Test amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP) do szybkiej identyfikacji Bemisia tabaci
29 października 2018
Ten artykuł przedstawia protokół szybkiego testu identyfikacyjnego dla Bemisia tabaci opartego na technologii amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP). Protokół wymaga minimalnego przeszkolenia laboratoryjnego i dlatego może być wdrażany na miejscu w punktach wejścia dla importu roślin, takich jak porty morskie i lotnicze.
Metoda ta zapewnia szybkie i niezawodne narzędzie diagnostyczne do identyfikacji Bemisia tabaci, inwazyjnego szkodnika owadziego wpływającego na produkcję warzyw i roślin ozdobnych w wielu krajach na całym świecie. Ze względu na swoją łatwość metoda może być stosowana na miejscu bezpośrednio w punktach wprowadzania produktów importowanych z roślin, takich jak porty i lotniska, a tym samym może potencjalnie zmniejszyć rozprzestrzenianie się Bemisia tabaci w sieciach handlowych. Na początek użyj nożyczek, aby pociąć ośmiorurkowy pasek LAMP na dwa, czterorurkowe paski LAMP.
Następnie oznacz probówki zgodnie ze schematem przedstawionym na rysunku pierwszym w protokole tekstowym. Następnie przygotuj wystarczającą ilość wzorcowej mieszanki reakcji B.tabaci LAMP na 80 reakcji. Następnie dozuj 22,5 mikrolitra mieszanki wzorcowej do każdej z probówek czterorurowych pasków LAMP.
Wiruj pulsacyjnie i umieść je na lodzie. Szybko wirówka wirowa i pulsacyjna B.tabaci LAMP PAC. Następnie dodaj 2,5 mikrolitra do probówki oznaczonej PAC w każdym z czterorurowych pasków LAMP.
Następnie zamknij pokrywy i przechowuj gotowe do użycia zestawy B.tabaci LAMP w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Aby rozpocząć ekstrakcję DNA, użyj sterylnych wykałaczek, aby przenieść próbki owadów do 0,5-mililitrowych probówek wirówkowych z 30 mikrolitrami roztworu do ekstrakcji DNA. Następnie inkubować próbki przez pięć minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza w mieszalniku ThermoMixer ustawionym na 300 obr./min.
Krótko odwirować próbki wirowo i pulsacyjnie. Rozmrozić jeden z gotowych do użycia zestawów B.tabaci LAMP. Następnie szybko wymieszaj zestaw i odwiruj go pulsacyjnie.
Dodaj 2,5 mikrolitra próbki ekstraktu DNA do probówek S-one i S-dwóch. Następnie dodaj 2,5 mikrolitra czystego alkalicznego roztworu do ekstrakcji DNA do probówki NAC. Po wirowaniu i pulsacyjnym odwirowaniu zestawu, włóż zestaw do urządzenia do analizy LAMP i wykonuj izotermiczną analizę amplifikacji DNA w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 60 minut.
W tym samym przebiegu należy przeprowadzić analizę temperatury topnienia produktów amplifikacji DNA, najpierw podgrzewając zestaw do 98 stopni Celsjusza i schładzając go do 75 stopni Celsjusza. Zweryfikuj odczyt LAMP za pomocą automatycznej aplikacji do walidacji LAMP. Najpierw zdefiniuj gatunek docelowy i liczbę badanych próbek przed kliknięciem przycisku Generuj raport.
Na koniec przenieś odczyt do odpowiednich pól wejściowych aplikacji walidacyjnej. Natychmiast po wprowadzeniu danych zostanie wyświetlony wynik walidacji. W tym protokole próbki owadów B.tabaci przechwycone w trakcie regularnego procesu kontroli importu w Szwajcarii zostały przeanalizowane za pomocą testu LAMP.
Z łącznej liczby 80 przeanalizowanych próbek, 75 próbek zostało poprawnie zidentyfikowanych jako prawdziwie dodatnie, a dwie próbki zostały poprawnie zidentyfikowane jako prawdziwie ujemne. Trzy próbki były jednak fałszywie ujemne i zostały błędnie zidentyfikowane jako nienależące do B. tabaci. Część testów została przeprowadzona na miejscu przez inspektorów zdrowia roślin na lotnisku w Zurychu.
W reprezentatywnych wynikach próbki pierwsza i druga zostały prawidłowo zidentyfikowane jako B. tabaci poprzez amplifikację DNA po około 30 minutach w oczekiwanej temperaturze wyżarzania około 82 stopni Celsjusza. Po opracowaniu metoda ta utorowała drogę do szybkiej i łatwej do przeprowadzenia identyfikacji Bemisia tabaci na miejscu. Protokół został opracowany w taki sposób, aby mógł być wykonywany przez inspektorów zdrowia roślin z ograniczonym przeszkoleniem laboratoryjnym.
Po pomyślnej walidacji metody na miejscu w szwajcarskim punkcie wprowadzania produktów importowanych z roślin, metoda może zostać dostosowana do innych patogenów roślin, ale także, w razie potrzeby, do innych patogenów ludzkich lub weterynaryjnych.
Przegląd
Niniejsza praca przedstawia szybki test identyfikacyjny dla Bemisia tabaci z wykorzystaniem technologii izotermicznej amplifikacji zapętlonej (LAMP). Metoda ta została zaprojektowana do wdrożenia w punktach kontroli importu roślin, wymagając minimalnego przeszkolenia laboratoryjnego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Fitopatologia
- Zarządzanie gatunkami inwazyjnymi
- Technologia diagnostyczna
Wstęp
- Bemisia tabaci jest inwazyjnym owadem szkodnikiem wpłyваjącym na uprawy na całym świecie.
- Wczesna detekcja jest kluczowa dla zapobiegania jego rozprzestrzenianiu się.
- Obecne metody mogą nie być odpowiednie do szybkiego testowania w terenie.
- Technologia LAMP oferuje obiecujące rozwiązanie dla szybkiej diagnostyki.
Cel badania
- Opracowanie szybkiego i niezawodnego testu do identyfikacji Bemisia tabaci.
- Umożliwienie przeprowadzania badań w punktach wwozu, takich jak lotniska i porty morskie.
- Ograniczenie ryzyka rozprzestrzeniania się szkodników poprzez handel.
Zastosowane Metody
- Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej LAMP i ekstrakcja DNA.
- Izotermiczna amplifikacja DNA w temperaturze 65°C.
- Analiza temperatury topnienia produktów amplifikacji.
- Walidacja wyników z wykorzystaniem zautomatyzowanej aplikacji.
Główne wyniki
- 75 z 80 próbek zostało prawidłowo zidentyfikowanych jako prawdziwie dodatnie.
- Dwie próbki zostały prawidłowo zidentyfikowane jako prawdziwie ujemne.
- Trzy próbki były fałszywie ujemne.
- Metoda została pomyślnie zwalidowana na miejscu przez inspektorów.
Wnioski
- Test LAMP stanowi szybką i skuteczną metodę identyfikacji szkodników.
- Może być on przeprowadzany przez osoby z ograniczonym przeszkoleniem laboratoryjnym.
- Metoda ta wykazuje potencjał do adaptacji w odniesieniu do innych patogenów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Szybka identyfikacja molekularna szkodników inwazyjnych, takich jak Bemisia tabaci, jest kluczowa dla zapobiegania stratom w rolnictwie i ochrony globalnych łańcuchów dostaw. Test LAMP umożliwia detekcję w miejscu pobrania próbki w punktach wjazdu i wjazdu, co zmniejsza zależność od scentralizowanych laboratoriów i przyspiesza czas reakcji. Wspiera to proaktywne zarządzanie ryzykiem w biotechnologii rolniczej oraz zgodność z przepisami handlu międzynarodowego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju (B+R) biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia specyficzne wykrywanie kompleksu gatunków Bemisia tabaci, wspierając testowanie hipotez w badaniach nad interakcjami wektor-patogen.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowany cel molekularny do walidacji kompetencji wektorów owadzich w modelach przedklinicznych.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe sygnały amplifikacji w ciągu 60 minut, umożliwiając wysokoprzepustowe badanie okazów owadów.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje minimalną ilość materiału próbkowego oraz stabilne liofilizowane odczynniki, co wspiera skalowalność analizy i możliwość zastosowania w terenie.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ułatwia korelację między obecnością wektora a ryzykiem transmisji wirusa w systemach istotnych dla przebiegu choroby.
- Wartość operacyjna: Wspiera długoterminowe monitorowanie populacji szkodników w badaniach w kontrolowanym środowisku.
Integracja potoku i przepływu pracy
Analiza ta wpisuje się w procesy wczesnego etapu odkryć, zapewniając szybką identyfikację wektorów przed badaniami nad przenoszeniem patogenów, co umożliwia świadomy wybór próbek do dalszych analiz.
- Biologia odkrywcza: Potwierdza tożsamość wektora, aby ograniczyć błędne powiązania w eksperymentach nad interakcjami wektor-wirus.
- Przesiewanie: Dostarcza binarnych wyników (dodatnich/ujemnych) z wewnętrznymi kontrolami, zapewniając gotowość testu do analizy oraz jego powtarzalność.
- Analityka: Integruje się z automatycznym oprogramowaniem walidacyjnym w celu standaryzacji interpretacji danych i zapewnienia spójności między laboratoriami.
- Badania translacyjne: Umożliwia śledzenie rozpowszechnienia wektorów w regionach geograficznych istotnych w kontekście pojawiających się zagrożeń wirusami roślin.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Projekt oparty na zestawach umożliwia ponowne zastosowanie w wielu punktach inspekcyjnych oraz adaptację do innych gatunków wektorów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność oznaczenia celu poprzez ograniczenie błędnej identyfikacji wektorów owadzych w badaniach biologicznych.
- Wartość operacyjna: Eliminuje konieczność oczyszczania DNA i termocyklowania, obniżając bariery techniczne oraz wymagania dotyczące szkolenia.
- Wartość strategiczna: Przyspiesza podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu działań (go/no-go) w ocenach ryzyka związanego ze szkodnikami, redukując potencjalne straty w plonach i wpływ ekonomiczny.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację zasobów nadzorczych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zwalidowane dane dotyczące wykrywania wektorów.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Podstawowe szkolenie z zakresu biologii molekularnej w obszarze obchodzenia się z odczynnikami i przygotowywania próbek.
- Dostęp do urządzenia do detekcji fluorescencji lub mętności kompatybilnego z metodą LAMP.
- Standardowe procedury operacyjne dotyczące transportu próbek i kontroli kontaminacji.
- Uwzględnienie modyfikacji dla różnych gatunków owadów lub stadiów rozwojowych.
- Stabilność środowiskowa odczynników podczas przechowywania i zastosowań w terenie.
