Name: Techniki fenotypowania w skali mikronowej wiązek naczyniowych kukurydzy w oparciu o rentgenowską tomografię mikrokomputerową (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Poznaj techniki fenotypowania wiązek naczyniowych kukurydzy w skali mikronowej przy użyciu mikrotomografii rentgenowskiej. Ta metoda umożliwia szczegółową analizę tkanek roślinnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania były wspierane przez Narodową Fundację Nauk o Przyrodzie Chin (No.31671577), Science and Technology Innovation Special Construction Funding Program of Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences(KJCX20180423), Chiński Program Rozwoju Badań (2016YFD0300605-01), Beijing Natural Science Foundation (5174033), Beijing Postdoctoral Research Foundation (2016 ZZ-66) oraz Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences Dotacja (KJCX20170404), (JNKYT201604).

1. Protokół przygotowania próbki
<ol>
	<li>W celu pobrania próbek należy pobrać łodygę, liście i korzeń świeżych roślin kukurydzy i podzielić je na trzy rodzaje grup próbek (każda grupa z czterema powtórzeniami). Następnie pokrój je na małe segmenty za pomocą ostrza chirurgicznego w następujący sposób: (1) wytnij segment środkowego międzywęźla łodygi o długości 1 - 1,5 cm; (2) wyciąć odcinek o maksymalnej szerokości liścia o długości 0,5 - 3 cm wzdłuż kierunku pionowego z główną żyłą; (3) Wytnij segment korzenia korony o długości 0,5 cm.</li>
	<li>W celu utrwalenia FAA należy zanurzyć segmenty próbki w roztworze FAA (90:5:5 v/v/v, 70% etanol:100% formaldehyd:100% kwas octowy) przez co najmniej 3 dni.</li>
	<li>Wykonaj procedurę odwadniania w sześciu sekwencyjnych gradientach etanolu (tj. 30%, 50%, 70%, 85%, 95% i 100%) i ustaw czas przetwarzania każdego gradientu etanolu na 30 minut.</li>
	<li>Umieść materiały roślinne w odpowiednich koszach na próbki wyprodukowanych za pomocą drukarki 3D, a następnie szybko przenieś kosze na próbki do celi próbki systemu suszenia w punkcie krytycznym CO2 . Ustaw parametry suszenia w następujący sposób: 
	(1) CO2 cale: duża prędkość. Wypełniacze uchwytów: 100%, 
	(2) Ładowanie: opóźnienie ładowania CO2 120 s w cyklu. Szybkość wymiany: 5. Numer cyklu: 12, 
	(3) Wyjście gazu: ciepło, szybko. Prędkość: wolna, 50%.
	<ol>
		<li>Zgodnie z różnicami morfologicznymi korzenia, łodygi i liścia kukurydzy, zaprojektuj i wydrukuj kosze na próbki za pomocą drukarki 3D (np. <silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść wysuszone materiały roślinne (korzeń kukurydzy, łodygę lub liść) w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml z 2 g stałego jodu, aby zabarwić materiały roślinne lotnymi oparami jodu, a następnie umieść probówki w pomieszczeniu odpornym na światło na 4-5 godzin.</li>
</ol>
2. Protokół skanowania mikro-tomografią komputerową
<ol>
	<li>Aby zeskanować do surowych danych TK, ustaw parametry skanowania TK w następujący sposób: 40 kV/250 μA (dla łodygi i liścia) lub 34 kV/210 μA (dla korzenia). Ustaw odpowiednie zakresy skanowania dla różnych rozmiarów i objętości użytych materiałów roślinnych i dostosuj rozmiary pikseli obrazowania w następujący sposób: 2,0 μm (dla korzenia kukurydzy), 6,77 μm (dla łodygi kukurydzy) i 10,0 μm (dla liścia kukurydzy).</li>
	<li>Aby zrekonstruować obrazy przekrojów, przekształć surowe dane CT na obrazy wycinków CT o rozdzielczości 2K (2,000 x 2,000 pikseli) za pomocą oprogramowania do rekonstrukcji obrazu. Więcej szczegółów znajduje się w instrukcji obsługi NRecon (http://bruker-microct.com/next/NReconUserGuide.pdf).</li>
</ol>
3. Protokół analizy obrazu dla pojedynczego obrazu CT łodygi lub liścia kukurydzy
UWAGA: Użyj oprogramowania do automatycznego obrazowania wiązek naczyniowych, aby przeprowadzić analizę fenotypowania wiązek naczyniowych w obrazach CT łodygi i liścia kukurydzy (Rysunek 2). Kroki korzystania z oprogramowania są opisane w następujący sposób.
<ol>
	<li>Wyznacz typ narządu, aby zainicjować różne potoki algorytmów. Kliknij przycisk Parametry metody i wybierz łodygę kukurydzy lub liść kukurydzy z pierwszego pola rozwijanego.</li>
	<li>Aby zaimportować obrazy, kliknij przycisk Zarządzanie danymi, ustaw katalog roboczy i automatycznie zaimportuj wszystkie obrazy plasterków w tym katalogu. Zaznaczanie obrazów jedno- lub wieloplasterkowych w potokach obrazów.</li>
	<li>Określ rzeczywisty rozmiar obrazu w pikselach. Kliknij przycisk Parametry metody i wprowadź rzeczywisty rozmiar obrazu w pikselach w elemencie edycji rozmiaru piksela.</li>
	<li>Aby obliczyć fenotypowanie, kliknij przycisk Obliczenia fenotypowania, aby automatycznie wyodrębnić cechy fenotypowe wiązek naczyniowych dla wszystkich wybranych obrazów plasterków.</li>
	<li>Kliknij przycisk Analiza statystyczna, aby wyświetlić wyniki w formacie TXT lub CSV.</li>
</ol>
4. Protokół analizy obrazu dla serii obrazów CT korzenia kukurydzy
UWAGA: Seria obrazów CT korzeni kukurydzy jest wykorzystywana do ekstrakcji trójwymiarowych struktur naczyń metaksylemu za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów. Główne kroki są następujące.
<ol>
	<li>Zaimportuj zrekonstruowane obrazy korzeni kukurydzy (w formacie pliku BMP) i określ dokładne parametry odstępów (rozmiar woksela [tj. x, y, z]). Użyj rekurencyjnego narzędzia Gaussa, aby wygładzić te obrazy w celu poprawy jakości obrazu.</li>
	<li>Przeprowadzić segmentację 3D naczyń metaksylemowych, dostosowując parametry progowe; spowoduje to wygenerowanie jednolitej kolorowej etykiety dla każdego połączonego naczynia metaksylemu.</li>
	<li>Ulepszaj i identyfikuj naczynia metaksylemu interaktywnie, korzystając z morfologii, bitów i operacji wypełniania powodziowego.</li>
	<li>Przeprowadzenie wizualizacji objętości i rekonstrukcji powierzchni naczyń. Użyj narzędzia do statystyk masek, aby policzyć i zmierzyć cechy fenotypowe naczynia na poziomach 2D i 3D.</li>
</ol>

<ol><li>Lucas, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plant+vascular+system%3A+evolution%2C+development+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">The plant vascular system: evolution, development and functions.</a> Journal of Integrative Plant Biology. 55, 294-388 (2013).</li>
<li>Gou, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/296353164_Effects_of_population_density_on_stalk_lodging_resistant_mechanism_and_agronomic_characteristics_of_maize">Effect of population density on stalk lodging resistant mechanism and agronomic characteristics of maize.</a> Acta Agronomica Sinia. 33, 1688-1695 (2007).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QTL+mapping+of+stalk+bending+strength+in+a+recombinant+inbred+line+maize+population%5BTitle%5D)+AND+%22Theoretical+and+Applied+Genetics%22%5BJournal%5D)">QTL mapping of stalk bending strength in a recombinant inbred line maize population.</a> Theoretical and Applied Genetics. 126, 2257-2266 (2013).</li>
<li>Wilson, J. R., Mertens, D. R., Hatfield, R. D. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/jsfa.2740630406">Isolates of cell types from sorghum stems: Digestion, cell wall and anatomical characteristics.</a> Journal of the Science of Food and Agriculture. 63, 407-417 (1993).</li>
<li>Hatfield, R., Wilson, J., Mertens, D. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/230497359_Composition_of_cell_walls_isolated_from_cell_types_of_grain_sorghum_stems">Composition of cell walls isolated from cell types of grain sorghum stems.</a> Journal of the Science of Food and Agriculture. 79, 891-899 (1999).</li>
<li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/305888478_Micron-scale_phenotyping_quantification_and_three-dimensional_microstructure_reconstruction_of_vascular_bundles_within_maize_stalks_based_on_micro-CT_scanning">Micron-scale phenotyping quantification and three-dimensional microstructure reconstruction of vascular bundles within maize stems based on micro-CT scanning.</a> Functional Plant Biology. 44 (1), 10-22 (2016).</li>
<li>Pan, X., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/320376063_Three-dimensional_Reconstruction_of_Maize_Roots_and_Quantitative_Analysis_of_Metaxylem_Vessels_based_on_X-ray_Micro-Computed_Tomography">Reconstruction of Maize Roots and Quantitative Analysis of Metaxylem Vessels based on X-ray Micro-Computed Tomography.</a> Canadian Journal of Plant Science. 98 (2), 457-466 (2018).</li>
<li>McElrone, A. J., Choat, B., Parkinson, D. Y., MacDowell, A. A., Brodersen, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+high+resolution+computed+tomography+to+visualize+the+three+dimensional+structure+and+function+of+plant+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), e50162(2013).</li>
<li>Cloetens, P., Mache, R., Schlenker, M., Lerbs-Mache, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phase+tomography+of+Arabidopsis+seeds+reveals+intercellular+void+network%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Quantitative phase tomography of Arabidopsis seeds reveals intercellular void network.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103, 14626-14630 (2006).</li>
<li>Dorca-Fornell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+leaf+mesophyll+porosity+following+transient+retinoblastoma-related+protein+silencing+is+revealed+by+microcomputed+tomography+imaging+and+leads+to+a+system-level+physiological+response+to+the+altered+cell+division+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Increased leaf mesophyll porosity following transient retinoblastoma-related protein silencing is revealed by microcomputed tomography imaging and leads to a system-level physiological response to the altered cell division pattern.</a> Plant Journal. 76 (6), 914-929 (2013).</li>
<li>Verboven, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Void+space+inside+the+developing+seed+of+Brassica+napus+and+the+modelling+of+its+function%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Void space inside the developing seed of Brassica napus and the modelling of its function.</a> New Phytologist. 199, 936-947 (2013).</li>
<li>Brodersen, C. R., Roark, L. C., Pittermann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiological+implications+of+primary+xylem+organization+in+two+ferns%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">The physiological implications of primary xylem organization in two ferns.</a> Plant, Cell & Environment. 35, 1898-1911 (2012).</li>
<li>Choat, B., Brodersen, C. R., McElrone, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchrotron+X-ray+microtomography+of+xylem+embolism+in+Sequoia+sempervirens+saplings+during+cycles+of+drought+and+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Synchrotron X-ray microtomography of xylem embolism in Sequoia sempervirens saplings during cycles of drought and recovery.</a> New Phytologist. 205, 1095-1105 (2015).</li>
<li>Torres-Ruiz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+x-ray+microtomography+observation+confirms+the+induction+of+embolism+upon+xylem+cutting+under+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Direct x-ray microtomography observation confirms the induction of embolism upon xylem cutting under tension.</a> Plant Physiology. 167, 40-43 (2015).</li>
<li>Staedler, Y. M., Masson, D., Schönenberger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+tissues+in+3D+via.+x-ray+tomography%3A+simple+contrasting+methods+allow+high+resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Plant tissues in 3D via. x-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging.</a> PLoS One. 8, 75295(2013).</li>
<li>Zhang, Y., Legay, S., Barrière, Y., Méchin, V., Legland, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Color+quantification+of+stained+maize+stem+section+describes+lignin+spatial+distribution+within+the+whole+stem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Science+of+Food+and+Agriculture%22%5BJournal%5D)">Color quantification of stained maize stem section describes lignin spatial distribution within the whole stem.</a> Journal of the Science of Food and Agriculture. 61, 3186-3192 (2013).</li>
<li>Legland, D., Devaux, M. F., Guillon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+mapping+of+maize+bundle+intensity+at+the+stem+scale+using+spatial+normalisation+of+replicated+images%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Statistical mapping of maize bundle intensity at the stem scale using spatial normalisation of replicated images.</a> PLoS One. 9 (3), 90673(2014).</li>
<li>Heckwolf, S., Heckwolf, M., Kaeppler, S. M., de Leon, N., Spalding, E. P. <a target="_blank" href="https://plantmethods.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13007-015-0070-x">Image analysis of anatomical traits in stem transections of maize and other grasses.</a> Plant Methods. 11, 26(2015).</li>
<li>Wu, H., Jaeger, M., Wang, M., Li, B., Zhang, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+distribution+of+vessels%2C+passage+cells+and+lateral+roots+along+the+root+axis+of+winter+wheat+%28Triticum+aestivum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional distribution of vessels, passage cells and lateral roots along the root axis of winter wheat (Triticum aestivum).</a> Annals of Botany. 107, 843-853 (2011).</li>
<li>Chopin, J., Laga, H., Huang, C. Y., Heuer, S., Miklavcic, S. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26398501">RootAnalyzer: A Cross-Section Image Analysis Tool for Automated Characterization of Root Cells and Tissues.</a> PLoS One. 10, 0137655(2015).</li>
<li>Passot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+pearl+millet+root+architecture+and+anatomy+reveals+three+types+of+lateral+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of pearl millet root architecture and anatomy reveals three types of lateral roots.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 829(2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dzięki udanemu zastosowaniu technologii CT w dziedzinie biomedycyny i materiałoznawstwa, technologia ta została stopniowo wprowadzona do dziedzin botaniki i rolnictwa, promując badania w dziedzinie nauk o życiu roślin jako obiecujące narzędzie techniczne. Pod koniec lat dziewięćdziesiątych XX wieku po raz pierwszy zastosowano technologię CT do badania struktur morfologicznych i rozwoju systemów korzeniowych roślin. W ciągu ostatniej dekady synchrotron HRCT stał się potężnym, nieniszczącym narzędziem dla biologów roślin i...

System naczyniowy kukurydzy przebiega przez całą roślinę, od korzenia i łodygi do liści, co stanowi kluczowe ścieżki transportu do dostarczania wody, mineralnych składników odżywczych i substancji organicznych1. Kolejną ważną funkcją układu naczyniowego jest zapewnienie mechanicznego wsparcia dla rośliny kukurydzy. Na przykład morfologia, liczba i rozmieszczenie wiązek naczyniowych w korzeniach i łodygach są ściśle związane z odpornością roślin kukurydzy na wyleganie2,3. Obecnie badania nad budową anatomiczną wiązek naczyniowych wykorzystują głównie techniki mikroskopowe i ultramikroskopowe do przedstawienia struktur anatomicznych określonej części łodygi, liścia lub korzenia, a następnie zmierzenia i policzenia tych interesujących struktur za pomocą badań ręcznych. Niewątpliwie ręczny pomiar różnych struktur mikroskopowych w wielkoskalowych mikroobrazach jest pracą bardzo żmudną i nieefektywną oraz poważnie ogranicza precyzję cech mikrofenotypowych, ze względu na swoją subiektywność i niespójność4,5.
Kukurydza nie ma wtórnego wzrostu, a zawartość komórek składa się głównie z wody w pierwotnym merystymie. Bez żadnej obróbki wstępnej, świeże próbki tkanek kukurydzy mogą być bezpośrednio skanowane za pomocą urządzenia do mikrotomografii komputerowej; Jednak wyniki skanowania są prawdopodobnie słabe i szorstkie. Główne przyczyny podsumowano w następujący sposób: (1) niska gęstość tłumienia tkanek roślinnych, skutkująca niskim kontrastem liczby atomowej i wysokim szumem na obrazach; (2) świeże materiały roślinne są podatne na odwodnienie i kurczenie się podczas normalnego środowiska skanowania, jak donosi Du6. Wyżej wymienione problemy stały się głównymi ograniczeniami w rozwoju i zastosowaniu technologii mikrofenotypowania kukurydzy, pszenicy, ryżu i innych roślin jednoliściennych. W tym miejscu wprowadzamy "protokół przygotowania próbki" do wstępnej obróbki próbek łodygi, liści i korzeni kukurydzy. Protokół ten pozwala uniknąć odwodnienia i deformacji materiałów roślinnych podczas tomografii komputerowej; W związku z tym korzystne jest wydłużenie czasu konserwacji próbek roślinnych przy zachowaniu niedeformacji. Co więcej, etap barwienia na bazie stałego jodu zwiększa również kontrast materiałów roślinnych; w ten sposób znacznie poprawia jakość obrazowania mikro-CT. Ponadto opracowaliśmy oprogramowanie do przetwarzania obrazów o nazwie VesselParser do przetwarzania obrazów CT łodyg i liści kukurydzy. Oprogramowanie to integruje zestaw potoków przetwarzania obrazu w celu wykonywania wysokowydajnej i automatycznej analizy fenotypowania dla obrazów 2D CT różnych tkanek roślinnych. Pęczki naczyniowe w całym przekroju łodygi i liścia kukurydzy są wykrywane, ekstrahowane i identyfikowane za pomocą metody automatycznego przetwarzania obrazu. W efekcie otrzymujemy 31 mikroskopijnych fenotypów łodygi kukurydzy i 33 mikroskopijne fenotypy liścia kukurydzy. Na potrzeby serii obrazów CT korzenia kukurydzy opracowaliśmy schemat przetwarzania obrazu w celu uzyskania cech fenotypowych 3D naczyń metaksylemu. Schemat ten jest lepszy pod względem skuteczności akwizycji i rekonstrukcji obrazu w porównaniu z tradycyjnymi metodami.
Te wyniki wskazują, że procesy przetwarzania obrazu, uwzględniające charakterystykę obrazowania zwykłego mikrotomografii rentgenowskiej, stanowią skuteczną metodę mikroskopowego fenotypowania wiązek naczyniowych; to niezwykle rozszerza zastosowania technik CT w nauce o roślinach i poprawia automatyczne fenotypowanie materiałów roślinnych w rozdzielczości komórkowej6,7.

<table><tbody><tr><td>System rentgenowskiej tomografii komputerowej Skyscan 1172</td><td>Bruker Corporation, Belgia</td><td>NA</td><td>Do tomografii komputerowej</td></tr><tr><td>System suszenia punktu krytycznego CO2 (Leica CPD300)</td><td>Leica Corporation, Niemcy</td><td>NA</td><td>Do suszenia próbek</td></tr><tr><td></td><td>Etanol dowolny</td><td>BRAK NA</td><td>Do utrwalania FAA</td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Dowolny</td><td>BRAK NA</td><td>Do utrwalania FAA</td></tr><tr><td>Acetic kwas</td><td>Dowolny</td><td>BRAK NIE dotyczy</td><td>Do mocowania FAA</td></tr><tr><td>Ostrze chirurgiczne</td><td>Dowolna</td><td>BRAK DANYCH</td><td>Do cięcia próbek</td></tr><tr><td>Drukarka 3D</td><td>Makerbot replicator 2, MakerBot Industries, USA</td><td>NA</td><td>Do drukowania koszy na próbki korzenia, łodygi i liścia kukurydzy</td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa</td><td>Corning, USA</td><td>NA</td><td>Umieść materiał korzeniowy, łodygowy lub liściowy</td></tr><tr><td>Jod stały</td><td>Dowolny</td><td>BRAK DANYCH</td><td>Do barwienia próbek</td></tr><tr><td>Oprogramowanie SkyScan Nrecon</td><td>SkyScan NRecon, wersja: 1.6.9.4, Bruker Corporation, Belgia</td><td>NA</td><td>Do rekonstrukcji obrazu</td></tr><tr><td>Oprogramowanie VesselParser</td><td>VesselParser, wersja: 3.0, National Engineering Research Center for Information Technology in Agriculture (NERCITA), Pekin, Chiny</td><td>NA</td><td>Protokół analizy obrazu dla pojedynczego obrazu CT łodygi lub liścia kukurydzy</td></tr><tr><td>ScanIP</td><td>ScanIP, wersja: 7.0; Simpleware, Exeter, Wielka Brytania</td><td>Ameryka</td><td>Północna Oprogramowanie do przetwarzania obrazów 3D</td></tr><tr><td>Rękawiczki lateksowe</td><td>Dowolna</td><td>pęseta NA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dowolna</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

techniki fenotypowania w skali mikronowej wiązek naczyniowych kukurydzy w oparciu o rentgenowską tomografię mikrokomputerową

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

Konieczne jest dokładne ilościowe określenie struktur anatomicznych materiałów kukurydzianych w oparciu o techniki wysokoprzepustowej analizy obrazu. W tym miejscu udostępniamy "protokół przygotowania próbki" dla materiałów kukurydzianych (tj. łodygi, liści i korzeni) nadających się do zwykłego skanowania za pomocą mikrotomografii komputerowej (mikro-CT). Opierając się na obrazach CT łodygi, liścia i korzenia kukurydzy o wysokiej rozdzielczości, opisujemy dwa protokoły analizy fenotypowej wiązek naczyniowych: (1) na podstawie obrazu CT łodygi i liścia kukurydzy opracowaliśmy specjalny potok analizy obrazu, aby automatycznie wyodrębnić 31 i 33 cechy fenotypowe wiązków naczyniowych; (2) w oparciu o serię obrazów CT korzenia kukurydzy, ustaliliśmy schemat przetwarzania obrazu dla trójwymiarowej (3-D) segmentacji naczyń metaksylemu i wyodrębniliśmy dwuwymiarowe (2-D) i 3-D cechy fenotypowe, takie jak objętość, powierzchnia naczyń metaksylemu itp. W porównaniu z tradycyjnym ręcznym pomiarem wiązek naczyniowych materiałów kukurydzianych, Proponowane protokoły znacznie poprawiają wydajność i dokładność kwantyfikacji fenotypowej w skali mikronowej.

Protokół przygotowania próbek odpowiedni do standardowego skanowania mikro-CT nie tylko zapobiega deformacji tkanek roślinnych, ale także zwiększa kontrast absorpcji promieni rentgenowskich. Wstępnie przetworzone materiały roślinne są skanowane za pomocą systemu mikro-CT w celu uzyskania wysokiej jakości obrazów przekrojowych, przy czym najwyższa rozdzielczość może osiągnąć 2 µm/pixel. Rycina 4 przedstawia zeskanowane obrazy mikro-CT łodygi, liścia i korzenia...

Oferujemy nowatorską metodę poprawy kontrastu absorpcji promieniowania rentgenowskiego tkanki kukurydzy, odpowiednią do zwykłego skanowania metodą tomografii mikrokomputerowej. Na podstawie obrazów CT wprowadzamy zestaw procesów przetwarzania obrazów dla różnych materiałów kukurydzianych, aby skutecznie wyodrębnić mikroskopijne fenotypy wiązek naczyniowych kukurydzy.

Techniki fenotypowania w skali mikronowej wiązek naczyniowych kukurydzy w oparciu o rentgenowską tomografię mikrokomputerową

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Metoda ta może przynieść szybkie odpowiedzi na pytania w planowanej budowie technik fenotypowania w skali mikronowej. Takich jak cząstki skanujące mikro-CT i metoda analizy fenotypowej dla wiązek naczyniowych kukurydzy. Główną zaletą tej techniki jest zapewnienie nowych i skutecznych sposobów badania fenotypowych cech wiązki naczyniowej kukurydzy poprzez przygotowanie próbki, tomografię komputerową i analizę protokołów.Implikacje tej techniki poszerzają zastosowania zwykłego skanowania mikro-tomografią komputerową i innych nauk o roślinach. Protokół ten można łatwo zmodyfikować, aby uwzględnić inne materiały roślinne, takie jak procedura suszenia odwadniania. Na początek zbierz łodygę, liść i korzeń ze świeżych roślin kukurydzy.I podziel je na trzy grupy próbek. Następnie za pomocą ostrza chirurgicznego wyciąć od jednego do 1,5 centymetra segmentu środkowego międzywęźla łodygi. Za pomocą tego samego ostrza chirurgicznego wytnij segment o długości od 1/2 do dwóch centymetrów od maksymalnej szerokości liścia w kierunku pionowym z główną żyłą.Użyj ostrza chirurgicznego, aby wyciąć 1/2 centymetra segment ze zmielonego korzenia. Następnie zanurz segmenty próbki w roztworze FAA przez co najmniej trzy dni. Odwadniać segmenty próbki przez 30 minut w sześciu sekwencyjnych gradientach etanolu.Następnie umieść materiały roślinne w odpowiednich koszach na próbki. Szybko przenieś kosze do celi na próbki w systemie suszenia punktu krytycznego dwutlenku węgla. Umieść wysuszone materiały roślinne w 50-mililitrowej probówce wirówkowej z dwoma gramami stałego jodu.Następnie umieść probówki w pomieszczeniu odpornym na światło na cztery do pięciu godzin. Najpierw ustaw parametry skanowania CT zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie ustaw zakresy skanowania zgodnie z różnymi rozmiarami i objętościami użytych materiałów roślinnych.Następnie dostosuj rozmiary pikseli obrazowania w następujący sposób:Dwa mikrometry dla korzenia. 6,77 mikrometra dla łodygi. I 10 mikrometrów na liść.Aby zrekonstruować obrazy przekrojów, użyj oprogramowania do tworzenia obrazów, aby przekonwertować surowe dane CT na obrazy plasterków CT o rozdzielczości 2K. Najpierw określ typ narządu, aby zainicjować różne potoki algorytmów w oprogramowaniu do automatycznego obrazowania. Następnie kliknij przycisk parametrów metody i wybierz łodygę kukurydzy lub liść kukurydzy w pierwszym polu rozwijanym.Kliknij przycisk zarządzania danymi, ustaw katalog roboczy i zaimportuj wszystkie obrazy plasterków w katalogu. Następnie wybierz obrazy jedno- lub wieloplasterkowe do potoków obrazów. Następnie określ rozmiar obrazu w pikselach.Wybierz parametry metody i wprowadź rozmiar obrazu w pikselach w odpowiednim elemencie edycji. Następnie kliknij przycisk obliczeń fenotypowania, aby automatycznie wyodrębnić cechy fenotypowe wiązek naczyniowych dla wszystkich wybranych obrazów plasterków. Kliknij przycisk analizy statystycznej, aby wydrukować wyniki tych analiz w postaci pliku tekstowego lub CSV.Zaimportuj zrekonstruowane obrazy korzeni kukurydzy i określ dokładne parametry przestrzeni. Następnie użyj rekurencyjnego narzędzia Gaussa, aby wygładzić obrazy i poprawić jakość obrazu. Dostosuj parametry progowe, aby przeprowadzić segmentację 3D naczyń metaksylemowych.Spowoduje to utworzenie jednolitej kolorowej etykiety dla każdego podłączonego naczynia metaksylemu. Następnie udoskonal i zidentyfikuj naczynia metaksylemu interaktywnie, wykorzystując morfologię bitową i operacje wypełniania powodziowego. Następnie należy przeprowadzić wizualizację objętości i rekonstrukcję powierzchni naczyń.Na koniec użyj narzędzia do statystyk maski, aby policzyć i zmierzyć cechy fenotypowe naczynia na poziomie 2D i 3D. Korzystając z analizy opisanej w protokole, obliczono cechy fenotypowe wiązek naczyniowych w łodygach, liściach i korzeniach kukurydzy. Stworzono wygenerowaną wizualizację 3D naczyń korzeniowych i metaksylemowych, wykorzystując wyniki segmentacji, rekonstrukcji i wizualizacji objętości.Prawidłowy protokół przygotowania próbki znacznie poprawia jakość emitowania skaningu mikro-CT dla łodygi, liścia i korzenia kukurydzy. Z automatycznym rurociągiem emitującym do szybkiej ekstrakcji cech fenotypowych wiązek naczyniowych dla łodygi i liści kukurydzy. A konfiguracja i przetwarzanie emisji skanują w celu analizy cech fenotypowych 3D wiązek naczyniowych dla korzenia kukurydzy.Technika ta zapewnia praktyczny sposób dokładnej i szybkiej kwalifikacji fenotypowej oraz identyfikacji wiązek naczyniowych kukurydzy.

micron-scale-phenotyping-techniques-maize-vascular-bundles-based-on-x

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Rentgenowska tomografia komputerowa (HRCT) o wysokiej rozdzielczości to nieniszcząca technika obrazowania diagnostycznego, która może być wykorzystana do badania struktury i funkcji naczyń krwionośnych roślin w 3D. Pokazujemy, w jaki sposób HRCT ułatwia eksplorację sieci ksylemu w szerokim zakresie tkanek i gatunków roślin.

Wykorzystanie tomografii komputerowej o wysokiej rozdzielczości do wizualizacji trójwymiarowej struktury i funkcji naczyń krwionośnych roślin

Technika dwuniciowej interferencji RNA (dsRNAi) jest stosowana do obniżania poziomu genu reduktazy cynamoylokoenzymu A (ZmCCR1) w kukurydzy w celu obniżenia zawartości ligniny roślinnej. Regulacja w dół ligniny ze ściany komórkowej jest wizualizowana za pomocą analiz mikroskopowych i określana ilościowo metodą Klasona. Analizowane są zmiany składu hemicelulozy i celulozy krystalicznej.

Regulacja ligniny w dół Zea mays za pomocą dsRNAi i analizy ligniny Klason

Kwantyfikacja podziału i ekspansji komórek ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia wzrostu całej rośliny. W tym miejscu przedstawiamy protokół obliczania parametrów komórkowych określających tempo wzrostu liści kukurydzy i podkreślamy wykorzystanie tych danych do badania molekularnych mechanizmów regulacji wzrostu poprzez kierowanie strategiami pobierania próbek specyficznymi dla danego etapu rozwoju.

Analiza kinematyczna podziału i ekspansji komórek: ilościowe określanie komórkowych podstaw wzrostu i pobieranie próbek stref rozwojowych w liściach Zea mays

Wiele ważnych rozwojowo genów ma specyficzne dla komórek lub tkanek wzorce ekspresji. W artykule opisano eksperymenty LM RNA-seq w celu identyfikacji genów, które ulegają zróżnicowanej ekspresji na granicy blaszki liściowej kukurydzy i pochwy oraz w mutantach lg1-R w porównaniu z typem dzikim. Omówione tu rozważania eksperymentalne odnoszą się do analiz transkryptomicznych innych zjawisk rozwojowych.

Eksperymentalny projekt mikrodysekcji laserowej RNA-Seq: wnioski z analizy rozwoju liści kukurydzy

Micro-CT to nieniszczące narzędzie, które może analizować struktury roślin w trzech wymiarach. Niniejszy protokół opisuje przygotowanie próbki w celu wykorzystania mikro-CT do analizy struktury i funkcji roślin pasożytniczych. Aby podkreślić zalety tej metody w połączeniu z określonymi preparatami, stosuje się różne gatunki.

Wykorzystanie mikrotomografii komputerowej do analizy interakcji pasożytniczych między rośliną a żywicielem

Zawiązki liści kukurydzy są głęboko ukryte i zwinięte, co utrudnia ich badanie. W niniejszej pracy przedstawiono metody przygotowania przekrojów poprzecznych i rozwiniętych całych wierzchowców zawiązków liści kukurydzy do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego.

Ulepszone metody przygotowania przekrojów poprzecznych i rozwiniętych całych mocowań zawiązków liści kukurydzy do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego

Zaprojektowaliśmy protokół fenotypowania oparty na obrazach, aby określić morfologiczne i fizjologiczne reakcje na pojedyncze i skojarzone zabiegi upałów, suszy i podlewania. Podejście to umożliwiło identyfikację wczesnych, późnych i regeneracyjnych reakcji na poziomie całego zakładu, w szczególności części nadziemnych, a także podkreśliło konieczność stosowania wielu czujników obrazowania.

Wysokoprzepustowe fenotypowanie oparte na obrazie w celu określenia morfologicznych i fizjologicznych odpowiedzi na pojedyncze i połączone stresy u ziemniaka

Ocena różnic anatomicznych między przekrojami poprzecznymi liści C3 i C4 pomaga zrozumieć efektywność fotosyntezy. W artykule opisano przygotowanie i badanie przekrojów poprzecznych liści z wolnej ręki i półcienkiej, wraz z zastrzeżeniami dotyczącymi przygotowania dla gatunków roślin uprawnych Triticum aestivum i Zea mays.

Ocena cech strukturalnych Triticum aestivum i Zea mays dla różnicowania fotosyntetycznego C3 i C4 przy użyciu przekrojów odręcznych i półcienkich

Przedstawiono metodę taniego obrazowania roślin do pomiaru fenotypów, wraz z najlepszymi praktykami przechwytywania obrazów i potokiem analizy obrazu do ilościowego określania cech roślin. Metody te zastosowano do pomiaru fenotypów kukurydzy (Zea mays) w warunkach upałów, suszy i połączonego stresu abiotycznego.

Obrazowanie i analiza w celu ilościowego określenia fenotypów stresu abiotycznego kukurydzy (Zea mays)

Wykorzystaliśmy synchrotronową tomografię rentgenowską w Europejskiej Instalacji Promieniowania Synchrotronowego (ESRF), aby nieinwazyjnie uzyskać trójwymiarowe zbiory danych tomograficznych o rozdzielczości piksela 0.7µm. Dzięki zastosowaniu oprogramowania do renderowania objętościowego możliwe jest zrekonstruowanie struktur wewnętrznych w ich stanie naturalnym, bez artefaktów powstających podczas sekcjonowania histologicznego.

Nieinwazyjna wizualizacja 3D z rozdzielczością submikronową z wykorzystaniem synchrotronowej tomografii rentgenowskiej

Poznaj techniki fenotypowania wiązek naczyniowych kukurydzy w skali mikronowej przy użyciu mikrotomografii rentgenowskiej. Ta metoda umożliwia szczegółową analizę tkanek roślinnych.

Techniki fenotypowania w skali mikronowej wiązek naczyniowych kukurydzy w oparciu o rentgenowską tomografię mikrokomputerową

Przeglądaj więcej filmów