Wizualizacja i analiza w czasie rzeczywistym uszkodzeń chondrocytów spowodowanych obciążeniem mechanicznym w całkowicie nienaruszonych eksplantatach chrząstki myszy

Metoda ta umożliwia badanie wpływu różnych schematów obciążenia mechanicznego, warunków środowiskowych czy etapów degeneracji chrząstki na podatność chondrocytów stawowych in situ. Siły fizyczne. W przeciwieństwie do innych technik, pomiary te są wykonywane w czasie rzeczywistym i w całkowicie nienaruszonej chrząstce bez naruszania natywnych warunków brzegowych.

Kolejną zaletą tej techniki jest wykorzystanie modelu mysiego, co pozwala na sprawdzenie, jak określone geny wpływają na podatność chondrocytów in situ w przypadku uszkodzenia mechanicznego. W celu wypreparowania dystalnej części kości udowej umieść mysz w pozycji leżącej na plecach i wykonaj pięciomilimetrowe nacięcie skóry w przedniej części kolana. Przedłuż nacięcie aż do kolana.

I odciągnij skórę, aby odsłonić staw kolanowy i mięśnie nóg. Zaczynając od bliższego końca kości udowej, użyj ostrza skalpela numer jedenaście, aby przeciąć wzdłuż kości w kierunku dystalnym. Ustawienie ostrza między jednostką ścięgna mięśnia czworogłowego uda a przednią stroną trzonu kości udowej.

Przedłuż nacięcie poza rzepkę. Przecięcie środka ścięgna rzepki w celu usunięcia jednostki ścięgna mięśnia czworogłowego. Następnie, zaczynając od bliższego końca kości udowej, umieść ostrze skalpela między jednostką ścięgna mięśnia podkolanowego a tylną stroną trzonu kości udowej i przeciąć wzdłuż kości w kierunku dystalnym.

Gdy nacięcie zbliża się do stawu kolanowego, przetnij tkankę miękką i zakończ cięcie za stawem kolanowym. Odciągnij mięśnie czworogłowe i ścięgna podkolanowe, aby odsłonić kość udową. I odetnij nadmiar mięśni po bocznej i środkowej stronie kości.

Przetnij mięsień łydki po tylnej stronie bliższej części kości piszczelowej. I odwróć nogę, aby uwidocznić tylną stronę kości udowej. Usuń nadmiar tkanki wokół stawu kolanowego, aby odsłonić dystalne kłykcie kości udowej i tylną powierzchnię bliższej kości piszczelowej.

Przeciąć więzadła krzyżowe przednie i tylne z dala od kłykci kości udowej. I odciągnij kość piszczelową od kości udowej, przecinając wszystkie więzadła, aby oddzielić dolną część nogi od kości udowej. Za pomocą standardowych nożyczek preparacyjnych przeciąć kość udową na bliższym końcu kości około ośmiu milimetrów powyżej stawu piszczelowo-udowego od strony bocznej.

I użyj kleszczyków jubilerskich, aby usunąć otaczające tkanki miękkie z kości udowej. Następnie odsłoń chrząstkę na obu kłykciach na dystalnym końcu kości udowej. Okresowo nawilżaj powierzchnię stawową za pomocą HBSS.

W celu wycięcia kości ramiennej umieść mysz w pozycji leżącej. I użyj mikronożyczek, aby wykonać pięciomilimetrowe nacięcie po tylnej stronie łokcia. Przedłużenie nacięcia wokół łokcia i odciągnięcie skóry w celu odsłonięcia mięśni ramienia i barku.

Zaczynając od bliższego końca kości ramiennej, umieść ostrze skalpela numer jedenaście między jednostką ścięgna mięśnia trójgłowego a tylną stroną kości ramiennej. I przeciąć wzdłuż kości w kierunku dystalnym. Przedłuż nacięcie w kierunku dystalnego końca kości ramiennej, przez ścięgno tricepsa i pociągnij triceps do tyłu w kierunku bliższego końca kości ramiennej, aż głowa kości ramiennej zostanie odsłonięta.

Przeciąć tkankę łączną wokół głowy kości ramiennej, nie dotykając powierzchni stawowej. I usuń kończynę z ciała. Nawodnij powierzchnię stawową głowy kości ramiennej za pomocą HBSS.

Aby odłączyć kość ramienną od ramienia, użyj kleszczy, aby odłamać bliższy koniec kości łokciowej po tylnej stronie ramienia. I przetnij tkankę łączną wokół dystalnego końca kości ramiennej, usuwając nadmiar tkanki z kości. Następnie użyj standardowych nożyczek preparacyjnych, aby usunąć guzowatość naramienną po tylnej stronie kości ramiennej.

I umieść wypreparowaną próbkę w 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówki zawierającej HBSS. W celu barwienia próbek Calcein AM należy przenieść kości do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 500 mikrolitrów 10,05 mikromolowej kalceiny w HBSS. I umieść rurkę w termomikserze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 800 obr./min, chroniąc przed światłem.

Po trzydziestu minutach umyj próbkę w świeżym HBSS przez dziesięć minut. I przenieś próbkę na szklane szkiełko niestandardowego mechanicznego urządzenia testującego zamontowanego pod mikroskopem, tak aby powierzchnia stawowa tylnych kłykci kości udowej lub głowy kości ramiennej znajdowała się na szkle. Uwodnić próbkę za pomocą HBSS i umieścić urządzenie z próbką na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego.

Wyobraź sobie chondrocyty stawowe wybarwione Calceiną AM przed przyłożeniem obciążenia pod 4-krotnym powiększeniem. Dostosuj ustawienia akwizycji, aby zoptymalizować jakość obrazu. Aby zastosować statyczne obciążenie mechaniczne, należy przytrzymać zalecane obciążenie statyczne na wierzchu próbki, tak aby chrząstka stawowa była dociśnięta do szkła nakrywkowego przez pięć minut przed usunięciem obciążenia.

Aby przyłożyć udarowe obciążenie mechaniczne, należy zrzucić cylindryczny impaktor o znanej masie na próbkę z określonej wysokości, zwalniając ładunek pięć sekund po uderzeniu. Natychmiast po usunięciu któregokolwiek z ładunków należy inkubować próbkę w świeżo przygotowanym 60 mikromolowym jodku propridium w jednym mililitrze HBSS. Przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie ponownie zobrazuj chondrocyty stawowe za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, jak właśnie pokazano.

Aby określić ilościowo obszar uszkodzonych i martwych komórek w wyniku zastosowanego schematu obciążenia mechanicznego, najpierw otwórz mikrofotografie powierzchni stawowej uzyskane przed i po zastosowaniu obciążenia mechanicznego w ImageJ. Połącz obrazy w stos. Ustaw skalę obrazów na podstawie rozdzielczości obrazu.

Następnie zdefiniuj obszar, w którym komórki stały się ujemne pod względem kalceiny i dodatnie PI. Komórki te uważa się za uszkodzone lub martwe. Następnie określ obszar uszkodzonych martwych komórek za pomocą narzędzia pomiarowego.

Co najmniej sześć testowanych zastosowało protokoły ładowania, które w sposób powtarzalny indukowały ilościowe zlokalizowane obszary uszkodzenia komórek w chrząstkach udowych i ramiennych uzyskanych od ośmio- do dziesięciotygodniowych myszy z zastawką C. We wszystkich testowanych protokołach obciążenia większe wielkości obciążenia i większa intensywność uderzeń znacznie pogorszyły przestrzenny zakres uszkodzenia komórek zarówno w kości udowej, jak i ramiennej. Podczas wykonywania sekcji należy pamiętać, aby nie kontaktować się z chrząstką stawową narzędziami chirurgicznymi, ponieważ może to zagrozić linii podstawowej przez zdolność próbek.

Zastosowanie tego modelu lustrzanego może ułatwić badania nad chorobą zwyrodnieniową stawów, ponieważ chorobę można łatwo wywołać u myszy poprzez manipulacje genetyczne, dietetyczne lub chirurgiczne. Nasza platforma zapewnia również narzędzie do zadawania pytań dotyczących podstawowych zagadnień naukowych oraz do badań przesiewowych interwencji terapeutycznych ukierunkowanych na mechaniczną podatność chondrocytów.