Name: Indukcja i ocena krzyżówek wsobnych z wykorzystaniem mrówki, Vollenhovia emeryi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: Poznaj metodę indukcji krzyżówek wsobnych u mrówki Vollenhovia emeryi w celu badania genetyki i determinacji płci. Protokół umożliwia analizę molekularną oraz ocenę płodności samców diploidalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Panu Taku Shimadzie, delegatowi AntRoom, Tokio, Japonia, za dostarczenie nam swojego zdjęcia V. emeryi reproductions. Projekt ten został sfinansowany przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS) Research Fellowship for Young Scientists (16J00011) oraz Grant in Aid for Young Scientists (B)(16K18626).

1. Terenowe zbieranie i utrzymywanie kolonii V. emeryi w laboratorium
UWAGA: Gniazda V. emeryi znajdują się w gnijących kłodach i powalonych, rozkładających się gałęziach drzew w lasach wtórnych w całej Japonii. Gatunek ten wykazuje dwa typy kolonii, tj. (1) kolonie produkujące tylko długoskrzydłe królowe i (2) kolonie produkujące głównie krótkoskrzydłe królowe oprócz niewielkiej liczby długoskrzydłych królowych8,14. W tym protokole zebraliśmy ten drugi typ kolonii w prefekturze Ishikawa w Japonii.
<ol>
	<li>Zbieraj kolonie V. emeryi wczesnym latem. 
	UWAGA: Aby uzyskać wystarczającą liczbę osobników płciowych w sezonie rozrodczym, preferowane są kolonie zawierające więcej niż 300 osobników.</li>
	<li>Przenieś okazy mrówek z zebranych gałęzi do sztucznego gipsowego gniazda ze szklaną pokrywą za pomocą aspiratora (<silna klasa="xfig">Rysunek 2, po lewej).</li>
	<li>Utrzymuj kolonie w sztucznym gnieździe w temperaturze 25 °C w cyklu 16:8 godzin światło/ciemność. Zapewnij wodę z kranu z butelką do mycia, aby zwilżyć tynk.
	<ol>
		<li>Dodawaj około 100 mg suchego proszku ze świerszczy zawiniętego w folię aluminiową i końcówkę wypełnioną wodą z brązowego cukru (końcówka 20 μl) co drugi dzień, aż pojawią się nowe zwierzęta rozrodcze (skrzydlate królowe F1 i samce F1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Eksperymentalne Krzyże Laboratoryjne
UWAGA: Nowe czynniki rozrodcze zaczynają się pojawiać od późnego lata do jesieni (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). Długoskrzydłe królowe są produkowane płciowo, a krótkoskrzydłe królowe są produkowane klonalnie i mają genom matczyny (<silna klasa="xfig">Ryc. 1). Używaj długoskrzydłych królowych i samców do krzyżówek wsobnych.
<ol>
	<li>Aby powstrzymać osobniki przed poruszaniem się, należy umieścić kolonie w pomieszczeniu o stałej temperaturze 4 °C na 15 minut.</li>
	<li>Usuń środkowe nogi 30 robotnic za pomocą kleszczy pod mikroskopem stereoskopowym i przenieś je do nowego mniejszego gipsowego gniazda (<silna klasa="xfig">Rysunek 2, po prawej) dla krzyżówek wsobnych. 
	UWAGA: Nogi są usuwane, aby odróżnić obecne robotnice od robotnic, które zostaną wyprodukowane przez kolejne krzyżówki wsobne.</li>
	<li>Dodaj 3-4 larwy lub poczwarki do gipsowego gniazda zawierającego robotnice. 
	UWAGA: Robotnice wykazują aktywność eksploracyjną w kolonii bez matek F0. Larwy lub poczwarki mogą skutecznie przyciągać te robotnice i nowe zwierzęta rozrodcze w środku kolonii podczas testu krzyżowego. W rezultacie utrzymuj warunki kolonii doświadczalnej zbliżone do normalnej kolonii.</li>
	<li>Przenieś długoskrzydłą królową i samca do gipsowego gniazda przygotowanego w kroku 2.3 do krzyżówek wsobnych.</li>
	<li>Utrzymywać kolonie w temperaturze 25 °C w cyklu 16:8 godzin światło/ciemność, z pokarmem i wodą dostarczanymi zgodnie z opisem w ppkt 1.3, aż królowa straci skrzydła i złoży jaja. 
	UWAGA: Trwa to od tygodnia do miesiąca.</li>
	<li>Codziennie sprawdzaj eksperymentalną kolonię pod mikroskopem stereoskopowym. Po wykonaniu krzyżówek wsobnych między potomstwem F1 jaja można obserwować pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
	<li>Po tym, jak królowa F1 zacznie składać jaja, należy usunąć z gniazda samce F1 oraz larwy lub poczwarki dodane w kroku 2.3, aby uniknąć mieszania się pokolenia F1 (samce i samice wykorzystywane do krzyżówek wsobnych) i pokolenia F2 (potomstwo powstałe z krzyżówek wsobnych). 
	UWAGA: Jeśli w rodzinie jest kilka samców, możliwe jest wywołanie krzyżówek wsobnych przy użyciu jednego samca i 1 do 3 królowych w tej samej kolonii doświadczalnej.</li>
	<li>Utrzymuj kolonie w tych samych warunkach, jak opisano w 1.3, aż pojawi się potomstwo F2. 
	UWAGA: Przenieś królową F1 i potomstwo F2 do nowego, większego gipsowego gniazda (<silna klasa="xfig">Rysunek 2, po lewej) w celu długoterminowego utrzymania kolonii.</li>
</ol>
3. Ocena sukcesu chowu wsobnego
<ol>
	<li>Ekstrakcja DNA i genotypowanie pokolenia rodzicielskiego (F0)
	<ol>
		<li>Usunąć jedną nogę królowej F0 za pomocą kleszczy i przenieść nogę do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 100 μl środka chelatującego.</li>
		<li>Pod mikroskopem stereoskopowym wypreparuj brzuch samicy w szklanym naczyniu wypełnionym 300 μl ultraczystej wody za pomocą kleszczy i wyizoluj spermatekę zawierającą plemniki od pokrytych samców.</li>
		<li>Oderwij tkankę spermateki i odizoluj plemniki od tkanki samicy za pomocą szpilek do owadów. 
		UWAGA: Aby ułatwić ekstrakcję plemników z spermateki, przechowuj próbki żeńskie w 100% EtOH przez więcej niż jeden dzień przed sekcją.</li>
		<li>Za pomocą mikropipety przenieś plemniki do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 100 μl środka chelatującego.</li>
		<li>Inkubować próbki matki F0 i plemników przygotowanych odpowiednio w kroku 3.1.1 i 3.1.3 w temperaturze 95 °C przez 20 minut. Odwirować błyskawicznie mikroprobówkę i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Genotyp wszystkich próbek przy użyciu metody opisanej gdzie indziej4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja DNA od pary mrówek wykorzystywanych do krzyżówek wsobnych (F1)
	<ol>
		<li>Po potwierdzeniu, że królowa F1 wyprodukowała jaja, należy pobrać DNA królowej za pomocą jej zrzuconych skrzydeł lub jednego środkowego odcinka nogi i genotypu, stosując tę samą metodę opisaną w sekcji 3.1 powyżej.</li>
		<li>Pobrać DNA samca F1 za pomocą jednej nogi i genotypować je tą samą metodą, co w sekcji 3.1 powyżej. 
		UWAGA: Próbki mogą być przechowywane w 100% EtOH przed ekstrakcją DNA, a DNA w środku chelatującym można przechowywać przez dwa miesiące w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena płodności samców pochodzących z krzyżówek wsobnych 
	UWAGA: Diploidalne samce powstałe z krzyżówek wsobnych są często bezpłodne.
	<ol>
		<li>Wypreparować wewnętrzne narządy rozrodcze w szklanym naczyniu z 400 μl roztworu PBS za pomocą kleszczy.</li>
		<li>Usuń PBS i dodaj 4% paraformaldehydu (PFA) za pomocą mikropipety.</li>
		<li>Utrwalić tkankę przez inkubację w PFA przez 30 minut w temperaturze pokojowej (15 - 25 °C).</li>
		<li>Umyj chusteczkę 5 razy 400 μl PBS za pomocą mikropipety.</li>
		<li>Rozcieńczyć roztwór 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) do 1 μg/ml w PBS.</li>
		<li>Usunąć PBS i dodać około 300 μl tego rozcieńczonego roztworu barwiącego DAPI do tkanki.</li>
		<li>Inkubować przez 15 minut w ciemnych warunkach, w temperaturze pokojowej (15 - 25 °C).</li>
		<li>Umyj tkankę 5 razy 400 μl PBS i przenieś tkankę na środek szkła szkiełkowego za pomocą kleszczy.</li>
		<li>Zamontuj tkankę na podłożu montażowym zawierającym falloidynę sprzężoną z tetrametylodaminą (TRITC).</li>
		<li>Obserwuj próbki za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego przy użyciu soczewek obiektywowych 20X lub 63X.</li>
		<li>Do wykrywania DAPI należy użyć lasera wzbudzającego o długości fali 405 nm i detektora hybrydowego o długości fali 410-530 nm.</li>
		<li>Do wykrywania TRITC należy użyć lasera wzbudzającego o długości fali 561 nm i detektora hybrydowego o długości fali 565-650 nm.</li>
		<li>Użyj prędkości skanowania 400 Hz (400 linii/s) przy rozdzielczości 1024 × 1024 pikseli.</li>
		<li>Rób zdjęcia za pomocą platformy programowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Mable, B. K., Otto, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+life+cycles+with+haploid+and+diploid+phases%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">The evolution of life cycles with haploid and diploid phases.</a> BioEssays. 20 (6), 453-462 (1998).</li>
<li>Beye, M., Hasselmann, M., Fondrk, M. K., Page, R. E., Omholt, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gene+csd+is+the+primary+signal+for+sexual+development+in+the+honeybee+and+encodes+an+SR-type+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The gene csd is the primary signal for sexual development in the honeybee and encodes an SR-type protein.</a> Cell. 114 (4), 419-429 (2003).</li>
<li>Hasselmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+evolutionary+nascence+of+a+novel+sex+determination+pathway+in+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evidence for the evolutionary nascence of a novel sex determination pathway in honeybees.</a> Nature. 454 (7203), 519-522 (2008).</li>
<li>Nissen, I., Müller, M., Beye, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22942126">The Am-tra2 gene is an essential regulator of female splice regulation at two levels of the sex determination hierarchy of the honeybee.</a> Genetics. 192 (3), 1015-1026 (2012).</li>
<li>Schmieder, S., Colinet, D., Poirié, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+back+the+nascence+of+a+new+sex-determination+pathway+to+the+ancestor+of+bees+and+ants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tracing back the nascence of a new sex-determination pathway to the ancestor of bees and ants.</a> Nature Communications. 3, 895(2012).</li>
<li>Miyakawa, M. O., Mikheyev, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QTL+Mapping+of+Sex+Determination+Loci+Supports+an+Ancient+Pathway+in+Ants+and+Honey+Bees%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">QTL Mapping of Sex Determination Loci Supports an Ancient Pathway in Ants and Honey Bees.</a> PLoS Genetics. 11 (11), (2015).</li>
<li>Miyakawa, M. O., Tsuchida, K., Miyakawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+doublesex+gene+integrates+multi-locus+complementary+sex+determination+signals+in+the+Japanese+ant%2C+Vollenhovia+emeryi%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The doublesex gene integrates multi-locus complementary sex determination signals in the Japanese ant, Vollenhovia emeryi.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 94, 42-49 (2018).</li>
<li>Ohkawara, K., Nakayama, M., Satoh, A., Trindl, A., Heinze, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+reproduction+and+genetic+caste+differences+in+a+queen-polymorphic+ant%2C+Vollenhovia+emeryi%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+letters%22%5BJournal%5D)">Clonal reproduction and genetic caste differences in a queen-polymorphic ant, Vollenhovia emeryi.</a> Biology letters. 2 (3), 359-363 (2006).</li>
<li>Kobayashi, K., Hasegawa, E., Ohkawara, K. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/j.1479-8298.2008.00272.x">Clonal reproduction by males of the ant Vollenhovia emeryi (Wheeler).</a> Entomological Science. 11 (2), 167-172 (2008).</li>
<li>Okamoto, M., Kobayashi, K., Hasegawa, E., Ohkawara, K. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/280627935_Sexual_and_asexual_reproduction_of_queens_in_a_myrmicine_ant_Vollenhovia_emeryi_Hymenoptera_Formicidae">Sexual and asexual reproduction of queens in a myrmicine ant, Vollenhovia emeryi (Hymenoptera: Formicidae).</a> Myrmecological News. 21, 13-17 (2015).</li>
<li>Schrempf, A., Aron, S., Heinze, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+determination+and+inbreeding+depression+in+an+ant+with+regular+sib-mating%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">Sex determination and inbreeding depression in an ant with regular sib-mating.</a> Heredity. 97 (1), 75-80 (2006).</li>
<li>De Boer, J. G., Ode, P. J., Rendahl, A. K., Vet, L. E. M., Whitfield, J. B., Heimpel, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+support+for+Multiple-locus+complementary+sex+determination+in+the+parasitoid+Cotesia+vestalis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Experimental support for Multiple-locus complementary sex determination in the parasitoid Cotesia vestalis.</a> Genetics. 180 (3), 1525-1535 (2008).</li>
<li>Paladino, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+sex+determination+in+the+parasitic+wasp+Diachasmimorpha+longicaudata%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Complementary sex determination in the parasitic wasp Diachasmimorpha longicaudata.</a> PLoS ONE. 10 (3), (2015).</li>
<li>Kobayashi, K., Hasegawa, E., Ohkawara, K. <a target="_blank" href="http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=US201301954975">No gene flow between wing forms and clonal reproduction by males in the long-winged form of the ant Vollenhovia emeryi.</a> Insectes Sociaux. 58 (2), 163-168 (2011).</li>
<li>Cowan, D. P., Stahlhut, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+reproductive+diploid+and+haploid+males+in+an+inbreeding+hymenopteran+with+complementary+sex+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Functionally reproductive diploid and haploid males in an inbreeding hymenopteran with complementary sex determination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (28), 10374-10379 (2004).</li>
<li>Armitage, S., Boomsma, J., Baer, B. <a target="_blank" href="https://research.ku.dk/search/?pure=en/publications/diploid-male-production-in-a-leafcutting-ant(99b05fe3-2eef-418e-82e6-9ae940a53b2c)/export.html">Diploid male production in a leaf-cutting ant.</a> Ecological Entomology. 35 (2), 175-182 (2010).</li>
<li>Krieger, M. J. B., Ross, K. G., Chang, C. W. Y., Keller, L. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/6884600">Frequency and origin of triploidy in the fire ant Solenopsis invicta.</a> Heredity. 82, February 1998 142-150 (1999).</li>
<li>Seeley, T. D., Mikheyev, A. S. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00040-003-0638-8">Reproductive decisions by honey bee colonies: Tuning investment in male production in relation to success in energy acquisition.</a> Insectes Sociaux. 50 (2), 134-138 (2003).</li>
<li>Hölldobler, B., Wilson, E. O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aH%C3%B6lldobler%2C+B+%22The+Ants%22">The Ants</a>. , Harvard University Press. http://www.amazon.co.uk/Ants-Bert-H?lldobler/dp/3540520929 (1990).</li>
<li>da Souza, D. J., Marques Ramos Ribeiro, M., Mello, A., Lino-Neto, J., Cotta Dângelo, R. A., Della Lucia, T. M. C. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/11250003.2010.490567">A laboratory observation of nuptial flight and mating behaviour of the parasite ant Acromyrmex ameliae (Hymenoptera: Formicidae).</a> Italian Journal of Zoology. 78 (3), 405-408 (2011).</li>
<li>Woyke, J. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/257472209_What_happens_to_diploid_drone_larvae_in_a_honeybee_colony--Ibid2_73-75">What happens to diploid drone larvae in a honeybee colony.</a> Journal of Apicultural Research. 2 (2), 73-75 (1963).</li>
<li>Schmidt, A. M., Linksvayer, T. A., Boomsma, J. J., Pedersen, J. S. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1365-2311.2011.01325.x">No benefit in diversity? The effect of genetic variation on survival and disease resistance in a polygynous social insect.</a> Ecological Entomology. 36 (6), 751-759 (2011).</li>
<li>Schrempf, a, Aron, S., Heinze, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+determination+and+inbreeding+depression+in+an+ant+with+regular+sib-mating%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">Sex determination and inbreeding depression in an ant with regular sib-mating.</a> Heredity. 97 (1), 75-80 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W artykule przedstawiono protokoły, które można wykorzystać do indukowania krzyżówek wsobnych i oceny występowania chowu wsobnego u mrówki V. emeryi. W eksperymentach konieczne jest genotypowanie osobników użytych do krzyżówek, aby upewnić się, że krzyżówki wsobne zakończyły się sukcesem. Skuteczność tych testów krzyżowych jest jednak wyraźnie widoczna, ponieważ diploidalne samce mogą być produkowane przez cały rok, podczas gdy haploidalne samce mogą być produkowane tylko jesienią, zarówno w terenie, jak i w lab...

Eusocjalne taksony błonkoskrzydłych, takie jak mrówki i pszczoły, rozwinęły haplodiploidalny system determinacji płci, w którym osobniki heterozygotyczne w jednym lub więcej uzupełniających loci determinacji płci (CSD) stają się samicami, podczas gdy te, które są homo- lub hemizygotyczne, stają się samcami (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A)1.
Genetyczne i molekularne komponenty biorące udział w kaskadzie determinacji płci zostały dobrze zbadane u pszczoły miodnej, Apis mellifera, organizmu modelowego błonkoskrzydłego2,3,4. Ostatnie badania genomiki porównawczej sugerują, że mrówki i pszczoły miodne mają wiele domniemanych homologów w szlaku determinacji płci, takich jak początkowy gen determinacji płci, csd5. Jednak nadal brakuje dowodów na funkcjonalną konserwację tych homologów w przypadku mrówek.
Aby rozwiązać ten problem, należy rozwinąć linie chowu wsobnego, ponieważ są one niezbędne do mapowania genetycznego i badań molekularnych. Jednak utrzymanie i przeprowadzenie eksperymentalnych krzyżówek między tymi organizmami w laboratorium jest trudne ze względu na złożony charakter cykli życiowych, które wyewoluowały.
Tutaj używamy Vollenhovia emeryi jako modelu do zbadania genetycznych i molekularnych podstaw systemu determinacji płci u mrówek6,7. Linie wsobne tego gatunku zostały opracowane wcześniej w celu mapowania sprzężeń loci cech ilościowych (QTL) dla cech związanych z determinacją płci po raz pierwszy w ants6. Ponadto zbadano molekularną kaskadę determinacji płci7. Gatunek ten wyewoluował niezwykły system rozmnażania, który wykorzystuje zarówno gynogenezę, jak i androgenezę (<silna klasa="xfig">Ryc. 1B)8,9. Większość nowych królowych i samców jest wytwarzana klonalnie odpowiednio z genomu matki i ojca. Ponadto robotnice i niektóre królowe są produkowane seksualnie8. Ten system rozrodu szczególnie dobrze nadaje się do badań genetycznych, ponieważ krzyżówki wsobne wyprodukowane przy użyciu wyhodowanych płciowo królowych i samców są genetycznie równoważne klasycznemu krzyżowaniu wstecznemu. Ponieważ królowe produkowane płciowo różnią się morfologicznie od królowych wytworzonych z genomów matczynych10 (Rysunek 1B), przeprowadzanie i ocena krzyżówek wsobnych jest znacznie uproszczone przy użyciu tej metody.
W tym artykule opisano metody zakładania kolonii laboratoryjnych do testów krzyżowych, stosowania krzyżówek wsobnych przy użyciu par full-sib oraz oceny sukcesu tych krzyżówek za pomocą genotypowania członków kolonii i sekcji genitaliów męskiego potomstwa.
Niezależnie od zastosowanego systemu reprodukcji, zastosowanie krzyżówek inbredialnych jest często niezbędnym pierwszym krokiem w każdym badaniu systemów determinacji płci u błonkoskrzydłych. Na przykład u Cardiocondyla obscurior, prawie całkowity brak diploidalnych samców po 10 pokoleniach pełnego krycia w laboratorium dowodzi braku locus11. Możliwe jest przewidzenie liczby loci CSD na podstawie stosunku samców wyprodukowanych w krzyżówkach chowu wsobnego6,12,13.

<table><tbody><tr><td>Tynk proszkowy</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Można użyć dowolnej marki</td></tr><tr><td>Węgiel drzewny, aktywowany, proszek</td><td>Wako</td><td>033-02117,037-02115</td><td></td></tr><tr><td>Szkło przesuwne</td><td>NIE DOTYCZY</td> NIE <td>DOTYCZY</td><td>Można użyć dowolnej marki</td></tr><tr><td>Sucha dieta krykieta</td><td>NIE</td><td></td> DOTYCZY <td>Nie dotyczy Można użyć dowolnej marki</td></tr><tr><td>Brązowy shuger&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Można użyć dowolnej marki</td></tr><tr><td>Styrenowy futerał w kształcie kwadratu</td><td>JAKO JEDEN</td><td>Dowolny rozmiar</td><td>Rozmiar różni się w zależności od liczby mrówek</td></tr><tr><td>Incbator</td><td></td><td></td><td>Można użyć dowolnej marki</td></tr><tr><td>Aluminiowa wanna blokowa Sucha jednostka termiczna DTU-1B</td><td>TAITEC</td><td>0014035-000</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Hyper Microtube, przezroczysta, okrągła dno</td><td>WATSON</td><td>131-715CS</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (99,5)</td><td>Wako</td><td>054-07225</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Można użyć dowolnej marki</td></tr><tr><td>Forseps</td><td>DUMONT</td><td>0108-5-PO</td><td></td></tr><tr><td>Chelex 100 forma sodowa</td><td>SIGMA</td><td>11139-85-8</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki z buforem fosforanowym (PBS), pH 7,4</td><td>TaKaRa</td><td>T9181</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Wako</td><td>162-16065</td><td></td></tr><tr><td>-Cellstain- Rozwiązanie DAPI</td><td>Dojindo Molecular Technologies</td><td>D523</td><td></td></tr><tr><td>ABI 3100xl Analizator genetyczny</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>Skontaktuj się bezpośrednio z konstruktorem, aby uzyskać więcej informacji.</td></tr><tr><td>Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy Leica TCS SP8</td><td>Leica</td><td></td><td>Skontaktuj się bezpośrednio z konstruktorem, aby uzyskać więcej informacji.</td></tr><tr><td>HC PL APO CS2 20x/0.75 IMM</td><td>Leica</td><td></td><td>Skontaktuj się bezpośrednio z konstruktorem, aby uzyskać więcej informacji.</td></tr><tr><td>HC PL APO CS2 63x/1.20 WATER</td><td>Leica</td><td></td><td>Skontaktuj się bezpośrednio z konstruktorem, aby uzyskać więcej informacji.</td></tr><tr><td>Leica HyDTM</td><td>Leica</td><td></td><td>Skontaktuj się bezpośrednio z konstruktorem, aby uzyskać więcej informacji.</td></tr><tr><td>Leica Application Suite X (LAS X)</td><td>Leica</td><td></td><td>Skontaktuj się bezpośrednio z konstruktorem, aby uzyskać więcej informacji.</td></tr></tbody></table>

indukcja i ocena krzyżówek wsobnych z wykorzystaniem mrówki, vollenhovia emeryi

Induction and Evaluation of Inbreeding Crosses Using the Ant, Vollenhovia Emeryi

Genetyczne i molekularne składniki kaskady determinacji płci zostały dokładnie zbadane u pszczoły miodnej, Apis mellifera, organizmu modelowego błonkoskrzydłego. Niewiele jednak wiadomo na temat mechanizmów determinacji płci występujących u innych niemodelowych taksonów błonkoskrzydłych, takich jak mrówki. Ze względu na złożony charakter cykli życiowych, które wyewoluowały u gatunków błonkoskrzydłych, trudno jest utrzymać i przeprowadzić eksperymentalne krzyżówki między tymi organizmami w laboratorium. W tym miejscu opisano metody przeprowadzania krzyżówek wsobnych i oceny sukcesu tych krzyżówek u mrówek Vollenhovia emeryi. Indukowanie chowu wsobnego w laboratorium przy użyciu V. emeryi jest stosunkowo proste ze względu na unikalną biologię gatunku. W szczególności gatunek ten wytwarza androgenetyczne samce, a samice rozrodcze wykazują polimorfizm skrzydeł, co upraszcza identyfikację fenotypów w krzyżówkach genetycznych. Ponadto ocena sukcesu chowu wsobnego jest prosta, ponieważ samce mogą być produkowane w sposób ciągły przez krzyżówki wsobne, podczas gdy normalne samce pojawiają się tylko podczas dobrze zdefiniowanego sezonu reprodukcyjnego na polu. Nasz protokół pozwala na wykorzystanie V. emeryi jako modelu do badania genetycznych i molekularnych podstaw systemu determinacji płci u gatunków mrówek.

Wyniki analizy mikrosatelitarnej z wykorzystaniem pokoleń F0 i F1 wykazały, że krzyżówki wsobne zostały przeprowadzone z sukcesem (Rycina 4)6. W wyniku krzyżówek wsobnych, w ciągu miesiąca od utworzenia eksperymentalnych kolonii krzyżowych, uzyskano zapłodnione królowe. Ćwiartka (27,1 ± 8,91% SD) całego potomstwa (F2) z krzyżówek wsobnych stanowiły samce, natomiast pozostała część to samice (robotnice i...

W tym protokole, metody przeprowadzania krzyżówek wsobnych i oceny sukcesu tych krzyżówek, są opisane dla mrówki Vollenhovia emeryi. Protokoły te są ważne dla eksperymentów mających na celu zrozumienie genetycznych podstaw systemów determinacji płci u błonkoskrzydłych.

Indukcja i ocena krzyżówek wsobnych z wykorzystaniem mrówki, Vollenhovia emeryi

The genetic and molecular components of the sex-determination cascade have been extensively studied in the honeybee, Apis mellifera, a hymenopteran model ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii molekularnej i sfery genetycznej błonkoskrzydłych, takie jak systemy determinacji płci. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy łatwo indukować linie wsobne nad mrówką Vollenhovia Emery, które są niezbędne do mapowania genetycznego i statusu molekularnego. Tak więc ta misja może dostarczyć informacji na temat systemu determinacji płci konkretnej mrówki, a także może być zastosowana do innych mrówek i innych gatunków błonkoskrzydłych, takich jak osy.Aby rozpocząć protokół, zbierz kolonie V.Emeryi wczesnym latem. Przenieś okazy mrówek z zebranych gałęzi do sztucznego gipsowego gniazda ze szklaną pokrywą za pomocą aspiratora. Utrzymuj kolonie w sztucznym gnieździe w temperaturze 25 stopni C, w 16-ośmiogodzinnym cyklu światło-ciemność.Wodę z kranu należy podawać w butelce do mycia, aby tynk był wilgotny co drugi dzień o tej samej porze. Następnie dodaj około 100 mikrogramów suchego proszku ze świerszcza zawiniętego w folię aluminiową i końcówkę wypełnioną wodą z brązowym cukrem do kolonii, używając końcówki o pojemności 20 mikrolitrów co drugi dzień, aż pojawią się nowe mrówki rozrodcze. Ważne jest, aby zbierać mikrokolonie z pól i zapewnić im wystarczającą ilość pożywienia, aby zdobyć nowe królowe i samce.Po pierwsze, powstrzymaj osobniki przed poruszaniem się, umieszczając kolonie w pomieszczeniu z kontrolowanym środowiskiem ustawionym na cztery stopnie Celsjusza na 15 minut. Usuń środkowe nogi 30 robotnic za pomocą kleszczy pod stereoskopem, aby odróżnić pokolenie F-zero od robotnic powstałych w kolejnych krzyżówkach wsobnych. Następnie przenieś mrówki do nowego, mniejszego gipsowego gniazda do krzyżówek wsobnych.Następnie dodaj trzy do czterech larw lub pube do gipsowego gniazda zawierającego robotnice. Przenieś długoskrzydłą królową i samca do wcześniej przygotowanego gipsowego gniazda do krzyżówek wsobnych. Na tym etapie ważne jest, aby utrzymać eksperymentalną kolonię krzyżową w tym samym stanie, w jakim znajduje się normalna kolonia.Trudno jest wywołać chów wsobny tylko poprzez umieszczenie samców i samic razem. Utrzymuj kolonie w temperaturze 25 stopni Celsjusza w 16-ośmiogodzinnym cyklu światła i ciemności z jedzeniem i wodą, dopóki królowa nie straci skrzydeł i nie złoży jaj. Codziennie sprawdzaj eksperymentalną kolonię pod mikroskopem stereoskopowym.Po ustawieniu krzyżówek wsobnych między potomstwem F-one, jaja można obserwować pod stereoskopem. Po tym, jak królowa F-one zacznie składać jaja, usuń samce F-one i larwy lub krążek z gniazda, aby zapobiec mieszaniu się pokolenia F-one i pokolenia F-dwa. Utrzymuj kolonie w tych samych warunkach, aż pojawi się potomstwo F-dwa.Usuń jedną nogę królowej F-zero za pomocą kleszczy. Przenieś nogę do mikroprobówki o pojemności 1,5 mililitra zawierającej 100 mikrolitrów środka chłodzącego. Pod stereoskopem wypreparuj kobiecy brzuch w szklanym naczyniu wypełnionym 300 mikrolitrami ultra czystej wody za pomocą kleszczy.Zdysymilizuj spermatykę zawierającą plemniki z pokrytych samców. Oderwij tkankę spermatica i odizoluj plemniki od tkanki samicy za pomocą szpilek do owadów. Za pomocą mikro podkładki do ciasta przenieś plemniki do 1,5 mililitrowej mikroprobówki zawierającej 100 mikrolitrów środka chłodzącego.Inkubować próbki z królowej F-zero i plemników w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 20 minut. Flash centro połączyć mikrorurkę i przechowywać próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po potwierdzeniu produkcji jaj przez matkę F-one pokrytą siv, należy wyekstrahować DNA królowej za pomocą zrzuconych skrzydeł lub jednej środkowej nogi i genotypu.Następnie wyekstrahuj DNA samca F-one poprzez genotypowanie jednej nogi. Aby ocenić płodność samców mrówek z krzyżówek wsobnych, należy wypreparować wewnętrzne narządy rozrodcze w szklanym naczyniu z 400 mikrolitrami roztworu PBS za pomocą kleszczy. Następnie usuń PBS i zastąp go czteroprocentowym paraformaldihydem za pomocą mikro podkładki do ciasta.Utrwalić tkankę, inkubując próbki w PFA przez czterdzieści minut w temperaturze pokojowej. Po utrwaleniu umyj chusteczki pięć razy 400 mikrolitrami PBS za pomocą mikro podkładki do ciasta. Rozcieńczyć roztwór DAPI do jednego miligrama na mililitr w PBS.Usunąć PBS i dodać około 300 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu barwiącego DAPI do tkanki. Inkubować tkankę przez 15 minut w ciemnych warunkach w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przemyj tkankę pięciokrotnie 400 mikrolitrami PBS i przenieś tkankę do środka szkiełka za pomocą kleszczy.Następnie zamontuj tkankę na podłożu montażowym zawierającym TRITC tetrametylorodaminę. Na koniec obserwuj próbki za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego przy użyciu 20 lub 60 soczewek obiektywowych 3x. Obrazy mikroskopowe jąder haploidalnego samca v Emeryi pokazują zdrową tkankę włóknistą lub plemniki, które są nieobecne u diploidalnego samca v Emeryi, które nie wykazały zdrowej tkanki włóknistej.Męskie narządy rozrodcze diploidalnego samca v Emeryi nie wytwarzały plemników, a ich jądra nie rozwijały się, co sugeruje, że samce powstałe w krzyżówkach wsobnych są bezpłodne. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała nam drogę do zbadania miatonii płciowej w stałym w Vollenhovia Emeryi dla gatunków mrówek o szybkim czasie.

induction-evaluation-inbreeding-crosses-using-ant-vollenhovia

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Indukcja neuralna jest pierwszym etapem formowania się mózgu. Jest to mechanizm, dzięki któremu węzeł Hensen’a (organizator) instruuje sąsiednie tkanki do przyjęcia losu neuralnego, tzn. do przekształcenia się w układ nerwowy. Niniejszy film prezentuje test indukcji neuralnej w embrionie kurczaka.

Analiza indukcji neuralnej w embrionie kurczaka

Opracowaliśmy metodologię przeprowadzania krzyżówek w Setaria viridis (S. viridis).  Metoda polega na przycięciu wiechy przed zabiegiem gorącej wody w celu zabicia żywotnego pyłku.  Krzyżówki są wykonywane zgodnie z dobrze kontrolowanym reżimem wzrostu i zazwyczaj skutkują odzyskaniem od 1 do 7 nasion zapylonych krzyżowo na wiechę.

Metody wykonywania krzyżówek w Setaria viridis, nowym systemie modelowym dla traw

Różnicowa zdolność konkurencyjna plemników wśród samców Drosophila o różnych genotypach może być stwierdzona poprzez eksperymenty z podwójnym kryciem. Każdy z tych eksperymentów obejmuje jednego z interesujących samców i samca referencyjnego. Łatwe do zidentyfikowania markery w potomstwie pozwalają na wnioskowanie o frakcji osobników spłodzonych przez każdego samca.

Ocena różnic w zdolności konkurencyjnej plemników u Drosophila

Spraye fungicydowe na kwitnące rośliny mogą narażać samotne pszczoły na wysokie stężenia pozostałości fungicydów przenoszonych przez pyłki. Wykorzystując eksperymenty laboratoryjne z udziałem larw pszczół hodowanych in vitro, badanie to bada interaktywne efekty spożywania pyłku poddanego działaniu fungicydów pochodzącego z roślin żywicielskich i niebędących żywicielami.

In vitro Hodowla pszczół samotnic: narzędzie do oceny czynników ryzyka larw

Ten protokół ma na celu ocenę żywotności Drosophila na każdym etapie rozwoju, od zarodka do dorosłego osobnika. Metoda ta może być stosowana do określania i porównywania żywotności różnych genotypów lub warunków wzrostu.

Bezpośrednia i prosta metoda oceny żywotności Drosophila melanogaster od zarodka do dorosłego osobnika

Przedstawiamy metodologię ustalania wymagań dotyczących zapylania odmian moreli (Prunus armeniaca L.), łącząc określenie samo(nie)zgodności za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z identyfikacją genotypu S za pomocą analizy PCR.

Określenie relacji między sobą i między (nie)zgodnością w moreli za pomocą zapylania ręcznego, mikroskopii i analiz genetycznych

Tutaj prezentujemy protokół badania konkurencyjności godowej samców Aedes aegypti przy użyciu barwnika fluorescencyjnego jako markera. Samice komarów są narażone na kontakt zarówno z oznaczonymi, jak i nieoznaczonymi samcami w celu kopulacji. Po kryciu ich plemniki są badane pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu określenia ich partnera godowego.

Wykorzystanie barwnika fluorescencyjnego, rodaminy B, do badania konkurencyjności godowej samców komarów Aedes aegypti

Tutaj prezentujemy ogólną metodę określania żywotności embrionalnej i całkowitej liczby wyprodukowanych zarodków (czerwiu) za pomocą organizmu modelowego C. elegans.

Pomiar żywotności zarodka i wielkości lęgu u Caenorhabditis elegans

Badanie to oceniało aktywność biologiczną ekstraktów z Tithonia diversifolia przy użyciu metod opartych na rodnikach oraz testu in vitro wylęgu jaj (EHA), aby ocenić ich wpływ na nicienie pokarmowe u małych przeżuwaczy. Opisano metodologię i kluczowe ustalenia, podkreślając potencjał tych ekstraktów do zwalczania pasożytów.

Ocena właściwości antyoksydacyjnych i anthelmintycznych ekstraktów Tithonia diversifolia przeciwko jajeczom nicieni pokarmowych z wykorzystaniem testów in vitro

Protokół ten zapewnia metodę pomiaru częstotliwości i dystrybucji krzyżowania podczas mejozy u Caenorhabditis elegans. Do określenia pochodzenia chromosomów wykorzystano genotypowanie polimorfizmu pojedynczego nukleotydu za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Mapowanie 4-punktowe pozwoliło określić rozkłady krzyżowe regionów lewego, środkowego i prawego ramienia każdego chromosomu. ...

Częstotliwość i dystrybucja krzyżowania się w mejozie Caenorhabditis elegans za pomocą genotypowania SNP przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym

Poznaj metodę indukcji krzyżówek wsobnych u mrówki Vollenhovia emeryi w celu badania genetyki i determinacji płci. Protokół umożliwia analizę molekularną oraz ocenę płodności samców diploidalnych.

Indukcja i ocena krzyżówek wsobnych z wykorzystaniem mrówki, Vollenhovia emeryi

Przeglądaj więcej filmów