Biokompatybilne kopolimery blokowe funkcjonalizowane metioniną do celowanego dostarczania plazmidowego DNA
6 sierpnia 2019
Ta praca przedstawia przygotowanie biokompatybilnych kopolimerów blokowych (mBG) funkcjonalizowanych metioniną metodą odwracalnego transferu łańcucha addycyjno-fragmentacyjnego (RAFT). Zbadano również zdolność do kompleksowania plazmidowego DNA otrzymanych mBG oraz skuteczność ich transfekcji. Metoda RAFT jest bardzo korzystna w przypadku polimeryzacji monomerów zawierających specjalne grupy funkcyjne.
Kationowe polimerowe nośniki leków mają zalety dobrej stabilności, niskiej immunogenności oraz łatwego przygotowania i modyfikacji. Tutaj oferujemy szybką i prostą metodę jego syntezy. Metoda odwracalnej polimeryzacji z przeniesieniem łańcucha addycyjno-fragmentacyjnego jest metodą mającą zastosowanie do otrzymywania polimerów blokowych o kontrolowanej masie cząsteczkowej i strukturze oraz przenoszących grupy funkcyjne.
Ci przewoźnicy leków mogą jednocześnie przenosić różne leki, aby osiągnąć wspólne leczenie raka, stanów zapalnych i innych chorób. Polimeryzacja IFT jest metodą klasyczną, a niniejszy protokół daje przykład jej zastosowania w terapii genowej. Kluczem do sukcesu syntezy tego polimeru jest precyzyjna kontrola temperatury reakcji.
Bardziej wskazane jest stosowanie kąpieli olejowej niż wodnej. Aby rozpocząć tę procedurę, należy zaopatrzyć się w kolbę okrągłodenną z gumowym korkiem i mieszadłem magnetycznym, które będzie używane jako butelka do polimeryzacji. Rozpuść 1,87 grama bis-hydroksy HEMA w jednym mililitrze wody destylowanej w butelce do polimeryzacji.
W pięciomililitrowej zlewce rozpuść 0,03 grama CTP i 0,02 grama ACVA w 0,5 mililitra 1,4-dioksanu. Dodaj tę mieszaninę do butelki do polimeryzacji. Następnie użyj syfonu kondensatu, aby zamrozić roztwór w butelce do polimeryzacji.
Przymocuj butelkę do żelaznego wspornika i użyj przewodu potykającego się igłą, aby odkurzyć i wstrzyknąć azot do mieszaniny reakcyjnej. Następnie zamknij butelkę do polimeryzacji i rozmrażaj roztwór w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Powtórz ten cykl zamrażania-pompy-rozmrażania trzy razy.
Następnie umieść butelkę w kąpieli olejowej w temperaturze 70 stopni Celsjusza i pozwól roztworowi reagować przez 24 godziny w atmosferze azotu. Następnego dnia schłodź butelkę do polimeryzacji w temperaturze zero stopni Celsjusza i otwórz gumowy korek, aby zakończyć reakcję polimeryzacji. Następnie schłodzić aceton w lodówce w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez dwie godziny i wymieszać go z roztworem reakcyjnym w butelce do polimeryzacji w stosunku 50 do jednego.
Odwirować tę mieszaninę przy 8 200 g przez 10 minut, aby usunąć aceton i zebrać osad. Aby oczyścić zsyntetyzowany poli bis-hydroksy HEMA, należy rozpuścić zebrany osad w dwóch mililitrach czystej wody. Następnie wymieszaj go ze 100 mililitrami wstępnie schłodzonego acetonu w stosunku od jednego do 50.
Odwirować roztwór o stężeniu 8, 200 razy g przez 10 minut, aby zebrać osad. Powtórz ten proces oczyszczania polegający na rozpuszczaniu, mieszaniu i odwirowaniu osadu trzy razy. Najpierw rozpuść 0,96 grama APMA i 0,93 grama oczyszczonego poli bis-hydroksy HEMA w pięciu mililitrach wody destylowanej w 10-mililitrowej zlewce.
Rozpuść 0,01 grama ACVA w 0,5 mililitra 1,4-dioksanu i dodaj go do roztworu APMA i poli bis-hydroksy HEMA. Przenieś tę mieszaninę do butelki do polimeryzacji i przewietrz suchym azotem przez godzinę. Następnie umieść butelkę polimeryzacyjną w kąpieli olejowej w temperaturze 70 stopni Celsjusza i pozwól jej reagować przez 24 godziny w atmosferze azotu.
Następnego dnia schłodź butelkę polimeryzacyjną w temperaturze zero stopni Celsjusza i otwórz gumowy korek, aby zakończyć roztwór procesu polimeryzacji. Na początek zasiaj komórki MCF-7 w dołkach sześciodołkowej płytki o gęstości 20 000 komórek na dołek. Hoduj komórki w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 12 godzin.
Następnie zastąp pożywkę hodowlaną świeżą pożywką zawierającą polimer kationowy i polipleksy pDNA o różnym stosunku stosunku azotu do fosforu. Hoduj komórki przez sześć godzin, a następnie zastąp pożywkę dwoma mililitrami świeżej pożywki RPMI 1640. Kontynuuj hodowlę przez 48 godzin.
Następnie zbierz komórki i użyj cytometru przepływowego, aby wykryć zieloną fluorescencję. W niniejszej pracy biokompatybilne kopolimery blokowe funkcjonalizowane metioniną są przygotowywane metodą odwracalnego transferu łańcucha addycyjno-fragmentacyjnego, a następnie badana jest zdolność do kompleksowania plazmidowego DNA otrzymanego mBG i ich skuteczność transfekcji. Średnia wielkość cząstek i potencjał zeta polipleksów mBG / pDNA wynoszą odpowiednio 124 nanometry i plus 15,7 miliwoltów przy stosunku N-do-P wynoszącym 16.
Opóźnienie elektroforetyczne ujawnia, że pDNA o stosunku N-do-P równym zero może poruszać się bez ograniczeń w żelu agarozowym i jest obserwowane jako pasek w obrazie żelowym. Kiedy pDNA jest skompleksowane z mBG, ruch pDNA jest opóźniony, a następnie jasność pasma jest zmniejszona. To pokazuje, że mBG może całkowicie skompleksować pDNA, gdy N do P jest wyższe niż cztery.
Cytotoksyczność polipleksów mBG / pDNA jest następnie mierzona za pomocą standardowego testu MTT Wyniki te pokazują, że polipleksy mBG / pDNA mają cytotoksyczność niż polipleksy PEI / pDNA przy proporcjach N-do-P czterech, ośmiu, 16 i 32. Jak można również zauważyć, cytotoksyczność polipleksów mBG/pDNA wzrasta wraz ze wzrostem stosunku N-do-P. Ta zwiększona cytotoksyczność jest wynikiem dodatnio naładowanego składnika GPMA.
Stosunek N-do-P stosowany w eksperymencie transfekcji pDNA jest dobierany zgodnie z wynikami cytotoksyczności. Zdolności transfekcyjne mBG1, mBG2 i mBG3 porównano poprzez pomiar intensywności fluorescencji GFP, a wyniki wykazały, że mBG3 jest optymalnym nośnikiem genu. Ważne jest, aby wyprowadzić powietrze z kolby okrągłodennej mułu i utrzymać temperaturę reakcji.
Otrzymane polimerowe nośniki leków mogą być stosowane do jednoczesnego dostarczania leków stosowanych w chemioterapii i leków genowych w celu synergicznego leczenia nowotworów lekoopornych. Molekularny mechanizm łączenia leków genowych i chemioterapeutyków może być dalej badany w leczeniu nowotworów lekoopornych. Aceton jest oceniany jako mało toksyczny ze względu na swoją ostrą toksyczność.
Należy unikać kluczy, wdychania oraz kontaktu z oczami lub skórą. Unikać ryzyka poparzenia podczas procedury podgrzewania.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia szybką i prostą metodę syntezy kationowych polimerowych nośników leków z wykorzystaniem metody polimeryzacji z odwracalnym przeniesieniem łańcucha z fragmentacją (RAFT). Zsyntetyzowane, funkcjonalizowane metioniną biozgodne kopolimery blokowe (mBG) poddano ocenie pod kątem zdolności do tworzenia kompleksów z plazmidowym DNA oraz ich wydajności transfekcji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Chemia polimerów
- Terapia genowa
- Systemy dostarczania leków
Wstęp
- Kationowe polimerowe nośniki leków zapewniają stabilność i niską immunogenność.
- Polimeryzacja RAFT pozwala na kontrolowanie masy cząsteczkowej i struktury.
- Nośniki te mogą transportować wiele leków w celu zastosowania terapii skojarzonej.
- Precyzyjna kontrola temperatury reakcji jest kluczowa dla sukcesu syntezy.
Cel badania
- Opracowanie metody syntezy biokompatybilnych kopolimerów blokowych.
- Zbadanie zdolności syntetyzowanych polimerów do tworzenia kompleksów z DNA.
- Ocena wydajności transfekcji nośników leków.
Zastosowane metody
- Polimeryzacja z odwracalnym przeniesieniem łańcucha (RAFT).
- Synteza blokowych kopolimerów funkcjonalizowanych metioniną.
- Ocena zdolności do tworzenia kompleksów z plazmidowym DNA.
- Ocena wydajności transfekcji.
Główne wyniki
- Zsyntetyzowany mBG wykazał skuteczne kompleksowanie plazmidowego DNA.
- Pomyślnie oceniono wydajność transfekcji.
- Polimeryzacja RAFT okazała się korzystna dla syntezy funkcjonalizowanych polimerów.
- Metoda ta umożliwia jednoczesne dostarczanie wielu leków.
Wnioski
- W badaniu pomyślnie opracowano metodę syntezy mBG.
- Te biokompatybilne polimery wykazują potencjał w zastosowaniach w terapii genowej.
- Dalsze badania mogłyby zwiększyć ich skuteczność w dostarczaniu leków.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Niniejsza praca przedstawia metodę syntezy biozgodnych kopolimerów blokowych funkcjonalizowanych metioniną w oparciu o polimeryzację RAFT, zdolnych do kompleksowania plazmidowego DNA, co stanowi regulowaną platformę do opracowywania wektorów dostarczania genów. Możliwość kontroli masy cząsteczkowej, stosunku ładunków oraz wielkości cząstek umożliwia projektowanie nienowirusowych nośników o przewidywalnych właściwościach i zredukowanej cytotoksyczności w porównaniu do PEI, co wspiera wczesny etap ograniczania ryzyka w rozwoju terapii kwasami nukleinowymi. Systemy te odpowiadają na zapotrzebowanie na skalowalną i powtarzalną syntezę polimerów w przedklinicznych procesach badawczych, w których przejrzystość mechanistyczna i spójność formulacji wpływają na decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie oddziaływań polimer-DNA poprzez mierzalną kompleksację przy określonych stosunkach N/P, co wspiera walidację celu poprzez kontrolowaną dostawę genów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalną drogę syntezy kationowych kopolimerów blokowych z regulowaną funkcjonalizacją metioninową i guanidynową, co zmniejsza zmienność w badaniach screeningowych na wczesnym etapie.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na wytworzenie dobrze zdefiniowanych polipleksów o mierzalnym potencjale zeta (+15,7 mV przy N/P 16) i rozmiarze (124 nm), co umożliwia standaryzowaną ocenę wydajności transfekcji i cytotoksyczności.
- Wartość operacyjna: Ułatwia wysokoprzepustowy screening wariantów polimerów (mBG1, mBG2, mBG3) poprzez powiązanie zawartości APMA (21%, 37%, 52%) z wynikami funkcjonalnymi w testach transferu genów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wykazuje całkowite opóźnienie migracji plazmidowego DNA przy N/P >4, co wskazuje na niezawodną ochronę ładunku – kluczowy parametr przedkliniczny dla stabilności wektora.
- Wartość operacyjna: Umożliwia przesiewową analizę formulacji dla różnych stosunków N/P (8, 16, 4) w celu zidentyfikowania optymalnych warunków transfekcji przy jednoczesnym monitorowaniu trendów cytotoksyczności powiązanych z zawartością GPMA.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając syntezę określonych nośników genów w celu identyfikacji wiodących kandydatów do dostarczania kwasów nukleinowych, gdzie zależności między strukturą a funkcją polimerów determinują decyzje o dalszym rozwoju.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących polimerowo zapośredniczonej dostawy genów, dostarczając mierzalnych wyników (rozmiar cząsteczek, potencjał zeta, wydajność transfekcji) w celu skorelowania struktury z aktywnością biologiczną.
- Przesiewanie: Umożliwia produkcję poliplexów gotowych do analizy o spójnym rozmiarze (100–200 nm przy N/P 16–32) i ładunku powierzchniowym, co poprawia powtarzalność w kampaniach oceny związków.
- Analityka: Generuje mierzalne odczyty biofizyczne (stosunek N/P, potencjał zeta, opóźnienie elektroforetyczne), które pozwalają na analizę porównawczą wariantów polimerów w ustandaryzowanych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy projektowanie polimerów z istotnością przedkliniczną poprzez wykazaną kompleksację pDNA i zmniejszoną cytotoksyczność w stosunku do PEI, co wspiera postępy w badaniach z uwzględnieniem oceny ryzyka.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy modułową platformę opartą na metodzie RAFT, którą można dostosować do innych funkcjonalnych aminokwasów lub terapii, promując standaryzację syntezy polimerów w różnych projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie wydajności nośników genów poprzez powiązanie projektowania molekularnego (zawartościy metioniny/guanidyny) z wiązaniem DNA i wynikami transfekcji.
- Wartość operacyjna: Dostarcza skalowalny, ułatwiający oczyszczanie protokół syntezy z wykorzystaniem wytrącania acetonem i kontroli RAFT, co poprawia powtarzalność między partiami.
- Wartość strategiczna: Redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach dzięki zaoferowaniu alternatywy dla PEI o niższej cytotoksyczności, co umożliwia lepsze podejmowanie decyzji go/no-go w rozwoju terapeutyków kwasów nukleowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera dostosowaną do ryzyka priorytetyzację wiodących polimerów (np. mBG3 jako optymalnego nośnika) w oparciu o wydajność transfekcji i profile bezpieczeństwa.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu polimeryzacji RAFT, w tym w zakresie odgazowywania metodą zamrażania-pompowania-odmrażania oraz pracy w atmosferze obojętnej.
- Powtarzalna synteza kopolimeru blokowego zależy od precyzyjnej kontroli temperatury (łaźnia olejowa w 70°C) oraz zastosowania specjalistycznych odczynników (ACVA, CTP).
- Niezbędna jest infrastruktura analityczna do przeprowadzania pomiarów GPC, potencjału zeta, wielkości cząsteczek oraz testów transfekcji opartych na fluorescencji w celu oceny wydajności polipleksów.
- Adaptacja do innych linii komórkowych lub ładunków może wymagać ponownej optymalizacji stosunku N/P oraz oceny cytotoksyczności ze względu na zmienne efekty pośredniczone przez GPMA.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność wieloetapowego oczyszczania oraz wrażliwość na tlen podczas polimeryzacji, co musi być niwelowane poprzez rygorystyczne protokoły odgazowywania.
