Name: Jednoczesna kriosekcja wielu mózgów gryzoni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Poznaj metodę jednoczesnej kriosekcji wielu mózgów gryzoni, która zmniejsza zmienność w immunohistochemii i przyspiesza przygotowanie tkanek. Technika ta optymalizuje wizualizację struktur anatomicznych i białek w badaniach neurobiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Fundusze Wsparcia Misji PCH wsparły badania opisane w tym manuskrypcie. Autorzy pragną podziękować Danielowi Griffithsowi za wykonanie zdjęć wykorzystanych w rysunkach.

Technika Megabrain została zoptymalizowana przy użyciu całych i półwyciętych mózgów od dorosłych samców myszy C57Bl65, młodych szczurów Sprague-Dawley i dorosłych szczurów Sprague-Dawley, które zostały perfundowane przezsercowo solą fizjologiczną buforowaną 1x fosforanem (PBS), a następnie 4% paraformaldehydu6. Podobne wyniki można osiągnąć u innych szczepów myszy i szczurów, u obu płci i w różnym wieku. W badaniu mającym na celu wygenerowanie danych do tego manuskryptu wykorzystano młode szczury Sprague-Dawley i zostało ono zatwierdzone przez University of Arizona Institutional Animal Care and Use Committee, a zwierzęta doświadczalne były pod opieką zgodnie z Przewodnikiem Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych7.
1. Krioprotekcja perfundowanych mózgów
<ol>
	<li>Po udanej perfuzji przezsercowej 6, zbierz pełną grupę brain6,8 od zwierząt i po utrwaleniu, umieszczając w 25 ml fiolce z 4% paraformaldehydem w PBS przez 24 godziny 
	UWAGA: Paraformaldehyd jest toksycznym utrwalaczem tkanek; Obchodź się ostrożnie. Przenieś paraformaldehyd do specjalnie oznakowanego pojemnika na odpady, który określa jego stężenie i objętość wewnątrz okapu na opary chemiczne, a następnie przechowuj w pojemniku na odpady chemiczne do czasu utylizacji przez Dział Bezpieczeństwa Chemicznego lub odpowiednio przeszkolony personel.</li>
	<li>Po upływie 24 godzin, w dygestorium usunąć mózg z 4% paraformaldehydu za pomocą szpatułki. Przenieś mózg do fiolki zawierającej około 20 ml 15% roztworu sacharozy w 1x soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS), aż mózg opadnie na dno fiolki (około 24 godzin).</li>
	<li>Następnie przenieś mózg do fiolki zawierającej około 20 ml 30% roztworu sacharozy w 1x TBS, aż mózg opadnie na dno fiolki (około 24-48 godzin).</li>
</ol>
2. Zamrożenie mózgu
<ol>
	<li>Umieść szklaną zlewkę o pojemności 500 ml na warstwie suchego lodu w wiaderku na lód. Wlać 300–400 ml izopentanu (2 metylobutanów) do szklanej zlewki.</li>
	<li>Pozwól, aby temperatura izopentanu osiągnęła temperaturę między -45 °C a -50 °C. Ściśle monitoruj i utrzymuj ten zakres temperatur za pomocą termometru, utrzymując go na stałym poziomie przez cały czas trwania procedury. Upewnij się, że odczyty temperatury są pobierane ze środka roztworu, a nie podczas dotykania dna lub boku zlewki.</li>
	<li>Na blacie napełnij jednorazową formę do zatapiania (patrz lista materiałów) około 1/2 masy Optimum Temperature (OCT; patrz Tabela materiałów). Upewnij się, że w KTZ nie ma pęcherzyków powietrza. Jeśli są jakieś pęcherzyki powietrza, usuń je szpatułką lub igłą.</li>
	<li>Usuń pierwszy mózg z fiolki z 30% sacharozą za pomocą szpatułki. W tym momencie należy zamrozić mózg w całości lub przeprowadzić go w półsekcji, w zależności od projektu badania.
	<ol>
		<li>W przypadku mózgów poddanych półsekcji użyj nowej żyletki, aby wykonać czyste cięcie w tkance w celu oddzielenia półkul. Jeśli nie jest to wymagane w badaniu, usuń móżdżek i opuszki węchowe na tym etapie. Jeśli móżdżek jest potrzebny do badania, sugeruje się wycięcie płaskiego obszaru na tylnym końcu mózgu, aby pomóc mózgowi stać prosto w formie. Jeśli badanie wymaga tylko tkanki z zlokalizowanego regionu, można użyć matrycy mózgu gryzonia do zablokowania mózgu na podstawie znanych współrzędnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Daj mózgom numeryczny system nazewnictwa. Narysuj diagram, jak pokazano na Rysunek 1. Napisz numer pierwszego mózgu, który zostanie umieszczony w formie Megabrain w pozycji 2, pozostawiając pozycję 1 jako puste miejsce, aby pomóc w szybkiej identyfikacji orientacji, w której mózgi zostały zamrożone.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy lub pęsety podnieś mózg, który ma zostać umieszczony w pozycji 1. Ustaw mózg tak, aby strona, która ma być przecięta, była skierowana do góry. Opuść mózg do OCT w odpowiednim miejscu, używając pęsety, aby dostosować jego położenie, aż stanie niezależnie.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.3–2.5 dla pozostałych mózgów/półkul, które mają zostać zamrożone w pozycjach 3–10. Unikaj umieszczania mózgów/półkul w układzie symetrycznym.</li>
	<li>Przejrzyj wszystkie 9 mózgów w formie Megabrain. Gdy mózgi staną niezależnie, pionowo i są prawidłowo zorientowane w OCT (jak pokazano na <silna klasa = "xfig">Rysunek 2B), dodaj więcej OCT do formy (aż górna część mózgów zostanie pokryta). Ponownie upewnij się, że w KTZ nie ma widocznych pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Użyj kleszczyków, aby przytrzymać róg formy, upewniając się, że kleszcze nie zostaną częściowo zanurzone w OCT (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A). Uważając, aby forma była wypoziomowana, opuść formę do izopentanu (-45 °C do -50 °C) tak, aby dolna jedna trzecia formy była zanurzona. Przytrzymaj go tutaj, aby wszelkie pęcherzyki w OCT mogły unieść się na powierzchnię i odsunąć od tkanki (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B).</li>
	<li>Po 30 s opuść całą formę do izopentanu i uwolnij z kleszczy, pozostawiając Megabrain zanurzony na co najmniej 3 minuty (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C). Upewnij się, że pleśń jest utrzymywana na poziomie, aby mózgi pozostały wyprostowane i w równej odległości (<silna klasa="xfig">Rysunek 3D).</li>
	<li>Po 3 minutach za pomocą kleszczy usuń z izopentanu pleśń zawierającą zamrożone, osadzone w OCT mózgi (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3E).</li>
	<li>Natychmiast zawiń foremkę i jej zawartość w folię aluminiową i oznacz ją numerami zwierząt lub identyfikacją Megabrain. Dotykaj zamrożonego Megabrain tak oszczędnie, jak to możliwe, aby uniknąć rozmrożenia tkanki.</li>
	<li>Ten Megabrain można teraz przenieść do zamrażarki o temperaturze -20 °C i przechowywać przez co najmniej 24 godziny 
	UWAGA: W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany, a Megabrain może być przechowywany w stanie zamrożonym do czasu kriosekcji.</li>
</ol>
3. Przygotowanie megamózgu do sekcji na kriostacie
<ol>
	<li>Ustaw temperaturę w komorze kriostatu na -19 °C. Upewnij się, że ta temperatura została osiągnięta, zanim przejdziesz dalej. Podczas sekcji należy upewnić się, że temperatura w szafie utrzymuje się w zakresie od -18 °C do -20 °C.</li>
	<li>Wyjmij Megabrain z zamrażarki w temperaturze -20 °C i umieść go w kriostacie. Umieść również uchwyt o odpowiednich wymiarach i dwa pędzle z cienką końcówką w kriostacie. Pozostaw zarówno Megabrain, jak i uchwyt w kriostacie na co najmniej 15 minut, aby osiągnąć temperaturę kriostatu.</li>
	<li>Odpowiednio oznacz slajdy numerem identyfikacyjnym Megabrain i numerem slajdu. Połóż te szkiełka na podgrzewaczu do szkiełek (35–45 °C).</li>
	<li>Rozpakuj Megabrain z folii aluminiowej. Użyj żyletki, aby pionowo przyciąć rogi formy, aby umożliwić łatwe wyjęcie bloku OCT z formy (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A).</li>
	<li>Naniec cienką warstwę (o grubości około 3 mm) OCT na uchwyt.</li>
	<li>Szybko, przy minimalnym kontakcie między palcami a OCT, umieść Megabrain na uchwycie w pożądanej orientacji. Na tym etapie można również użyć dużych kleszczy, aby zminimalizować rozmrażanie. Przed rozpoczęciem cięcia pozostaw uchwyt mocowany Megabrain w kriostacie na 15–20 minut, aby OCT całkowicie zamarzło.</li>
	<li>Gdy warstwa podstawowa OCT zamarznie, nałóż warstwę OCT o grubości 2 mm wokół boków Megabrain i pozwól, aby spływała z boków na uchwyt. Pomaga to przymocować Megabrain do uchwytu. Ponownie, zanim przejdziesz dalej, pozostaw uchwyt zamontowany na Megabrain w kriostacie na 15-20 minut, aby OCT mógł zamarznąć.</li>
	<li>Użyj żyletki, aby usunąć nadmiar OCT z boków lub spodu uchwytu (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B).</li>
</ol>
4. Kriosekcja megamózgu
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem upewnij się, że dostępna jest zlewka zawierająca co najmniej 20 ml 1x PBS.</li>
	<li>Umieść uchwyt, zamontowany za pomocą Megabrain, w głowicy uchwytu na kriostacie (Rysunek 4B).</li>
	<li>Ustaw kriostat tak, aby cięł na żądaną grubość. Obecna metodologia została zoptymalizowana dla przekrojów od 10 μm do 50 μm.</li>
	<li>Przytnij OCT i tkankę w razie potrzeby, aby dotrzeć do pożądanego obszaru mózgu do pobrania tkanki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4C).</li>
	<li>Gdy będziesz gotowy do pobrania tkanki, opuść płytkę zabezpieczającą, aż oprze się na stoliku i obróć uchwyt kriostatu, aby pobrać pojedynczą sekcję. Powoli zdejmij płytkę stabilizacyjną, uważając, aby podzielony na sekcje Megabrain nie był przymocowany do płyty stabilizacyjnej i nie spadł ze sceny <silna klasa = "xfig" >Rysunek 4D).</li>
	<li>Delikatnie użyj pędzli, aby rozwinąć sekcję Megabrain, aż będzie leżeć płasko na stole kriostatycznym (<silna klasa="xfig">Rysunek 5A). (W razie potrzeby trzymaj OCT płasko za pomocą pędzli, aby zapobiec toczeniu się).</li>
	<li>Wyjmij slajd z podgrzewacza slajdów i najedź na slajd etykietą do dołu nad sekcją Megabrain na scenie, pozwalając sekcji przykleić się do slajdu.</li>
	<li>Szybko nałóż kroplę 1x PBS na każdy fragment tkanki na szkiełku i nie pozwól im wyschnąć, dopóki nie zostaną wyszczotkowane na płasko (patrz krok 4.9).</li>
	<li>Użyj pędzla z cienką końcówką zanurzonego w 1x PBS, aby wyszczotkować wszelkie pęcherzyki w tkance i rozłóż chusteczkę tak, aby leżała płasko na szkiełku (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 5B). Należy uważać, aby nie zmienić położenia sekcji mózgu, a tym samym nie stracić względnej pozycji w stosunku do innych sekcji tkanki. Manipuluj tkanką ostrożnie, aby uniknąć rozdarć. Skrawki mózgu należy trzymać z dala od krawędzi szkiełka, ponieważ w niektórych protokołach barwienia wymagana jest przestrzeń obwodowa do nałożenia szkiełka nakrywkowego i długopisu PAP.</li>
	<li>Umieść szkiełko z powrotem na podgrzewaczu do szkiełek i susz przez 45 minut. Przykryj w razie potrzeby, aby zapobiec osadzaniu się kurzu na chusteczce. Po wyschnięciu szkiełka należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.</li>
</ol>

<ol><li>Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+markers+for+quantitative+studies+of+neurons+and+glia+in+human+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).</li>
<li>Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+in+immunohistochemistry.+A+research+method+or+a+diagnostic+tool+in+surgical+pathology%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Pathologica%22%5BJournal%5D)">Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology?</a> Pathologica. 87 (3), 300-309 (1995).</li>
<li>Walker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods%2C+utility+and+semiquantitative+assessment+I%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I.</a> Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).</li>
<li>Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+for+immunohistochemistry+on+cryosectioned+rat+brain+tissue%3A+example+staining+for+microglia+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).</li>
<li>Harrison, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolvins+AT-D1+and+E1+differentially+impact+functional+outcome%2C+post-traumatic+sleep%2C+and+microglial+activation+following+diffuse+brain+injury+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li>
<li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+bioscience+research+reporting%3A+the+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> PLoS Biology. 8 (6), e1000412(2010).</li>
<li>Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+removing+the+brain+and+spinal+cord+as+one+unit+from+adult+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats.</a> Lab Animal (NY). 40 (2), 53-57 (2011).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protocols. 2008, pdb prot4986 (2008).</li>
<li>Ji, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Impact+of+Repeated+Freeze-Thaw+Cycles+on+the+Quality+of+Biomolecules+in+Four+Different+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreservation+and+Biobanking%22%5BJournal%5D)">The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues.</a> Biopreservation and Biobanking. 15 (5), 475-483 (2017).</li>
<li>Pegg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+and+principles+of+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Reproductive+Medicine%22%5BJournal%5D)">The history and principles of cryopreservation.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 20 (1), 5-13 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Podczas tej procedury należy wziąć pod uwagę, że temperatura Megabrain i jego otoczenia musi być stale monitorowana, aby zapobiec rozmrożeniu i ponownemu zamrożeniu tkanki. Mózg można wyjąć z zamrażarki o temperaturze -20 °C tylko do 3 razy, ponieważ za każdym razem, gdy jest dotykany i pozostawiany w kriostacie, przy cieplejszej zmiennej temperaturze, tkanka rozmraża się i ponownie zamarza, powodując galaretowatą teksturę i nieprawidłową integralność tkanek10. Dlatego optymalne jest wycięcie Mega...

Tutaj prezentujemy protokół dla nowatorskiej metody, którą nazywamy Megabrain, opracowanej do kriosekcji wielu mózgów gryzoni jednocześnie do dalszych procedur immunohistochemicznych. Megabrain pozwala na produkcję pojedynczych szkiełek zawierających tkanki pochodzące od wielu zwierząt. Technika ta została zoptymalizowana do jednoczesnego wycinania odcinków koronalnych z 9 półkul dorosłego szczura lub 5 pełnych mózgów dorosłych. Dlatego technika ta ma największe zastosowanie w dużych badaniach immunohistochemicznych lub innych analizach wykonywanych na szkiełkowej tkance mózgowej z dużej kohorty zwierząt.
Immunohistochemia polega na użyciu specyficznych przeciwciał skierowanych przeciwko białkom będącym przedmiotem zainteresowania, aby zrozumieć i scharakteryzować ich ekspresję oraz zmiany komórkowe w określonej tkance1,2,3. Zastosowanie immunohistochemii jest powszechne w badaniach neurologicznych, wśród innych dyscyplin naukowych, pomagając w komórkowym i molekularnym zrozumieniu mózgu4. Badania na dużą skalę z udziałem wielu zwierząt i sekcji mózgu mogą być zarówno zasobochłonne, jak i czasochłonne. W związku z tym istnieje wieloaspektowe uzasadnienie stojące za opracowaniem Megabrain: skrócenie czasu spędzonego na kriosekcji, montowaniu i barwieniu tkanek, przy jednoczesnym zużyciu mniejszej ilości odczynników. Co więcej, możliwość usprawnienia procesu i barwienia wielu mózgów w tej samej rundzie pomaga złagodzić część zmienności między partiami barwienia, co jest ograniczeniem immunohistochemii3. Ponadto sekcjonowanie Megabrain jest oszczędzającą czas alternatywą dla sekcji pojedynczych zamrożonych mózgów gryzoni i pozwala na szybkie porównanie tkanek między zwierzętami, a nawet grupami leczonymi za pomocą technik mikroskopowych.

<table><tbody><tr><td>Związek CRIO OCT Andwin scientific tissue-tek (przypadek 12)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-65</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Jednorazowe formy do zatapiania</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-41</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Precyzyjna prosta, szeroka, mocna pęseta / kleszcze</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-128</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 20 ml HDPE Fiolki scyntylacyjne z Nakrętka polipropylenowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-23</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza, butelka foliowa 2,5 kg</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2-212</td> Należy <td>uzupełnić zarówno stężenie 15%, jak i 30% sacharozy.</td></tr><tr><td>2-metylobutan (certyfikowany), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3551-4</td><td></td></tr><tr><td>Zlewki wysokie PYREX</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-546E</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Uniwersalne termometry do cieczy w szkle z częściowym zanurzeniem (-50 do +50 &deg; C)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-201-642</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Szpatułka Scoopula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>STANLEY Żyletka</td><td>Grainger</td><td>4A807</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza do mikrotomu Edge-Rite</td> Szkiełka mikroskopowe <td>Fisher Scientific</td><td>14-070-60</td><td></td></tr><tr><td>(1" frost) - białe</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-034-979</td><td></td></tr><tr><td>Gibco&nbsp; PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) 10x, pH 7,2</td><td>Fisher Scientific</td><td>70-013-032</td><td>Rozcieńczyć do 1X&nbsp; przed użyciem</td></tr><tr><td>15-częściowe drobne pędzle malarskie</td><td>Amazon</td><td>B079J12ZRV</td><td></td></tr><tr><td>Długopis PAP</td><td>abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt wiertarski pokazany na rysunku 4 został wykonany na zamówienie przez technika laboratoryjnego, jednak podobne rozmiary są dostępne do zamówienia w innych firmach na rynku.</td><td>Mikroskopia elektronowa</td><td>EMS065</td><td></td></tr></tbody></table>

jednoczesna kriosekcja wielu mózgów gryzoni

Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains

Histologia i immunohistochemia to rutynowe metody analizy do wizualizacji mikroskopijnej anatomii i lokalizacji białek w tkance biologicznej. W neurobiologii, a także w wielu innych dziedzinach naukowych, techniki te są stosowane. Immunohistochemię można przeprowadzić na tkance montowanej na szkiełku lub na odcinkach swobodnie pływających. Przygotowanie próbek montowanych na szkiełku jest procesem czasochłonnym. Następujący protokół techniki, zwanej Megabrain, skrócił czas potrzebny na kriosekcję i zamontowanie tkanki mózgowej nawet o 90% poprzez połączenie wielu mózgów w jeden zamrożony blok. Co więcej, technika ta zmniejszyła zmienność obserwowaną między rundami barwienia w dużym badaniu histochemicznym. Obecna technika została zoptymalizowana pod kątem wykorzystania tkanki mózgowej gryzoni w dalszych analizach immunohistochemicznych; Można go jednak zastosować w różnych dziedzinach naukowych, w których stosuje się kriosekcję.

Pozytywnym rezultatem tej procedury jest tkanka przylegająca płasko do szkiełka, bez pęcherzyków powietrza i rozdarć, w orientacji, w której została zamrożona. Przekroje tkankowe są rozmieszczone w równych odstępach i łatwo identyfikowalne dzięki poprawnemu umieszczeniu mózgu w OCT oraz dokładnemu opisaniu, jak pokazano na Rysunku 1. Zakładając, że tkanka mózgową pobrano od zwierząt w podobnym wieku i że tkanka została prawidłowo wyrównana w OCT, przekroje ze...

Tutaj prezentujemy protokół zamrażania i cięcia tkanki mózgowej od wielu zwierząt jako oszczędzającą czas alternatywę dla przetwarzania pojedynczych mózgów. Zmniejsza to zmienność barwienia podczas immunohistochemii i skraca czas kriosekcji i obrazowania.

Jednoczesna kriosekcja wielu mózgów gryzoni

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In ...

Ta oszczędzająca czas metoda zmniejsza zmienność między rundami procedur immunohistochemicznych w badaniach neurobiologicznych, aby zoptymalizować wizualizację anatomii oraz lokalnych białek i tkanek. Główną zaletą tej techniki jest to, że skraca ona czas potrzebny na kriosekcję i montaż tkanki mózgowej poprzez połączenie wielu mózgów w jeden zamrożony blok. Chociaż technika ta jest zoptymalizowana pod kątem przekrojów koronalnych mózgów gryzoni, można ją dostosować do przekrojów strzałkowych lub poprzecznych lub różnych typów tkanek, takich jak mięśnie lub wątroba.Po udanej perfuzji przezsercowej, po utrwaleniu mózgów zwierząt w 25-mililitrowej fiolce 4% paraformaldehydu w PBS przez 24 godziny. Następnie użyj kleszczy z końcówkami, aby usunąć mózg z paraformaldehydu. Przenieś mózgi do fiolki z około 20 mililitrami 30% roztworu sacharozy w TBS.Trzymaj mózg i roztwór, aż opadną na dno fiolki. Następnie umieść szklaną zlewkę o pojemności 500 mililitrów na warstwie suchego lodu w wiaderku z lodem. Następnie wlej 300 do 400 mililitrów izopentanu do zlewki.Utrzymuj izopentan między minus 45 a minus 50 stopni Celsjusza. Na blacie stołu napełnij jednorazową formę do zatapiania mniej więcej do połowy środkiem o optymalnej temperaturze cięcia lub środkiem OCT. Użyj igły, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza z formy.Użyj kleszczy z końcówką, aby usunąć pierwszy mózg z roztworu sacharozy. Następnie użyj nowej żyletki, aby usunąć móżdżek i opuszki węchowe przed oddzieleniem półkul. Następnie daj mózgom numeryczny system nazewnictwa.Użyj kleszczy, podnieś mózg, który ma być umieszczony w pozycji drugiej, i ustaw go tak, aby strona do cięcia była skierowana do góry. Opuść mózg do OCT i użyj pęsety, aby dostosować jego pozycję, aż stanie niezależnie. Kluczową modyfikacją tej techniki jest puste miejsce w pozycji pierwszej.Przestrzeń ta jest wyznaczona tak, aby umożliwić łatwą identyfikację orientacji megamózgu, a tym samym identyfikację zwierzęcia związanego z każdym mózgiem. Po umieszczeniu wszystkich mózgów w formie, dodaj wystarczającą ilość OCT, aby pokryć wierzchołki mózgów, a następnie użyj igły, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Przytrzymaj róg formy kleszczami, upewniając się, że kleszcze nie zostaną częściowo zanurzone w OCT.Następnie opuść formę do izopentanu tak, aby dolna jedna trzecia formy była zanurzona. Po 30 sekundach opuść całą formę do izopentanu i uwolnij ją z kleszczy. Po trzech minutach użyj kleszczyków, aby usunąć pleśń z izopentanu.Natychmiast zawiń formę i jej zawartość w folię aluminiową i odpowiednio ją oznacz. Przenieś megamózg do zamrażarki o temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza na co najmniej 24 godziny. Najpierw ustaw temperaturę komory kriostatu na minus 19 stopni Celsjusza.Wyjmij megamózg z zamrażarki i umieść go w kriostacie. Następnie umieść uchwyt i dwa pędzle z cienką końcówką w kriostacie. Następnie oznacz slajdy numerem identyfikacyjnym megabrain i numerem slajdu i połóż slajdy na podgrzewaczu do slajdów.Następnie rozpakuj megamózg i użyj żyletki, aby przeciąć rogi formy. Nałóż cienką warstwę OCT na uchwyt wiertarski. Następnie szybko umieść megamózg na uchwycie.Po całkowitym zamrożeniu OCT nałóż dwumilimetrową warstwę OCT na boki megamózgu i pozwól mu spłynąć po bokach na uchwyt. Użyj żyletki, aby usunąć nadmiar OCT z boków i spodu uchwytu. Najpierw umieść uchwyt zamontowany z megamózgiem na głowicy uchwytu kriostatu.Następnie ustaw kriostat na żądaną grubość. W razie potrzeby przytnij OCT i tkankę, aby dotrzeć do pożądanego obszaru mózgu w celu pobrania tkanki. Następnie opuść płytkę stabilizacyjną, aż oprze się na stoliku i obróć uchwyt kriostatu, aby wziąć pojedynczą sekcję.Powoli zdejmij płytkę zabezpieczającą, uważając, aby nie dotknąć części tkanki. Delikatnie użyj pędzli, aby rozwinąć część chusteczki, aż będzie leżeć płasko. W razie potrzeby trzymaj OCT płasko za pomocą pędzli, aby zapobiec toczeniu się.Następnie wyjmij szkiełko z podgrzewacza do slajdów i najedź etykietą slajdu stroną do dołu nad sekcją megabrain i pozwól jej przykleić się do szkiełka. Szybko nałóż kroplę PBS na wycinek tkanki. Za pomocą pędzla z cienką końcówką zanurzonego w PBS wyszczotkuj wszelkie pęcherzyki w sekcji tkanki i rozłóż chusteczkę tak, aby leżała płasko na szkiełku.Na koniec umieść szkiełko na podgrzewaczu do wyschnięcia przez 45 minut i przechowuj szkiełko w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. W tym protokole tkanka mózgowa od dziewięciu zwierząt została przygotowana i poddana jednoczesnej kriosekcji. Po kriosekcji można przeprowadzić barwienie H&E w celu oceny jakości krioprotekcji.Reprezentatywne wyniki zjonizowanej cząsteczki adaptera wiążącego wapń lub barwienia Iba1 mikrogleju pokazują spójne barwienie między każdym badanym mózgiem na pojedynczym megamózgu. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o ciągłym monitorowaniu temperatury podczas zamrażania megamózgu, aby zapobiec pękaniu lub rozmrażaniu, a następnie ponownemu zamrożeniu tkanki, co prowadzi do nieprawidłowej integralności tkanki. Nie zaleca się segregacji różnych grup leczonych w oddzielnych megamózgach, ponieważ może to spowodować różnice między grupami podczas barwienia oraz zmniejszyć stronniczość i subiektywność podczas obrazowania i analizy.Nie zapominaj, że praca z paraformaldehydem może być niezwykle niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak noszenie PBE i praca w kapturze, powinny być zawsze podejmowane podczas wykonywania tej procedury.

simultaneous-cryosectioning-of-multiple-rodent-brains

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Profilowanie ekspresji RNA w oddzielnych regionach mózgu myszy wymaga precyzyjnej i powtarzalnej strategii pobierania tkanek. W niniejszym opracowaniu opisano protokół wykorzystujący zarówno sekcjonowanie mózgu w płaszczyźnie czołowej, jak i mikrodysekcję wspomaganą wycinakiem do tkanek. Wydajność i jakość całkowitego RNA uzyskanego z otrzymanych próbek potwierdzają użyteczność przedstawionej metody.

Metoda mikroskopii bez użycia laserowej mikrodysekcji do mikrodysekcji dyskretnych obszarów mózgu myszy w celu izolacji całkowitego RNA oraz późniejszego sekwencjonowania następnej generacji i profilowania ekspresji genów

Opisujemy procedury przygotowania oraz rejestracji elektrofizjologicznej z plastrów mózgu, które zachowują oś grzbietowo-brzuszną przyśrodkowej kory entorynalnej (MEC). Ponieważ neuronalne kodowanie lokalizacji wykazuje organizację grzbietowo-brzuszną w obrębie MEC, procedury te ułatwiają badanie mechanizmów komórkowych istotnych dla nawigacji i pamięci.

Przygotowanie przekrojów parasagitalnych do badania organizacji grzbietowo-brzusznej przyśrodkowej kory entorynalnej gryzoni

Ten film przedstawia szczegółowy protokół krok po kroku dotyczący przygotowania zamrożonych skrawków tkanki mózgowej myszy do dalszych analiz.

Przetwarzanie mózgu myszy do dalszej analizy

Ten protokół opisuje podstawowe kroki proceduralne do wykonywania nagrań z użyciem krosówek dla całej komórki. Technika ta pozwala na badanie zachowania elektrycznego neuronów, a gdy jest wykonywana w wycinkach mózgu, pozwala na ocenę różnych funkcji neuronalnych z neuronów, które są nadal zintegrowane w stosunkowo dobrze zachowanych obwodach mózgowych.

Nagrania z użyciem zacisku krosowego całych komórek w wycinkach mózgu

Kolejne kriosekcje są zbierane, aby umożliwić zastosowania histologiczne i wzbogacenie RNA do pomiarów ekspresji genów przy użyciu sąsiednich regionów z pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy. Wysokiej jakości RNA uzyskuje się z 20 - 30 mg zbiorczych kriosekcji, a pomiary są bezpośrednio porównywane między aplikacjami.

Kriosekcja sąsiadujących ze sobą obszarów pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy w celu ekspresji genów i analiz histologicznych

Tutaj oferujemy tanią i niezawodną metodę generowania elektroporowanych organicznych kultur warstwowych mózgu z mysich zarodków, odpowiednich do mikroskopii konfokalnej i technik obrazowania na żywo.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowe kultury warstwowe embrionalnych mózgów myszy do obrazowania na żywo migrujących interneuronów GABA-ergicznych

Ta procedura opisuje zbieranie dyskretnie zamrożonych obszarów mózgu w celu uzyskania wysokiej jakości białka i RNA przy użyciu tanich i powszechnie dostępnych narzędzi.

Gromadzenie zamrożonych obszarów mózgu gryzoni do dalszych analiz

Przedstawiamy praktyczny, krok po kroku, szybki protokół usuwania mózgu myszy i preparowania dyskretnych obszarów z świeżej tkanki mózgowej. Pozyskiwanie regionów mózgu do analizy molekularnej stało się rutyną w wielu laboratoriach neurobiologicznych. Te obszary mózgu są natychmiast zamrażane w celu uzyskania wysokiej jakości danych transkryptomicznych do analizy na poziomie systemu.

Mikrodysekcja mózgu myszy na funkcjonalnie i anatomicznie różne regiony

Obecny protokół opisuje standaryzowaną resekcję guzów mózgu u gryzoni za pomocą minimalnie inwazyjnego podejścia ze zintegrowanym systemem konserwacji tkanek. Technika ta ma implikacje dla dokładnego odzwierciedlenia standardu opieki w modelach gryzoni i innych zwierząt.

Wdrożenie minimalnie inwazyjnej resekcji guza mózgu u gryzoni w celu pobrania tkanek o wysokiej żywotności

Obecny protokół opisuje praktyczną strategię przyspieszenia etapu weryfikacji współrzędnych iniekcji stereotaktycznej przed przeprowadzeniem śledzenia wirusa za pomocą barwników i zamrożonych skrawków.

Wstępna walidacja współrzędnych iniekcji stereotaktycznej za pomocą kriosekcji

Współczesne neurobiologie muszą badać różnice między wieloma gatunkami, w tym gryzoniami laboratoryjnymi i ludźmi. Jednak trudności techniczne pojawiają się, gdy w grę wchodzą ssaki o dużym mózgu. Podejście to dotyczy zmienności międzygatunkowej populacji neuronalnych u bardzo różnych ssaków, co pozwala na porównywalne wyniki do mapowania w celu ujawnienia wzorców ewolucyjnych.

Podejście porównawcze do ilościowych badań liczenia komórek w bardzo różnych mózgach ssaków

Poznaj metodę jednoczesnej kriosekcji wielu mózgów gryzoni, która zmniejsza zmienność w immunohistochemii i przyspiesza przygotowanie tkanek. Technika ta optymalizuje wizualizację struktur anatomicznych i białek w badaniach neurobiologicznych.

Jednoczesna kriosekcja wielu mózgów gryzoni

Przeglądaj więcej filmów