Przezczaszkowa stymulacja prądem stałym (tDCS) u myszy

Procedura Alvara Gaauda polega na zastosowaniu przezczaszkowej stymulacji prądem stałym u myszy. Osiągnięto to poprzez generowanie prądów o niskim natężeniu z generatora prądu stałego i przesyłanie ich bezpośrednio do zwierzęcia przez elektrody. tDCS został przebadany jako niefarmakologiczna alternatywa terapeutyczna dla głównych zaburzeń psychicznych u ludzi, takich jak depresja, schizofrenia, choroba Alzheimera, AHDH i autyzm.

Co więcej, tDCS jest unikalną techniką ze względu na niski koszt, łatwość użycia i nieinwazyjny profil. Jednak biologiczne skutki tDCS nie są w pełni zrozumiałe i nie ma zgody co do parametrów stymulacji, takich jak intensywność prądu, czas trwania i kafelki obszarów mózgu. W związku z tym stosowanie minimalnych rzędów jest niezbędne do dokładnego zbadania takich mechanizmów, co doprowadzi do lepszego zrozumienia skuteczności klinicznej tDCS poprzez pozyskiwanie i analizę behawioralnych danych komórkowych i molekularnych.

Obecnie istnieją dwie konfiguracje elektrod dla tDCS, określane jako stymulacja anodowa i katodowa. W stymulacji anodowej prądy są dostarczane bezpośrednio do głowy zwierzęcia, przez ciało zwierzęcia oraz do katody umieszczonej na klatce piersiowej zwierzęcia. Podczas stymulacji katodowej prąd przepływa przez klatkę piersiową zwierzęcia, przemieszcza się do jego głowy i do katody.

W obu sytuacjach generator prądu kontroluje natężenie prądu i czas trwania stymulacji. Jednocześnie zapewniając jakość kontaktu i wnioskując o informacjach zwrotnych. Istnieje wiele różnych konfiguracji aktywnego pozycjonowania.

W związku z tym należy wziąć pod uwagę wszystkie osie trójwymiarowe. W tym protokole elektroda na głowę została wszczepiona na jeden milimetr w ukorzenioną bregmę, na boczną do środkowej linii czaszki, a elektroda ciała została umieszczona na klatce piersiowej zwierzęcia. Ze względu na symulację krótkiego okresu zalecono stosowanie szybkiego działania i krótkotrwałego znieczulenia, takiego jak odparowany izofluran.

Procedura ta składa się z dwóch kluczowych etapów. Umieszczenie elektrod i przezczaszkowa stymulacja prądem stałym. Narzędzia chirurgiczne sterylizowano przed konserwacją w temperaturze 440 stopni Celsjusza.

Waciki bawełniane sterylizowano w autoklawie w temperaturze 20 funtów na cal kwadratowy w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 20 minut. Ustaw regulator platformy termicznej na 37 stopni Celsjusza. Zważyć zwierzę i obliczyć odpowiednią dawkę do indukcji znieczulenia.

Użyj mieszaniny ketaminy i ksylazyny w dawce 100 miligramów na kilogram ketaminy i 8 miligramów na kilogram ksylazyny. Rozmiar igły 31G. Zwierzę powinno zasnąć w ciągu 2 do 3 minut.

Użyj golarki elektrycznej lub maszynki do golenia, aby ogolić pole operacyjne. Umieść zwierzę na aparacie stereotaktycznym nad wstępnie podgrzaną płytą grzewczą. Chwyć głowę zwierzęcia i włóż końcówki nauszników do każdego z uszu zwierzęcia, aby przymocować je do platformy sterotaktycznej.

Sprawdź, czy nie ma bocznego przesuwania głowy i niewielkiego ruchu w pionie, powoli przesuwając głowę zwierzęcia. Delikatnie nasuń maskę anestezjologiczną na nos myszy i zamocuj na miejscu, dokręcając. Nałóż maść do oczu zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu rogówki podczas zabiegu.

Za pomocą bawełnianego wacika przygotuj miejsce operacji za pomocą trzech naprzemiennych peelingów jodu powidonu lub 2% chloroheksydyny i 70% etynolu. Użyj pęsety, aby sprawdzić, czy znieczulenie zostało przyjęte, lekko ściskając palce u nóg zwierzęcia i weryfikując prawa ogólnego odruchu wycofania pedoterapii zwierzęcia. Wykonaj nacięcie około trzech milimetrów za linią uszu zwierzęcia i zatrzymaj się na linii oczu.

Miejsce nacięcia musi mieć około jednego centymetra długości, aby było wystarczająco duże, aby można było przyjąć implant. Delikatnie zeskrob czaszkę skrobakiem do kości, aby poprawić przyczepność kleju i cementu. Należy to zrobić lekką ręką z zamiarem stworzenia mikrozadrapań.

Ostrożnie przymocuj haczyki chirurgiczne do luźnej skóry, aby utrzymać otwarte pole operacyjne i uwolnić je od przeszkód, takich jak skóra i sierść. Użyj sterylnego bawełnianego wacika, aby delikatnie osuszyć skórę głowy zwierzęcia. Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby uwidocznić górną część czaszki zwierzęcia.

Przymocuj igłę do uchwytu sterotaksyjnego i zlokalizuj bregmę. Umieść igłę bezpośrednio nad głową zwierzęcia, lekko dotykając bregmy. Użyj bregmy jako odniesienia, aby dostosować współrzędne obszaru zainteresowania.

Zamocuj implant na uchwycie stereotaktycznym. Umieść implant nad głową zwierzęcia i powoli opuść go na obszar zainteresowania. Za pomocą igły rozprowadź jedną kroplę, około 35 mikrolitrów, kleju superglue na przestrzeni implantu.

Powoli przesuwaj uchwyt w dół, aż dotknie czaszki. Upewnij się, że przestrzeń implantu jest całkowicie stykająca się z powierzchnią. Przygotuj cement chirurgiczny zgodnie z instrukcjami producenta.

Po precyzyjnym ustawieniu nałóż trzy cienkie, równe warstwy cementu w poprzek czaszki i na dolną część implantu. Nakładaj kropla po kropli za pomocą pędzla do aplikacji. Warstwy muszą tworzyć strukturę w kształcie litery U, aby zapewnić dalsze wsparcie strukturalne implantu.

Pozostaw gwint implantu czysty z cementu, aby umożliwić gładkie, niezakłócone połączenie. Pozostaw każdą warstwę do wyschnięcia na około cztery minuty. Po wyschnięciu ostrożnie wyjmij uchwyt, aż do całkowitego odłączenia go od implantu.

Zawsze należy zachować szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z implantem, ponieważ może on zostać przypadkowo zniszczony z czaszki zwierzęcia. Nawilżaj skórę zwierzęcia i miejsce nacięcia wacikiem nasączonym solą fizjologiczną. Przeciąć skórę nad podstawą implantu.

Użyj pęsety, aby połączyć tkankę i zamknij nacięcie jedną kroplą kleju chirurgicznego na punkt 2 centymetrów tkanki. Naciekać 1 do 2% lidokainy w miejscu nacięcia i tkankach leżących poniżej. Nawodnij zwierzę jednocześnie 500 mikrolitrami dzwonka mleczanowego.

Umieść mysz w ogrzanej, czystej klatce domowej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zbuduj małe naczynie z mokrymi granulkami karmy w klatce, aby mieć łatwy dostęp do jedzenia w kolejnych godzinach. Zarejestruj wagę zwierzęcia po operacji.

Zwierzęciu należy podawać ketoprofen. 5 miligramów na kilogram jednocześnie po zabiegu i przez następne dwa dni. Upewnij się, że stymulator tDCS jest w pełni naładowany.

Podłącz anody i katody do stymulatora tDCS i udostępnij je w pobliżu miejsca symulacji. Przymocuj elektrodę typu bolcowego do uchwytu sterotaksyjnego. Ustaw platformę termiczną na 37 stopni Celsjusza.

Włącz przepływomierz tlenu w systemie znieczulenia wziewnego na 1 litr na minutę. Umieść mysz w komorze indukcyjnej znieczulenia. Włącz waporyzator izofluranu do 3%Pozwól zwierzęciu doświadczyć działania izofluranu przez cztery minuty.

Gdy zwierzę znajduje się w komorze indukcyjnej, użyj sterylnej strzykawki, aby napełnić elektrodę ciała 0,9% roztworem soli fizjologicznej. Wyjmij zwierzę z komory indukcyjnej i umieść jego klatkę piersiową nad elektrodą ciała. Delikatnie nasuń maskę anestezjologiczną na nos myszy i zamocuj na miejscu.

Obniż wydajność izofluranu do 1,5%Napełnij implant i elektrodę typu szpilkowego solą fizjologiczną. Ostrożnie połącz je ze sobą. Dostosuj czas stymulacji i aktualną intensywność zgodnie ze swoim protokołem.

Sprawdź jakość styku w systemie tDCS później. Rozpocznij stymulację. Obserwuj, jak prąd wzrasta przez 20 sekund do wybranej wartości.

I utrzymując się w niezłomnym miejscu przez ustalony czas. Następnie, na końcu sekcji, ponownie się rozpędza. Aktywuj przycisk goleni, aby sterować.

Obserwuj, jak prąd wzrasta przez 20 sekund do wybranej wartości. A następnie w dół o jeden przez resztę okresu stymulacji, z końcową rampą do wybranej wartości, na końcu, z kolejnym zwężeniem w dół. Po zakończeniu sekcji stymulacji ostrożnie przenieś zwierzę do wstępnie ogrzanej klatki o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 minut.

Protokół ten wykorzystuje tDCS do stymulacji kory mózgowej myszy jeden milimetr przed bregmą. Ten wykres przedstawia statystyczną ekspresję genów po protokole stymulacji tDCS. Używanie natężenia prądu 0,35 miliampera przez 10 minut dziennie.

Implant tCDS okazał się zdolny do życia od pierwszego do piątego dnia, bez znaczącej różnicy między dniami w jakości kontaktu. Istnieje wiele protokołów stymulacji tCDS w modelowych mózgach. Protokoły muszą być wybrane zgodnie ze specyfiką eksperymentu, na którym się opiera.

Obszar stymulacji, natężenie prądu, czas trwania sesji i ustawienie elektrod. W tym konkretnym protokole naszym celem było modulowanie kory ruchowej za pomocą naszego znanego tDCS prądem o natężeniu 350 mikroamperów przez 10 minut. Po obejrzeniu tego filmu będziesz mógł wykonać tDCS u myszy.

Kiedy ktoś ćwiczy operację, może to zająć do czterech minut na zwierzę. Konieczne jest uwzględnienie wytycznych dotyczących opieki nad zwierzętami podczas wykorzystywania myszy podczas operacji i przestrzegania opieki pooperacyjnej nad zwierzętami, aby zwierzęta pozostały zdrowe podczas badania. Zalecamy również odczekanie od pięciu do siedmiu dni po wszczepieniu implantu w celu przeprowadzenia eksperymentów, ponieważ fizjologiczna reakcja zwierzęcia na uraz może zakłócać wyniki biologiczne.