Połączenie barwienia histochemicznego i analizy obrazu w celu ilościowego określenia skrobi w zawiązkach jajników czereśni podczas spoczynku zimowego

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące spoczynku roślin drzewiastych, takich jak dlaczego pąki kwiatowe muszą gromadzić zimno zimą, aby prawidłowo kwitnąć. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona ilościowe oznaczanie skrobi w bardzo małych próbkach zawiązków kwiatowych. Takie podejście jest bardzo przydatne do wykrywania fizjologicznej aktywności zawiązka kwiatowego w okresie spoczynku i może być również stosowane do innych gatunków drzew, takich jak morela lub śliwka.

Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w uśpiony pąk kwiatowy, można ją również zastosować do innych procesów, takich jak faza reprodukcyjna od zapylenia do początku owocowania. Aby rozpocząć, zbierz pięć pędów z pola. Następnie zważ i utrwal 10 pąków kwiatowych w 10-mililitrowej szklanej probówce z roztworem utrwalającym przez co najmniej 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie wyrzuć utrwalacz i dodaj tyle 75% etanolu, aby pokryć próbki. Uzyskaj trzy pędy o długości od 15 do 30 centymetrów i średnicy pięciu milimetrów z 10 pąkami kwiatowymi każdy. Następnie umieść pędy na nasączonej wodą piance florystycznej w komorze wzrostowej.

Po 10 dniach w komorze wzrostowej usuń pąki kwiatowe z pędów i zważ je. Co tydzień od początku jesieni do pęknięcia pąków wiosną oceniaj wzrost pąków kwiatowych. Usuń zewnętrzne łuski pąków z każdej próbki, a następnie umieść każdy pączek w szkiełku zegarmistrzowskim zawierającym 75% etanolu.

Użyj precyzyjnych kleszczy i skalpela okulistycznego, aby wyciąć pąki i uzyskać co najmniej jeden zawiązek kwiatowy z każdego pąka. Zanurz próbki pojedynczo w wosku parafinowym, aby utworzyć blok i pokrój je na obrotowym mikrotomie. Po podziale próbek na sekcje nanieś kroplę świeżego jodu Lugola na wycinek.

Po pięciu minutach usuń nadmiar plamy bibułą. Następnie nałóż niewielką kroplę syntetycznego podłoża montażowego, umieść małą szklankę nakrywkową na próbce i mocno dociśnij. Po wyschnięciu nośnika montażowego obserwuj zabarwiony fragment pod mikroskopem jasnego pola.

Najpierw wyreguluj przysłonę, przysłonę i regulację jasności zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie upewnij się, że w uchwycie filtra nie ma filtrów i wybierz stan jasnego pola w mikroskopie. Następnie dostosuj ustawienia aparatu dla barwionego preparatu bez chusteczek.

Ustaw jasność na 50%Następnie, aktywuj funkcję prześwietlenia/niedoświetlenia i dostosuj czas ekspozycji na granicy prześwietlenia. Zastosuj funkcję balansu bieli i korekcję cieniowania. Zmierz poziom szarości uzyskanego czarno-białego obrazu barwionego preparatu bez tkanki.

Następnie nałóż filtr 4N, uzyskaj kolejny czarno-biały obraz preparatu i zmierz poziom szarości. Następnie uzyskaj obraz tego samego preparatu bez światła i zmierz poziom szarości wynikowego obrazu i skalibruj. Następnie należy uzyskać kolorowy obraz przykładowego przekroju w formacie TIFF o rozdzielczości co najmniej 300 dpi.

Utwórz obraz binarny odpowiadający zabarwionemu obszarowi, a następnie ustaw trzy progi kolorów, aż obraz binarny dokładnie odzwierciedli barwione granulki skrobi. Powtórz ten proces z innymi preparatami i tkankami, aby dostroić końcowe poziomy wykrywania. Korzystając z systemu analizy obrazu, zmierz sumę gęstości optycznej każdego piksela pod maską, aby określić ilościowo zawartość skrobi w terenie.

W tym protokole wzrost pąków kwiatowych i stan spoczynku oceniano, mierząc wzrost masy pąków po 10 dniach w odpowiednich warunkach. W okresie spoczynku nie zaobserwowano żadnych zmian po 10 dniach w odpowiednich warunkach. Po przezwyciężeniu spoczynku pąki pęczniały i pękały w komorze wzrostu.

Zawartość skrobi w zawiązkach jajnika określono ilościowo za pomocą analizy obrazu w każdym mikrotomowym sekcie. Konsekwentnie, ilość skrobi wczesną zimą wykazywała wartość gęstości optycznej mniejszą niż 40 000, a maksymalna ilość osiągała wartość między 120 000 a 140 000 w obu latach badania. Biorąc pod uwagę spoczynek, maksymalna ilość skrobi występowała równocześnie z chłodnym wypełnieniem w obu latach.

Należy pamiętać, że poziomy detekcji używane przez analizator obrazu są bezpośrednio zależne od kalibracji systemu. Obejmuje to warunki oświetleniowe, intensywność barwienia i powiększenie mikroskopu. Warunek ten musi być ustalony dla wszystkich preparatów.

Połączenie technik histochemicznych z analizą obrazu okazało się bardzo przydatne do zbadania rezerwy węglowodanów w zawiązkach kwiatowych w różnych fazach spoczynku. Może być również stosowany do innych gatunków i tkanek. Związek między uwalnianiem w stanie spoczynku a akumulacją skrobi w zawiązkach jajników, ujawniony przy użyciu tej metody, stanowi solidną podstawę do zrozumienia biologicznych podstaw wymagań dotyczących spoczynku i chłodzenia.

Przyszłe wysiłki muszą skupić się na badaniu wiarygodnych wskaźników biologicznych, które mogłyby łatwo wskazać stan spoczynku drzewa. Tymczasem wzorzec zmian skrobi w okresie spoczynku może być wykorzystany do dalszych badań fizjologicznych i genetycznych.