Indukcja i ocena krzyżówek wsobnych z wykorzystaniem mrówki, Vollenhovia emeryi

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii molekularnej i sfery genetycznej błonkoskrzydłych, takie jak systemy determinacji płci. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy łatwo indukować linie wsobne nad mrówką Vollenhovia Emery, które są niezbędne do mapowania genetycznego i statusu molekularnego. Tak więc ta misja może dostarczyć informacji na temat systemu determinacji płci konkretnej mrówki, a także może być zastosowana do innych mrówek i innych gatunków błonkoskrzydłych, takich jak osy.

Aby rozpocząć protokół, zbierz kolonie V.Emeryi wczesnym latem. Przenieś okazy mrówek z zebranych gałęzi do sztucznego gipsowego gniazda ze szklaną pokrywą za pomocą aspiratora. Utrzymuj kolonie w sztucznym gnieździe w temperaturze 25 stopni C, w 16-ośmiogodzinnym cyklu światło-ciemność.

Wodę z kranu należy podawać w butelce do mycia, aby tynk był wilgotny co drugi dzień o tej samej porze. Następnie dodaj około 100 mikrogramów suchego proszku ze świerszcza zawiniętego w folię aluminiową i końcówkę wypełnioną wodą z brązowym cukrem do kolonii, używając końcówki o pojemności 20 mikrolitrów co drugi dzień, aż pojawią się nowe mrówki rozrodcze. Ważne jest, aby zbierać mikrokolonie z pól i zapewnić im wystarczającą ilość pożywienia, aby zdobyć nowe królowe i samce.

Po pierwsze, powstrzymaj osobniki przed poruszaniem się, umieszczając kolonie w pomieszczeniu z kontrolowanym środowiskiem ustawionym na cztery stopnie Celsjusza na 15 minut. Usuń środkowe nogi 30 robotnic za pomocą kleszczy pod stereoskopem, aby odróżnić pokolenie F-zero od robotnic powstałych w kolejnych krzyżówkach wsobnych. Następnie przenieś mrówki do nowego, mniejszego gipsowego gniazda do krzyżówek wsobnych.

Następnie dodaj trzy do czterech larw lub pube do gipsowego gniazda zawierającego robotnice. Przenieś długoskrzydłą królową i samca do wcześniej przygotowanego gipsowego gniazda do krzyżówek wsobnych. Na tym etapie ważne jest, aby utrzymać eksperymentalną kolonię krzyżową w tym samym stanie, w jakim znajduje się normalna kolonia.

Trudno jest wywołać chów wsobny tylko poprzez umieszczenie samców i samic razem. Utrzymuj kolonie w temperaturze 25 stopni Celsjusza w 16-ośmiogodzinnym cyklu światła i ciemności z jedzeniem i wodą, dopóki królowa nie straci skrzydeł i nie złoży jaj. Codziennie sprawdzaj eksperymentalną kolonię pod mikroskopem stereoskopowym.

Po ustawieniu krzyżówek wsobnych między potomstwem F-one, jaja można obserwować pod stereoskopem. Po tym, jak królowa F-one zacznie składać jaja, usuń samce F-one i larwy lub krążek z gniazda, aby zapobiec mieszaniu się pokolenia F-one i pokolenia F-dwa. Utrzymuj kolonie w tych samych warunkach, aż pojawi się potomstwo F-dwa.

Usuń jedną nogę królowej F-zero za pomocą kleszczy. Przenieś nogę do mikroprobówki o pojemności 1,5 mililitra zawierającej 100 mikrolitrów środka chłodzącego. Pod stereoskopem wypreparuj kobiecy brzuch w szklanym naczyniu wypełnionym 300 mikrolitrami ultra czystej wody za pomocą kleszczy.

Zdysymilizuj spermatykę zawierającą plemniki z pokrytych samców. Oderwij tkankę spermatica i odizoluj plemniki od tkanki samicy za pomocą szpilek do owadów. Za pomocą mikro podkładki do ciasta przenieś plemniki do 1,5 mililitrowej mikroprobówki zawierającej 100 mikrolitrów środka chłodzącego.

Inkubować próbki z królowej F-zero i plemników w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 20 minut. Flash centro połączyć mikrorurkę i przechowywać próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po potwierdzeniu produkcji jaj przez matkę F-one pokrytą siv, należy wyekstrahować DNA królowej za pomocą zrzuconych skrzydeł lub jednej środkowej nogi i genotypu.

Następnie wyekstrahuj DNA samca F-one poprzez genotypowanie jednej nogi. Aby ocenić płodność samców mrówek z krzyżówek wsobnych, należy wypreparować wewnętrzne narządy rozrodcze w szklanym naczyniu z 400 mikrolitrami roztworu PBS za pomocą kleszczy. Następnie usuń PBS i zastąp go czteroprocentowym paraformaldihydem za pomocą mikro podkładki do ciasta.

Utrwalić tkankę, inkubując próbki w PFA przez czterdzieści minut w temperaturze pokojowej. Po utrwaleniu umyj chusteczki pięć razy 400 mikrolitrami PBS za pomocą mikro podkładki do ciasta. Rozcieńczyć roztwór DAPI do jednego miligrama na mililitr w PBS.

Usunąć PBS i dodać około 300 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu barwiącego DAPI do tkanki. Inkubować tkankę przez 15 minut w ciemnych warunkach w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przemyj tkankę pięciokrotnie 400 mikrolitrami PBS i przenieś tkankę do środka szkiełka za pomocą kleszczy.

Następnie zamontuj tkankę na podłożu montażowym zawierającym TRITC tetrametylorodaminę. Na koniec obserwuj próbki za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego przy użyciu 20 lub 60 soczewek obiektywowych 3x. Obrazy mikroskopowe jąder haploidalnego samca v Emeryi pokazują zdrową tkankę włóknistą lub plemniki, które są nieobecne u diploidalnego samca v Emeryi, które nie wykazały zdrowej tkanki włóknistej.

Męskie narządy rozrodcze diploidalnego samca v Emeryi nie wytwarzały plemników, a ich jądra nie rozwijały się, co sugeruje, że samce powstałe w krzyżówkach wsobnych są bezpłodne. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała nam drogę do zbadania miatonii płciowej w stałym w Vollenhovia Emeryi dla gatunków mrówek o szybkim czasie.