Name: Zautomatyzowana kwantyfikacja oparta na obrazie pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili przy użyciu NETQUANT (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną metodę kwantyfikacji pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili NETQUANT w obrazach immunofluorescencyjnych. To narzędzie umożliwia niezależną analizę pojedynczych komórek i standaryzację wyników między laboratoriami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca została sfinansowana przez Fundację Crafoord (TM i PN), grant badawczy rządu szwedzkiego (PN, TM), Szwedzką Radę ds. Badań (PN) i Fundację Groschinsky'ego (TM, PN).

Komisja etyczna Uniwersytetu w Lund zatwierdziła pobieranie krwi żylnej od zdrowych ochotników zgodnie z Deklaracją Helsińską (2013/728). Wszyscy ochotnicy wyrazili pisemną zgodę na udział w badaniu.
1. Izolacja neutrofili z krwi obwodowej za pomocą wirowania w gradiencie gęstości
<ol>
	<li>Należy pobrać krew żylną człowieka do probówek zawierających heparynę i pozostawić probówki do czasu osiągnięcia temperatury pokojowej. 
	Uwaga: Aby uzyskać wystarczająco duży osad komórkowy, wymagane jest pobranie minimum 16 ml krwi od zdrowego dawcy.</li>
	<li>Wymieszać krew z taką samą objętością 2% dekstranu w soli fizjologicznej (0,9% NaCl) i pozostawić do sedymentacji w temperaturze pokojowej przez 30 min w sterylnym, stożkowym probówce do wirowania o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Odssać nadłożu do sterylnej stożkowatej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i wirować z prędkością 20 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Od tego etapu kontynuuj izolację w 4 °C lub na lodzie.</li>
	<li>Osad resuspendować w 5 ml schłodzonej do temperatury lodowej soli fizjologicznej i nanieść na 5 ml gradientu do izolacji leukocytów (9,1% diatryzoanu sodu z 5,7% dekstranem, m/v) w sterylnej stożkowej probówce do wirowania o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Wirować przez 30 min przy 40 x g w 4 °C.</li>
	<li>Odssać supernatant i go usunąć.</li>
	<li>Zlizuj erytrocyty, resuspendując osad w 3 ml lodowatej wody przez 30 s. Bezzwłocznie dodaj 1 ml 3,6% NaCl, a następnie dopełnij objętość do 10 ml lodowatym roztworem soli fizjologicznej.</li>
	<li>Odwiruj zawiesinę komórkową przez 10 min przy 350 x g.</li>
	<li>Usunąć nadsącz, zebrać osad komórkowy i zawiesić go ponownie w 1 ml soli fizjologicznej. Odstawić. 10 µL w probówce do mikrocentryfugowania w celu oceny liczby i żywotności komórek przy użyciu błękitu trypanowego w komorze Bürkera.</li>
	<li>Dodaj 10 µL zawiesiny komórkowej do 90 µL 0,4% roztworu błękitu trypanowego. Nabrać 10 µL zawiesiny komórkowej w komorze Bürkera. Należy policzyć komórki w 4 kwadratach ograniczonych przez 3 linie w każdym narożniku komory. Komórki, które przybrały ciemnoniebieski kolor w wyniku wchłonięcia barwnika, są nieżywe i powinny zostać wykluczone z całkowitej liczby komórek.</li>
	<li>Liczbę komórek należy wyrazić w jednostkach komórek/ml zgodnie z poniższym równaniem. 
	<img alt="Schemat formuły liczenia komórek: Obliczanie liczby komórek/ml przy użyciu błękitu Trypanu, współczynnika komory i współczynnika rozcieńczenia." src="/files/ftp_upload/58528/58528eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie"> 
	Uwaga: W tym przypadku współczynnik komory wynosił 10 00, współczynnik rozcieńczenia wynosił 10, a całkowita liczba pól wynosiła 4.</li>
	<li>Rozcieńczyć pozostałą zawiesinę komórkową do 10 ml w celu przeprowadzenia końcowego etapu płukania.</li>
	<li>Wirować przez 5 min przy 20 x g.</li>
	<li>Resuspenduj neutrofile w pożywce RPMI-1640 z dodatkiem 2 mg/ml inaktywowanej ciepłem ludzkiej albuminy surowiczej (HSA) do stężenia 5 x 105 komórek/ml</li>
</ol>
2. Przygotowanie szkiełek podstawowych i stymulacja neutrofili
<ol>
	<li>Umieścić po jednej szkiełku nakrywce (10 mm, #1) w każdym dołku płytki 12-dołkowej, a następnie pokryć szkiełka, dodając 20 µL 0,01% roztworu poli-L-lizyny i pozostawić w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Przemyć szkiełka nakrywce raz 30 µL solą fosforanową buforowaną (PBS) i pozostawić do wyschnięcia.</li>
	<li>Dodać 40 µL zawiesiny neutrofili o stężeniu 5 x 105 neutrophils/mL do każdego dołka i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 min.</li>
	<li>Przenieść płytkę zawierającą neutrofile do inkubatora w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 na 15 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant. Do kontroli dodać 400 µL uprzednio podgrzanego medium RPMI-1640 z 2 mg/mL HSA. W celu stymulacji dodać 30 µL podgrzanego medium RPMI z 20 nM phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA).</li>
	<li>Stymulować neutrofile przez 150 min w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.</li>
</ol>
3. Wizualizacja NETów
<ol>
	<li>Usunąć supernatant i przemyć próbki 2x przy użyciu 20 µL PBS.</li>
	<li>Utrwalić próbki, dodając 20 µL 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS na 20 min w temperaturze 37 °C. 
	Uwaga: PFA jest toksyczny i należy z nim obchodzić się ostrożnie.</li>
	<li>Przemyć próbki 3x przy użyciu 20 µL PBS.</li>
	<li>Przeprowadzić permeabilizację próbek, dodając 50 µL 0,5% Triton X-10 na 30 s.</li>
	<li>Przemyć próbki 3x przy użyciu 20 µL PBS.</li>
	<li>Zablokować próbki, stosując 5% surowicę kozia w PBS przez 1 h w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać 30 µL pierwszego przeciwciała królika przeciwko ludzkiej elastazie neutrofilowej w roztworze blokującym przy rozcieńczeniu 1:50 na 90 min w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przemyć próbki 3x przy użyciu 30 µL PBS.</li>
	<li>Dodać 30 µL drugiego fluorescencyjnego przeciwciała koziego przeciwko króliczemu przy rozcieńczeniu 1:10 na 90 min w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przemyć szkiełka podstawowe 3x przy użyciu 30 µL PBS.</li>
	<li>Wyjąć szkiełka podstawowe z dołków i zamontować szkiełko, stosując 10 µL medium montującego zawierającego DAPI. Przechowywać przez noc w temperaturze pokojowej w ciemności w celu wysuszenia próbek. 
	Uwaga: Barwienie DNA za pomocą DAPI jest kluczowym etapem metody. W razie problemów użytkownicy mogą dodać egzogenną roztwór DAPI w końcowym zakresie stężeń 0,1‒0,5 µg/mL przez 2‒3 min, a następnie przeprowadzić 3 etapy płukania 30 µL PBS.</li>
	<li>Nabyć obrazy za pomocą szerokopolowego mikroskopu fluorescencyjnego z użyciem obiektywu 20X.</li>
</ol>
4. Analiza i kwantyfikacja NETów przy użyciu NETQUANT
Uwaga: NETQUANT można pobrać, klikając plik instalacyjny znajdujący się w archiwum Zenodo Github lub na stronie internetowej Nordenfelt Lab (<a href="https://nordlab.med.lu.se/?page_id=34" target="_blank">https://nordlab.med.lu.se/?page_id=34</a>).
<ol>
	<li>Importowanie zestawów danych do analizy, nazywanie kanałów i konwersja obrazów
	<ol>
		<li>Otwórz kartę Setup w programie NETQUANT.</li>
		<li>Wybierz folder źródłowy do analizy, klikając opcję Get path w menu źródłowym, i zaznacz folder zawierający sekwencje obrazów do analizy.</li>
		<li>Kliknij opcję Get Path w menu docelowym i wybierz folder do zapisywania danych po analizie obrazów.</li>
		<li>Nazwij kanały tak, aby „DNA channel” odpowiadał barwieniu DNA (np. DNA lub DAPI), a „NET-channel” obrazował barwienie białek związanych z NET (np. NET, elastaza neutrofilowa) na obrazach. Dla prawidłowego działania oprogramowania (zaleca się) nazwać folder zawierający pliki obrazów kontrolnych jako „control”. 
		Uwaga: Kanał NET odnosi się wyłącznie do barwienia markerów białek ziarnuelkowych związanych z NET.</li>
		<li>Wprowadź metadane obrazów do oprogramowania, klikając przycisk Load image information w podmenu Image information.</li>
		<li>W podmenu Channel order wybierz prawidłową kolejność kanałów zawartych w obrazach. Opcja ta została wprowadzona jako zabezpieczenie przed przypadkowymi błędami w dopasowaniu.</li>
		<li>Pobierz podstawowe właściwości obrazów z danych surowych i dokonaj konwersji obrazów, klikając przycisk Prepare data button. Przekonwertowane obrazy pojawią się w podmenu Sample type. Kliknij menu Sample type, aby wyświetlić i wybrać wszystkie zestawy danych pobrane do analizy.</li>
		<li>Wybierz obraz z podmenu Sample type i kliknij przycisk Display image data, aby wyświetlić obrazy rozdzielone odpowiednio na kanał DNA i NET.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Segmentacja komórek w kanale DNA i kanale NET
	<ol>
		<li>Wybierz metodę segmentacji, klikając podmenu Method zarówno dla kanału DNA, jak i kanału NET. 
		Uwaga: Domyślna metoda segmentacji jest ustawiona na adaptive i jest to zalecane ustawienie. Dostępne są również inne opcje, takie jak global, edge i Chan-Vese. Dołączono również opcję watershed, aby pomóc w rozróżnianiu blisko położonych komórek lub struktur NET.</li>
		<li>Przejdź do karty Segmentation, aby najpierw przeprowadzić segmentację komórek kontrolnych w obu kanałach, klikając opcję Segment control samples.</li>
		<li>Wybierz PMA z podmenu typu próbki i kliknij opcję Batch (zalecane), aby rozpocząć segmentację wszystkich obrazów zawartych w zestawie danych. Wybierz obrazy w menu typu próbki i kliknij przycisk Display image data, aby zwizualizować i zweryfikować binarne maski obrazów (maskę DNA i maskę NET) wygenerowane po segmentacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza pojedynczych komórek w celu określenia identyfikowalnych właściwości
	<ol>
		<li>Przejdź do karty analizy i przeanalizuj próbki kontrolne, klikając przycisk Determine threshold.</li>
		<li>Zmień typ próbki na PMA i kliknij przycisk Get cell properties, aby zakończyć analizę próbek stymulowanych.</li>
		<li>Wybierz obraz z podmenu Sample type i kliknij przycisk Display image data, aby wyświetlić nałożone obrazy oraz liczbę wszystkich komórek i komórek tworzących NET na obrazie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Porównanie właściwości komórek w celu identyfikacji komórek tworzących NET
	<ol>
		<li>Wybierz próbkę z podmenu typu próbki i kliknij przycisk Analyze NETs, aby zakończyć analizę. Do analizy można wybrać poszczególne obrazy z podmenu typu próbki lub przeanalizować całą partię obrazów, wybierając opcję batch (zalecane).</li>
		<li>Ręcznie dostosuj kryteria NET, aby uzyskać optymalne wyniki dla danej próbki. Porównaj zidentyfikowane NET z oryginalnymi obrazami, aby ocenić jakość identyfikacji. 
		Uwaga: Kryteria NET można następnie zastosować do wszystkich obrazów w zestawie danych. Wszelkie zmiany w kryteriach NET są stosowane jednocześnie we wszystkich próbkach kontrolnych. Ogranicza to możliwość wystąpienia potencjalnych różnic wynikających z nadmiernego dopasowania (over-fitting) parametrów NET. Ustawienia w kryteriach NET mogą być dostosowane do wymagań użytkownika. Związek między wskaźnikami fałszywych odkryć a NETQUANT był badany wcześniej13. Typowe zakresy dla wzrostu powierzchni wynoszą 2‒4, okrągłość powinna wynosić 0,7‒0,9, a stosunek DNA/NET od 0,6 do 2,0.</li>
		<li>Przejrzyj podsumowanie danych w podmenu Cell data, gdzie wyświetlana jest liczba obrazów, liczba komórek na obraz oraz procent NET na obraz. 
		Uwaga: Całkowity procent NET w całym zestawie danych jest wyświetlany przez „NET-gauge”. Całkowita liczba obrazów, liczba komórek, procent NET w próbce (NETs%) oraz NETs% w próbce kontrolnej są wyświetlane w tabeli statystyk podsumowujących poniżej NET-gauge. Zalecamy raportowanie danych kontrolnych wraz z danymi uzyskanymi z próbek stymulowanych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyniki analizy
	<ol>
		<li>Przejdź do karty Output, aby wybrać i przejrzeć wyniki.</li>
		<li>Przeanalizuj i porównaj różne wyniki danych wygenerowane z analizy próbek kontrolnych i PMA, wybierając formę wyjścia i klikając przycisk Output results. 
		Uwaga: Wszystkie dane wygenerowane po analizie zarówno dla kontroli, jak i stymulacji, są zapisywane w folderze analizy wybranym w podmenu docelowym. Dane są zapisywane w formatach .csv lub .pdf.</li>
		<li>Uruchom Method file, aby uzyskać wersję oprogramowania oraz kryteria NET użyte do analizy (do zamieszczenia w sekcji materiały i metody publikacji).</li>
		<li>Kliknij Results data table, aby zwizualizować poszczególne punkty danych w danej próbce.</li>
		<li>Wizualizuj rozkład powierzchni NET i stosunek DNA:NET w próbkach. Czerwona linia na wykresach wskazuje wartość progową.</li>
		<li>Określ powierzchnię NET w stosunku do kształtu DNA, klikając plik Bivariate distribution.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wczytywanie poprzednich analiz i automatyzacja wszystkich kroków
	<ol>
		<li>Wczytaj wcześniej pomyślnie zastosowane ustawienia analizy do NETQUANT za pomocą przycisku Load previous analysis.</li>
		<li>Użyj przycisku Batch all steps zawartego w menu Setup, aby uruchomić kroki 5‒12 (Rycina 1, Rycina 2, Rycina 3, Rycina 4, Rycina 5) bezpośrednio w celu uzyskania końcowego wyniku.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Nauseef, W. M., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+at+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils at work.</a> Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).</li>
<li>Borregaard, N., Cowland, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granules+of+the+human+neutrophilic+polymorphonuclear+leukocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte.</a> Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).</li>
<li>Nordenfelt, P., Tapper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+dynamics+during+phagocytosis+by+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils.</a> Journal of Leukocyte Biology. 90 (2), 271-284 (2011).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Sorensen, O. E., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+-+the+dark+side+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps - the dark side of neutrophils.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).</li>
<li>Yipp, B. G., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETosis%3A+how+vital+is+it%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NETosis: how vital is it?</a> Blood. 122 (16), 2784-2794 (2013).</li>
<li>Jorch, S. K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).</li>
<li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li>
<li>Mohanty, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mechanism+for+NETosis+provides+antimicrobial+defense+at+the+oral+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A novel mechanism for NETosis provides antimicrobial defense at the oral mucosa.</a> Blood. 126 (18), 2128-2137 (2015).</li>
<li>Hakkim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Raf-MEK-ERK+pathway+is+required+for+neutrophil+extracellular+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).</li>
<li>Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+quantification+of+in+vitro+NET+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Automatic quantification of in vitro NET formation.</a> Frontiers in Immunology. 3, 413(2012).</li>
<li>Coelho, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+determination+of+NET+%28neutrophil+extracellular+traps%29+coverage+in+fluorescent+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Automatic determination of NET (neutrophil extracellular traps) coverage in fluorescent microscopy images.</a> Bioinformatics. 31 (14), 2364-2370 (2015).</li>
<li>Mohanty, T., Sorensen, O. E., Nordenfelt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETQUANT%3A+Automated+Quantification+of+Neutrophil+Extracellular+Traps%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">NETQUANT: Automated Quantification of Neutrophil Extracellular Traps.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1999(2017).</li>
<li>Kaplan, M. J., Radic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+double-edged+swords+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity.</a> Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).</li>
<li>Cedervall, J., Olsson, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity+Gone+Astray+-+NETs+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Immunity Gone Astray - NETs in Cancer.</a> Trends in Cancer. 2 (11), 633-634 (2016).</li>
<li>Ginley, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+detection+and+quantification+of+human+and+mouse+neutrophil+extracellular+traps+in+flow+cytometry+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Computational detection and quantification of human and mouse neutrophil extracellular traps in flow cytometry and confocal microscopy.</a> Scientific Reports. 7 (1), 17755(2017).</li>
</ol>

TM i PN mają zgłoszony patent związany z algorytmami stosowanymi w NETQUANT.

Formacja NET jest stosunkowo nowym dodatkiem do zróżnicowanego arsenału neutrofili4 i zauważalny jest wzrost zainteresowania badaniem implikacji NET w szerokim zakresie obszarów badawczych 5,7,14,15. Akwizycja obrazów za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej, a następnie kwantyfikacja oparta na obrazie jest szeroko stosowaną metodą ilościowego oznaczania NET. Takie p...

Neutrofile są kluczowymi mediatorami wrodzonych reakcji obronnych gospodarza przeciwko szerokiej gamie patogenów mikrobiologicznych1. Wykonują swoje funkcje przeciwdrobnoustrojowe, uwalniając granulki zawierające szeroki wachlarz białek przeciwdrobnoustrojowych2, wytwarzając reaktywne formy tlenu (ROS) i podchloryt1, oraz poprzez fagocytozę3. Ponadto Brinkmann i wsp.4 opisał zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofili (NET) jako nowy mechanizm, dzięki któremu neutrofile wyłapują i eliminują inwazyjne patogeny. Od czasu ich odkrycia nieco ponad dekadę temu4, NET są zamieszane w wiele różnych chorób zakaźnych5,6 i non-infectious7 chorób. Tworzenie NET jest procesem aktywnym i powoduje ekstruzję DNA chromatyny pokrytego granulowanymi białkami przeciwdrobnoustrojowymi pochodzącymi z granulek8. Niektóre z kluczowych zmian w morfologii komórkowej i jądrowej związanych z powstawaniem NET obejmują utratę morfologii jądrowej, dekondensację chromatyny, mobilizację białek ziarnistych z cytoplazmy do jądra oraz wzrost średnicy jądra i komórki8,9.
Sieci podobne do sieci, które mogą wyglądać jak rozproszone struktury nieco większe niż komórka lub jako struktury kilkakrotnie większe niż pojedynczy neutrofil, są uważane za wskaźniki NETosis5,10. Za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej NET można wykryć poprzez sondowanie DNA za pomocą sondy fluorescencyjnej, takiej jak 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) oraz przez barwienie immunofluorescencyjne białek związanych z NET, takich jak elastaza neutrofilowa. Kwantyfikacja nakładających się obszarów barwienia dla DNA i białek związanych z NET określa całkowity obszar pod NET w image11.
Dostępnych jest wiele opcji analizy obrazu, które umożliwiają ilościowe określanie NETs na podstawie obrazów fluorescencyjnych11,12. Jednak te opcje oprogramowania mają ograniczenia, ponieważ nie są przyjazne dla użytkownika i/lub w pełni zautomatyzowane. W tym artykule demonstrujemy działanie NETQUANT13, bezpłatnej aplikacji, która może wykonywać bezstronną, w pełni zautomatyzowaną kwantyfikację NET opartą na obrazie mikroskopii immunofluorescencyjnej. Aplikacja posiada przyjazny dla użytkownika interfejs graficzny (GUI) i może wykonywać analizę pojedynczych komórek. Oprogramowanie określa ilościowo NETozę na obrazie, wykrywając zmiany morfologiczne w obszarze markera związanego z DNA-NET, deformację jądra związaną z dekondensacją chromatyny i wzrost stosunku białek związanych DNA:NET. Podsumowując, wiele kryteriów definicji NET pozwala na rygorystyczną kwantyfikację NET w kilku zestawach danych w bezstronny sposób.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer Heparynizowane probówki z tworzywa sztucznego</td><td>BD Biosciences</td><td>367885</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Axis-Shield</td><td>114547</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 z L-glutaminą</td><td>Gibco</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>Kolby stożkowe 50 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td></td></tr><tr><td>Kolby stożkowe 15 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>Tkanka 12-dołkowa Płytki hodowlane</td><td>Falcon</td><td>10626491</td><td></td></tr><tr><td>#1 Szkiełka nakrywkowe 10mm</td><td>Menzel Glaser</td><td>CS10100</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka podstawowe</td><td>Menzel Glaser</td><td>631-0098</td><td></td></tr><tr><td>Pierwotna elastaza antyludzka</td><td>DAKO DAKO</td><td>królik 1373, immunizacja kontraktowa</td><td></td></tr><tr><td>Wtórny fluorofor sprzężony koza anty-królik</td><td>Technologie życia</td><td>A-11072, A-11070</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik PROLONG-Gold Antifade z technologiami DAPI</td><td>Life</td><td>P36930</td><td>Podłoże montażowe</td></tr><tr><td>Kozia surowica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>12-mirystynian 13-octanu Phorbol (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79346</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti-E Mikroskop epifluorescencyjny</td> Aparat CCD firmy <td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Andor Zyla</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Apochromat Obiektywy 20x, 40x</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Windows 10</td><td>Microsoft</td><td></td><td>System operacyjny</td></tr><tr><td>macOS Sierra 10.12</td><td>Apple</td><td></td><td>System operacyjny</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zautomatyzowana kwantyfikacja oparta na obrazie pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili przy użyciu netquant

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) to podobne do sieci struktury przeciwdrobnoustrojowe składające się z DNA i białek przeciwdrobnoustrojowych pochodzących z granulek. Mikroskopia immunofluorescencyjna i metody kwantyfikacji oparte na obrazie pozostają ważnymi narzędziami do ilościowego określania tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili. Istnieją jednak kluczowe ograniczenia dotyczące metod opartych na immunofluorescencji, które są obecnie dostępne do ilościowego oznaczania NET. Ręczne metody kwantyfikacji NET na podstawie obrazów są często subiektywne, podatne na błędy i żmudne dla użytkowników, zwłaszcza niedoświadczonych. Ponadto obecnie dostępne opcje oprogramowania do oznaczania ilościowego są albo półautomatyczne, albo wymagają szkolenia przed obsługą. W tym miejscu demonstrujemy implementację zautomatyzowanej metody kwantyfikacji obrazu opartej na immunofluorescencji do oceny powstawania NET o nazwie NETQUANT. Oprogramowanie jest łatwe w użyciu i posiada przyjazny dla użytkownika graficzny interfejs użytkownika (GUI). Uwzględnia ona parametry biologicznie istotne, takie jak wzrost powierzchni i stosunek białek markerowych DNA:NET oraz deformacja jądrowa w celu zdefiniowania powstawania NET. Co więcej, narzędzie to jest zbudowane jako bezpłatna aplikacja i pozwala na kwantyfikację i analizę rozdzielczości pojedynczej komórki.

Neutrofile w stężeniu 5 x 105 neutrophils/mL wysiano na szkiełka podstawowe umieszczone w płytce 12-dołkowej, a następnie stymulowano za pomocą 20 nM PMA lub pozostawiono bez stymulacji przez 150 min. Próbki barwiono przy użyciu pierwszorzędowych króliczych przeciwciał anty-ludzka elastaza neutrofilowa, drugorzędowych kozich przeciwciał anty-króliczych sprzężonych z fluorophorem oraz DAPI – barwnikiem fluorescencyjnym wiążącym DNA (szczegóły znajdują się w Tabeli materi...

Tutaj prezentujemy protokół do generowania zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET) i obsługi NETQUANT, w pełni automatycznej opcji oprogramowania do ilościowego oznaczania NET w obrazach immunofluorescencyjnych.

Zautomatyzowana kwantyfikacja oparta na obrazie pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili przy użyciu NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

W tym artykule przedstawiamy NETQUANT, w pełni zautomatyzowane podejście do ilościowego oznaczania NETS i obrazów immunofluorescencyjnych. Pomoże to naukowcom w dokonywaniu porównywalnych analiz obrazów na podstawie danych generowanych przez wielu użytkowników i w różnych warunkach. Zaletami tej techniki są łatwość użycia, analiza danych z pojedynczych komórek, wiele kryteriów oceny powstawania NET oraz bezstronna analiza wielu obrazów.Zainstaluj i otwórz oprogramowanie analityczne. Aktualną wersję można znaleźć w archiwum Zenodo GitHub lub na stronie Nordonfelt Lab. Na karcie Ustawienia wybierz folder źródłowy do analizy, klikając opcję Pobierz ścieżkę w menu źródłowym.Wybierz folder zawierający sekwencje obrazów, które mają zostać przeanalizowane. Ponownie kliknij opcję pobierz ścieżkę w menu docelowym i wybierz folder docelowy do zapisania danych po analizie obrazu. Następnie, w przypadku korzystania z oddzielnych obrazów kanałów, nazwij foldery kanałów tak, aby kanał DNA odpowiadał barwieniu jądrowego DNA, a kanał NET przedstawiał barwienie elastazą neutrofilową na obrazach.Folder zawierający pliki obrazów kontrolnych należy również nazwać formantem. Następnie kliknij przycisk załaduj informacje o obrazie i załaduj metadane obrazu do oprogramowania. Następnie w podmenu kolejności kanałów wybierz odpowiednią kolejność kanałów zawartą na obrazach.Pomaga to zapobiegać przypadkowym niedopasowaniom. Teraz kliknij przycisk przygotuj dane, aby uzyskać podstawowe właściwości obrazu z surowych danych i przekonwertować obrazy. Przekonwertowane obrazy pojawią się następnie w podmenu typów próbek.Kliknij menu typu próbki, wybierz obraz z podmenu i kliknij wyświetl dane obrazu, aby wyświetlić obrazy podzielone odpowiednio na DNA i pułapkę zewnątrzkomórkową neutrofili lub kanał NET. Aby podzielić komórki na odpowiednie kanały, wybierz zakładkę metody segmentacji i wybierz metodę z podmenu metody zarówno dla kanałów DNA, jak i NET. Domyślna metoda segmentacji jest ustawiona na adaptacyjną i jest to ustawienie zalecane.W oprogramowaniu dostępne są inne opcje, w tym global edge i chanverse. Uwzględniono również opcję zlewni, aby pomóc w rozróżnieniu między blisko umieszczonymi komórkami lub sieciami NET. Również w zakładce segmentacja należy kliknąć na opcję segmentu prób kontrolnych.Następnie wybierz PMA z podmenu typu próbki i kliknij opcję wsadu, aby rozpocząć segmentację wszystkich obrazów zawartych w zestawie danych. Następnie wybierz obrazy w menu typu próbki i kliknij przycisk wyświetlania danych obrazu, aby zwizualizować i zweryfikować binarne maski obrazu zarówno dla masek DNA, jak i NET wygenerowanych po segmentacji. Teraz w zakładce analiza kliknij przycisk wyznacz próg, aby przeanalizować próbki kontrolne.Następnie po prawej stronie zmień typ próbki na PMA i kliknij przycisk Pobierz właściwości komórki, aby zakończyć analizę stymulowanych próbek. Następnie wybierz obraz z podmenu typu próbki i kliknij przycisk wyświetlania danych obrazu, aby wyświetlić nakładkę oraz liczbę komórek i komórek tworzących NET na obrazie. Zacznij od wybrania próbki z podmenu typu próbki.Poszczególne obrazy można wybrać z podmenu typu próbki do analizy lub całą partię obrazów można przeanalizować, wybierając opcję wsadu. Po wybraniu kliknij przycisk analizuj NETs, aby zakończyć analizę. Dostosuj kryteria NET ręcznie, aby uzyskać optymalne wyniki dla danej próbki.Porównaj zidentyfikowane sieci NET z oryginalnymi obrazami, aby ocenić jakość identyfikacji. Po wykonaniu tego kroku kryteria NET można zastosować do wszystkich obrazów w zestawie danych. Wszelkie zmiany wprowadzone do kryteriów NET są również jednocześnie stosowane do wszystkich prób kontrolnych.Sprawdź podsumowanie danych w podmenu danych komórki, w którym wyświetlana jest liczba obrazów, liczba komórek na obraz i procent sieci NET na obraz. Wejdź do zakładki danych wyjściowych, aby wybrać i wyświetlić wyniki wyjściowe. Przeglądaj i porównuj różne dane wyjściowe wygenerowane w wyniku analizy próbek kontrolnych i poddanych działaniu PMA, wybierając formę wyników i klikając przycisk wyników wyjściowych.Następnie uruchom plik CSV tabeli danych z wynikami, aby zbadać dane z jednej komórki i kliknij pliki PDF z wynikami, aby wyświetlić rozkład powierzchni NET i stosunek DNA do NET w próbkach. Czerwona linia wskazuje wartość progową na wykresach. Na koniec kliknij plik rozkładu dwuwymiarowego wyników, aby określić obszar NET w funkcji kształtu DNA.W tym przypadku przeanalizowano 15 obrazów neutrofili kontrolnych i 15 obrazów neutrofili stymulowanych PMA w czasie krótszym niż 10 minut. Policzono całkowitą liczbę komórek, a odsetek komórek z zewnątrzkomórkowymi pułapkami neutrofilowymi określono za pomocą metody automatycznej kwantyfikacji opisanej w tym artykule. Wyniki te pokazują, że neutrofile stymulowane PMA mają większą powierzchnię, wzrost deformacji jądrowej i wyższy stosunek DNA do NET niż próbki kontrolne.Po połączeniu w wykres 3D, próbki stymulowane PMA mają tendencję do pokazywania obszarów zaciśniętych grup niż próbki kontrolne. Podejmując próbę wykonania procedury, należy pamiętać, że chociaż przepływ pracy został przetestowany przy użyciu wielu dawców, zaleca się, aby użytkownik decydował o parametrach oprogramowania odpowiednio na podstawie indywidualnego zestawu danych.

automated-image-based-quantification-neutrophil-extracellular-traps

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje indukcję i wizualizację zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili lub NET w wstępnie oznakowanych neutrofilach przy użyciu surowicy pacjenta zawierającej przeciwciała cytoplazmatyczne anty-neutrofilowe. Co więcej, zastosowanie nieprzepuszczalnego barwnika DNA i mikroskopii fluorescencyjnej umożliwia wizualizację NET.

Indukcja i wizualizacja zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili we wstępnie znakowanych neutrofilach

Opisujemy metody izolowania neutrofili u psów z krwi pełnej i wizualizacji powstawania NET w żywych neutrofilach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Opisano również protokoły ilościowego oznaczania powstawania NET i ekspresji cytrulinowanego histonu H3 (citH3) za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.

In vitro Tworzenie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili u psów: analiza dynamiczna i ilościowa za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ten protokół opisuje wysoce czuły i wysokoprzepustowy test pułapki zewnątrzkomórkowej neutrofili (NET) do półautomatycznego oznaczania ilościowego tworzenia ex vivo NET za pomocą immunofluorescencji trójwymiarowej mikroskopii konfokalnej. Protokół ten może być wykorzystany do oceny powstawania i degradacji NET po różnych bodźcach i może być wykorzystany do badania potencjalnych terapii ukierunkowanych na NET.

Wysokoprzepustowy test do oceny i ilościowego określania tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych w neutrofilach

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) neutrofili to trójwymiarowe struktury generowane przez stymulowane granulocyty neutrofilowe. W ostatnich latach stało się jasne, że sieci NET są zaangażowane w wiele różnych chorób. Wykrywanie NET w tkance może mieć znaczenie diagnostyczne, dlatego wymagane są standardowe protokoły znakowania składników NET.

Znakowanie immunofluorescencyjne ludzkich i mysich pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w tkance zatopionej w parafinie

Prezentowany tutaj jest protokół do indukcji i analizy in vitro zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych (NET). Kwantyfikacja DNA, katelicydyny (LL37) i aktywności enzymów dostarczyła danych, które pokazują zmienność składu i morfologii NET indukowanych przez bodźce mikrobiologiczne i chemiczne w podobnie kontrolowanych warunkach.

Analiza morfologiczna i kompozycyjna pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili indukowanych bodźcami mikrobiologicznymi i chemicznymi

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) neutrofili są związane z różnymi chorobami, a immunofluorescencja jest często używana do ich wizualizacji. Istnieją jednak różne protokoły barwienia, aw wielu przypadkach badany jest tylko jeden rodzaj tkanki. W tym miejscu ustalamy ogólnie stosowany protokół barwienia NET w tkankach mysich i ludzkich.

Obrazowanie immunofluorescencyjne zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych w tkankach ludzkich i mysich

Prezentujemy zautomatyzowaną, wysokoprzepustową metodę ilościowego oznaczania pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) przy użyciu systemu analizy żywych komórek, w połączeniu z zależnym od przepuszczalności błony metodą podwójnego barwnika.

Technika wysokoprzepustowa w czasie rzeczywistym do ilościowego określania tworzenia się pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w ludzkich neutrofilach

Ten zdefiniowany protokół opisuje podejście do mikroskopii wysokoprzepustowej w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji i ilościowego określenia uwalniania ludzkich neutrofili zewnątrzkomórkowych (NET) in vitro. Powtarzalna metoda pozwala na zbadanie charakterystyki i kinetyki uwalniania NET po stymulacji odrębnymi induktorami NETozy oraz umożliwia ocenę farmakologii antagonistów NETozy.

Wysokoprzepustowa, mikroskopowa kwantyfikacja uwalniania ludzkich neutrofili z zewnątrzkomórkowych pułapek i ocena farmakologii antagonistów w czasie rzeczywistym

Zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe (NETs) stanowią istotny mechanizm odporności wrodzonej służący do zwalczania patogennych bakterii, grzybów i pasożytów. W niniejszym opracowaniu opisujemy metody izolacji granulocytów neutrofilowych z krwi ludzkiej oraz ich aktywacji w celu tworzenia NETs. Przedstawiamy techniki przygotowania próbek umożliwiające wizualizację NETs w mikroskopii świetlnej i elektronowej.

Zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe: Jak je generować i wizualizować

Przedstawiono protokół jednoczesnej kwantyfikacji i porównania trzech składników komórkowych i zewnątrzkomórkowych w biofilmach. Metodologia obejmuje wykorzystanie konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej, oprogramowania do analizy strukturalnej i wizualizacji biofilmu oraz oprogramowania do analizy statystycznej.

Jednoczesna kwantyfikacja komórkowych i zewnątrzkomórkowych składników biofilmów

Poznaj zautomatyzowaną metodę kwantyfikacji pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili NETQUANT w obrazach immunofluorescencyjnych. To narzędzie umożliwia niezależną analizę pojedynczych komórek i standaryzację wyników między laboratoriami.

Zautomatyzowana kwantyfikacja oparta na obrazie pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili przy użyciu NETQUANT

Przeglądaj więcej filmów