Name: Połączenie barwienia histochemicznego i analizy obrazu w celu ilościowego określenia skrobi w zawiązkach jajników czereśni podczas spoczynku zimowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Poznaj metodę ilościowego oznaczania skrobi w zawiązkach kwiatowych czereśni podczas spoczynku zimowego. Połączenie barwienia histochemicznego z analizą obrazu pozwala badać aktywność fizjologiczną roślin drzewiastych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Marii Herrero i Eliseo Rivasowi za ich pomocne dyskusje i rady. Prace te były wspierane przez Ministerio de Economía y Competitividad — Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego, Unia Europejska [grant nr BES-2010-037992 dla E. F.]; Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria [numery grantów RFP2015-00015-00, RTA2014-00085-00, RTA2017-00003-00]; oraz Gobierno de Aragón — Europejski Fundusz Społeczny, Unia Europejska [Grupo Consolidado A12-17R].

1. Określanie spoczynku i zbieranie materiału roślinnego
<ol>
	<li>Spróbuj pąków kwiatowych na polu. Badania spoczynku są eksperymentami długoterminowymi i wymagają, aby dorosłe drzewa były wystarczająco duże, aby zbierać pąki i pędy przez całą zimę bez uszczerbku dla rozwoju drzew następnej wiosny. W zależności od systemu szkolenia może być wymagane specjalne zarządzanie sadem; W związku z tym przycinanie może być mniej dotkliwe niż w przypadku produkcji owoców.
	<ol>
		<li>Każdego tygodnia, od początku jesieni do początku pękania pąków, zbierz i zważ 10 pąków kwiatowych.</li>
		<li>Utrwalić pąki kwiatowe, umieszczając je w szklanej probówce o pojemności 10 ml z nakrętką i zanurzyć próbki w utrwalającym roztworze etanolu/kwasu octowego (3:1) przez co najmniej 24 godziny w temperaturze 4 °C. Następnie wyrzuć utrwalacz i dodaj 75% etanolu, obficie upewniając się, że pokrywa próbki. Próbki można przechowywać w tym roztworze w temperaturze 4 °C do momentu użycia. 
		Uwaga: Infiltracja próżniowa może być użyta do usunięcia pęcherzyków powietrza wewnątrz pąka i zapobieżenia ich unoszeniu się. Ułatwia to przenikanie utrwalacza do tkanek, ale może uszkodzić strukturę tkanek. Staraj się tego unikać, jeśli nie jest to konieczne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobranie próbek pędów na polu.
	<ol>
		<li>Każdego tygodnia, od początku jesieni do początku pękania pąków, weź trzy pędy o długości 15 - 30 cm i średnicy 5 mm, zawierające co najmniej 10 pąków kwiatowych każdy. Umieścić je na nasączonej wodą piance florystycznej w komorze wzrostowej w temperaturze 22 ± 1 °C z 12-godzinnym fotoperiodem świetlnym.</li>
		<li>Po 10 dniach w komorze wzrostowej zbierz i zważ 10 pąków kwiatowych z pędów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oceń wzrost pąków i określ stan spoczynku. Okres pobierania próbek musi być dostosowany do warunków panujących w danym miejscu. W warunkach sadowniczych (Saragossa, Hiszpania, 41°44'30 � N, 0°47′00 � W, 220 m n.p.m.) pobieranie próbek pędów prowadzono od 30 listopada do końca lutego lub początku marca.
	<ol>
		<li>Co tydzień oceniaj reakcję pąków kwiatowych na odpowiednie warunki wzrostu w komorze, od początku jesieni do pęknięcia pąków na wiosnę, porównując wagę 10 pąków zebranych z pola.</li>
		<li>Jeśli nie ma różnic lub różnice te są mniejsze niż 30%, należy wziąć pod uwagę, że pąki nie spełniły swoich wymagań dotyczących chłodzenia i są endodormantami22. Jeśli różnice są większe niż 30%, należy wziąć pod uwagę, że pąki spełniły swoje wymagania dotyczące chłodzenia i są ekodormantyczne22.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie materiału roślinnego do ilościowego oznaczania skrobi
<ol>
	<li>Wybierz około sześciu stałych pąków z każdej daty pobierania próbek (patrz krok 1.1). W zależności od odmiany, każdy pączek kwiatowy czereśni zawiera do pięciu zawiązków kwiatowych.
	<ol>
		<li>Usuń zewnętrzne łuski pąków i umieść je na szkiełku zegarmistrzowskim z 75% etanolem, aby zapobiec jego wysychaniu.</li>
		<li>Wypreparuj pączek i wyekstrahuj co najmniej jeden zawiązek kwiatowy na pączek za pomocą precyzyjnych kleszczy i skalpela okulistycznego pod mikroskopem stereoskopowym. Zawiązki kwiatowe można przechowywać w szklanej probówce o pojemności 10 ml zawierającej 75% etanolu w temperaturze 4 °C lub od razu przejść do następnego kroku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwodnić próbki w serii trzeciorzędowego alkoholu butylowego.
	<ol>
		<li>Zastąp 75% roztwór etanolu 10 ml 75% trzeciorzędowego alkoholu butylowego (TBA), aby obficie pokryć próbki i inkubować je przez 1,5 godziny. Pipeta Pasteura może być przydatna do wyrzucenia roztworu.</li>
		<li>Powtórzyć krok 2.2.1, dodając TBA o rosnących stężeniach (85%, 95% i 100% v/v; oraz 3x z czystym TBA) w piecu suszącym w temperaturze 30 °C z ekstrakcją powietrza, ponieważ czysty TBA krystalizuje w temperaturze pokojowej (< 20 °C) i jest bardzo lotny i toksyczny. Jeśli TBA skrystalizuje się z próbką, uszkodzi tkanki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zanurzyć próbki w parafinie18.
	<ol>
		<li>Stopić parafinę, wprowadzając perełki parafinowe do pieca suszącego w temperaturze 60 °C z ekstrakcją powietrza poprzedniego dnia. Perły parafinowe można również topić na płycie grzejnej, ale upewnij się, że ciekła parafina ma temperaturę 60 °C, a nie wyższą, aby uniknąć uszkodzenia tkanek.</li>
		<li>Zastąp TBA mieszaniną TBA i oleju parafinowego (1:1) i inkubuj przez 24 godziny w piecu do suszenia w temperaturze 60 °C. Następnie zastąpić mieszaninę TBA i oleju parafinowego czystą stopioną parafiną i inkubować przez co najmniej 6 godzin w piecu suszącym w temperaturze 60 °C. Powtórzyć to 2 razy i inkubować ostatnią zmianę przez co najmniej 4 - 6 dni.</li>
		<li>Umieść każdą próbkę na małej metalowej podstawie na gorącej powierzchni, zatopionej w wosku parafinowym i nadaj tempo kasecie do zatapiania. Umieść go na zimnej powierzchni i usuń blok po zestaleniu się wosku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparaty należy podzielić na sekcje i ponownie nawodnić.
	<ol>
		<li>Przygotować klej Haupta: rozpuścić 1 g zwykłej żelatyny Knox w 100 ml wody destylowanej o temperaturze 30 °C, następnie dodać 2 g luźnych kryształów fenolu (C6H5OH) i 15 ml glicerolu. Rozprowadź klej Haupt na szkiełku za pomocą pędzla i dodaj kroplę 1% roztworu formaldehydu.</li>
		<li>Każdy blok parafiny należy rozciąć na głębokość 10 μm w mikrotomie rotacyjnym i umieścić skrawki na szkiełku podstawowym pokrytym klejem Haupta.</li>
		<li>Umieścić szkiełka podstawowe wraz z sekcjami na powierzchni grzewczej w temperaturze 35 - 40 °C do wyschnięcia, a następnie przenieść szkiełka podstawowe na stojak na szkiełka.</li>
		<li>Przygotuj roztwory do odparafinowania i ponownego nawodnienia. Umieścić 200 ml Histoclear II w trzech naczyniach do barwienia szkła, drugim z Histoclear II: etanol (1:1, v/v), serię etanolową (100%, 70%, 40%, v/v) i końcowe płukanie wodą destylowaną.</li>
		<li>Odwoskować skrawki trzema płukaniami, każde 5 minut, w Histoclear II i w Histoclear II: etanol (1:1, v/v). Umieść stojak na szkiełka wewnątrz naczyń do barwienia szkła, upewniając się, że roztwór całkowicie zakrywa szkiełka, a następnie przenieś stojak na szkiełka z jednego roztworu do drugiego.</li>
		<li>Ponownie uwodnić sekcje w następujących seriach 2-minutowych płukań: seria etanolu (100%, 70%, 40%, v/v) i końcowe płukanie wodą destylowaną. Na koniec wysuszyć szkiełka w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Plamić sekcje18.
	<ol>
		<li>Przygotować barwnik I2KI: rozpuścić 2 g jodku potasu (KI) i 0,2 g jodu (I2) w 100 ml wody destylowanej. Nałóż kroplę świeżego I2KI na sekcję (sekcje) przez 5 minut, a następnie wyrzuć nadmiar plamy, wchłaniając ją bibułą. Szybko przejdź do następnego kroku.</li>
		<li>Nałóż niewielką kroplę syntetycznego nośnika montażowego, umieść małą szklankę nakrywkową na wierzchu i mocno dociśnij. Po wyschnięciu podłoża mocującego obserwować pod mikroskopem w jasnym polu w celu wstępnej oceny skrobi jajnikowej. 
		Uwaga: Ten krok nie jest obowiązkowy, chociaż uzyskuje się lepszy kontrast między skrobią a tłem. Jeżeli po ilościowym określeniu skrobi skrobia musi być ponownie użyta z innymi plamami, należy umieścić szkło nakrywkowe na kropli plamy i wyrzucić nadmiar, wchłaniając go bibułą (patrz ppkt 2.5.1). Następnie, po ilościowym określeniu skrobi, przepłukać plamę I2KI wodą destylowaną i umieścić preparaty na powierzchni grzewczej w temperaturze 35-40 °C aż do wyschnięcia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Kwantyfikacja zawartości skrobi
<ol>
	<li>Skalibruj warunki optyczne. 
	Uwaga: Poziomy detekcji używane przez analizator obrazu do wykrywania barwionej skrobi są bezpośrednio zależne od warunków oświetleniowych i powiększenia mikroskopu; W ten sposób ustal te warunki dla wszystkich ocenianych preparatów. Dostosuj proponowaną tutaj regulację do dostępnego mikroskopu i warunków oświetleniowych.
	<ol>
		<li>Dostosuj przysłonę przy 20-krotnym powiększeniu i regulatorze jasności lub natężeniu światła.</li>
		<li>Upewnij się, że w uchwycie filtra nie ma filtrów i wybierz warunki jasnego pola w mikroskopie. Wybierz odpowiednie powiększenie (np. 40X dla zawiązka jajnika czereśni).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontroluj warunki akwizycji obrazu. Dostosuj ustawienia aparatu za pomocą barwionego preparatu bez chusteczki za pomocą Obraz | Akwizycja | Podgląd wstępny.
	<ol>
		<li>Ustaw jasność na 50%, wzmocnienie na 1,0x, a histogram wskazuje wartość gamma na 1,00 i kontrast na 0 - 100, wyrównując się z granicami histogramu rozkładu jasności.</li>
		<li>Aktywuj funkcję prześwietlenia/niedoświetlenia i dostosuj czas ekspozycji na granicy prześwietlenia.</li>
		<li>Zastosuj funkcję balansu bieli do całego obrazu, aby wyświetlić wszystkie elementy obrazu o neutralnych kolorach bez żadnych odcieni kolorów, a korekcję cieniowania do całego obrazu, aby uzyskać skorygowany i jednorodny obraz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skalibruj system analizy obrazu, aby uzyskać wartości kontrolne poziomu szarości (0,; 255, biały) o różnych gęstościach optycznych (OD), które są uzyskiwane przez wartości transmitancji (T).
	<ol>
		<li>Uzyskaj obraz barwionego preparatu bez tkanki, uważanego za biały kontrolny, i zmierz poziom szarości czarno-białego obrazu za pomocą opcji Pomiar | Szara miara | Kalibracja szarości | Wartość referencyjna = 0 | Środek | Kalibracja | Dobrze. Odpowiada to 100% przepuszczalności; zatem gęstość optyczna 0, zgodnie z OD = 2 - log T.</li>
		<li>Uzyskaj obraz tego samego preparatu z filtrem 4N, który zmniejsza ilość światła 4x, i zmierz poziom szarości czarno-białego obrazu za pomocą Measure | Szara miara | Kalibracja szarości | Wartość referencyjna = 0,6 | Środek | Kalibracja | Dobrze. Odpowiada to przepuszczalności 25%; zatem gęstość optyczna 0,6, zgodnie z OD = 2 - log T.</li>
		<li>Uzyskaj obraz tego samego preparatu bez światła, uważany za, i zmierz poziom szarości czarno-białego obrazu za pomocą opcji Pomiar | Szara miara | Kalibracja szarości | Wartość referencyjna = 1 | Środek | Kalibracja | Dobrze. Odpowiada to przepuszczalności 0%; zatem gęstość optyczna 1, zgodnie z OD = 2 - log T.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykryj skrobię.
	<ol>
		<li>Uzyskaj kolorowy obraz pola do pomiaru w formacie TIFF o rozdzielczości co najmniej 300 punktów na cal (dpi).</li>
		<li>Utwórz obraz binarny odpowiadający poplamionemu obszarowi. Ustaw trzy progi kolorów (wartości od 0 do 255 dla każdego), aż obraz binarny dokładnie odzwierciedli zaobserwowane zabarwione granulki skrobi za pomocą punktu menu Obraz | Wykrywanie | Wybierz progi czerwonego, niebieskiego i zielonego | Dobrze. Dokonuj wielokrotnych porównań wizualnych w różnych preparatach i tkankach, aby dostroić końcowe poziomy wykrywania. Przechowuj i używaj tych poziomów do wszystkich preparatów.</li>
		<li>Określ ilościowo skrobię. Przekształć oryginalny kolorowy obraz w czarno-biały obraz za pomocą systemu analizy obrazu. Użyj obrazu binarnego jako maski nałożonej na obraz czarno-biały za pomocą opcji Obraz | Edycja binarna. Zmierz sumę gęstości optycznej każdego piksela pod maską za pomocą opcji Zmierz | Poziom szarości | OK i potraktuj tę wartość jako zawartość skrobi w mierzonym polu.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 3.4.1 - 3.4.3 w czterech miejscach zawiązków jajnika, aby uzyskać reprezentatywną wartość zawartości skrobi w jajniku zawiązków kwiatowych.</li>
		<li>Powtórz kroki 3.4.1 - 3.4.3 i 3.4.5 dla różnych kwiatów w każdej dacie zbioru.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kurokura, T., Mimida, N., Battey, N. H., Hytönen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+seasonal+flowering+in+the+Rosaceae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">The regulation of seasonal flowering in the Rosaceae.</a> Journal of Experimental Botany. 64 (14), 4131-4141 (2013).</li>
<li>Rohde, A., Bhalerao, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+dormancy+in+the+perennial+context%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Plant dormancy in the perennial context.</a> Trends in Plant Science. 12 (5), 217-223 (2007).</li>
<li>Fadón, E., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0098847217302794">Unveiling winter dormancy through empirical experiments.</a> Environmental and Experimental Botany. 152, 28-36 (2018).</li>
<li>Fadón, E., Rodrigo, J., Herrero, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00468-018-1735-7">Is there a specific stage to rest? Morphological changes in flower primordia in relation to endodormancy in sweet cherry (Prunus avium L.).</a> Trees - Structure and Function. , In Press (2018).</li>
<li>Fadón, E., Herrero, M., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dormant+flower+buds+actively+accumulate+starch+over+winter+in+sweet+cherry%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Dormant flower buds actively accumulate starch over winter in sweet cherry.</a> Frontiers in Plant Science. 9 (171), (2018).</li>
<li>Loescher, W. H., Mccamant, T., Keller, J. D. <a target="_blank" href="http://hortsci.ashspublications.org/content/25/3/274.full.pdf">Carbohydrate reserves, translocation and storage in woody plant roots.</a> HortScience. 25 (3), 274-281 (1990).</li>
<li>Hedhly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starch+turnover+and+metabolism+during+flower+and+early+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Starch turnover and metabolism during flower and early embryo development.</a> Plant Physiology. , (2016).</li>
<li>Rodrigo, J., Hormaza, J. I., Herrero, M. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1034/j.1399-3054.2000.108001035.x">Ovary starch reserves and flower development in apricot (Prunus armeniaca).</a> Physiologia Plantarum. 108 (1), 35-41 (2000).</li>
<li>Julian, C., Rodrigo, J., Herrero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stamen+development+and+winter+dormancy+in+apricot+%28Prunus+armeniaca%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Stamen development and winter dormancy in apricot (Prunus armeniaca).</a> Annals of Botany. 108 (4), 617-625 (2011).</li>
<li>Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pistil+starch+reserves+at+anthesis+correlate+with+final+flower+fate+in+avocado+%28Persea+americana%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pistil starch reserves at anthesis correlate with final flower fate in avocado (Persea americana).</a> PLoS One. 8 (10), e78467(2013).</li>
<li>Smith, A. M., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nprot/journal/v1/n3/abs/nprot.2006.232.html">Quantification of starch in plant tissues.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1342-1345 (2006).</li>
<li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Imaging+Software+Tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Biological Imaging Software Tools.</a> Nature Methods. 9 (7), (2013).</li>
<li>Rodrigo, J., Herrero, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s004970050124">Influence of intraovular reserves on ovule fate in apricot (Prunus armeniaca L.).</a> Sexual Plant Reproduction. 11, 86-93 (1998).</li>
<li>Zhou, J., Spallek, T., Faulkner, C., Robatzek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CalloseMeasurer%3A+A+novel+software+solution+to+measure+callose+deposition+and+recognise+spreading+callose+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">CalloseMeasurer: A novel software solution to measure callose deposition and recognise spreading callose patterns.</a> Plant Methods. 8 (1), (2012).</li>
<li>Faulkner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+quantitative+image+analysis+tool+for+the+identification+of+microtubule+patterns+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">An automated quantitative image analysis tool for the identification of microtubule patterns in plants.</a> Traffic. 18 (10), 683-693 (2017).</li>
<li>Kuhn, B. F. <a target="_blank" href="http://www.pubhort.org/ejhs/2006/file_338662.pdf">Determination of starch in ovules of the sour cherry cv. &#34;Stevnsbaer.&#34.</a> European Journal of Horticultural Science. 71 (3), 120-124 (2006).</li>
<li>Johansen, D. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohansen%2C+DA+%22Plant+microtechnique%22">Plant microtechnique</a>. , McGraw-Hill. New York, NY. (1940).</li>
<li>Ruzin, S. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRuzin%2C+SE+%22Plant+microtechnique+and+microscopy%22">Plant microtechnique and microscopy</a>. , Oxford University Press. New York, NY. (1999).</li>
<li>Rodrigo, J., Rivas, E., Herrero, M. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1399-3054.1997.tb03437.x">Starch determination in plant tissues using a computerized image analysis system.</a> Physiologia Plantarum. 99 (1), 105-110 (1997).</li>
<li>Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovary+starch+reserves+and+pistil+development+in+avocado+%28Persea+americana%29%5BTitle%5D)+AND+%22Physiologia+Plantarum%22%5BJournal%5D)">Ovary starch reserves and pistil development in avocado (Persea americana).</a> Physiologia Plantarum. 140 (4), 395-404 (2010).</li>
<li>Suarez, C., Castro, A. J., Rapoport, H. F., Rodriguez-García, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological%2C+histological+and+ultrastructural+changes+in+the+olive+pistil+during+flowering%5BTitle%5D)+AND+%22Sexual+Plant+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Morphological, histological and ultrastructural changes in the olive pistil during flowering.</a> Sexual Plant Reproduction. 25, 133-146 (2012).</li>
<li>Lang, G. A., Early, J. D., Martin, G. C., Darnell, R. L. <a target="_blank" href="https://www.scienceopen.com/document?vid=72cb57c5-ade2-4529-b2ff-f7987d4b215e">Endodormancy, paradormancy, and ecodormancy - Physiological terminology and classification for dormancy research.</a> HortScience. 22 (3), 371-377 (1987).</li>
<li>Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+clearing+and+staining+of+arabidopsis+flower+organs+and+siliques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole-mount clearing and staining of arabidopsis flower organs and siliques.</a> Journal of Visualized Experiments. 2018 (134), 1-10 (2018).</li>
<li>Kaufmann, H., Blanke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+carbohydrate+levels+and+relative+water+content+%28RWC%29+to+distinguish+dormancy+phases+in+sweet+cherry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Changes in carbohydrate levels and relative water content (RWC) to distinguish dormancy phases in sweet cherry.</a> Journal of Plant Physiology. 218 (July), 1-5 (2017).</li>
<li>Herrero, M., Dickinson, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pollen-pistil+incompatibility+in+Petunia+hybrida%3A+changes+in+the+pistil+following+compatible+and+incompatible+intraspecific+crosses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Pollen-pistil incompatibility in Petunia hybrida: changes in the pistil following compatible and incompatible intraspecific crosses.</a> Journal of Cell Science. 36, 1-18 (1979).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), R100(2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Spoczynek bylin drzewiastych ma wyraźne implikacje dla produkcji owoców i leśnictwa w zmieniającym się klimacie, chociaż proces biologiczny stojący za spoczynkiem pozostaje niejasny. Do badań nad spoczynkiem można podchodzić z różnych punktów widzenia, ale badania poszukujące biologicznego markera spoczynku zimowego nasiliły się w ostatnich latach. Jednak większość prób znalezienia jednoznacznego wskaźnika pokazującego, kiedy pączek przerwał spoczynek, zakończyła się niepowodzeniem3. Opisana tu me...

Rośliny drzewiaste strefy umiarkowanej dostosowują się do pór roku, modulując swój wzrost i rozwój. Podczas gdy rozwijają się wiosną i latem, przestają rosnąć jesienią, aby przejść w stan uśpienia zimą1. Chociaż spoczynek pozwala im przetrwać w niskich temperaturach zimowych, chłodzenie jest warunkiem wstępnym prawidłowego pękania pąków na wiosnę2. Ważne implikacje spoczynku w produkcji owoców strefy umiarkowanej i leśnictwie doprowadziły do podjęcia różnorodnych wysiłków w celu określenia i przewidzenia okresu spoczynku3. W przypadku gatunków drzew owocowych eksperymenty empiryczne przenoszące pędy do warunków wymuszających oraz prognozy statystyczne oparte na danych dotyczących kwitnienia są aktualnymi podejściami do określenia daty przerwania spoczynku, co pozwala badaczom oszacować wymagania dotyczące chłodzenia dla każdej odmiany. Jednak sposób określania stanu spoczynku na podstawie procesów biologicznych pozostaje niejasny3. 
Kwitnienie na drzewach owocowych strefy umiarkowanej, takich jak czereśnia (Prunus avium L.), występuje raz w roku i trwa około dwóch tygodni. Jednak kwiaty zaczynają się różnicować i rozwijać około 10 miesięcy wcześniej, podczas poprzedniego lata4. Primordia kwiatowe przestają rosnąć jesienią, aby zimą pozostać uśpione w pąkach. W tym okresie każda odmiana musi zgromadzić określone wymagania dotyczące chłodzenia, aby kwitnąć prawidłowo4. Pomimo braku zmian fenologicznych w pąkach zimą, zawiązki kwiatów są fizjologicznie aktywne w okresie spoczynku, a akumulacja niskich temperatur została ostatnio powiązana z dynamiką akumulacji lub spadku skrobi w komórkach zawiązka jajnika, oferując nowe podejście do określania spoczynku5. Jednak mały rozmiar i lokalizacja zawiązka jajnika wymagają specjalnej metodologii.
Skrobia jest głównym węglowodanem magazynującym gatunki roślin drzewiastych6. Tak więc zmiany w skrobi zostały powiązane z fizjologiczną aktywnością tkanek kwiatowych, które potrzebują węglowodanów do wspierania swojego rozwoju7,8. Różne kluczowe zdarzenia podczas procesu rozrodczego są również związane z różnicami w zawartości skrobi w różnych strukturach kwiatowych, takimi jak mejoza pylników9, wzrost łagiewki pyłkowej poprzez styl lub zapłodnienie zalążka10. Techniki histochemiczne pozwalają na wykrycie skrobi w każdej poszczególnej tkance zawiązków kwiatowych w okresie spoczynku. Pozostaje jednak trudność w ilościowym określeniu tej skrobi, aby umożliwić śledzenie jej wzorca akumulacji/spadku w czasie lub porównanie zawartości skrobi między tkankami, odmianami lub latami. Wynika to z niewielkiej ilości tkanki dostępnej dla technik analitycznych11. Alternatywnie, analiza obrazu połączona z mikroskopią12 pozwala na ilościowe określenie skrobi w bardzo małych próbkach tkanki roślinnej13. 
Podejścia łączące mikroskopię i analizę obrazu zostały użyte do ilościowego określenia zawartości różnych składników w tkankach roślinnych, takich jak callose14, microtubes15, lub starch16, mierząc rozmiar obszaru zabarwionego przez określone plamy. W przypadku skrobi można go łatwo wykryć za pomocą reakcji jodek potasu z jodkiem (I2KI) 17. Ta metoda jest bardzo specyficzna; I2KI interkaluje się w strukturze laminarnej ziaren skrobi i tworzy ciemnoniebieski lub czerwono-brązowy kolor, w zależności od zawartości amylozy w klasie skrobi<sup='xref'>18. Skrawki barwione barwnikiem I2KI wykazują odpowiedni kontrast między skrobią a tkanką tła, co pozwala na jednoznaczne wykrycie skrobi i późniejszą kwantyfikację przez system analizy obrazu19. Chociaż barwnik ten nie jest stechiometryczny, akumulacja jodu jest proporcjonalna do długości cząsteczki skrobi, która może się bardzo różnić17. W związku z tym rozmiar zabarwionego obszaru wyrażony jako liczba pikseli może nie odzwierciedlać dokładnie zawartości skrobi, ponieważ można stwierdzić duże różnice w zawartości skrobi między polami z barwionymi obszarami o podobnej wielkości. Alternatywnie, zawartość skrobi można ocenić, mierząc gęstość optyczną barwionych granulek na czarno-białych obrazach uzyskanych z mikroskopu, tak jak to opisano w różnych tkankach w apricot8,13,19, avocado10,20 i Olive21.
Tutaj opisujemy metodologię, która łączy eksperymentalne określanie stanu spoczynku z ilościowym oznaczaniem zawartości skrobi w tkance zawiązka jajnika od jesieni do wiosny u czereśni, oferując nowe narzędzie do zrozumienia i przewidywania spoczynku w oparciu o badanie biologicznych mechanizmów związanych ze spoczynkiem.

<table><tbody><tr><td>Skala precyzyjna</td><td>Sartorius</td><td>CP225D</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ-16</td><td></td></tr><tr><td>Piec suszący</td><td>Memmert</td><td>U15</td><td></td></tr><tr><td>Stacja zatapiania parafiny</td><td>Leica Microsystems</td><td>EG1140H</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom rotacyjny</td><td>Reichert-Jung</td><td>1130/Biocut</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze mikrotomu</td><td>Feather</td><td>S35</td><td>Stal nierdzewna</td></tr><tr><td>Mikroskop jasnego pola</td><td>Aparat cyfrowy Leica Microsystems</td><td>DM2500</td><td></td></tr><tr><td>System</td> analizy obrazu <td>Leica Microsystems</td><td>DC-300</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Quantiment Q550</td><td></td></tr></tbody></table>

połączenie barwienia histochemicznego i analizy obrazu w celu ilościowego określenia skrobi w zawiązkach jajników czereśni podczas spoczynku zimowego

Combining Histochemical Staining and Image Analysis to Quantify Starch in the Ovary Primordia of Sweet Cherry during Winter Dormancy

Zmiany w skrobi w małych strukturach są związane z kluczowymi wydarzeniami podczas kilku procesów rozwojowych roślin, w tym fazy reprodukcyjnej od zapylenia do zapłodnienia i początku owocowania. Jednak różnice w skrobi podczas różnicowania kwiatów nie są w pełni znane, głównie ze względu na trudności w ilościowym określeniu zawartości skrobi w szczególnie małych strukturach zawiązków kwiatowych. W tym miejscu opisano metodę oznaczania ilościowego zawartości skrobi w zawiązkach jajników czereśni (Prunus avium L.) za pomocą systemu analizy obrazu dołączonego do mikroskopu, który umożliwia powiązanie zmian zawartości skrobi z różnymi fazami spoczynku od jesieni do wiosny. W tym celu stan spoczynku pąków kwiatowych określa się poprzez ocenę wzrostu pąków pędów przeniesionych do kontrolowanych warunków w różnych momentach zimy. W celu ilościowego określenia skrobi w zawiązkach jajnika pąki kwiatowe są kolejno zbierane, utrwalane, zatapiane w wosku parafinowym, cięte i barwione I2Kl (jodek potasu-jodek). Preparaty są obserwowane pod mikroskopem i analizowane przez analizator obrazu, który wyraźnie odróżnia skrobię od tła. Wartości zawartości skrobi uzyskuje się poprzez pomiar gęstości optycznej obrazu, która odpowiada barwionej skrobi, biorąc pod uwagę sumę gęstości optycznej każdego piksela jako oszacowanie zawartości skrobi w badanej klatce.

Badania nad spoczynkiem wymagają określenia momentu, w którym spełnione zostają wymagania dotyczące chłodzenia. Pomimo braku zmian fenologicznych w warunkach polowych podczas zimy (Rysunek 1A), drzewa wiśni nie odzyskują zdolności do wzrostu w odpowiednich warunkach, dopóki nie spędzą określonego czasu w niskich temperaturach. Regularne przenoszenie pędów do komory z kontrolowanymi warunkami (Rysunek 1B) w okresie zimowym pozwoli...

Przedstawiamy metodologię ilościowego określania zawartości skrobi w zawiązkach jajników u czereśni (Prunus avium L.) podczas spoczynku zimowego za pomocą systemu analizy obrazu w połączeniu z technikami histochemicznymi.

Połączenie barwienia histochemicznego i analizy obrazu w celu ilościowego określenia skrobi w zawiązkach jajników czereśni podczas spoczynku zimowego

Changes in starch in small structures are associated with key events during several plant developmental processes, including the reproductive phase from ...

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące spoczynku roślin drzewiastych, takich jak dlaczego pąki kwiatowe muszą gromadzić zimno zimą, aby prawidłowo kwitnąć. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona ilościowe oznaczanie skrobi w bardzo małych próbkach zawiązków kwiatowych. Takie podejście jest bardzo przydatne do wykrywania fizjologicznej aktywności zawiązka kwiatowego w okresie spoczynku i może być również stosowane do innych gatunków drzew, takich jak morela lub śliwka.Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w uśpiony pąk kwiatowy, można ją również zastosować do innych procesów, takich jak faza reprodukcyjna od zapylenia do początku owocowania. Aby rozpocząć, zbierz pięć pędów z pola. Następnie zważ i utrwal 10 pąków kwiatowych w 10-mililitrowej szklanej probówce z roztworem utrwalającym przez co najmniej 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie wyrzuć utrwalacz i dodaj tyle 75% etanolu, aby pokryć próbki. Uzyskaj trzy pędy o długości od 15 do 30 centymetrów i średnicy pięciu milimetrów z 10 pąkami kwiatowymi każdy. Następnie umieść pędy na nasączonej wodą piance florystycznej w komorze wzrostowej.Po 10 dniach w komorze wzrostowej usuń pąki kwiatowe z pędów i zważ je. Co tydzień od początku jesieni do pęknięcia pąków wiosną oceniaj wzrost pąków kwiatowych. Usuń zewnętrzne łuski pąków z każdej próbki, a następnie umieść każdy pączek w szkiełku zegarmistrzowskim zawierającym 75% etanolu.Użyj precyzyjnych kleszczy i skalpela okulistycznego, aby wyciąć pąki i uzyskać co najmniej jeden zawiązek kwiatowy z każdego pąka. Zanurz próbki pojedynczo w wosku parafinowym, aby utworzyć blok i pokrój je na obrotowym mikrotomie. Po podziale próbek na sekcje nanieś kroplę świeżego jodu Lugola na wycinek.Po pięciu minutach usuń nadmiar plamy bibułą. Następnie nałóż niewielką kroplę syntetycznego podłoża montażowego, umieść małą szklankę nakrywkową na próbce i mocno dociśnij. Po wyschnięciu nośnika montażowego obserwuj zabarwiony fragment pod mikroskopem jasnego pola.Najpierw wyreguluj przysłonę, przysłonę i regulację jasności zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie upewnij się, że w uchwycie filtra nie ma filtrów i wybierz stan jasnego pola w mikroskopie. Następnie dostosuj ustawienia aparatu dla barwionego preparatu bez chusteczek.Ustaw jasność na 50%Następnie, aktywuj funkcję prześwietlenia/niedoświetlenia i dostosuj czas ekspozycji na granicy prześwietlenia. Zastosuj funkcję balansu bieli i korekcję cieniowania. Zmierz poziom szarości uzyskanego czarno-białego obrazu barwionego preparatu bez tkanki.Następnie nałóż filtr 4N, uzyskaj kolejny czarno-biały obraz preparatu i zmierz poziom szarości. Następnie uzyskaj obraz tego samego preparatu bez światła i zmierz poziom szarości wynikowego obrazu i skalibruj. Następnie należy uzyskać kolorowy obraz przykładowego przekroju w formacie TIFF o rozdzielczości co najmniej 300 dpi.Utwórz obraz binarny odpowiadający zabarwionemu obszarowi, a następnie ustaw trzy progi kolorów, aż obraz binarny dokładnie odzwierciedli barwione granulki skrobi. Powtórz ten proces z innymi preparatami i tkankami, aby dostroić końcowe poziomy wykrywania. Korzystając z systemu analizy obrazu, zmierz sumę gęstości optycznej każdego piksela pod maską, aby określić ilościowo zawartość skrobi w terenie.W tym protokole wzrost pąków kwiatowych i stan spoczynku oceniano, mierząc wzrost masy pąków po 10 dniach w odpowiednich warunkach. W okresie spoczynku nie zaobserwowano żadnych zmian po 10 dniach w odpowiednich warunkach. Po przezwyciężeniu spoczynku pąki pęczniały i pękały w komorze wzrostu.Zawartość skrobi w zawiązkach jajnika określono ilościowo za pomocą analizy obrazu w każdym mikrotomowym sekcie. Konsekwentnie, ilość skrobi wczesną zimą wykazywała wartość gęstości optycznej mniejszą niż 40 000, a maksymalna ilość osiągała wartość między 120 000 a 140 000 w obu latach badania. Biorąc pod uwagę spoczynek, maksymalna ilość skrobi występowała równocześnie z chłodnym wypełnieniem w obu latach.Należy pamiętać, że poziomy detekcji używane przez analizator obrazu są bezpośrednio zależne od kalibracji systemu. Obejmuje to warunki oświetleniowe, intensywność barwienia i powiększenie mikroskopu. Warunek ten musi być ustalony dla wszystkich preparatów.Połączenie technik histochemicznych z analizą obrazu okazało się bardzo przydatne do zbadania rezerwy węglowodanów w zawiązkach kwiatowych w różnych fazach spoczynku. Może być również stosowany do innych gatunków i tkanek. Związek między uwalnianiem w stanie spoczynku a akumulacją skrobi w zawiązkach jajników, ujawniony przy użyciu tej metody, stanowi solidną podstawę do zrozumienia biologicznych podstaw wymagań dotyczących spoczynku i chłodzenia.Przyszłe wysiłki muszą skupić się na badaniu wiarygodnych wskaźników biologicznych, które mogłyby łatwo wskazać stan spoczynku drzewa. Tymczasem wzorzec zmian skrobi w okresie spoczynku może być wykorzystany do dalszych badań fizjologicznych i genetycznych.

combining-histochemical-staining-image-analysis-to-quantify-starch

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Skład ściany komórkowej rośliny różni się w zależności od typu tkanki i może zawierać ligninę, celulozę, hemicelulozy i pektyny. Opracowano różne techniki barwienia w celu wizualizacji różnic na poziomie typu komórki. Niniejszy artykuł jest kompilacją powszechnie stosowanych technik barwienia ścian komórkowych.

Barwienie histochemiczne drugorzędowych elementów ściany komórkowej Arabidopsis thaliana

Zapewniamy tutaj skuteczny i niezawodny protokół barwienia immunologicznego, fluorescencji hybrydyzacji in situ, barwienia DNA, a następnie ilościowego obrazowania w wysokiej rozdzielczości w zalążkach Arabidopsis thaliana. Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej.

Skuteczna metoda ilościowej, jednokomórkowej analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej w zalążkach z całą górą u Arabidopsis

Przedstawiono protokół barwienia immunologicznego na zarodkach mszyc, w którym omówiono krytyczne warunki zmniejszania barwienia tła i zwiększania przepuszczalności tkanek. Warunki te zostały specjalnie opracowane do skutecznego wykrywania ekspresji białek w tkankach embrionalnych mszyc.

Identyfikacja warunków krytycznych dla barwienia immunologicznego w zarodkach mszyc grochowych: zwiększenie przepuszczalności tkanek i zmniejszenie barwienia tła

Udostępniamy protokół obrazowania wewnątrzkomórkowego pH linii nabłonkowych komórek macierzystych w żywej tkance jajnika Drosophila. Opisujemy metody generowania transgenicznych muszek wykazujących ekspresję biosensora pH, mCherry::p Hluorin, obrazowania biosensora za pomocą ilościowego obrazowania fluorescencyjnego, generowania krzywych standardowych i konwersji wartości intensywności fluorescencji na wartości pH.

Metody obrazowania wewnątrzkomórkowego pH linii komórek macierzystych pęcherzyka w żywej tkance jajnika Drosophila

W tym protokole opisujemy techniki prawidłowego preparowania kwiatów i krzemionek Arabidopsis, niektóre podstawowe techniki oczyszczania oraz wybrane procedury barwienia dla obserwacji struktur rozrodczych na całej powierzchni.

Całościowe oczyszczanie i barwienie organów kwiatowych Arabidopsis i krzemianek

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego oznaczania pęcherzyków w hodowanych jajnikach młodych myszy bez seryjnego cięcia. Stosując immunofluorescencję całego narządu i oczyszczanie tkanek, cięcie fizyczne zastępuje się cięciem optycznym. Ta metoda przygotowania i wizualizacji próbek utrzymuje integralność narządów i ułatwia automatyczną ocenę ilościową określonych komórek.

Immunofluorescencja całej góry i kwantyfikacja pęcherzyków w hodowanych jajnikach myszy

Ta technika pozwala na szybkie i proste przygotowanie sekcji żywicy o rozmiarach całych nasion do obserwacji i analizy komórek, granulek skrobi i ciał białkowych w różnych regionach nasion.

Prosta metoda cięcia na sucho w celu uzyskania całego przekroju żywicy wielkości nasion i jej zastosowania

Izolowane protoplasty komórek miazgi jabłkowej zostały załadowane odczynnikiem fluorescencyjnym wapnia w celu wykrycia cytoplazmatycznego stężenia Ca2+.

Barwienie cytoplazmatycznego Ca2+ Fluo-4/AM w miazgi jabłkowej

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół obrazowania całych jajników do analiz ilościowych i jakościowych przy użyciu barwienia immunologicznego z całą mocą, mikroskopii wielofotonowej oraz wizualizacji i analizy 3D. Protokół ten umożliwia wysokowydajne, niezawodne i powtarzalne przetwarzanie, które ma zastosowanie w toksykologii, diagnostyce klinicznej i testach genomowych funkcji jajników.

Immunofluorescencja, oczyszczanie i mikroskopia wielofotonowa całego jajnika do ilościowej analizy 3D rozwijającej się rezerwy jajnikowej u myszy

Ten protokół ma na celu dostarczenie szczegółowych procedur zbierania, utrwalania i utrzymywania próbek roślin mykoheterotroficznych, stosując różne techniki mikroskopowe, takie jak skaningowa i transmisyjna mikroskopia elektronowa, mikroskopia świetlna, konfokalna i fluorescencyjna do badania kolonizacji grzybów w tkankach roślinnych i nasionach kiełkujących z grzybami mikoryzowymi.

Techniki mikroskopowe interpretacji kolonizacji grzybów w tkankach roślin mykoheterotroficznych i symbiotycznego kiełkowania nasion

Ten artykuł opisuje dwie metody fenotypowania bez użycia peelingów naskórka do scharakteryzowania genów kontrolujących rozwój aparatów szparkowych. Pierwsza metoda pokazuje, jak analizować fenotyp aparatów szparkowych przy użyciu naskórka roślinnego barwionego błękitem O-toluidyny. Druga metoda opisuje, w jaki sposób identyfikować ligandy szparkowe i monitorować ich aktywność biologiczną.

Identyfikacja genów zaangażowanych w rozwój aparatów szparkowych poprzez ocenę fenotypu naskórka

Poznaj metodę ilościowego oznaczania skrobi w zawiązkach kwiatowych czereśni podczas spoczynku zimowego. Połączenie barwienia histochemicznego z analizą obrazu pozwala badać aktywność fizjologiczną roślin drzewiastych.

Połączenie barwienia histochemicznego i analizy obrazu w celu ilościowego określenia skrobi w zawiązkach jajników czereśni podczas spoczynku zimowego (Wideo) | JoVE Journal

Połączenie barwienia histochemicznego i analizy obrazu w celu ilościowego określenia skrobi w zawiązkach jajników czereśni podczas spoczynku zimowego

Przeglądaj więcej filmów