Izolacja, fiksacja i obrazowanie immunofluorescencyjne nadnerczy myszy

Immunofluorescencja to podstawowa metoda, która może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nadnerczy dotyczące strefowości nadnerczy, tożsamości i funkcji komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia badanie wielu białek przy jednoczesnym zachowaniu morfologii tkanki nadnerczy. Aby usunąć mysie nadnercza, przeciąć otaczającą tkankę tłuszczową i umieścić gruczoł w jednym dołku 24-dołkowej płytki zawierającej świeży PBS na lodzie.

Przenieś gruczoł na szalkę Petriego lub szklaną podpórkę pod mikroskopem preparacyjnym i użyj dwóch igieł o rozmiarze 25, aby usunąć sąsiednią tkankę tłuszczową. Kiedy cały tłuszcz zostanie usunięty, utrwal tkankę w 4% paraformaldehydzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza, kołysząc przez dwie godziny. Pod koniec inkubacji przepłukać gruczoł trzema 15-minutowymi płukaniami w temperaturze czterech stopni Celsjusza w jednym do dwóch mililitrów świeżego PBS na pranie.

Po ostatnim płukaniu odwodnić gruczoł w dwóch sekwencyjnych zanurzeniach w etanolu w temperaturze czterech stopni Celsjusza z kołysaniem przez dwie godziny na inkubację. Aby przygotować tkankę nadnerczy do przetwarzania, owiń gruczoł gazą i zamknij nadnercze w kasecie zatapiającej tkanki. Następnie umieść kasetę w słoiku wypełnionym 70% etanolem na przechowywanie w czterech stopniach Celsjusza do czasu przetworzenia.

Aby przetworzyć tkankę, włóż kasetę do procesora tkanek w celu przetworzenia zgodnie z tabelą. Pod koniec programu przenieś kasetę do stacji zatapiania wypełnionej stopioną parafiną o temperaturze 65 stopni i za pomocą kleszczy odwiń gazę. Delikatnie przenieś nadnercze w odpowiednią pozycję na środku podstawy formy do zatapiania i wlej stopioną parafinę na gruczoł.

Następnie ostrożnie przenieś formę do zatapiania na tackę chłodzącą, aby ułatwić utwardzenie parafiny. Przed cięciem za pomocą mikrotomu obrotowego oznacz serię szkiełek mikroskopowych i połóż je na podgrzewaczu do szkiełek o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dozuj około 450 mikrolitrów autoklawowanej ultra czystej wody typu one na każde szkiełko i ustaw grubość cięcia sekcji mikrotomu na pięć mikrometrów.

Załaduj osadzoną tkankę na blok tnący i opuść blok parafinowy, aż próbka znajdzie się na poziomie powierzchni z krawędzią ostrza mikrotomu. Obracając pokrętłem w stałym rytmie, wykonaj wstępne przycinanie, aby usunąć parafinę i odsłonić tkankę nadnerczy. Następnie należy pobrać pięć odcinków mikrometrycznych przez koniec nadnercza za pomocą kleszczy, aby przenieść każdą sekcję do kropli wody na jedno z wstępnie oznaczonych szkiełek podczas jej zbierania.

Po potwierdzeniu obecności tkanki w skrawkach za pomocą mikroskopii, wysusz szkiełka na gorącej płycie przez około dwie godziny i piecz je co najmniej przez noc na tacy do szkiełka w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż woda przestanie być widoczna. Po wyschnięciu przechowuj szkiełka w pudełku na szkiełka w temperaturze pokojowej. W celu pobrania antygenu immunofluorescencyjnego należy odparafinować szkiełka za pomocą dwóch pięciominutowych zanurzeń w 100% ksylenu, a następnie ponownie uwodnić w opadającej serii zanurzenia w etanolu i wodzie.

Po zanurzeniu w wodzie przenieś szkiełka do metalowego uchwytu na szkiełka i umieść uchwyt w zlewce z wrzącym 0,01 molowym cytrynianem na gorącej płycie na 10 minut. Pod koniec inkubacji wyjmij zlewkę z płyty grzejnej i pozwól jej ostygnąć przez 20 minut, uważając, aby wszystkie odcinki nadnerczy były nadal pokryte buforem. Gdy zlewka ostygnie, przenieś szkiełka do słoika Coplin na trzy 10-minutowe mycia w świeżym PBS z delikatnym kołysaniem.

Po ostatnim umyciu ostrożnie przetrzyj powierzchnię każdego szkiełka, nie uszkadzając odcinków tkanek i za pomocą markera hydrofobowego wykonaj okrąg wokół każdej sekcji. Umieść szkiełka w wilgotnej komorze i szybko dodaj co najmniej 50 mikrolitrów roztworu blokującego do każdej sekcji na godzinną inkubację w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji blokującej umyć szkiełka trzy razy w świeżym PBS przez pięć minut na mycie z kołysaniem i powrotem szkiełek do komory.

Następnie dodaj główny koktajl przeciwciał do każdej sekcji w celu inkubacji przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego ranka umyj próbki trzema 15-minutowymi płukaniami w świeżym PBS na mycie i oznacz szkiełka odpowiednim roztworem przeciwciał wtórnych przez jedną godzinę, chroniąc je przed światłem. Pod koniec inkubacji przemyć próbki trzema 15-minutowymi płukaniami na kołysce zabezpieczonej przed światłem, znakując jądra skrawków DAPI przez siedem minut w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem po ostatnim przemyciu.

Po trzech pięciominutowych płukaniach PBS z kołysaniem, dodać 60 mikrolitrów środka montażowego odpowiedniego do immunofluorescencji wzdłuż powierzchni jednej szklanki nakrywkowej na próbkę i lekko docisnąć każdy fragment tkanki szkiełka do dołu na szkle nakrywkowym, uważając, aby uniknąć pęcherzyków. Następnie połóż każde szkiełko płasko w ciemnym pojemniku do utwardzania w temperaturze pokojowej przez co najmniej 24 godziny przed obrazowaniem. Podczas procesu usuwania tłuszczu bardzo ważne jest, aby nie dopuścić do wyschnięcia nadnerczy, ponieważ odwodnienie może uszkodzić strukturę tkanki.

Po udanym usunięciu otaczającej tkanki tłuszczowej, nadnercza powinny być łatwo wykrywalne bez dodatkowego widocznego tłuszczu. Barwienie immunologiczne odcinków nadnerczy, jak wykazano, ujawnia barwienie komórek kory nadnerczy steroidogennym czynnikiem jądrowym, barwienie komórkami rdzenia za pomocą hydroksylazy tyrozyny, barwienie DAPI jąder komórek niesteroidogennych torebki zewnętrznej oraz barwienie komórkami kory nadnerczy i rdzenia. Próbując tej procedury, należy pamiętać, że nadnercza myszy są małe, a ich położenie jest nieco zmienne, co utrudnia ich wykrycie.

Dlatego tak ważne jest, aby mieć wyraźny widok na obszar podczas sekcji. Procedury te są podstawowymi technikami badania nadnerczy in vivo. W związku z tym można wykonać dodatkowe metody barwienia immunologicznego w celu zaspokojenia określonych potrzeb naukowych.

Po jego opracowaniu, barwienie immunologiczne utorowało drogę naukowcom z dziedzin nauk biomedycznych do badania ekspresji białek in situ, które są użytecznym narzędziem w wielu dyscyplinach i dziedzinach.