Name: Wizualizacja i analiza w czasie rzeczywistym uszkodzeń chondrocytów spowodowanych obciążeniem mechanicznym w całkowicie nienaruszonych eksplantatach chrząstki myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji uszkodzeń chondrocytów w czasie rzeczywistym w nienaruszonych eksplantatach chrząstki myszy. Technika umożliwia badanie wpływu obciążenia mechanicznego na komórki stawowe in situ.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Richardowi Waughowi i Luisowi Delgadillo za hojne wykorzystanie ich pH-metru i osmometru. Ponadto autorzy chcieliby podziękować Andrei Lee za wkład we wstępny rozwój systemu testowania mechanicznego. To badanie zostało sfinansowane przez NIH P30 AR069655.

Wszystkie prace nad zwierzętami zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Zasobów Zwierzęcych Uniwersytetu w Rochester.
1. Rozwiązania
<ol>
	<li>Przygotuj zbilansowany roztwór soli Hanka (1X HBSS) zawierający wapń, magnez i bez czerwieni fenolowej. Dostosuj pH do 7,4, dodając niewielkie ilości HCl lub NaOH.</li>
	<li>Dostosuj osmolarność do 303 mOsm, dodając NaCl lub wodę dejonizowaną. Używaj bufora podczas preparacji, przygotowania próbki i badań mechanicznych.</li>
</ol>
2. Rozwarstwienie dystalnej kości udowej i bliższej kości ramiennej z całkowicie nienaruszoną chrząstką stawową
<ol>
	<li>Poddać mysz eutanazji zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi za pomocą komory inhalacyjnej CO2 , a następnie zwichnąć szyjkę macicy. Przestrzegaj zasad aseptyki przez cały czas. 
	UWAGA: Można używać myszy w wieku od 8 do 81 tygodni dowolnego szczepu i płci.</li>
	<li>Do sekcji należy używać następujących narzędzi chirurgicznych: mikronożyczki (używane do wykonywania nacięć), standardowe nożyczki preparacyjne (używane do cięcia kości), skalpel z ostrzem skalpela #11 (używany do cięcia tkanek miękkich), kleszczyki jubilerskie (używane do usuwania tkanek miękkich) i standardowe kleszczyki (używane do obierania tkanek miękkich i skóry).</li>
	<li>W przypadku rozwarstwienia dystalnej części kości udowej postępuj zgodnie z poniższymi instrukcjami.
	<ol>
		<li>Ustaw mysz w pozycji leżącej.</li>
		<li>Wykonaj małe (~5 mm) nacięcie w skórze w przedniej części kolana.</li>
		<li>Przedłuż nacięcie dookoła kolana i odciągnij skórę, aby odsłonić staw kolanowy i mięśnie nóg.</li>
		<li>Zaczynając od bliższego końca kości udowej, użyj ostrza skalpela (#11), aby ciąć wzdłuż kierunku dystalnej. Umieść ostrze między jednostką mięśnia czworogłowego i ścięgna a przednią stroną trzonu kości udowej. Przedłuż cięcie w kierunku i obok rzepki, a zakończ przecinając środek ścięgna rzepki, usuwając w ten sposób jednostkę mięsień czworogłowy-ścięgno.</li>
		<li>Zaczynając od bliższego końca kości udowej, użyj ostrza skalpela (#11), aby ciąć wzdłuż kierunku dystalnej. Umieść ostrze między jednostką mięśniowo-ścięgnistą ścięgna ścięgna podkolanowego a tylną stroną trzonu kości udowej. Gdy nacięcie zbliży się do stawu kolanowego, zacznij przecinać tkankę miękką, unikając kontaktu skalpela z powierzchnią stawową na dystalnych kłykciach kości udowej. Zakończ cięcie za stawem kolanowym.</li>
		<li>Odciągnij mięśnie czworogłowe i ścięgna podkolanowe, aby odsłonić kość udową. Odetnij nadmiar mięśni po bocznej i przyśrodkowej stronie kości udowej.</li>
		<li>Przetnij mięsień łydki po tylnej stronie bliższej części kości piszczelowej i odwróć nogę, aby uwidocznić tylną stronę kości udowej.</li>
		<li>Odsłoń dystalne kłykcie kości udowej i tylną powierzchnię bliższej kości piszczelowej, usuwając nadmiar tkanki wokół stawu kolanowego.</li>
		<li>Przeciąć więzadła krzyżowe przednie i tylne za pomocą skalpela, odcinając od kłykci kości udowej. Odciągnij kość piszczelową od kości udowej i odetnij wszystkie więzadła, aby oddzielić dolną część nogi od kości udowej.</li>
		<li>Za pomocą standardowych nożyczek preparacyjnych przeciąć kość udową na bliższym końcu kości (8 mm powyżej stawu piszczelowo-udowego) od strony bocznej. Po przecięciu kości należy zetrzeć widoczny szpik na zewnątrz kości, aby uniknąć ewentualnego zanieczyszczenia komórkami szpiku kostnego. 
		UWAGA: Cięcie od strony bocznej zmniejsza ryzyko rozprzestrzeniania się pęknięć wzdłuż kości.</li>
		<li>Usuń otaczające tkanki miękkie (tj. więzadła i nadmiar mięśni) z kości udowej za pomocą kleszczy jubilerskich i odsłoń chrząstkę na obu kłykciach na dystalnym końcu kości udowej. Unikaj kontaktu chrząstki z kleszczami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku sekcji kości ramiennej postępuj zgodnie z poniższymi instrukcjami.
	<ol>
		<li>Ustaw mysz w pozycji leżącej.</li>
		<li>Wykonaj nacięcie (~5 mm) w skórze po tylnej stronie łokcia za pomocą mikronożyczek, przedłuż nacięcie wokół łokcia i odciągnij skórę, aby odsłonić mięśnie ramienia i barku.</li>
		<li>Zaczynając od bliższego końca kości ramiennej, użyj ostrza skalpela (#11), aby ciąć wzdłuż kierunku dystalnej. Umieść ostrze między jednostką mięśnia trójgłowego i ścięgna a tylną stroną kości ramiennej. Przedłuż cięcie w kierunku dystalnego końca kości ramiennej i zakończ przecinając ścięgno tricepsa.</li>
		<li>Następnie odciągnij triceps w kierunku bliższego końca kości ramiennej, aż głowa kości ramiennej zostanie odsłonięta.</li>
		<li>Przeciąć tkankę łączną wokół głowy kości ramiennej za pomocą ostrza skalpela (#11) bez dotykania powierzchni stawowej i usunąć kończynę (ramię i ramię) z ciała. Okresowo nawilżaj powierzchnię stawową głowy kości ramiennej za pomocą HBSS.</li>
		<li>Odłącz kość ramienną od ramienia, najpierw odrywając bliższy koniec kości łokciowej po tylnej stronie ramienia za pomocą kleszczy, a następnie przecinając tkankę łączną wokół dystalnego końca kości ramiennej. Usuń nadmiar tkanki z kości ramiennej.</li>
		<li>Odetnij guzowatość naramienną na tylnej stronie kości ramiennej za pomocą standardowych nożyczek preparacyjnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić wypreparowaną próbkę (próbki) w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej bufor HBSS.</li>
</ol>
3. Protokół barwienia na żywo (Calcein AM) / Martwy (jodek propidyny)
<ol>
	<li>Plamić za pomocą kalceiny AM w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy kalceiny AM, dodając 12,5 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) do fiolki z 50 μg kalceiny AM, co daje stężenie podstawowe 4 mg/ml (4,02 mM).</li>
		<li>Rozcieńczyć podstawowy roztwór kalceiny w stosunku 1:400 w HBSS, aby osiągnąć stężenie 10 μg/ml (10,05 μM) wapnia AM (na przykład dodać 1,25 μl roztworu podstawowego do 500 μl HBSS).</li>
		<li>Wirować rozcieńczony roztwór barwiący przez 5 s przy 2,000 x g, aby upewnić się, że cały barwnik, który może czasami przyklejać się do ścianek probówki, zmiesza się z buforem. Nie usuwać supernatantu. Odwiruj roztwór, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie.</li>
		<li>Wypreparowaną próbkę umieścić w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 μl rozcieńczonego roztworu barwiącego. Inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut w termomikserze, mieszając z prędkością 800 obr./min. Upewnij się, że rurki są pokryte folią aluminiową, aby chronić przed wystawieniem na działanie światła.</li>
		<li>Przenieść próbkę do buforu HBSS wolnego od kalceiny AM. W tym momencie próbka jest gotowa do badań mechanicznych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj roztwór barwiący jodku propidyny (PI) w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór do barwienia PI, rozcieńczając zakupiony roztwór podstawowy (1 mg/ml, 1,5 mM) w stosunku 1:25 w HBSS, aby osiągnąć 40 μg/ml (60 μM) PI. Na przykład dodać 40 μl roztworu podstawowego do 1000 μl HBSS.</li>
		<li>Roztwór do barwienia PI należy przechowywać w folii aluminiowej, aby chronić go przed działaniem światła. Natychmiast po przeprowadzeniu testu mechanicznego należy użyć roztworu barwiącego w celu wykrycia uszkodzonych komórek (patrz punkt 4). 
		UWAGA: Można również wykonać barwienie PI przed załadowaniem, aby bardziej rygorystycznie ocenić jakość sekcji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Protokół testów mechanicznych
<ol>
	<li>Umieść próbkę (kość udową lub ramienną) na szkiełku podstawowym mechanicznym urządzeniu testowym zamontowanym pod mikroskopem w taki sposób, aby powierzchnia stawowa na tylnych kłykciach kości udowej lub głowie kości ramiennej znajdowała się na szkle (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1). 
	UWAGA: Przymocuj drewniany aplikator o długości 10 mm (średnica = 2 mm) do dystalnej strony kości ramiennej za pomocą kleju cyjanoakrylowego przed umieszczeniem go na urządzeniu w celu ustabilizowania próbki na płaskiej powierzchni. Szczegółowy opis platformy do badań mechanicznych znajduje się w pliku uzupełniającym 1: sekcja 1.</li>
	<li>Uwodnić próbkę za pomocą HBSS i umieścić urządzenie z próbką pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
	<li>Wyobraź sobie chondrocyty stawowe barwione kalceiną AM (długości fal wzbudzenia/emisji = 495/515 nm) przed (wyjściowym) zastosowaniem obciążenia pod mikroskopem fluorescencyjnym z suchą soczewką 4X (NA = 0,13). Dostosuj ustawienia akwizycji, aby zoptymalizować jakość obrazu.</li>
	<li>Obciążyć próbkę mechanicznie w taki sposób, aby chrząstka stawowa została dociśnięta do szkła nakrywkowego.
	<ol>
		<li>W przypadku obciążenia statycznego należy przyłożyć zalecane obciążenie statyczne (np. 0,5 N) na wierzch próbki (kość udową lub ramienną). Przytrzymaj ładunek przez 5 minut, a następnie usuń go.</li>
		<li>W przypadku uderzenia należy zastosować zalecaną energię uderzenia (np. 1 mJ) na próbkę, upuszczając cylindryczny impaktor o znanej masie (np. 0,1 N) z określonej wysokości (np. 1 cm). Zwolnij ładunek 5 s po uderzeniu. 
		UWAGA: Masę impaktora (mg) i zalecaną wysokość (h) można przeliczyć na energię uderzenia (E) za pomocą następującego równania: E = mgh.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować próbkę w roztworze barwiącym PI przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wyobraź sobie chondrocyty stawowe barwione kalceiną AM i PI (długości fal wzbudzenia/emisji = 535/617 nm) pod mikroskopem fluorescencyjnym (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2).</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Określ ilościowo obszar uszkodzonych/martwych komórek ze względu na zastosowany schemat obciążenia mechanicznego.
	<ol>
		<li>Otwórz mikrofotografie powierzchni stawowej uzyskane przed i po przyłożeniu obciążenia mechanicznego w ImageJ18.</li>
		<li>Połącz obrazy w stos.</li>
		<li>Ustaw skalę obrazów na podstawie rozdzielczości obrazu.</li>
		<li>Użyj narzędzia Wielokąt, aby zdefiniować obszar, w którym komórki stały się kalceinowo-ujemne (utrata zielonej fluorescencji) i PI-dodatnie (wzmocnienie czerwonej fluorescencji). Komórki te uważa się za uszkodzone lub martwe.</li>
		<li>Określ obszar uszkodzonych/martwych komórek za pomocą narzędzia Pomiar.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lotz, M. K., Kraus, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+in+osteoarthritis.+Posttraumatic+osteoarthritis%3A+pathogenesis+and+pharmacological+treatment+options%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">New developments in osteoarthritis. Posttraumatic osteoarthritis: pathogenesis and pharmacological treatment options.</a> Arthritis Research & Therapy. 12 (3), 211(2010).</li>
<li>Pallante, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+performance+of+osteochondral+allografts+in+the+goat+is+diminished+with+extended+storage+and+decreased+cartilage+cellularity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">The in vivo performance of osteochondral allografts in the goat is diminished with extended storage and decreased cartilage cellularity.</a> American Journal of Sports Medicine. 40 (8), 1814-1823 (2012).</li>
<li>Delco, M. L., Bonnevie, E. D., Bonassar, L. J., Fortier, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+is+an+acute+response+of+articular+chondrocytes+to+mechanical+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction is an acute response of articular chondrocytes to mechanical injury.</a> Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 739-750 (2018).</li>
<li>Ewers, B. J., Dvoracek-Driksna, D., Orth, M. W., Haut, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extent+of+matrix+damage+and+chondrocyte+death+in+mechanically+traumatized+articular+cartilage+explants+depends+on+rate+of+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">The extent of matrix damage and chondrocyte death in mechanically traumatized articular cartilage explants depends on rate of loading.</a> Journal of Orthopaedic Research. 19 (5), 779-784 (2001).</li>
<li>Goodwin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotenone+prevents+impact-induced+chondrocyte+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Rotenone prevents impact-induced chondrocyte death.</a> Journal of Orthopaedic Research. 28 (8), 1057-1063 (2010).</li>
<li>Issa, R., Boeving, M., Kinter, M., Griffin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+biomechanical+stress+on+endogenous+antioxidant+networks+in+bovine+articular+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of biomechanical stress on endogenous antioxidant networks in bovine articular cartilage.</a> Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 760-769 (2018).</li>
<li>Bartell, L. R., Fortier, L. A., Bonassar, L. J., Cohen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+microscale+strain+fields+in+articular+cartilage+during+rapid+impact+reveals+thresholds+for+chondrocyte+death+and+a+protective+role+for+the+superficial+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Measuring microscale strain fields in articular cartilage during rapid impact reveals thresholds for chondrocyte death and a protective role for the superficial layer.</a> Journal of Biomechanics. 48 (12), 3440-3446 (2015).</li>
<li>Levin, A. S., Chen, C. T., Torzilli, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+tissue+maturity+on+cell+viability+in+load-injured+articular+cartilage+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Effect of tissue maturity on cell viability in load-injured articular cartilage explants.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 13 (6), 488-496 (2005).</li>
<li>Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy+between+Piezo1+and+Piezo2+channels+confers+high-strain+mechanosensitivity+to+articular+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Synergy between Piezo1 and Piezo2 channels confers high-strain mechanosensitivity to articular cartilage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (47), E5114-E5122 (2014).</li>
<li>Jeffrey, J. E., Gregory, D. W., Aspden, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+damage+and+chondrocyte+viability+following+a+single+impact+load+on+articular+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Matrix damage and chondrocyte viability following a single impact load on articular cartilage.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 322 (1), 87-96 (1995).</li>
<li>Chen, C. T., Bhargava, M., Lin, P. M., Torzilli, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time%2C+stress%2C+and+location+dependent+chondrocyte+death+and+collagen+damage+in+cyclically+loaded+articular+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Time, stress, and location dependent chondrocyte death and collagen damage in cyclically loaded articular cartilage.</a> Journal of Orthopaedic Research. 21 (5), 888-898 (2003).</li>
<li>Morel, V., Mercay, A., Quinn, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prestrain+decreases+cartilage+susceptibility+to+injury+by+ramp+compression+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Prestrain decreases cartilage susceptibility to injury by ramp compression in vitro.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 13 (11), 964-970 (2005).</li>
<li>Sauter, E., Buckwalter, J. A., McKinley, T. O., Martin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+dissolution+blocks+oxidant+release+and+cell+death+in+injured+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal dissolution blocks oxidant release and cell death in injured cartilage.</a> Journal of Orthopaedic Research. 30 (4), 593-598 (2012).</li>
<li>Martin, J. A., Buckwalter, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-traumatic+osteoarthritis%3A+the+role+of+stress+induced+chondrocyte+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">Post-traumatic osteoarthritis: the role of stress induced chondrocyte damage.</a> Biorheology. 43 (3,4), 517-521 (2006).</li>
<li>Martin, J. A., Brown, T., Heiner, A., Buckwalter, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-traumatic+osteoarthritis%3A+the+role+of+accelerated+chondrocyte+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">Post-traumatic osteoarthritis: the role of accelerated chondrocyte senescence.</a> Biorheology. 41 (3-4), 479-491 (2004).</li>
<li>Kotelsky, A., Woo, C. W., Delgadillo, L. F., Richards, M. S., Buckley, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Alternative+Method+to+Characterize+the+Quasi-Static%2C+Nonlinear+Material+Properties+of+Murine+Articular+Cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">An Alternative Method to Characterize the Quasi-Static, Nonlinear Material Properties of Murine Articular Cartilage.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 140 (1), (2018).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+superficial+chondrocyte+death+reduces+catabolic+cartilage+damage+in+murine+posttraumatic+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Induced superficial chondrocyte death reduces catabolic cartilage damage in murine posttraumatic osteoarthritis.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2893-2902 (2016).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Habouri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+12%2F15-lipoxygenase+accelerates+the+development+of+aging-associated+and+instability-induced+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Deletion of 12/15-lipoxygenase accelerates the development of aging-associated and instability-induced osteoarthritis.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 25 (10), 1719-1728 (2017).</li>
<li>Higuchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+knockdown+of+hyaluronidase+2+in+articular+cartilage+stimulates+osteoarthritic+progression+in+a+mice+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Conditional knockdown of hyaluronidase 2 in articular cartilage stimulates osteoarthritic progression in a mice model.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7028(2017).</li>
<li>Zhu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+beta-catenin+signaling+in+articular+chondrocytes+leads+to+osteoarthritis-like+phenotype+in+adult+beta-catenin+conditional+activation+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Activation of beta-catenin signaling in articular chondrocytes leads to osteoarthritis-like phenotype in adult beta-catenin conditional activation mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 24 (1), 12-21 (2009).</li>
<li>Hu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+osteoarthritis-like+changes+in+the+joints+of+mice+deficient+in+type+IX+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of osteoarthritis-like changes in the joints of mice deficient in type IX collagen.</a> Arthritis & Rheumatology. 54 (9), 2891-2900 (2006).</li>
<li>Mooney, R. A., Sampson, E. R., Lerea, J., Rosier, R. N., Zuscik, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fat+diet+accelerates+progression+of+osteoarthritis+after+meniscal%2FLigamentous+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">High-fat diet accelerates progression of osteoarthritis after meniscal/Ligamentous injury.</a> Arthritis Research & Therapy. 13 (6), R198(2011).</li>
<li>Griffin, T. M., Huebner, J. L., Kraus, V. B., Yan, Z., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+osteoarthritis+and+metabolic+inflammation+by+a+very+high-fat+diet+in+mice%3A+effects+of+short-term+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Induction of osteoarthritis and metabolic inflammation by a very high-fat diet in mice: effects of short-term exercise.</a> Arthritis & Rheumatology. 64 (2), 443-453 (2012).</li>
<li>Kamekura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritis+development+in+novel+experimental+mouse+models+induced+by+knee+joint+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 13 (7), 632-641 (2005).</li>
<li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+%28DMM%29+model+of+osteoarthritis+in+the+129%2FSvEv+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li>
<li>Huang, H., Skelly, J. D., Ayers, D. C., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+Changes+in+the+Articular+Cartilage+and+Subchondral+Bone+of+C57BL%2F6+Mice+after+Surgical+Destabilization+of+Medial+Meniscus%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Age-dependent Changes in the Articular Cartilage and Subchondral Bone of C57BL/6 Mice after Surgical Destabilization of Medial Meniscus.</a> Scientific Reports. 7, 42294(2017).</li>
<li>Hamada, D., Sampson, E. R., Maynard, R. D., Zuscik, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+induction+of+posttraumatic+osteoarthritis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Surgical induction of posttraumatic osteoarthritis in the mouse.</a> Methods in Molecular Biology. 1130, 61-72 (2014).</li>
<li>Wilhelmi, G., Faust, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suitability+of+the+C57+black+mouse+as+an+experimental+animal+for+the+study+of+skeletal+changes+due+to+ageing%2C+with+special+reference+to+osteo-arthrosis+and+its+response+to+tribenoside%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Suitability of the C57 black mouse as an experimental animal for the study of skeletal changes due to ageing, with special reference to osteo-arthrosis and its response to tribenoside.</a> Pharmacology. 14 (4), 289-296 (1976).</li>
<li>Stoop, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+II+collagen+degradation+in+spontaneous+osteoarthritis+in+C57Bl%2F6+and+BALB%2Fc+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Type II collagen degradation in spontaneous osteoarthritis in C57Bl/6 and BALB/c mice.</a> Arthritis & Rheumatism. 42 (11), 2381-2389 (1999).</li>
<li>McNeil, P. L., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emergency+response+team+for+membrane+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">An emergency response team for membrane repair.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (6), 499-505 (2005).</li>
<li>Adebayo, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinematics+of+meniscal-+and+ACL-transected+mouse+knees+during+controlled+tibial+compressive+loading+captured+using+roentgen+stereophotogrammetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Kinematics of meniscal- and ACL-transected mouse knees during controlled tibial compressive loading captured using roentgen stereophotogrammetry.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (2), 353-360 (2017).</li>
<li>Vahedipour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+the+structure+of+the+mouse+gait+controller%3A+Mice+respond+to+substrate+perturbations+with+adaptations+in+gait+on+a+continuum+between+trot+and+bound%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Uncovering the structure of the mouse gait controller: Mice respond to substrate perturbations with adaptations in gait on a continuum between trot and bound.</a> Journal of Biomechanics. , (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisane powyżej metody zostały z powodzeniem zastosowane do wizualizacji żywotnych i uszkodzonych/martwych chondrocytów stawowych in situ ze stawów myszy po przepisanych obciążeniach mechanicznych lub uderzeniach. W szczególności udało nam się przeanalizować mechaniczną podatność chondrocytów w całkowicie nienaruszonej chrząstce stawowej z dwóch różnych stawów maziowych: stawu kolanowego (dystalne kości udowe) i barku (kość ramienna). Nasze reprezentatywne wyniki pokazują, że przestrzenny zasięg uszkodzenia komó...

Chrząstka stawowa (AC) to nośna tkanka, która pokrywa i chroni kości w stawach maziowych, zapewniając płynną artykulację stawów. Homeostaza tkanek zależy od żywotności chondrocytów, jedynego typu komórek znajdujących się w AC. Jednak narażenie chrząstki na ekstremalne siły spowodowane urazem (np. upadki, wypadek samochodowy lub urazy sportowe) lub z powodu pourazowej niestabilności stawu może wywołać śmierć chondrocytów, prowadząc do nieodwracalnego rozpadu stawu (choroba zwyrodnieniowa stawów)1. Ponadto w procedurach przeszczepu kostno-chrzęstnego, które mają na celu naprawę miejscowych ubytków w uszkodzonej chrząstce, uraz mechaniczny związany z wprowadzeniem przeszczepu zmniejsza żywotność chondrocytów i ma szkodliwy wpływ na wyniki chirurgiczne2.
Modele eksplantatów chrząstek są powszechnie używane do badania podatności chondrocytów stawowych na mechanicznie wywołaną śmierć komórki. Modele te zazwyczaj wykorzystują eksplantaty od dużych zwierząt do badania wpływu warunków obciążenia, warunków środowiskowych i innych czynników na podatność komórek3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Jednak ze względu na duży rozmiar połączeń natywnych, modele te na ogół wymagają usunięcia czopa z powierzchni stawowej nienaruszonego złącza, co narusza natywne warunki brzegowe. Co więcej, na ogół wymagają zastosowania dużych obciążeń mechanicznych w celu wywołania uszkodzenia komórek. Alternatywnie, modele eksplantatów chrząstki mysiej mają kilka zalet w porównaniu z większymi modelami zwierzęcymi w badaniu mechanicznej wrażliwości chondrocytów in situ. W szczególności, ze względu na mniejsze wymiary, modele te ułatwiają badanie w pełni nienaruszonej chrząstki stawowej bez zmiany natywnej integralności tkanki. Ponadto obciążenie chrząstki mysiej następuje na małych obszarach kontaktowych, tak że śmierć/uszkodzenie chondrocytów może być wywołane małymi obciążeniami (<1 N). Wreszcie, genomem myszy można łatwo manipulować, co umożliwia badanie, w jaki sposób określone geny wpływają na podatność chondrocytów in situ na uszkodzenia mechaniczne.
Ogólnym celem metody przedstawionej w tym manuskrypcie jest ilościowe określenie i wizualizacja - w czasie rzeczywistym - przestrzennego zasięgu śmierci/uszkodzenia komórek in situ z powodu zastosowanych obciążeń mechanicznych na całkowicie nienaruszonych eksplantatach chrząstki na kości myszy in vitro. Metoda ta wymaga starannego wypreparowania stawów maziowych myszy bez uszczerbku dla żywotności chondrocytów, a następnie przeprowadzenia testów mechanicznych żywotnie barwionych eksplantatów za pomocą urządzenia zamontowanego pod mikroskopem, podobnego do platformy testowej, którą niedawno opracowaliśmy w celu ilościowego określenia właściwości mechanicznych chrząstki myszy<klasa sup = "xref">16. Podczas badań mechanicznych duża część (nienaruszonej) powierzchni stawowej wypreparowanej kości jest widoczna na pojedynczym mikrozdjęciu fluorescencyjnym, co umożliwia szybką analizę żywotności komórek po przyłożeniu obciążenia. Podobna analiza żywotności komórek powierzchniowych w eksplantatach chrząstki myszy została przeprowadzona wcześniej, ale bez jednoczesnego zastosowania load17. Potencjalne zastosowania naszej metody obejmują badania porównawcze mające na celu zbadanie podatności chondrocytów stawowych na różne kontrolowane warunki środowiskowe i mechaniczne, a także badania przesiewowe terapii mających na celu zmniejszenie wrażliwości chondrocytów na obciążenia mechaniczne.

<table><tbody><tr><td>Calcein, AM&nbsp;</td><td>Invitrogen firmy Thermo Fisher Scientific</td><td>C3100MP</td><td>20x50mg , Eugene, OR, USA</td></tr><tr><td>Jodek propidium</td><td>Invitrogen firmy Thermo Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td>1 mg/ml roztwór w wodzie, 10mL, Eugene, OR, USA</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td>1L DMSO, bezwodny, &ge; 99,9%, St. Louis, MO, USA</td></tr><tr><td>HBSS (wapń, magnez, bez czerwieni fenolowej)&nbsp;</td><td>Gibco by Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td>1X, 500mL, Grand Island, NY, USA</td></tr><tr><td>Ostrze chirurgiczne z piór (#11)</td><td>VWR</td><td>102097-822</td><td>Hatfield, PA, USA</td></tr><tr><td>Osmometr ciśnienia pary, VAPRO</td><td>ELITechGroup</td><td>Model 5520</td><td>Puteaux, Francja</td></tr><tr><td>pH-metr&nbsp;</td><td>Beckman</td><td>Model Phi 32&nbsp;</td><td>Brea, Kalifornia, Stany Zjednoczone</td></tr><tr><td>Termomikser Eppendorf&nbsp;</td><td>Eppendorf AG&nbsp;</td><td>Model 5350</td><td>Hamburg, Niemcy</td></tr><tr><td>Zmotoryzowany odwrócony mikroskop badawczy</td><td>Olypmus</td><td>Model IX-81</td><td>Center Valley, PA, USA</td></tr><tr><td>Drewniany aplikator</td><td>Puritan Medical Products Company, LLC</td><td>807</td><td>6"x100, Guilford, ME, USA</td></tr><tr><td>1.5 Szkiełka nakrywkowe</td><td>Warner Instruments, LLC</td><td>64-1696</td><td>#1.5, grubość 0,17 mm, średnica 40 mm, Hamden, CT, USA</td></tr></tbody></table>

wizualizacja i analiza w czasie rzeczywistym uszkodzeń chondrocytów spowodowanych obciążeniem mechanicznym w całkowicie nienaruszonych eksplantatach chrząstki myszy

Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants

Homeostaza chrząstki stawowej zależy od żywotności rezydujących komórek (chondrocytów). Niestety, uraz mechaniczny może wywołać rozległą śmierć chondrocytów, potencjalnie prowadząc do nieodwracalnego rozpadu stawu i wystąpienia choroby zwyrodnieniowej stawów. Ponadto utrzymanie żywotności chondrocytów jest ważne w zabiegach przeszczepów chrzęstnoszkieletowych w celu uzyskania optymalnych wyników chirurgicznych. Przedstawiono metodę oceny przestrzennego zasięgu uszkodzenia/obumarcia komórek na powierzchni stawowej nienaruszonych mysich stawów maziowych po zastosowaniu kontrolowanych obciążeń mechanicznych lub uderzeń. Metoda ta może być stosowana w badaniach porównawczych w celu zbadania wpływu różnych schematów obciążenia mechanicznego, różnych warunków środowiskowych lub manipulacji genetycznych, a także różnych etapów degeneracji chrząstki na krótko- i/lub długoterminową podatność chondrocytów stawowych in situ. Celem protokołu przedstawionego w pracy jest ocena przestrzennego zasięgu uszkodzenia/śmierci komórek na powierzchni stawowej mysich stawów maziowych. Co ważne, metoda ta umożliwia badanie na całkowicie nienaruszonej chrząstce bez naruszania natywnych warunków brzegowych. Co więcej, pozwala na wizualizację w czasie rzeczywistym żywotnie zabarwionych chondrocytów stawowych oraz analizę uszkodzeń komórek wywołanych przez zastosowanie kontrolowanych schematów obciążenia statycznego i udarowego, opartego na pojedynczym obrazie. Nasze reprezentatywne wyniki pokazują, że w zdrowych eksplantatach chrząstki przestrzenny zakres uszkodzenia komórek zależy w dużej mierze od wielkości obciążenia i intensywności uderzenia. Nasza metoda może być łatwo dostosowana do badania wpływu różnych schematów obciążenia mechanicznego, różnych warunków środowiskowych lub różnych manipulacji genetycznych na mechaniczną podatność chondrocytów stawowych in situ.

Sześć różnych protokołów obciążenia (obciążenie statyczne: 0,1 N, 0,5 N i 1 N przez 5 min; oraz obciążenie dynamiczne: 1 mJ, 2 mJ i 4 mJ) w sposób powtarzalny wywołało mierzalne, zlokalizowane obszary uszkodzeń komórek w chrząstce udowej i ramiennej uzyskanej od 8–10-tygodniowych myszy BALB/c (Rysunek 2). Co istotne, zakres przestrzenny uszkodzeń chondrocytów na powierzchni stawowej został zmierzony szybko i łatwo w programie ImageJ. Reprezentatywne wyniki wy...

Przedstawiamy metodę oceny przestrzennego zasięgu uszkodzenia/śmierci komórek na powierzchni stawowej nienaruszonych stawów mysich po zastosowaniu kontrolowanych obciążeń mechanicznych lub uderzeń. Metoda ta może być wykorzystana do zbadania, w jaki sposób choroba zwyrodnieniowa stawów, czynniki genetyczne i/lub różne schematy obciążenia wpływają na podatność chondrocytów in situ.

Wizualizacja i analiza w czasie rzeczywistym uszkodzeń chondrocytów spowodowanych obciążeniem mechanicznym w całkowicie nienaruszonych eksplantatach chrząstki myszy

Homeostasis of articular cartilage depends on the viability of resident cells (chondrocytes). Unfortunately, mechanical trauma can induce widespread ...

Metoda ta umożliwia badanie wpływu różnych schematów obciążenia mechanicznego, warunków środowiskowych czy etapów degeneracji chrząstki na podatność chondrocytów stawowych in situ. Siły fizyczne. W przeciwieństwie do innych technik, pomiary te są wykonywane w czasie rzeczywistym i w całkowicie nienaruszonej chrząstce bez naruszania natywnych warunków brzegowych.Kolejną zaletą tej techniki jest wykorzystanie modelu mysiego, co pozwala na sprawdzenie, jak określone geny wpływają na podatność chondrocytów in situ w przypadku uszkodzenia mechanicznego. W celu wypreparowania dystalnej części kości udowej umieść mysz w pozycji leżącej na plecach i wykonaj pięciomilimetrowe nacięcie skóry w przedniej części kolana. Przedłuż nacięcie aż do kolana.I odciągnij skórę, aby odsłonić staw kolanowy i mięśnie nóg. Zaczynając od bliższego końca kości udowej, użyj ostrza skalpela numer jedenaście, aby przeciąć wzdłuż kości w kierunku dystalnym. Ustawienie ostrza między jednostką ścięgna mięśnia czworogłowego uda a przednią stroną trzonu kości udowej.Przedłuż nacięcie poza rzepkę. Przecięcie środka ścięgna rzepki w celu usunięcia jednostki ścięgna mięśnia czworogłowego. Następnie, zaczynając od bliższego końca kości udowej, umieść ostrze skalpela między jednostką ścięgna mięśnia podkolanowego a tylną stroną trzonu kości udowej i przeciąć wzdłuż kości w kierunku dystalnym.Gdy nacięcie zbliża się do stawu kolanowego, przetnij tkankę miękką i zakończ cięcie za stawem kolanowym. Odciągnij mięśnie czworogłowe i ścięgna podkolanowe, aby odsłonić kość udową. I odetnij nadmiar mięśni po bocznej i środkowej stronie kości.Przetnij mięsień łydki po tylnej stronie bliższej części kości piszczelowej. I odwróć nogę, aby uwidocznić tylną stronę kości udowej. Usuń nadmiar tkanki wokół stawu kolanowego, aby odsłonić dystalne kłykcie kości udowej i tylną powierzchnię bliższej kości piszczelowej.Przeciąć więzadła krzyżowe przednie i tylne z dala od kłykci kości udowej. I odciągnij kość piszczelową od kości udowej, przecinając wszystkie więzadła, aby oddzielić dolną część nogi od kości udowej. Za pomocą standardowych nożyczek preparacyjnych przeciąć kość udową na bliższym końcu kości około ośmiu milimetrów powyżej stawu piszczelowo-udowego od strony bocznej.I użyj kleszczyków jubilerskich, aby usunąć otaczające tkanki miękkie z kości udowej. Następnie odsłoń chrząstkę na obu kłykciach na dystalnym końcu kości udowej. Okresowo nawilżaj powierzchnię stawową za pomocą HBSS.W celu wycięcia kości ramiennej umieść mysz w pozycji leżącej. I użyj mikronożyczek, aby wykonać pięciomilimetrowe nacięcie po tylnej stronie łokcia. Przedłużenie nacięcia wokół łokcia i odciągnięcie skóry w celu odsłonięcia mięśni ramienia i barku.Zaczynając od bliższego końca kości ramiennej, umieść ostrze skalpela numer jedenaście między jednostką ścięgna mięśnia trójgłowego a tylną stroną kości ramiennej. I przeciąć wzdłuż kości w kierunku dystalnym. Przedłuż nacięcie w kierunku dystalnego końca kości ramiennej, przez ścięgno tricepsa i pociągnij triceps do tyłu w kierunku bliższego końca kości ramiennej, aż głowa kości ramiennej zostanie odsłonięta.Przeciąć tkankę łączną wokół głowy kości ramiennej, nie dotykając powierzchni stawowej. I usuń kończynę z ciała. Nawodnij powierzchnię stawową głowy kości ramiennej za pomocą HBSS.Aby odłączyć kość ramienną od ramienia, użyj kleszczy, aby odłamać bliższy koniec kości łokciowej po tylnej stronie ramienia. I przetnij tkankę łączną wokół dystalnego końca kości ramiennej, usuwając nadmiar tkanki z kości. Następnie użyj standardowych nożyczek preparacyjnych, aby usunąć guzowatość naramienną po tylnej stronie kości ramiennej.I umieść wypreparowaną próbkę w 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówki zawierającej HBSS. W celu barwienia próbek Calcein AM należy przenieść kości do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 500 mikrolitrów 10,05 mikromolowej kalceiny w HBSS. I umieść rurkę w termomikserze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 800 obr./min, chroniąc przed światłem.Po trzydziestu minutach umyj próbkę w świeżym HBSS przez dziesięć minut. I przenieś próbkę na szklane szkiełko niestandardowego mechanicznego urządzenia testującego zamontowanego pod mikroskopem, tak aby powierzchnia stawowa tylnych kłykci kości udowej lub głowy kości ramiennej znajdowała się na szkle. Uwodnić próbkę za pomocą HBSS i umieścić urządzenie z próbką na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego.Wyobraź sobie chondrocyty stawowe wybarwione Calceiną AM przed przyłożeniem obciążenia pod 4-krotnym powiększeniem. Dostosuj ustawienia akwizycji, aby zoptymalizować jakość obrazu. Aby zastosować statyczne obciążenie mechaniczne, należy przytrzymać zalecane obciążenie statyczne na wierzchu próbki, tak aby chrząstka stawowa była dociśnięta do szkła nakrywkowego przez pięć minut przed usunięciem obciążenia.Aby przyłożyć udarowe obciążenie mechaniczne, należy zrzucić cylindryczny impaktor o znanej masie na próbkę z określonej wysokości, zwalniając ładunek pięć sekund po uderzeniu. Natychmiast po usunięciu któregokolwiek z ładunków należy inkubować próbkę w świeżo przygotowanym 60 mikromolowym jodku propridium w jednym mililitrze HBSS. Przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie ponownie zobrazuj chondrocyty stawowe za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, jak właśnie pokazano.Aby określić ilościowo obszar uszkodzonych i martwych komórek w wyniku zastosowanego schematu obciążenia mechanicznego, najpierw otwórz mikrofotografie powierzchni stawowej uzyskane przed i po zastosowaniu obciążenia mechanicznego w ImageJ. Połącz obrazy w stos. Ustaw skalę obrazów na podstawie rozdzielczości obrazu.Następnie zdefiniuj obszar, w którym komórki stały się ujemne pod względem kalceiny i dodatnie PI. Komórki te uważa się za uszkodzone lub martwe. Następnie określ obszar uszkodzonych martwych komórek za pomocą narzędzia pomiarowego.Co najmniej sześć testowanych zastosowało protokoły ładowania, które w sposób powtarzalny indukowały ilościowe zlokalizowane obszary uszkodzenia komórek w chrząstkach udowych i ramiennych uzyskanych od ośmio- do dziesięciotygodniowych myszy z zastawką C. We wszystkich testowanych protokołach obciążenia większe wielkości obciążenia i większa intensywność uderzeń znacznie pogorszyły przestrzenny zakres uszkodzenia komórek zarówno w kości udowej, jak i ramiennej. Podczas wykonywania sekcji należy pamiętać, aby nie kontaktować się z chrząstką stawową narzędziami chirurgicznymi, ponieważ może to zagrozić linii podstawowej przez zdolność próbek.Zastosowanie tego modelu lustrzanego może ułatwić badania nad chorobą zwyrodnieniową stawów, ponieważ chorobę można łatwo wywołać u myszy poprzez manipulacje genetyczne, dietetyczne lub chirurgiczne. Nasza platforma zapewnia również narzędzie do zadawania pytań dotyczących podstawowych zagadnień naukowych oraz do badań przesiewowych interwencji terapeutycznych ukierunkowanych na mechaniczną podatność chondrocytów.

real-time-visualization-analysis-chondrocyte-injury-due-to-mechanical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Biosynteza chrzęstnej macierzy pozakomórkowej przez chondrocyty może ulegać zmianom pod wpływem bodźców mechanicznych. Niniejsza metoda opisuje technikę aplikowania dynamicznych odkształceń ściskających do chondrocytów zamkniętych w konstrukcjach 3D oraz ocenę indukowanych zmian w metabolizmie chondrocytów.

Mechaniczna stymulacja hydrożeli z chondrocytów i agarozy

Zaprojektowaliśmy nowatorski bioreaktor obciążenia mechanicznego, który może zastosować jednoosiowe lub dwuosiowe naprężenie mechaniczne do biokompozytu chrząstki przed przeszczepem do ubytku chrząstki stawowej.

Projekt dwuosiowego bioreaktora obciążenia mechanicznego dla inżynierii tkankowej

Organizacja komórkowa kości twarzoczaszki od dawna była przedmiotem hipotezy, ale nigdy nie została bezpośrednio zwizualizowana. Wielospektralne znakowanie komórek i obrazowanie na żywo in vivo umożliwiają wizualizację dynamicznego zachowania komórek w dolnej szczęce danio pręgowanego. Tutaj szczegółowo opisujemy protokół manipulowania transgenicznymi rybami Zebrabow i bezpośrednio obserwujemy interkalację komórek i zmiany morfologiczne chondrocytów w chrząstce Meckla.

Wizualizacja interkalacji chondrocytów i proliferacji kierunkowej za pomocą analizy komórek klonalnych Zebrabow w embrionalnej chrząstce Meckla

Ten protokół opisuje minimalnie inwazyjną technikę osteosyntezy wykorzystującą śródszpikową do standaryzowanej stabilizacji złamań kości udowej, która może być wykorzystana do analizy endochrzęstnego gojenia kości u myszy.

Minimalnie inwazyjny model do analizy gojenia złamań śródchrzęstnych u myszy w standaryzowanych warunkach biomechanicznych

Tutaj prezentujemy protokół opisujący izolację i hodowlę eksplantatów chrząstek z kolan bydlęcych. Metoda ta stanowi łatwe i przystępne narzędzie do opisywania zmian w tkankach w odpowiedzi na bodźce biologiczne lub nowatorskie terapie ukierunkowane na staw.

Model hodowli tkankowej ex vivo przebudowy chrząstki w eksplantatach bydlęcego kolana

Tutaj prezentujemy model uszkodzenia chrząstki śródstawowej w kolanie szczura wywołany cyklicznym obciążeniem, generowany przez 60 cyklicznych uciśnięć powyżej 20 N, skutkujących uszkodzeniem chrząstki kłykciowej kości udowej u szczurów.

Nieinwazyjna metoda generowania modelu uszkodzenia chrząstki stawowej w kolanie szczura wywołanego cyklicznym obciążeniem

Obecny protokół opisuje kontrolowane zadrapania mikroostrza na powierzchni chrząstki stawowej po destabilizacji kolana myszy poprzez przecięcie przyśrodkowego więzadła minipiszczelowego. Ten model zwierzęcy przedstawia przyspieszoną postać choroby zwyrodnieniowej stawów (OA) odpowiednią do badania tworzenia osteofitów, osteosklerozy i bólu we wczesnym stadium.

Destabilizacja przyśrodkowego łąkotki i chrząstki rys mysiego modelu przyspieszonej choroby zwyrodnieniowej stawów

Ten protokół opisuje ulepszony model myszy do urazów płytki wzrostu kości u nastolatków. Używając transgenicznych myszy z trójliniowymi fluorescencyjnymi reporterami dla kolagenu typu I, II i X, pierwotnych matryc związanych z trzema różnymi podłożami płytki wzrostowej, umieszczanie urazów jest kierowane przez natywną fluorescencję pod mikroskopem.

Trójkolorowy transgeniczny model myszy do badania uszkodzeń płytki wzrostowej

Aby lepiej zrozumieć reakcję chondrocytów na mechaniczne przeciążenie chrząstki, protokół opisuje rozwój modelu wpływu chrząstki ex vivo, który był subletalny przez 24 godziny.

In vitro Model wpływu do generowania subletalnego uszkodzenia chondrocytów w eksplantatach chrząstki bydlęcej

Przedstawiamy tutaj zintegrowany protokół generowania kontrolowanych zmian kostnych-chondralnych u kolan owiec, aby ustanowić eksperymentalny model odpowiedni do badań regeneracji tkanek kości i chrząstki. Protokół określa metodę wywołania pełnogrubego ubytku kości kostnodzielnej w kłykciu udowym, wykorzystując techniki minimalizujące wpływ na dobrostan zwierząt oraz zmienność wyników.

Ustanowienie i ocena modelu owiec o pełnej grubości ubytku kości kościowego

Poznaj metodę wizualizacji uszkodzeń chondrocytów w czasie rzeczywistym w nienaruszonych eksplantatach chrząstki myszy. Technika umożliwia badanie wpływu obciążenia mechanicznego na komórki stawowe in situ.

Wizualizacja i analiza w czasie rzeczywistym uszkodzeń chondrocytów spowodowanych obciążeniem mechanicznym w całkowicie nienaruszonych eksplantatach chrząstki myszy (Wideo) | JoVE Journal

Wizualizacja i analiza w czasie rzeczywistym uszkodzeń chondrocytów spowodowanych obciążeniem mechanicznym w całkowicie nienaruszonych eksplantatach chrząstki myszy

Przeglądaj więcej filmów