słodzik do mieszanki antybiotyków, ponieważ jest to kluczowy czynnik zapobiegający odwodnieniu myszy.
Wlej koktajl antybiotykowy do butelki z wodą w ilości około 100 mililitrów na butelkę. Chroń butelkę przed światłem i umieść w klatce na mysz. Zastąp koktajl antybiotykowy świeżym bulionem dwa razy w tygodniu na czas trwania eksperymentu.
Dokładne monitorowanie masy ciała i ogólnego stanu zdrowia myszy powinno być prowadzone codziennie przez cały okres podawania antybiotyków. Zważ i oznacz dwie mililitrowe probówki autoklawu do pobrania próbki. W celu pobrania świeżych próbek kału umieść każdą mysz w ograniczniku.
Następnie zbierz granulki kału bezpośrednio z odbytu w probówce zbiorczej. Po przeprowadzeniu eutanazji zgodnie z opisem w protokole technicznym należy położyć tuszę myszy z całkowicie odsłoniętym brzuchem i spryskać okolice brzucha 70% etanolem. Za pomocą wysterylizowanych kleszczy i nożyczek wykonaj poprzeczne nacięcie w jamie brzusznej, aby odsłonić usztywnienie bez uszkadzania jakichkolwiek tkanek wewnętrznych.
Podnieś okołodoczną i wykonaj nacięcie, aby odsłonić jelita. Usuń jelita kleszczami i nożyczkami i umieść je na sterylnej szalce Petriego. Ostrożnie użyj kleszczy, aby oddzielić jelito cienkie od tętnic krezkowych i tłuszczu.
Rozszerz jelito i umieść je na czystej chusteczce laboratoryjnej. Za pomocą linijki zmierz i odetnij cztery centymetry dystalnego odcinka jelita krętego jelita cienkiego. Wytnij i wyrzuć jeden centymetr jelita proksymalnego do jelita ślepego.
Pozostanie trzycentymetrowa część jelita krętego, która zostanie wykorzystana do zebrania bakterii jelitowych. Przytrzymaj część jelita krętego nad sterylną probówką o pojemności dwóch mililitrów. Zebrać zawartość jelita, bezpośrednio wytłaczając jelito i pobierając próbkę do probówki.
Ta próbka będzie zawierała bakterie z zawartości jelita krętego. Przygotuj 20-mililitrową strzykawkę z zimną solą fizjologiczną buforowaną fosforanem i przepłucz część jelita krętego, odrzucając przepływ. Umieść porcję jelita krętego na sterylnej szalce Petriego i otwórz ją wzdłuż nożyczkami.
Zeskrob wnętrze ściany jelita krętego skalpelem. Zbierz wszelkie bakterie na skalpelu, myjąc go jednym mililitrem PBS nad czystą probówką wirówkową. Wiruj z prędkością ośmiu tysięcy razy G przez pięć minut, aby osadzać bakterie.
Po odwirowaniu odrzucić supernatant. Ta próbka będzie zawierała bakterie ze ściany jelita krętego. Zważyć probówki zawierające próbki kału i jelita krętego.
Odejmij masę od pustych probówek, aby uzyskać masę kału w każdej próbce. Ekstrahuj bakteryjne DNA z próbek kału, zawartości jelita krętego i ściany jelita krętego za pomocą dostępnych na rynku zestawów. Przechowuj próbki DNA w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu użycia.
Rozmrozić na lodzie wzorzec qPCR, próbkę kału DNA i odczynniki qPCR z dostępnego w handlu zestawu. Rozcieńczyć wzorzec w sterylnej wodzie wolnej od DNA w zakresie od 10 do siedmiu do 10 do dwóch kopii na mikrolitr. Rozcieńczyć DNA próbki kału do stężeń połowy, jednej piątej i jednej dziesiątej.
Następnie wykonaj reakcję mieszanki wzorcowej dla całkowitej liczby reakcji plus jeden. Zmieszać 30 mikrolitrów mieszanki wzorcowej i 5 mikrolitrów matrycy, która jest wzorcem, próbką lub wodą do kontroli ujemnej. Następnie dodaj 10 mikrolitrów tej mieszanki do każdego dołka w 384-dołkowej płytce optycznej qPCR.
Każdą reakcję należy przeprowadzić w trzech egzemplarzach. Uszczelnić płytkę qPCR i krótko odwirować. Następnie załaduj płytkę na maszynę qPCR, która jest zaprogramowana zgodnie z listą w protokole technicznym.
Na koniec uzyskaj wartości progowe cyklu dla wzorca i próbek przed obliczeniem liczby kopii 16S rDNA dla próbek kału. Reprezentatywne wyniki wskazują na utratę masy ciała u myszy po podaniu antybiotyków przez zgłębnik doustny lub przez wodę pitną. Nie wykryto zauważalnej utraty masy ciała u myszy, które otrzymują antybiotyki przez zgłębnik doustny.
Kiedy myszy są leczone antybiotykami w wodzie pitnej, tracą około 10% masy ciała w ciągu pierwszych kilku dni leczenia, ale następnie odzyskują normalny przyrost masy ciała. Kwantyfikacja bakterii w próbkach kału wymaga użycia krzywej wzorcowej uzyskanej przez wykreślenie logarytmu liczby kopii dla wzorca w porównaniu z wartościami C-T uzyskanymi w qPCR. W zakresie liniowym równanie analizy regresji umożliwia ilościowe określenie obfitości 16S rDNA w próbkach kału.
Jak pokazano tutaj dla próbek kału, treści z jelita cienkiego i ściany jelita cienkiego. Po pięciu lub 10 dniach doustnego podawania antybiotyków następuje silny spadek gęstości bakterii w próbkach kału myszy leczonych antybiotykiem. Jednak gęstość bakterii w kale powróciła do normalnego poziomu po tygodniu od zaprzestania podawania antybiotyku.
Zarówno doustne podawanie przez zgłębnik, jak i podawanie antybiotyków w wodzie pitnej na krótko zmniejszają obciążenie bakteriami kałowymi u leczonych myszy. Naukowcy, którzy wybierają indywidualną metodę, która lepiej odpowiada wymaganiom eksperymentalnym, biorąc pod uwagę takie czynniki, jak długość leczenia. Metoda qPCR do oznaczania ilościowego bakterii może być modyfikowana w celu ilościowego określenia poszczególnych taksonów bakteryjnych przy użyciu określonych starterów.
Dostarczy to zarówno ilościowych, jak i jakościowych informacji na temat wielkości i składu mikrobiomu.
Przegląd
Ten protokół zapewnia niezawodną metodę ilościowego określania zmian w mikrobiocie jelitowej myszy po oralnym podaniu antybiotyków. Pomaga w badaniach nad interakcjami mikrobioty i patologiami związanymi z dysbiozą mikrobiomu.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Mikrobiologia
- Neuronauki
- Farmakologia
Tło
- Zrozumienie wpływu antybiotyków na mikrobiotę jelitową jest kluczowe dla badań nad powiązanymi chorobami.
- Leczenie antybiotykami może prowadzić do dysbiozy mikrobiomu, wpływając na ogólne zdrowie.
- Utrata wagi jest częstym efektem ubocznym podawania antybiotyków myszom.
- Protokoły dotyczące skutecznego podawania i monitorowania są niezbędne do uzyskania dokładnych wyników.
Cel badania
- Ustanowienie metody podawania antybiotyków myszom bez znaczącej utraty wagi.
- Zbieranie i analiza próbek kału w celu ilościowego określenia DNA bakterii.
- Zbadanie wpływu antybiotyków na skład mikrobioty jelitowej.
Zastosowane metody
- Przygotowanie koktajli antybiotyków do podawania przez zgłębnik lub do wody pitnej.
- Zbieranie próbek kału i treści jelitowej po eutanazji.
- Ekstrakcja DNA z próbek przy użyciu komercyjnych zestawów.
- Ilościowe określenie bakterii poprzez analizę qPCR.
Główne wyniki
- Myszy, którym podawano antybiotyki przez zgłębnik, nie występowała znacząca utrata wagi.
- Antybiotyki w wodzie pitnej prowadziły do początkowej utraty wagi, jednak obserwowano odzyskanie.
- Ilościowe określenie DNA bakterii ujawniło znaczące zmiany w składzie mikrobioty.
- Ustalono krzywe standardowe dla dokładnego pomiaru obfitości 16S rDNA.
Wnioski
- Protokół skutecznie minimalizuje utratę wagi podczas leczenia antybiotykami u myszy.
- Przedstawia niezawodną metodę badania wpływu antybiotyków na mikrobiotę jelitową.
- Wyniki przyczyniają się do lepszego zrozumienia dysbiozy mikrobiomu i jej implikacji zdrowotnych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables reliable quantification of murine intestinal microbiota changes following oral antibiotic treatment, supporting preclinical studies of microbial dysbiosis linked to immunopathologies. By minimizing weight loss artifacts, it improves data interpretability for target validation in inflammation and immune-mediated disease models. The qPCR-based bacterial density assay provides quantitative, reproducible outputs essential for mechanistic de-risking and predictive confidence in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microbiota-immune crosstalk hypotheses in inflammatory bowel disease and arthritis models.
- Operational Value: Provides weight-stable antibiotic regimens that reduce confounding variables in target phenotype assessment.
- Predictive Value: Supports functional target validation by correlating microbial density shifts with immune cell functional readouts.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Delivers standardized fecal sample preparation and DNA extraction compatible with high-throughput qPCR platforms.
- Quantitative Output: Generates 16S rDNA copy number measurements via standard curves, enabling lot-to-lot consistency in microbiome modulation studies.
- Scalability: Supports longitudinal sampling designs for dose-response and time-course screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models antibiotic-induced dysbiosis observed in human patients, enhancing translational validity of preclinical findings.
- Mechanistic De-risking: Links microbial community changes to immune cell function, reducing ambiguity in pathway-target relationships.
- Preclinical Continuity: Enables longitudinal tracking of microbiota recovery post-treatment, informing safety and resistance risk assessments.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead optimization, providing microbiota modulation as a mechanistic variable in immunology and infectious disease programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of microbiota-dependent phenotypes in disease models via controlled antibiotic perturbation.
- Screening: Enables assay-ready microbiome samples for evaluating compound effects on bacterial load and composition.
- Analytics: Delivers quantitative 16S rDNA abundance data that allows cross-condition comparison and effect size calculation.
- Translational Research: Connects murine microbiota changes to human-relevant dysbiosis patterns, supporting biomarker-aligned study designs.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable microbiota quantification capability applicable across multiple therapeutic areas and model systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing weight-loss confounders in microbiota-immune studies.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized antibiotic cocktails and qPCR validation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing mechanistic links between microbial shifts and immune outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on microbiota-dependent disease relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine handling, oral gavage technique, and anaerobic sample processing.
- Depends on qPCR instrumentation, standard curve generation, and DNA extraction kit compatibility.
- Necessitates cross-team standardization for sample collection timing, storage, and normalization procedures.
- Involves adaptation considerations when extending to different mouse strains, antibiotic combinations, or intestinal segments.
- Includes practical limitations such as the need for euthanasia to access intestinal tissue and potential variability in fecal pellet yield.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:39
Administration of Antibiotics
2:29
Collection of Fecal Samples from Stool, Ileum Content and Ileum Wall
5:16
Quantification of Intestinal Microbiota by qPCR
6:33
Results: Quantification of Intestinal Microbiota by qPCR after Oral Antibiotic Treatment
7:51
Conclusion
