Name: Nowe metody podawania donosowego w znieczuleniu wziewnym w celu oceny dostarczania leków z nosa do mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-14T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Poznaj nowe metody podawania donosowego w znieczuleniu wziewnym do oceny dostarczania leków z nosa do mózgu u myszy. Technika umożliwia ilościową analizę dystrybucji leków przy minimalnym stresie zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było częściowo wspierane przez Private University Research Branding Project od MEXT; Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (17K08249 [do T.K. i T.S.]) od Japan Society for the Promotion of Science (JSPS); grant na wspólne badania od Hamaguchi Foundation for the Advancement of Biochemistry [dla T.S.] oraz Fundacji Naukowej Takeda [dla T.K.]. Dziękujemy Panu Yuya Nito i Pani Akiko Asami za ich cenną pomoc techniczną w przeprowadzeniu eksperymentów.

To badanie na zwierzętach (#AP17P004) zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Nihon (Tokio, Japonia). To badanie (#17-0001) zostało zatwierdzone przez Centrum Radioizotopów Szkoły Farmacji Uniwersytetu Nihon.
1. Zwierzęta używane do donosowego podawania w znieczuleniu wziewnym
<ol>
	<li>Myszy eksperymentalne należy umieścić w klatkach ze stali nierdzewnej w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność (światło w godzinach 8:00–20:00), z kontrolowaną temperaturą utrzymywaną na poziomie 23 ± 1°C, wilgotnością 50% ± 10% oraz dostępem ad libitum do pożywienia i wody.</li>
	<li>Przed eksperymentem należy znieczulić myszy poprzez inhalację 2% izofluranu, po rozpoczęciu leczenia w stężeniu 4%. Potwierdź wymagany poziom znieczulenia, sprawdzając, czy nie zniknęła korekta powierzchni. </li>
</ol>
2. Przygotowanie rozwiązania administracyjnego
<ol>
	<li>Przygotować roztwór do podawania [14C]-inuliny (50 μM, 0,5 μCi/ml na mysz) rozcieńczając w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
3. Podawanie donosowe myszom
<ol>
	<li>Metoda mikropipet z wykorzystaniem tymczasowo otwieranej maski inhalacyjnej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) 
	Uwaga: Ta technika jest modyfikacją protokołu podawania donosowego przy użyciu mikropipety opracowanej przez Freya i wsp.3
	<ol>
		<li>Unieruchom myszy w pozycji leżącej na tablicy korkowej, przyklejając ich kończyny w znieczuleniu wziewnym 2% izofluranem (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).</li>
		<li>Podawaj całkowitą objętość 25 μl roztworu do podawania każdej myszy w odstępach 30-sekundowych, w dawkach od 1 do 2 μl podawanych naprzemiennie do lewego i prawego nozdrza, podczas gdy myszy są unieruchomione w znieczuleniu wziewnym (<klasa silna = "xfig">Ryc. 1B i C).</li>
		<li>Uwaga: Odpadowy gaz znieczulający jest usuwany za pomocą środków aktywnych (okap wyciągowy, utwardzona szafka bezpieczeństwa biologicznego, próżnia itp.), gdy maska jest otwarta i w sposób pasywny (kanister z gazem znieczulającym) po zamknięciu </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwrotna kaniulacja metod od strony dróg oddechowych przez przełyk (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2) 
	Uwaga: Ta technika jest modyfikacją protokołu wchłaniania donosowego dla szczurów ustalonego przez Hirai i wsp.7
	<ol>
		<li>Unieruchom myszy w pozycji leżącej na tablicy korkowej, zaklejając ich kończyny w znieczuleniu wziewnym 2% izofluranem.</li>
		<li>Włosy na szyi są golone i przygotowywane poprzez aplikację betadyny lub chlorheksydyny, a następnie płukanie nasączone alkoholem.</li>
		<li>Odsłoń tchawicę i przełyk, rozszerzając skórę poniżej gardła kleszczami po wykonaniu małego nacięcia (1,5 cm) nożyczkami.</li>
		<li>Wykonaj nacięcie (1 mm) w tchawicy za pomocą nożyczek.</li>
		<li>Wprowadzić kaniulę (średnica wewnętrzna: 0,58 mm, średnica zewnętrzna: 0,965 mm) na długość 1,2 cm i przymocować przeciwległy koniec kaniuli do wnętrza maski wziewnej.</li>
		<li>Wykonaj nacięcie (1 mm) w przełyku za pomocą nożyczek, włóż kaniulę (średnica wewnętrzna: 0,28 mm, średnica zewnętrzna: 0,61 mm) na długość 1,4 cm w kierunku tylnej części jamy nosowej i podwiąż ją (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A i B). 
		Uwaga: Procedury od 3.2.2 do 3.2.4 przeprowadzono pod mikroskopem stereoskopowym w powiększeniu ×10.</li>
		<li>Przymocować igłę (27 g × 1/2) do strzykawki o pojemności 1 ml wypełnionej roztworem do podawania i podłączyć do programowalnej pompy mikrostrzykawkowej.</li>
		<li>Podłącz powyższą igłę do kaniuli, która została wprowadzona do przełyku w punkcie 3.2.5 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
		<li>Podawać całkowitą objętość 25 μl [14C] roztworu inuliny ze stałą szybkością (5 μl/min) (ryc. 2C i 2D).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Eksperyment ilościowy z użyciem znakowanych radioaktywnie makrocząsteczek rozpuszczalnych w wodzie ([14C]-inulina)
<ol>
	<li>Odetnij głowy eksperymentalnym myszom w znieczuleniu i otwórz ich czaszki, używając nożyczek i od strony rdzenia przedłużonego, uważając, aby nie uszkodzić mózgu.</li>
	<li>Ostrożnie wyekstrahuj cały mózg, nabierając go za pomocą mikroszpatułki z czaszki.</li>
	<li>Umieść bibułę filtracyjną zwilżoną roztworem soli fizjologicznej na szalce Petriego, która jest przechowywana na lodzie.</li>
	<li>Umieść wyekstrahowane mózgi na zwilżonej bibule filtracyjnej.</li>
	<li>Krew przylegającą do powierzchni mózgu zetrzeć wacikiem zwilżonym roztworem soli fizjologicznej, aby wyeliminować przynajmniej wpływ [14C]-inuliny we krwi na powierzchnię mózgu.</li>
	<li>Szybko rozbioruj mózgi i podziel je na trzy części: opuszkę węchową, mózg i rdzeń przedłużony (w tym most).</li>
	<li>Umieścić próbki mózgu w solubilizatorze tkanek w temperaturze 50 °C na 1 godzinę.</li>
	<li>Dodać 10 μl płynnego koktajlu scyntylacyjnego do próbek mózgu.</li>
	<li>Przenieść 25 μl podwielokrotności roztworu do podawania rozpuszczonego w koktajlu scyntylacyjnym do fiolki scyntylacyjnej w celu określenia radioaktywności zastosowanego roztworu.</li>
	<li>Zmierzyć rozpady na minutę radioaktywności [14C] w próbce mózgu ([14C] Xmózg) i zastosowanym roztworze ([14C] Xw dawce) w płynnym liczniku scyntylacyjnym wyposażonym w odpowiednią poprawkę krzyżową dla 3H i 14C.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Obliczyć poziomy dystrybucji leku (%) dla dawki wstrzykiwanej (ID%), stosując następujące równanie: 
	ID%⁄g mózg = ([14C] Xmózg/[14C] Xw dawce) × 100, 
	gdzie Xmózgu (dpm/g mózgu) jest ilością [14C]-inuliny mierzoną w tkance mózgowej, adawka X IN (dpm/25 μl roztworu) jest stężeniem [14C]-inuliny w roztworze używanym do podawania donosowego.</li>
</ol>

<ol><li>Sakane, T., Yamashita, S., Yata, N., Sezaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transnasal+delivery+of+5-fluorouracil+to+the+brain+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Drug+Targeting%22%5BJournal%5D)">Transnasal delivery of 5-fluorouracil to the brain in the rat.</a> Journal of Drug Targeting. 7 (3), 233-240 (1999).</li>
<li>Illum, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+drugs+from+the+nasal+cavity+to+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutical+Science%22%5BJournal%5D)">Transport of drugs from the nasal cavity to the central nervous system.</a> European Journal of Pharmaceutical Science. 11 (1), 1-18 (2000).</li>
<li>Hanson, L. R., Frey, W. H. 2nd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+delivery+bypasses+the+blood-brain+barrier+to+target+therapeutic+agents+to+the+central+nervous+system+and+treat+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intranasal delivery bypasses the blood-brain barrier to target therapeutic agents to the central nervous system and treat neurodegenerative disease.</a> BMC Neuroscience. 9 (Suppl 3), S5(2008).</li>
<li>Chapman, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+treatment+of+central+nervous+system+dysfunction+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Intranasal treatment of central nervous system dysfunction in humans.</a> Pharmaceutical Research. 30 (10), 2475-2484 (2012).</li>
<li>Kanazawa, T. <a target="_blank" href="https://europepmc.org/abstract/med/29607986">Development of non-invasive drug delivery system to the brain for brain diseases therapy.</a> Yakugaku-Zasshi. 138 (4), 443-450 (2018).</li>
<li>Kozlovskaya, L., Abou-Kaoud, M., Stepensky, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+drug+delivery+to+the+brain+via+nasal+route%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of drug delivery to the brain via nasal route.</a> Journal of Controlled Release. 189, 133-140 (2014).</li>
<li>Hirai, S., Yashiki, T., Matsuzawa, T., Mima, H. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0378517381900582">Absorption of drugs from the nasal mucosa of rat.</a> International Journal of Pharmaceutics. 7 (4), 317-325 (1981).</li>
<li>Lochhead, J. J., Thorne, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+delivery+of+biologics+to+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Intranasal delivery of biologics to the central nervous system.</a> Advances in Drug Delivery Reviews. 64 (7), 614-628 (2011).</li>
<li>Lalatsa, A., Schatzlein, A. G., Stepensky, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+deliver+peptide+drugs+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Strategies to deliver peptide drugs to the brain.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (4), 1081-1093 (2014).</li>
<li>Kanazawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+delivery+of+small+interfering+ribonucleic+acid+and+drugs+through+intranasal+administration+with+nano-sized+polymer+micelles%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Devices%22%5BJournal%5D)">Brain delivery of small interfering ribonucleic acid and drugs through intranasal administration with nano-sized polymer micelles.</a> Medical Devices. 8, 57-64 (2015).</li>
<li>Kanazawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+nose-to-brain+delivery+of+hydrophilic+macromolecules+with+stearate-+or+polyethylene+glycol-modified+arginine-rich+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Enhancement of nose-to-brain delivery of hydrophilic macromolecules with stearate- or polyethylene glycol-modified arginine-rich peptide.</a> International Journal of Pharmacology. 530 (1-2), 195-200 (2017).</li>
<li>Kamei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+an+enhanced+nose-to-brain+delivery+of+insulin+on+mild+and+progressive+memory+loss+in+the+senescence-accelerated+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Effect of an enhanced nose-to-brain delivery of insulin on mild and progressive memory loss in the senescence-accelerated mouse.</a> Molecular Pharmaceutics. 14 (3), 916-927 (2017).</li>
<li>Suzuki, T., Oshimi, M., Tomono, K., Hanano, M., Watanabe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+transport+mechanism+of+pentazocine+across+the+blood-brain+barrier+using+the+in+situ+rat+brain+perfusion+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Science%22%5BJournal%5D)">Investigation of transport mechanism of pentazocine across the blood-brain barrier using the in situ rat brain perfusion technique.</a> Journal of Pharmaceutical Science. 91 (11), 2346-2353 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Oczekuje się, że dostarczanie leków z nosa do mózgu będzie miało wyraźny wpływ na zaburzenia ośrodkowego układu nerwowego, ponieważ szlak ten stanowi bezpośrednią trasę transportową, która omija barierę krew-mózg. Dotej pory opisano trzy różne ścieżki łączące nos z mózgiem. Pierwszym z nich jest szlak nerwu węchowego, który przechodzi od błony śluzowej węchu w błonie śluzowej nosa do przodomózgowia przez nerw węchowy. Drugi to szlak nerwu trójdzielnego, który przechodzi od błony śluzowej dróg odde...

Bioleki, takie jak peptydy, oligonukleotydy i przeciwciała, są uważane za potencjalnie przydatne jako nowe środki terapeutyczne dla opornych na leczenie zaburzeń ośrodkowego układu nerwowego, które obecnie nie mają terapii leczniczej. Ponieważ jednak większość leków biologicznych to makrocząsteczki rozpuszczalne w wodzie, dostarczanie z krwi do mózgu po podaniu dożylnym lub doustnym jest niezwykle trudne ze względu na impedancję bariery krew-mózg (BBB).
W ostatnich latach donosowe podawanie donosowe było potencjalną ścieżką dostarczania środków terapeutycznych z nosa do mózgu, która pozwala uniknąć BBB1,2,3,4,5. Pojawiło się jednak stosunkowo niewiele doniesień dotyczących analizy ilościowej ścieżki dostarczania od nosa do mózgu6. Co więcej, nie było praktycznie żadnych doniesień na temat ustalonych optymalnych warunków podawania i schematów dawkowania, takich jak objętość, czasy, okresy czasu i szybkość, dla badań nad dostarczaniem z nosa do mózgu. Wyżej wymienione braki można przypisać następującym przyczynom: (i) optymalna metoda podawania donosowego dla myszy nie została jeszcze ustalona, oraz (ii) podawanie donosowe przez pipetowanie, które jest powszechnie stosowane, zwykle charakteryzuje się zmiennością międzyosobniczą wśród zwierząt ze względu na klirens śluzowo-rzęskowy (MC), co często prowadzi do niedoszacowania rzeczywistego potencjału dostarczania danego leku z nosa do mózgu.
Znieczulenie wziewne z użyciem izofluranu (inicjacja: 4%, utrzymanie: 2%) z maską inhalacyjną dla gryzoni zyskało szerokie zastosowanie, w celu zmniejszenia lub wyeliminowania bólu związanego z operacją wykonywaną na zwierzętach doświadczalnych. Stosowanie masek sprawia, że stosunkowo łatwo jest wykonywać typowe podawanie leku zwierzętom doświadczalnym w znieczuleniu wziewnym drogą podskórną, dootrzewnową i dożylną. Jednak w przypadku podawania donosowego maska musi zostać tymczasowo zdjęta ze zwierząt w celu podania leku. Przy podaniu dawki poniżej 2% izofluranu zwierzęta zazwyczaj szybko budzą się po znieczuleniu wziewnym. Gdy objętość podawana w jednej dawce jest duża, może to spowodować przepływ roztworu leku z jamy nosowej do przełyku, a zatem może być konieczne podzielenie pojedynczej dużej dawki na kilka mniejszych dawek do podawania donosowego małym zwierzętom. Ponieważ podanie donosowe wymaga zdjęcia maski w celu wielokrotnego podawania i wystarczającego czasu na długotrwałe podawanie do jamy nosowej, istnieje duże prawdopodobieństwo, że myszy obudzą się ze znieczulenia podczas procedury podawania. To sprawia, że bardzo trudno jest wykonać podanie donosowe w stabilnym stanie znieczulenia i prawdopodobnie przyczynia się do obserwowanej międzyosobniczej zmienności dostarczania z nosa do mózgu wśród gryzoni.
W tym badaniu opracowaliśmy dwie nowatorskie metody stabilnego podawania donosowego w znieczuleniu wziewnym, które nakładają minimalny stres fizyczny na zwierzęta doświadczalne. Do pierwszej metody zastosowaliśmy czasowo otwieraną maskę, która umożliwia podanie donosowe podczas znieczulenia wziewnego. Otwierana część maski zawiera silikonową zatyczkę, która może być używana zgodnie z czasem podawania, aby ułatwić stabilne podawanie donosowe za pomocą pipety. W przypadku drugiej metody chirurgicznie wprowadzono kaniulę, która przechodziła z przełyku do jamy nosowej, a następnie podłączono do niej pompę strzykawkową, aby roztwór leku mógł być bezpośrednio i niezawodnie dostarczany do jamy nosowej w stabilnym znieczuleniu wziewnym. Metoda ta może zwiększyć dostarczanie leków do mózgu drogą z nosa do mózgu, ponieważ poprzez znaczne zminimalizowanie skutków MC, lek retencyjnie w jamie nosowej uległby poprawie. Ponadto opisujemy metodę ilościowej oceny poziomów dystrybucji leków (% dla wstrzykniętej dawki/g mózgu) w mózgu przy użyciu znakowanej radioaktywnie [14C]-inuliny [masa cząsteczkowa (MW): 5000] jako modelowego substratu rozpuszczalnych w wodzie makrocząsteczek.

<table><tbody><tr><td>mysz ddY</td><td>Japonia SLC, Inc.</td><td></td><td>Mężczyzna, 4-6 tygodni, 20-30 g</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Pfizer</td><td>v002139</td><td></td></tr><tr><td>Konfiguracja izofluranu</td><td>SHINANO manufacturing CO. LTD.</td><td>SN-487-OTAir, SN-489-4</td><td></td></tr><tr><td>Maska izofulanowa</td><td>SHINANO manufacturing CO. LTD.</td><td></td><td>Dla małych gryzoni</td></tr><tr><td>Maska Isoflurane (typ otwierany)</td><td>SHINANO manufacturing CO. LTD.</td><td></td><td>Specjalne zamówienia</td></tr><tr><td>Pudełko anestezjologiczne</td><td>SHINANO manufacturing CO. LTD.</td><td>SN-487-85-02</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do eksperymentów na zwierzętach-1</td><td>NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.</td><td>B-27H</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do eksperymentów na zwierzętach-2</td><td>NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.</td><td>Pęseta B-13H-1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NARZĘDZIA FINE SCIENCE Inc.</td><td>11272-30</td><td>Dumont #7 Pęseta Dumoxel-2</td></tr><tr><td></td><td>NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.</td><td>A-12-1</td><td></td></tr><tr><td>Rurka kaniuli (PE-50)</td><td>Becton, Dickinson and Company.</td><td>5069773</td><td>Średnica wewnętrzna: 0,58 mm, średnica zewnętrzna: 0,965 mm</td></tr><tr><td>Rurka kaniuli (SP-10)</td><td>NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.</td><td>KN-392</td><td>ID: 0,28 mm, OD: 0,61 mm</td></tr><tr><td>Golarka</td><td>MARUKAN, LTD.</td><td>DC-381</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Igła 27G 1/2 w 13 mm</td><td>TERUMO CORPORATION</td><td>NN-2738R</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>TERUMO CORPORATION</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Neuro science</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td>Membrana celulozowa</td><td>Toyo Roshi Kaisya, Ltd.</td><td></td><td></td>00011090</tr><tr><td>Mikroszpatułka</td><td>Shimizu Akira Inc.</td><td>91-0088</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipeta (0,5-10 μl)</td><td>Eppendorf AG</td><td>Z368083</td><td></td></tr><tr><td>Chip do pipet</td><td>Eppendorf AG</td><td>0030 000.811</td><td></td></tr><tr><td>System</td><td>etykietowania Tape TimeMed, Inc.</td><td>T-534-R</td><td>Do mocowania myszy</td></tr><tr><td>[14C]-Inulina</td><td>American Radiolabeled Chemicals Inc.</td><td>ARC0124A</td><td>0,1 mCi/ml</td></tr><tr><td>EtOH</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>054-00461</td><td></td></tr><tr><td>Licznik scyntylacyjny cieczy</td><td>Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Inc</td><td>Tri-Carb 4810TR</td><td></td></tr></tbody></table>

nowe metody podawania donosowego w znieczuleniu wziewnym w celu oceny dostarczania leków z nosa do mózgu

Novel Methods for Intranasal Administration Under Inhalation Anesthesia to Evaluate Nose-to-Brain Drug Delivery

Donosicielstwo zostało uznane za potencjalną drogę dostarczania z nosa do mózgu środków terapeutycznych, które omijają barierę krew-mózg. Pojawiło się jednak niewiele doniesień dotyczących nie tylko analizy ilościowej, ale także optymalnych warunków podawania i schematów dawkowania w badaniach nad porodem z nosa do mózgu. Ograniczony postęp w badaniach nad mechanizmami szlaku no-mózg z wykorzystaniem gryzoni stanowi istotną przeszkodę w projektowaniu systemów dostarczania leków z nosa do mózgu.
Aby osiągnąć pewien postęp w tym względzie, opracowaliśmy i oceniliśmy dwie nowe metody stabilnego podawania donosowego w znieczuleniu wziewnym dla zwierząt doświadczalnych. Opisano również metodę oceny poziomów dystrybucji leków w mózgu poprzez szlak nos-mózg przy użyciu znakowanej radioaktywnie [14C]-inuliny (masa cząsteczkowa: 5000) jako modelowego substratu rozpuszczalnych w wodzie makrocząsteczek.
Początkowo opracowaliśmy protokół podawania donosowego oparty na pipetach za pomocą tymczasowo otwieranych masek, co umożliwiło nam niezawodne podawanie zwierzętom w stabilnym znieczuleniu. Korzystając z tego systemu, [14C]-inulina mogła być dostarczana do mózgu z niewielkim błędem eksperymentalnym.
Następnie opracowaliśmy protokół podawania donosowego polegający na odwrotnej kaniulacji od strony dróg oddechowych przez przełyk, który został opracowany w celu zminimalizowania skutków klirensu śluzowo-rzęskowego (MC). Technika ta doprowadziła do istotnie wyższych poziomów [14C]-inuliny, którą ilościowo wykryto w opuszce węchowej, mózgu i rdzeniu przedłużonym, niż metoda pipetowana. Wydaje się, że dzieje się tak dlatego, że retencja roztworu leku w jamie nosowej została znacznie zwiększona przez aktywne podawanie za pomocą pompy strzykawkowej w kierunku przeciwnym do MC do jamy nosowej.
Podsumowując, można oczekiwać, że dwie metody podawania donosowego opracowane w tym badaniu będą niezwykle użytecznymi technikami oceny farmakokinetyki u gryzoni. W szczególności metoda odwrotnej kaniulacji może być przydatna do oceny pełnego potencjału dostarczania kandydatów na leki z nosa do mózgu.

Rysunek 3 przedstawia poziomy [14C]-inuliny (ID%⁄g mózgu) w opuszce węchowej (A), mózgu przednim (B) i rdzeniu przedłużonym (C) uzyskane przy zastosowaniu dwóch typów podania donosowego ocenianych w niniejszym badaniu. Podanie donosowe z wykorzystaniem metody pipety umożliwiło dostarczenie [14C]-inuliny do mózgu przy użyciu otwieranych masek inhalacyjnych (Rysunek 1). W warunkach znieczulenia inhalacyjnego w...

Tutaj opisujemy dwie nowatorskie metody stabilnego podawania donosowego w znieczuleniu wziewnym przy minimalnym wysiłku fizycznym dla zwierząt doświadczalnych. Opisano również metodę ilościowej oceny poziomów dystrybucji leków w mózgu poprzez szlak nos-mózg przy użyciu znakowanej radioaktywnie [14C]-inuliny jako modelowego substratu rozpuszczalnych w wodzie makrocząsteczek.

Nowe metody podawania donosowego w znieczuleniu wziewnym w celu oceny dostarczania leków z nosa do mózgu

Intranasal administration has been reported to be a potential pathway for nose-to-brain delivery of therapeutic agents that circumvents the blood-brain ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nauk farmaceutycznych dotyczące podawania donosowego oraz farmakokinetyki i farmakologii leków będących przedmiotem zainteresowania. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do ilościowej oceny kandydatów na leki dostarczające z nosa do mózgu i znieczulenia wziewnego przy minimalnym stresie dla zwierząt. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię chorób ośrodkowego układu nerwowego, ponieważ przyczynia się ona do rozwoju technologii dostarczania leków drogą z nosa do mózgu.Procedurę zademonstruje Mitsuyoshi Fukuda, doktorant z mojego laboratorium. Do podawania donosowego za pomocą mikropipety w izolowanym urządzeniu do badania izotopów radiowych. Przyklej i znieczul mysz do tablicy korkowej w pozycji leżącej na plecach i podaj 25 mikrolitrów roztworu inuliny węglowej-14 w dawkach od jednego do dwóch mikrolitrów, na przemian, do prawego i lewego nozdrza zwierzęcia.W przypadku odwrotnej kaniulacji od strony dróg oddechowych przez przełyk, umieść znieczuloną mysz pod mikroskopem preparacyjnym i wykonaj 1,5-centymetrowe nacięcie skóry nad gardłem. Użyj kleszczy, aby rozszerzyć nacięcie, aż tchawica zostanie odsłonięta, i wykonaj jednomilimetrowe nacięcie w odsłoniętej tchawicy. Włóż kaniulę 1,2 centymetra do wcześniej zaznaczonej pozycji do nacięcia i przymocuj przeciwległy koniec kaniuli do wnętrza maski inhalacyjnej.Następnie użyj kleszczy, aby odsłonić przełyk spod tchawicy. Za pomocą nożyczek wykonaj jednomilimetrowe nacięcie w przełyku i włóż drugą kaniulę 1,4 centymetra do zaznaczonej pozycji w kierunku tylnego końca jamy nosowej. Ważne jest, aby wprowadzić kaniulę na odpowiednią długość w zależności od wagi zwierzęcia doświadczalnego i dostosować długość kaniuli w pozostałych.Podwiązać kaniulę przełyku i przymocować igłę o rozmiarze 27 do jednomililitrowej strzykawki wypełnionej roztworem do podawania, podłączonej do programowalnej pompy mikrostrzykawkowej. Następnie podawaj 25 mikrolitrów inuliny węglowej-14 ze stałą szybkością pięciu mikrolitrów na minutę, aż do podania całej objętości roztworu. Powolna, ale stała szybkość dyfuzji jest ważna dla zatrzymania jak największej ilości roztworu leku w jamie nosowej.Aby określić ilościowo ilość inuliny węglowej-14, która przekroczyła barierę krew-mózg 30 minut po podaniu inuliny, użyj nożyczek, aby ostrożnie otworzyć czaszkę każdego eksperymentalnie leczonego zwierzęcia od strony rdzenia przedłużonego i użyj mikroszpatułki, aby ostrożnie zgarnąć mózg. Umieść każdy mózg na kawałku bibuły filtracyjnej zwilżonej solą fizjologiczną na szalce Petriego na lodzie podczas zbierania. I użyj bawełnianego wacika nasączonego solą fizjologiczną, aby oczyścić krew z powierzchni każdego mózgu.Następnie, szybko, ale ostrożnie, rozbioruj mózg na opuszkę węchową, mózg i rdzeń przedłużony, a także sekcje mostu. I umieść próbki mózgu w solubilizatorze tkanek na godzinę w temperaturze 50 stopni Celsjusza, a następnie dodaj 10 mikrolitrów płynnego koktajlu scyntylacyjnego. Aby określić radioaktywność zastosowanego roztworu, należy przenieść 25 mikrolitrową podwielokrotność roztworu do podawania, rozpuszczonego w koktajlu scyntylacyjnym, do fiolki scyntylacyjnej i zmierzyć rozpady na minutę radioaktywności węgla-14 w próbce mózgu i nałożonym roztworze w płynnym liczniku scyntylacyjnym.W znieczuleniu wziewnym nie obserwuje się eksperymentalnej zmienności międzyosobniczej wśród zwierząt podawanych donosowo po podaniu leku. Gdy stosuje się metodę podawania do jamy nosowej z odwróconą kaniulą przełykową, obserwuje się znacznie wyższe poziomy inuliny węglowej-14 w opuszce węchowej, mózgu i rdzeniu przedłużonym niż za pomocą mikropipet. Co więcej, wyższa zawartość inuliny węgla-14 jest wykrywana w opuszce węchowej i rdzeniu przedłużonym, które są wyraźnie rozwinięte na szlaku nos do mózgu, niż w mózgu.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się dostarczaniem z nosa do mózgu w celu zbadania bioaktywności wielkocząsteczkowych środków terapeutycznych w ośrodkowym układzie nerwowym.

novel-methods-for-intranasal-administration-under-inhalation

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisano metodę podawania leków drogą donosową u czuwających myszy w celu ukierunkowania ich działania na mózg. Metoda ta umożliwia wielokrotne dawkowanie w długich okresach poprzez podawanie leku donosowo bez znieczulenia, zapewniając transport z nosa do mózgu przy minimalnej ekspozycji systemowej.

Podawanie terapeutyków OUN drogą donosową u czuwających myszy

Ten film pokazuje wytwarzanie aerozoli leków i celowe dostarczanie tych aerozoli myszom tylko do nosa za pomocą urządzenia do inhalacji wyposażonego w generator aerozolu. Mysz jest unieruchomiona w ograniczniku tylko na nos i podłączona do jednostki inhalacyjnej, która dostarcza lek bezpośrednio do jamy nosowej myszy. Następnie lek przechodzi przez tchawicę i dostaje się do płuc.

Technika wytwarzania i dostarczania aerozoli leków bezpośrednio do płuc myszy

Źródło: Ullah, I., et.al. Urządzenie pozycjonujące do umieszczania myszy podczas donosowego dostarczania siRNA do ośrodkowego układu nerwowego. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film demonstruje precyzyjną technikę podawania donosowego w celu dostarczania ukierunkowanych na neurony kompleksów peptyd-siRNA do mózgu myszy za pomocą specjalistycznego urządzenia pozycjonującego. Znieczulone myszy są zabezpieczone w pozycji głowy w dół i do przodu, aby zoptymalizować wdychanie siRNA, jednocześnie...

donosowe podawanie siRNA do mózgu myszy za pomocą urządzenia pozycjonującego

Źródło: Kanazawa, T., et al. Nowatorskie metody podawania donosowego w znieczuleniu wziewnym w celu oceny dostarczania leków z nosa do mózgu. J. Vis. Exp. (2018)Ten film demonstruje donosowe podawanie leków znakowanych radioaktywnie znieczulonej myszy w celu uzyskania dostarczania leku z nosa do mózgu. Wyjaśnia, w jaki sposób leki przenikają przez nabłonek nosa i przemieszczają się szlakami neuronalnymi, aby dotrzeć do mózgu, a także w jaki sposób ruch rzęsek wpływa na zatrzymywanie i usuwanie...

Donosowe podawanie leku myszom za pomocą pipety i odwrotnej kaniulacji w celu dostarczania leku z nosa do mózgu

Ten manuskrypt omawia modelowanie i symulacje różnych protokołów dostarczania leków do regionu węchowego w modelach nosowych dróg oddechowych opartych na obrazach. Wiele modułów oprogramowania jest wykorzystywanych do opracowania anatomicznie dokładnego modelu nosa, generowania siatki obliczeniowej, symulacji przepływu powietrza przez nos i przewidywania osadzania się cząstek w okolicy węchowej.

Modelowanie i symulacje dostarczania leków węchowych z pasywną i aktywną kontrolą wdychanych do nosa aerozoli farmaceutycznych

Opisana tutaj jednostka inhalacyjna może generować, pobierać próbki do charakterystyki i równomiernie deponować aerozol leku w płucach gryzoni. Umożliwia to przedkliniczne określenie skuteczności i bezpieczeństwa dawek leków zdeponowanych w płucach; kluczowe dane umożliwiające kliniczne opracowanie leków wziewnych.

Wdychanie suchego proszku i aerozoli w nebulizach farmaceutyków dostarczanych myszom przy użyciu systemu naświetlania tylko przez nos

Komórki macierzyste są obiecującymi nośnikami terapeutycznymi w leczeniu guzów mózgu ze względu na ich wewnętrzny tropizm nowotworowy. Nieinwazyjne donosowe podawanie komórek macierzystych omija barierę krew-mózg i wykazuje duży potencjał w zakresie translacji klinicznej. W artykule podsumowano podstawowe zasady podawania donosowych komórek macierzystych w mysim modelu glejaka.

Donosowe podawanie terapeutycznych komórek macierzystych do glejaka w modelu mysim

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący urządzenie do pozycjonowania myszy, który umożliwia odpowiednie rozmieszczenie myszy do donosowego podawania preparatu peptydowo-siRNA ukierunkowanego na mózg, umożliwiając skuteczne wyciszanie genów w ośrodkowym układzie nerwowym.

Urządzenie pozycjonujące do umieszczania myszy podczas donosowego dostarczania siRNA do ośrodkowego układu nerwowego

Ta technika bezpośredniego wstrzykiwania leków do tchawicy noworodków gryzoni jest ważna w badaniu wpływu lokalnie podawanych leków lub leków biologicznych na choroby płuc u noworodków. Dodatkowo metoda ta może być również stosowana do wywoływania uszkodzenia płuc w modelach zwierzęcych.

Minimalnie inwazyjna metoda dotchawniczego wkraplania leków u nowonarodzonych gryzoni w leczeniu chorób płuc

Protokół ten przedstawia rozbicie Rayleigha jako łagodny proces aerozolizowania niewirusowych wektorów mRNA. Regionalna depozycja dla aerozolowanych wektorów mRNA jest oceniana za pomocą modelu Alberta Idealized Nasal Inlet (AINI). Ekspresja zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) w ludzkich komórkach płuc reprezentuje utrzymanie funkcji fizykochemicznych i biologicznych wektorów mRNA po aerozoli.

Intranosowe podawanie polyplexów mRNA za pomocą aerozoli Rayleigh Breakup: metoda in vitro do osadzania nosa i testów funkcjonalnych

Poznaj nowe metody podawania donosowego w znieczuleniu wziewnym do oceny dostarczania leków z nosa do mózgu u myszy. Technika umożliwia ilościową analizę dystrybucji leków przy minimalnym stresie zwierząt.

Nowe metody podawania donosowego w znieczuleniu wziewnym w celu oceny dostarczania leków z nosa do mózgu

Przeglądaj więcej filmów