Jednoczesna kriosekcja wielu mózgów gryzoni

Ta oszczędzająca czas metoda zmniejsza zmienność między rundami procedur immunohistochemicznych w badaniach neurobiologicznych, aby zoptymalizować wizualizację anatomii oraz lokalnych białek i tkanek. Główną zaletą tej techniki jest to, że skraca ona czas potrzebny na kriosekcję i montaż tkanki mózgowej poprzez połączenie wielu mózgów w jeden zamrożony blok. Chociaż technika ta jest zoptymalizowana pod kątem przekrojów koronalnych mózgów gryzoni, można ją dostosować do przekrojów strzałkowych lub poprzecznych lub różnych typów tkanek, takich jak mięśnie lub wątroba.

Po udanej perfuzji przezsercowej, po utrwaleniu mózgów zwierząt w 25-mililitrowej fiolce 4% paraformaldehydu w PBS przez 24 godziny. Następnie użyj kleszczy z końcówkami, aby usunąć mózg z paraformaldehydu. Przenieś mózgi do fiolki z około 20 mililitrami 30% roztworu sacharozy w TBS.

Trzymaj mózg i roztwór, aż opadną na dno fiolki. Następnie umieść szklaną zlewkę o pojemności 500 mililitrów na warstwie suchego lodu w wiaderku z lodem. Następnie wlej 300 do 400 mililitrów izopentanu do zlewki.

Utrzymuj izopentan między minus 45 a minus 50 stopni Celsjusza. Na blacie stołu napełnij jednorazową formę do zatapiania mniej więcej do połowy środkiem o optymalnej temperaturze cięcia lub środkiem OCT. Użyj igły, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza z formy.

Użyj kleszczy z końcówką, aby usunąć pierwszy mózg z roztworu sacharozy. Następnie użyj nowej żyletki, aby usunąć móżdżek i opuszki węchowe przed oddzieleniem półkul. Następnie daj mózgom numeryczny system nazewnictwa.

Użyj kleszczy, podnieś mózg, który ma być umieszczony w pozycji drugiej, i ustaw go tak, aby strona do cięcia była skierowana do góry. Opuść mózg do OCT i użyj pęsety, aby dostosować jego pozycję, aż stanie niezależnie. Kluczową modyfikacją tej techniki jest puste miejsce w pozycji pierwszej.

Przestrzeń ta jest wyznaczona tak, aby umożliwić łatwą identyfikację orientacji megamózgu, a tym samym identyfikację zwierzęcia związanego z każdym mózgiem. Po umieszczeniu wszystkich mózgów w formie, dodaj wystarczającą ilość OCT, aby pokryć wierzchołki mózgów, a następnie użyj igły, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Przytrzymaj róg formy kleszczami, upewniając się, że kleszcze nie zostaną częściowo zanurzone w OCT.

Następnie opuść formę do izopentanu tak, aby dolna jedna trzecia formy była zanurzona. Po 30 sekundach opuść całą formę do izopentanu i uwolnij ją z kleszczy. Po trzech minutach użyj kleszczyków, aby usunąć pleśń z izopentanu.

Natychmiast zawiń formę i jej zawartość w folię aluminiową i odpowiednio ją oznacz. Przenieś megamózg do zamrażarki o temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza na co najmniej 24 godziny. Najpierw ustaw temperaturę komory kriostatu na minus 19 stopni Celsjusza.

Wyjmij megamózg z zamrażarki i umieść go w kriostacie. Następnie umieść uchwyt i dwa pędzle z cienką końcówką w kriostacie. Następnie oznacz slajdy numerem identyfikacyjnym megabrain i numerem slajdu i połóż slajdy na podgrzewaczu do slajdów.

Następnie rozpakuj megamózg i użyj żyletki, aby przeciąć rogi formy. Nałóż cienką warstwę OCT na uchwyt wiertarski. Następnie szybko umieść megamózg na uchwycie.

Po całkowitym zamrożeniu OCT nałóż dwumilimetrową warstwę OCT na boki megamózgu i pozwól mu spłynąć po bokach na uchwyt. Użyj żyletki, aby usunąć nadmiar OCT z boków i spodu uchwytu. Najpierw umieść uchwyt zamontowany z megamózgiem na głowicy uchwytu kriostatu.

Następnie ustaw kriostat na żądaną grubość. W razie potrzeby przytnij OCT i tkankę, aby dotrzeć do pożądanego obszaru mózgu w celu pobrania tkanki. Następnie opuść płytkę stabilizacyjną, aż oprze się na stoliku i obróć uchwyt kriostatu, aby wziąć pojedynczą sekcję.

Powoli zdejmij płytkę zabezpieczającą, uważając, aby nie dotknąć części tkanki. Delikatnie użyj pędzli, aby rozwinąć część chusteczki, aż będzie leżeć płasko. W razie potrzeby trzymaj OCT płasko za pomocą pędzli, aby zapobiec toczeniu się.

Następnie wyjmij szkiełko z podgrzewacza do slajdów i najedź etykietą slajdu stroną do dołu nad sekcją megabrain i pozwól jej przykleić się do szkiełka. Szybko nałóż kroplę PBS na wycinek tkanki. Za pomocą pędzla z cienką końcówką zanurzonego w PBS wyszczotkuj wszelkie pęcherzyki w sekcji tkanki i rozłóż chusteczkę tak, aby leżała płasko na szkiełku.

Na koniec umieść szkiełko na podgrzewaczu do wyschnięcia przez 45 minut i przechowuj szkiełko w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. W tym protokole tkanka mózgowa od dziewięciu zwierząt została przygotowana i poddana jednoczesnej kriosekcji. Po kriosekcji można przeprowadzić barwienie H&E w celu oceny jakości krioprotekcji.

Reprezentatywne wyniki zjonizowanej cząsteczki adaptera wiążącego wapń lub barwienia Iba1 mikrogleju pokazują spójne barwienie między każdym badanym mózgiem na pojedynczym megamózgu. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o ciągłym monitorowaniu temperatury podczas zamrażania megamózgu, aby zapobiec pękaniu lub rozmrażaniu, a następnie ponownemu zamrożeniu tkanki, co prowadzi do nieprawidłowej integralności tkanki. Nie zaleca się segregacji różnych grup leczonych w oddzielnych megamózgach, ponieważ może to spowodować różnice między grupami podczas barwienia oraz zmniejszyć stronniczość i subiektywność podczas obrazowania i analizy.

Nie zapominaj, że praca z paraformaldehydem może być niezwykle niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak noszenie PBE i praca w kapturze, powinny być zawsze podejmowane podczas wykonywania tej procedury.