Biokompatybilne kopolimery blokowe funkcjonalizowane metioniną do celowanego dostarczania plazmidowego DNA
6 sierpnia 2019
Ta praca przedstawia przygotowanie biokompatybilnych kopolimerów blokowych (mBG) funkcjonalizowanych metioniną metodą odwracalnego transferu łańcucha addycyjno-fragmentacyjnego (RAFT). Zbadano również zdolność do kompleksowania plazmidowego DNA otrzymanych mBG oraz skuteczność ich transfekcji. Metoda RAFT jest bardzo korzystna w przypadku polimeryzacji monomerów zawierających specjalne grupy funkcyjne.
Kationowe polimerowe nośniki leków mają zalety dobrej stabilności, niskiej immunogenności oraz łatwego przygotowania i modyfikacji. Tutaj oferujemy szybką i prostą metodę jego syntezy. Metoda odwracalnej polimeryzacji z przeniesieniem łańcucha addycyjno-fragmentacyjnego jest metodą mającą zastosowanie do otrzymywania polimerów blokowych o kontrolowanej masie cząsteczkowej i strukturze oraz przenoszących grupy funkcyjne.
Ci przewoźnicy leków mogą jednocześnie przenosić różne leki, aby osiągnąć wspólne leczenie raka, stanów zapalnych i innych chorób. Polimeryzacja IFT jest metodą klasyczną, a niniejszy protokół daje przykład jej zastosowania w terapii genowej. Kluczem do sukcesu syntezy tego polimeru jest precyzyjna kontrola temperatury reakcji.
Bardziej wskazane jest stosowanie kąpieli olejowej niż wodnej. Aby rozpocząć tę procedurę, należy zaopatrzyć się w kolbę okrągłodenną z gumowym korkiem i mieszadłem magnetycznym, które będzie używane jako butelka do polimeryzacji. Rozpuść 1,87 grama bis-hydroksy HEMA w jednym mililitrze wody destylowanej w butelce do polimeryzacji.
W pięciomililitrowej zlewce rozpuść 0,03 grama CTP i 0,02 grama ACVA w 0,5 mililitra 1,4-dioksanu. Dodaj tę mieszaninę do butelki do polimeryzacji. Następnie użyj syfonu kondensatu, aby zamrozić roztwór w butelce do polimeryzacji.
Przymocuj butelkę do żelaznego wspornika i użyj przewodu potykającego się igłą, aby odkurzyć i wstrzyknąć azot do mieszaniny reakcyjnej. Następnie zamknij butelkę do polimeryzacji i rozmrażaj roztwór w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Powtórz ten cykl zamrażania-pompy-rozmrażania trzy razy.
Następnie umieść butelkę w kąpieli olejowej w temperaturze 70 stopni Celsjusza i pozwól roztworowi reagować przez 24 godziny w atmosferze azotu. Następnego dnia schłodź butelkę do polimeryzacji w temperaturze zero stopni Celsjusza i otwórz gumowy korek, aby zakończyć reakcję polimeryzacji. Następnie schłodzić aceton w lodówce w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez dwie godziny i wymieszać go z roztworem reakcyjnym w butelce do polimeryzacji w stosunku 50 do jednego.
Odwirować tę mieszaninę przy 8 200 g przez 10 minut, aby usunąć aceton i zebrać osad. Aby oczyścić zsyntetyzowany poli bis-hydroksy HEMA, należy rozpuścić zebrany osad w dwóch mililitrach czystej wody. Następnie wymieszaj go ze 100 mililitrami wstępnie schłodzonego acetonu w stosunku od jednego do 50.
Odwirować roztwór o stężeniu 8, 200 razy g przez 10 minut, aby zebrać osad. Powtórz ten proces oczyszczania polegający na rozpuszczaniu, mieszaniu i odwirowaniu osadu trzy razy. Najpierw rozpuść 0,96 grama APMA i 0,93 grama oczyszczonego poli bis-hydroksy HEMA w pięciu mililitrach wody destylowanej w 10-mililitrowej zlewce.
Rozpuść 0,01 grama ACVA w 0,5 mililitra 1,4-dioksanu i dodaj go do roztworu APMA i poli bis-hydroksy HEMA. Przenieś tę mieszaninę do butelki do polimeryzacji i przewietrz suchym azotem przez godzinę. Następnie umieść butelkę polimeryzacyjną w kąpieli olejowej w temperaturze 70 stopni Celsjusza i pozwól jej reagować przez 24 godziny w atmosferze azotu.
Następnego dnia schłodź butelkę polimeryzacyjną w temperaturze zero stopni Celsjusza i otwórz gumowy korek, aby zakończyć roztwór procesu polimeryzacji. Na początek zasiaj komórki MCF-7 w dołkach sześciodołkowej płytki o gęstości 20 000 komórek na dołek. Hoduj komórki w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 12 godzin.
Następnie zastąp pożywkę hodowlaną świeżą pożywką zawierającą polimer kationowy i polipleksy pDNA o różnym stosunku stosunku azotu do fosforu. Hoduj komórki przez sześć godzin, a następnie zastąp pożywkę dwoma mililitrami świeżej pożywki RPMI 1640. Kontynuuj hodowlę przez 48 godzin.
Następnie zbierz komórki i użyj cytometru przepływowego, aby wykryć zieloną fluorescencję. W niniejszej pracy biokompatybilne kopolimery blokowe funkcjonalizowane metioniną są przygotowywane metodą odwracalnego transferu łańcucha addycyjno-fragmentacyjnego, a następnie badana jest zdolność do kompleksowania plazmidowego DNA otrzymanego mBG i ich skuteczność transfekcji. Średnia wielkość cząstek i potencjał zeta polipleksów mBG / pDNA wynoszą odpowiednio 124 nanometry i plus 15,7 miliwoltów przy stosunku N-do-P wynoszącym 16.
Opóźnienie elektroforetyczne ujawnia, że pDNA o stosunku N-do-P równym zero może poruszać się bez ograniczeń w żelu agarozowym i jest obserwowane jako pasek w obrazie żelowym. Kiedy pDNA jest skompleksowane z mBG, ruch pDNA jest opóźniony, a następnie jasność pasma jest zmniejszona. To pokazuje, że mBG może całkowicie skompleksować pDNA, gdy N do P jest wyższe niż cztery.
Cytotoksyczność polipleksów mBG / pDNA jest następnie mierzona za pomocą standardowego testu MTT Wyniki te pokazują, że polipleksy mBG / pDNA mają cytotoksyczność niż polipleksy PEI / pDNA przy proporcjach N-do-P czterech, ośmiu, 16 i 32. Jak można również zauważyć, cytotoksyczność polipleksów mBG/pDNA wzrasta wraz ze wzrostem stosunku N-do-P. Ta zwiększona cytotoksyczność jest wynikiem dodatnio naładowanego składnika GPMA.
Stosunek N-do-P stosowany w eksperymencie transfekcji pDNA jest dobierany zgodnie z wynikami cytotoksyczności. Zdolności transfekcyjne mBG1, mBG2 i mBG3 porównano poprzez pomiar intensywności fluorescencji GFP, a wyniki wykazały, że mBG3 jest optymalnym nośnikiem genu. Ważne jest, aby wyprowadzić powietrze z kolby okrągłodennej mułu i utrzymać temperaturę reakcji.
Otrzymane polimerowe nośniki leków mogą być stosowane do jednoczesnego dostarczania leków stosowanych w chemioterapii i leków genowych w celu synergicznego leczenia nowotworów lekoopornych. Molekularny mechanizm łączenia leków genowych i chemioterapeutyków może być dalej badany w leczeniu nowotworów lekoopornych. Aceton jest oceniany jako mało toksyczny ze względu na swoją ostrą toksyczność.
Należy unikać kluczy, wdychania oraz kontaktu z oczami lub skórą. Unikać ryzyka poparzenia podczas procedury podgrzewania.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie przedstawia szybki i prosty sposób syntezy kationowych nośników leków polimerowych z wykorzystaniem metody polimeryzacji z odwracalnym transferem łańcucha poprzez dodanie-fragmentację (RAFT). Zsyntetyzowane, funkcjonalizowane metioninową biokompatybilne kopolimery blokowe (mBG) zostały oceniane pod kątem ich zdolności do kompleksowania DNA plazmidowego i wydajności transfekcji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Chemia polimerów
- Genoterapia
- Systemy dostarczania leków
Tło
- Kationowe nośniki leków polimerowych oferują stabilność i niską immunogenność.
- Polimeryzacja RAFT pozwala na kontrolę masy cząsteczkowej i struktury.
- Te nośniki mogą transportować wiele leków do współpracy w leczeniu.
- Precyzyjna kontrola temperatury reakcji jest kluczowa dla udanej syntezy.
Cel badania
- Opracowanie metody syntezy biokompatybilnych kopolimerów blokowych.
- Badanie zdolności do kompleksowania DNA przez zsyntetyzowane polimery.
- Ocenienie wydajności transfekcji nośników leków.
Stosowane metody
- Polimeryzacja z odwracalnym transferem łańcucha poprzez dodanie-fragmentację (RAFT).
- Synteza funkcjonalizowanych metioninem kopolimerów blokowych.
- Ocena zdolności do kompleksowania DNA plazmidowego.
- Ocenienie wydajności transfekcji.
Główne wyniki
- Zsyntetyzowane mBG wykazały efektywne kompleksowanie DNA plazmidowego.
- Wydajność transfekcji została pomyślnie oceniona.
- Polimeryzacja RAFT okazała się przydatna w syntezie funkcjonalizowanego polimeru.
- Metoda umożliwia jednoczesne dostarczanie wielu leków.
Wnioski
- Badanie z powodzeniem opracowane metodę syntezy mBG.
- Te biokompatybilne polimery prezentują obiecujące zastosowania w terapii genowej.
- Dalsze badania mogą poprawić ich efektywność w dostarczaniu leków.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This work presents a RAFT polymerization-based method for synthesizing methionine-functionalized biocompatible block copolymers capable of complexing plasmid DNA, offering a tunable platform for gene delivery vector development. The ability to control molecular weight, charge ratio, and particle size enables predictive design of non-viral carriers with reduced cytotoxicity compared to PEI, supporting early-stage de-risking of nucleic acid therapeutics. Such systems address the need for scalable, reproducible polymer synthesis in preclinical discovery workflows where mechanistic clarity and formulation consistency impact go/no-go decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of polymer-DNA interactions through quantifiable complexation at defined N/P ratios, supporting target validation via controlled gene delivery.
- Operational Value: Provides a reproducible synthesis route for cationic block copolymers with tunable methionine and guanidine functionalization, reducing variability in early screening assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates well-defined polyplexes with measurable zeta potential (+15.7 mV at N/P 16) and size (124 nm), enabling standardized assessment of transfection efficiency and cytotoxicity.
- Operational Value: Facilitates high-throughput screening of polymer variants (mBG1, mBG2, mBG3) by linking APMA content (21%, 37%, 52%) to functional outcomes in gene transfer assays.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates complete plasmid DNA retardation at N/P >4, indicating reliable cargo protection—a key preclinical benchmark for vector stability.
- Operational Value: Supports formulation screening across N/P ratios (8, 16, 4) to identify optimal transfection conditions while monitoring cytotoxicity trends linked to GPMA content.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling synthesis of defined gene carriers for lead identification in nucleic acid delivery, where polymer structure-function relationships inform advancement decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on polymer-mediated gene delivery by providing quantifiable outputs (particle size, zeta potential, transfection efficiency) to correlate structure with biological activity.
- Screening: Enables assay-ready polyplex production with consistent size (100–200 nm at N/P 16–32) and surface charge, improving reproducibility across compound evaluation campaigns.
- Analytics: Generates measurable biophysical readouts (N/P ratio, zeta potential, electrophoretic retardation) that allow comparative analysis of polymer variants under standardized conditions.
- Translational Research: Connects polymer design to preclinical relevance through demonstrated pDNA complexation and reduced cytotoxicity relative to PEI, supporting risk-adjusted advancement.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular RAFT-based platform adaptable to other functional amino acids or therapeutics, promoting cross-project standardization in polymer synthesis.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in gene carrier performance by linking molecular design (methionine/guanidine content) to DNA binding and transfection outcomes.
- Operational Value: Delivers a scalable, purification-friendly synthesis protocol using acetone precipitation and RAFT control, improving batch-to-batch consistency.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by offering a lower-cytotoxicity alternative to PEI, enabling better go/no-go decisions in nucleic acid therapeutic development.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of polymer leads (e.g., mBG3 as optimal carrier) based on transfection efficiency and safety profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RAFT polymerization, including freeze-pump-thaw degassing and inert atmosphere handling.
- Dependent on precise temperature control (oil bath at 70°C) and specialized reagents (ACVA, CTP) for reproducible block copolymer synthesis.
- Necessitates analytical infrastructure for GPC, zeta potential, particle sizing, and fluorescence-based transfection assays to evaluate polyplex performance.
- Adaptation to other cell lines or payloads may require re-optimization of N/P ratio and cytotoxicity assessment due to variable GPMA-mediated effects.
- Practical limitations include the need for multi-step purification and sensitivity to oxygen during polymerization, which must be mitigated via rigorous degassing protocols.
