Name: Pomiar oddziaływań białek kulistych i nitkowatych za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i termoforezy w mikroskali (MST) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Odkryj metodę pomiaru oddziaływań białek kulistych i nitkowatych za pomocą spektroskopii NMR i termoforezy MST. Protokół umożliwia szybką analizę wiązań na poziomie atomowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt był wspierany przez NSERC RGPIN-2018-04994, Campus Alberta Innovation Program (RCP-12-002C) oraz Alberta Prion Research Institute / Alberta Innovates Bio Solutions (201600018), przyznane granty M.O i Genome Canada oraz Canada Foundation for Innovation przyznane The Metabolomics Innovation Centre (TMIC) i NANUC.

<ol><li>Vinogradova, O., Qin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+as+a+unique+tool+in+assessment+and+complex+determination+of+weak+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Topics+in+Current+Chemistry%22%5BJournal%5D)">NMR as a unique tool in assessment and complex determination of weak protein-protein interactions.</a> Topics in Current Chemistry. 326, 35-45 (2012).</li>
<li>McKercher, M. A., Wuttke, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+Chemical+Shift+Mapping+of+SH2+Peptide+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">NMR Chemical Shift Mapping of SH2 Peptide Interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 1555, Clifton, N.J. 269-290 (2017).</li>
<li>Al-Jassar, C., Bikker, H., Overduin, M., Chidgey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+Basis+of+Desmosome-Targeted+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanistic Basis of Desmosome-Targeted Diseases.</a> Journal of Molecular Biology. 425 (21), 4006-4022 (2013).</li>
<li>Fogl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+intermediate+filament+recognition+by+plakin+repeat+domains+revealed+by+envoplakin+targeting+of+vimentin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mechanism of intermediate filament recognition by plakin repeat domains revealed by envoplakin targeting of vimentin.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Protein+Protocols+Handbook%22">The Protein Protocols Handbook</a>. Walker, J. M. , 2nd ed, Humana Press. (2002).</li>
<li>Wishart, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1H%2C+13C+and+15N+chemical+shift+referencing+in+biomolecular+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+NMR%22%5BJournal%5D)">1H, 13C and 15N chemical shift referencing in biomolecular NMR.</a> J. Biomol. NMR. 6, 135-140 (1995).</li>
<li>Casali, N. Escherichia coli Host Strains. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCasali%2C+N+%22E.+coli+Plasmid+Vectors%22">E. coli Plasmid Vectors</a>. , Humana Press. 27-48 (2003).</li>
<li>Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).</li>
<li>Kozak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+protein+samples+for+NMR+using+thermal+shift+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Nmr%22%5BJournal%5D)">Optimization of protein samples for NMR using thermal shift assays.</a> Journal of Biomolecular Nmr. 64, 281-289 (2016).</li>
<li>Burgess, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+practical+review+of+size+exclusion+chromatography%3A+Rules+of+thumb%2C+limitations%2C+and+troubleshooting%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">A brief practical review of size exclusion chromatography: Rules of thumb, limitations, and troubleshooting.</a> Protein Expression and Purification. , In Press (2018).</li>
<li>Kunji, E. R. S., Harding, M., Butler, P. J. G., Akamine, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+molecular+mass+and+dimensions+of+membrane+proteins+by+size+exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of the molecular mass and dimensions of membrane proteins by size exclusion chromatography.</a> Methods. 46 (2), 62-72 (2008).</li>
<li>Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+light+scattering%3A+a+practical+guide+and+applications+in+biomedical+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).</li>
<li>Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation%3A+A+versatile+tool+for+the+characterisation+of+macromolecular+complexes+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution.</a> Methods. 95, 55-61 (2016).</li>
<li>Pearson, J. Z., et al. Chapter One - Next-Generation AUC Adds a Spectral Dimension: Development of Multiwavelength Detectors for the Analytical Ultracentrifuge. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687915003936">Methods in Enzymology</a>. Cole, J. L. 562, Academic Press. 1-26 (2015).</li>
<li>Gorbet, G. E., Pearson, J. Z., Demeler, A. K., Cölfen, H., Demeler, B. Chapter Two - Next-Generation AUC: Analysis of Multiwavelength Analytical Ultracentrifugation Data. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687915002980">Methods in Enzymology</a>. Cole, J. L. 562, Academic Press. 27-47 (2015).</li>
<li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nature Communications. 1, 100(2010).</li>
<li>Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022286014002750">MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond.</a> Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawniają konfliktu interesów.

Eksperyment NMR 2D 15N-resolution jest jedną z najczęściej stosowanych metod pokazujących, jak oddziałują dwie cząsteczki. Jest to najbardziej bogata w informacje metoda, która pozwala na ciągłe monitorowanie sygnałów obu partnerów przez cały czas trwania eksperymentu miareczkowania w stanie roztworu. Chociaż metoda ta jest typowo jakościowa w przypadku dużych kompleksów, może być również stosowana w korzystnych przypadkach do pomiaru powinowactwa wiązań, w których sygnały NMR mogą być śledzone w widmach o wysokiej rozdzielczości. Tam, gdzie można wygodnie dokonać przypisań, na przykład w przypadku wielu białek o wielkości poniżej 20 kDa, można również zmapować miejsca wiązania. Testy uzupełniające, takie jak MST, dostarczają ilościowych informacji na temat interakcji w roztworze i wymagają mniejszej ilości białka w stanach nieznakowanych. Porównanie danych dotyczących wiązania mutantów jest przydatne do zapewnienia kontroli w celu zapewnienia, że interakcje udowodnione przez poszerzenie linii NMR są autentyczne, a nie artefaktami, na przykład agregacji lub zmianami lepkości.
Ekspresja białka
Usprawnienie procesu ekspresji zmniejsza ilość pracochłonnej produkcji białka. Częścią tego procesu optymalizacji jest identyfikacja odpowiedniego szczepu E. coli do rekombinowanej ekspresji białka. Preferencja szczepu zależy od takich elementów, jak charakter używanego wektora, a w szczególności ostateczna stabilność rekombinowanego białka, które ulega ekspresji7. Ryzyko degradacji białka heterologicznego przez endogenne proteazy E. coli można zmniejszyć, stosując E. coli z niedoborem proteazy, takie jak szczep BL21. W przypadku genów zawierających rzadkie kodony preferowany może być szczep taki jak BL21-CodonPlus (DE3)RIPL. Szczep ten łączy w sobie niedobór proteazy szczepu BL21 z dodatkowymi endogennymi kopiami rzadkich kodonów tRNA dla argininy, izoleucyny, proliny i leucyny. Alternatywnie, rzadkich kodonów, które mogą zagrozić nadekspresji, można uniknąć, zamawiając konstrukcję zoptymalizowaną pod kątem kodonów ze źródła komercyjnego. Dostępnych jest wiele szczepów E. coli do rekombinowanej ekspresji genów, z których każdy jest zoptymalizowany pod kątem obejścia określonego problemu podczas ekspresji7. W przypadku tego badania standardowy szczep BL21(DE3) z niedoborem proteazy wytworzył odpowiednie ilości rozpuszczalnego białka do późniejszego oczyszczenia i analizy.
Oczyszczanie białek
Protokół oczyszczania danego białka jest często unikalny w tym sensie, że każde białko pozostaje stabilne i rozpuszczalne w różnych warunkach, takich jak temperatura, stężenie soli lub pH. Ogólna skuteczność oczyszczania za pomocą chromatografii powinowactwa jest również wrażliwa na stężenie substancji eluujących, takich jak imidazol, na różnych etapach procesu oczyszczania. W tej pracy krytycznymi warunkami buforowymi dla IMAC były pH dla E-PRD i stężenie imidazolu dla VimRod. Wymagane było pH 7,5, aby uniknąć wytrącania się E-PRD po wstępnej elucji z kolumny IMAC. W przypadku oczyszczania VimRod za pomocą IMAC stwierdzono, że zwiększenie stężenia imidazolu z 30 do 50 mM podczas etapu płukania kolumny spowodowało znaczną poprawę czystości końcowych frakcji elucyjnych. Na etapie elucji stwierdzono również, że zwiększenie stężenia imidazolu z 250 do 350 mM poprawia wydajność końcowej elucji. Początkowe próby elucji białka przy użyciu 250 mM imidazolu doprowadziły do niepełnej elucji VimRodu, co ujawnił końcowy pasek imidazolu 1 M kolumny (dane nie pokazane). Zwiększenie stężenia imidazolu do 350 mM dla elucji było wystarczające do odzyskania całego białka związanego z kolumną. S może służyć dwóm celom, ponieważ działa jako etap polerowania do oczyszczania białka, jednocześnie wykonując wymianę buforu. Wymiana buforu jest krytycznym etapem późniejszej analizy wiązania, ponieważ usuwa imidazol używany do elucji białka znakowanego His6. Jest to również okazja do zmiany warunków, takich jak stężenie soli lub pH, które mogą mieć wpływ na skuteczność niektórych dalszych technik lub testów. Przesunięcie termiczne białka (PTS) może być wykorzystane do identyfikacji optymalnych do dalszych testów, szczególnie w przypadku tych, które wymagają stabilnego białka przez dłuższy czas w temperaturze pokojowej 8,9.
Analiza powiązań
Świeżo przygotowane białko ma kluczowe znaczenie dla dokładnych testów wiązania, chociaż można również użyć zamrożonego białka, o ile wyniki są porównywane. Białka nitkowate, takie jak wimentyna, multimeryzują w sposób zależny od soli i pH, a zatem warunki roztworu muszą być zoptymalizowane, a stan oligomeryczny oszacowany za pomocą metody takiej jak SEC10,11, dynamiczne rozpraszanie światła 12 lub ultrawirowanie analityczne13,14,15. Spektroskopia NMR dobrze nadaje się do pomiaru oddziaływań ligandów małych białek w rozdzielczości atomowej. Jednakże, gdy białko oddziałuje z większą cząsteczką, następuje wolniejsze bębnienie, a to powoduje utratę sygnałów, które mogą potwierdzić wiązanie, chociaż niekoniecznie pozwalają na mapowanie miejsc wiązania, co również wymagałoby przypisania co najmniej rezonansów szkieletowych. W tym scenariuszu eksperymenty NMR nie pozwalają na identyfikację miejsca interakcji. W związku z tym stosuje się mutagenezę ukierunkowaną na miejsce w celu identyfikacji krytycznych reszt potrzebnych do wiązania. Takie mutanty nie wykazują zatem utraty sygnału. W tym protokole zmutowana forma z podstawieniem w pozycji 1914 zachowuje szczytową intensywność w obecności VimRodu, a zatem potwierdza zakłócenie interakcji E-PRD i VimRod. Przypisanie rezonansów szkieletowych i łańcucha bocznego dodałoby wartości temu podejściu, zwłaszcza że struktura swobodnego E-PRD została rozwiązana za pomocą krystalografii rentgenowskiej4. Przyszłe zastosowania NMR obejmują charakterystykę złożonych oddziaływań między większymi cząsteczkami i skorzystają z magnesów o ultrawysokim polu oraz wykorzystania innych obserwowalnych grup, takich jak 13znakowanych C i trifluorometylogrupowych jako reporterów.
MST ma wiele zalet w badaniu interakcji wiążących16. Elementy wiążące są dowolne w roztworze i nie są unieruchomione. Analiza jakości próbek jest wbudowana w oprogramowanie z raportowaniem kontroli jakości agregacji, adsorpcji do kapilar lub niewystarczającego znakowania fluorescencyjnego cząsteczki docelowej. Zwykle stosuje się niewielkie ilości celu, stężenie znakowanego celu wynosi zwykle między 20-50 nM w objętości 10-20 μl/reakcji. Protokół ten wykorzystuje bardzo małe objętości reakcji (10 μl), aby zmaksymalizować stężenie liganda, które można osiągnąć w miareczkowaniu, co pozwala na scharakteryzowanie słabych oddziaływań wiążących. Wymaga to dokładnego pipetowania i zachowania ostrożności, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków podczas dokładnego mieszania. Odpowiednie wymieszanie ma kluczowe znaczenie dla dokładnych, spójnych pomiarów fluorescencji wzdłuż zestawu seryjnych rozcieńczeń. Ilość Tween-20 w eksperymentach MST została zmniejszona ze standardowego 0,05% do 0,015%, aby zmniejszyć tendencję do tworzenia pęcherzyków i poprawić mieszanie.
Barwnik RED-Tris-NTA zapewnia szybki, łatwy i wygodny sposób fluorescencyjnego znakowania dowolnego białka, które ma znacznik He. Etykietowanie jest skutecznie zakończone w zaledwie 30 minut i jest bardzo szczelne, dzięki czemu nie jest konieczna procedura usuwania barwnika. Nie dokonuje się żadnych modyfikacji reszt aminokwasowych w białku, które mogłyby zmienić właściwości wiązania ligandów. Zastrzeżenie polega na tym, że tylko białko, które ma być znakowane, powinno mieć znacznik His6. Wymagało to rozszczepienia znacznika z białka liganda, E-PRD, oraz usunięcia znacznika i nienaruszonego E-PRD za pomocą drugiego kroku kolumny IMAC. Jeśli to możliwe, białko liganda powinno być przygotowane bez użycia znacznika He. Alternatywnie, białka mogą być kowalencyjnie znakowane fluoroforem poprzez sprzężenie aminowe z resztą lizyny lub sprzężenie tiolowe z resztą cysteiny. Należy jednak zachować ostrożność podczas korzystania z takich systemów, ponieważ kowalencyjne przyłączenie fluoroforu może wpływać na oddziaływania wiązania elektrostatycznego lub biegunowego w oparciu o reszty lizyny lub cysteiny. Kwantyfikacja powinowactwa wiązania między VimRod i E-PRD przez MST była niezwykle wrażliwa na stężenie soli. Problem ten został złagodzony przez początkową dializę zarówno celu, jak i liganda w tej samej partii buforu testowego. Niemniej jednak nasycenie krzywej wiązania MST nie mogło zostać osiągnięte podczas wykonywania testu MST w obecności 150 mM NaCl ze względu na złożone zachowanie VimRod. Wiarygodne, kompletne dane uzyskano po obniżeniu stężenia NaCl do 10 mM, co pozwoliło na dokładne obliczenieKD. W związku z tym zaleca się staranną optymalizację warunków roztworu i porównanie z testami uzupełniającymi w celu uzyskania wiarygodnych wyników. Ponadto MST może być stosowany do ilościowego określania zależności od soli dla danej interakcji, ilościowego określania właściwości stechiometrycznych interakcji białek, monitorowania fałdowania białek i badania kinetyki enzymów17.

Interakcje między białkami pozwalają na tworzenie molekularnych maszyn, które tworzą porządek w komórkach. Indywidualne interakcje są często słabe, ale zwykle przyczyniają się do powstawania wielowartościowych kompleksów, które mogą współpracować i dynamicznie regulować. Czułe testy, które zapewniają rozdzielczość atomową i informacje ilościowe o takich złożonych interakcjach, są potrzebne do wydedukowania mechanizmów i zaprojektowania interwencji, takich jak cząsteczki podobne do leków. Spektroskopia NMR jest skuteczną metodą uzyskiwania takich informacji o interakcjach białkowych, a także służy do szybkiego badania przesiewowego ligandów, w tym tych, które słabo się wiążą1. Stosowane metody NMR można podzielić na te, które obserwują białka lub obserwują ligandy. W tym artykule zastosowano pierwsze podejście, w którym uzyskuje się widmo białka znakowanego stabilnym izotopem, które jest stosunkowo małe (zwykle poniżej 20 kDa), a nieznakowany ligand jest miareczkowany. Pozwala to na mapowanie oznakowanych pozostałości biorących udział w interakcji w korzystnych przypadkach. Gdy kompleks się uformuje, zachodzą zmiany w środowisku chemicznym oddziałujących reszt, które objawiają się zmianami w przesunięciu chemicznym i kształcie ich sygnałów NMR. Zakres tych zmian koreluje ze stopniem zaangażowania tych grup w interakcję. Perturbacje przesunięcia chemicznego (CSP) można zmierzyć, porównując serię widm NMR białka zebranych pod nieobecność i obecność różnych ilości liganda. W przypadku większych ligandów lub złożonych oddziaływań można zmierzyć zmianę kształtu lub intensywności piku w celu wydedukowania oddziaływań.
Najczęstszym eksperymentem 2D używanym do wykrywania oddziaływań ligandów jest eksperyment z 15N-heterojądrowymi pojedynczymi korelacjami kwantowymi (HSQC)2. Wymaga to, aby jedno białko było równomiernie znakowane 15N, co zwykle osiąga się poprzez ekspresję ich jako wersji znakowanych powinowactwem w kulturach bakterii E. coli hodowanych w 15pożywkach wzbogaconych w N. Wiązanie jest widoczne, gdy widma HSQC zebrane podczas miareczkowania nakładają się na siebie, ujawniając zmiany pików dla podzbioru reszt biorących udział w tworzeniu kompleksu. Interakcja może zachodzić w reżimie szybkiej wymiany, w którym sygnały stanu wolnego i nasyconego ligandem zapadają się w jeden uśredniony pik populacji. Alternatywnie, w przypadku powolnej wymiany między stanami, oba sygnały są obserwowane za pomocą całek, które reprezentują ich względne ilości. Podczas gdy analiza kształtu linii NMR może być wykorzystana do oszacowania powinowactwa wiązania w niektórych przypadkach, metody takie jak MST okazały się również wygodne i zapewniają krzyżową walidację rzeczywistych interakcji.
Podany przykład dotyczy dwóch białek znajdujących się w desmosomach. Pośredniczą w połączeniach między powierzchniami komórek a cytoszkieletem i pośredniczą w wielowartościowych interakcjach między maszynami adhezyjnymi komórek a włóknami pośrednimi, aby utrzymać integralność tkanek skóry i serca oraz wytrzymać siły ścinające. Choroby mogą wystąpić, gdy białka desmosomalne, takie jak desmoplakina lub wimentyna, są zagrożone przez mutacje lub autoprzeciwciała, co prowadzi do destabilizacji połączeń komórka-komórka, a zatem ich interakcje mają kluczowe znaczenie3. Strukturalne podstawy wiązania ligandów przez białka desmosomalne można scharakteryzować za pomocą spektroskopii NMR, podczas gdy interakcje można określić ilościowo za pomocą MST. Metody przedstawione w niniejszym dokumencie zostały wykorzystane do scharakteryzowania interakcji między domenami powtórzeń plakiny (PRD), które często występują jako zestawy tandemowe, które oferują podstawowe rowki, a wimentyną, pośrednim włóknem, które oddziałuje przez kwaśną powierzchnię oferowaną przez jego spiralny wiązkę4. Kompleksy te powstają na błonie komórkowej, gdzie zakotwiczają się w pośrednich włóknach cytoszkieletu komórkowego do desmosomów, które łączą się z sąsiednimi komórkami, tworząc w ten sposób sieć wiązań adhezyjnych, które promieniują przez tkankę.

<table><tbody><tr><td>Monolith NT.115, zawiera oprogramowanie sterujące i analityczne</td><td>NanoTemper Technologies</td><td>MO-G008</td><td>Przyrząd do termoforezy mikroskalowej</td></tr><tr><td>Zestaw do etykietowania His-Tag RED-Tris-NTA</td><td>NanoTemper Technologies</td><td>MO-L008</td><td>Barwnik RED-tris-NTA do</td></tr><tr><td>kapilar</td> MST Standard <td>Kapilary NanoTemper</td><td>Technologies MO-K022</td><td>do MST</td></tr><tr><td>HisTrap HP, 5 ml</td><td>GE Healthcare</td><td>17524801</td><td>Kolumna IMAC</td></tr><tr><td>Żywica HisPur Ni-NTA, 100 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88222</td><td>Żywica IMAC</td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg</td><td>GE Healthcare</td><td>28989333</td><td>SEC</td></tr><tr><td>kolumna proteaza TEV</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4455</td><td>łupliwość jego znacznika z E-PRD</td></tr><tr><td>BL21(DE3) Kompetentny E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527H</td><td>komórki do ekspresji białek</td></tr><tr><td>cOmcomplete Protease Inhibitor Cocktail Tabletki Bez EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11873580001</td><td>inhibitory proteazy do oczyszczania białek przez IMAC</td></tr><tr><td>TCEP, chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706</td><td>środek redukujący do oczyszczania białek</td></tr><tr><td>Odczynniki (HEPES, NaCl itp.)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>różne</td><td>Przygotowanie pożywek i</td></tr><tr><td>Chlorek amonu (15N, 99%)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>Znakowanie izotopów</td><td>NLM-467</td> dla NMR</tr><tr><td>D2O, tlenek deuteru (D, 99,8%)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-2259</td><td>Przygotowanie próbki NMR</td></tr><tr><td>DSS, 2,2-dimetylo-2-silapentano-5-sulfonian sodu, 2,2-dimetylo-2-silapentan-5-sulfonian-D6 (D,98%)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-8206</td><td>odniesienie do</td></tr><tr><td>precyzyjnych probówek NMR 5 mm, długich 7"</td><td>SJM/Deuterotubes</td><td>Probówki NMR BOROECO-5-7</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr NMR (14,1 Tesli)</td><td>Akwizycja danych NMR</td> <td>przez firmę Bruker</td><td></td></tr><tr><td>Sonda kriogeniczna TCI 5mm z-PFG</td><td>Akwizycja danych NMR</td> przez <td>firmę Bruker</td><td></td></tr> <tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker TopSpin 4.0.1</td><td>Przetwarzanie danych NMR</td><td>przez Bruker</td><td></td></tr><tr><td>MO. Kontroluj</td><td>technologie</td><td></td> NanoTemper <td>zawarte w Monlith NT.115</td></tr><tr><td>MO. Analiza powinowactwa</td><td>Technologie</td><td></td> NanoTemper <td>zawarte w Monlith NT.115</td></tr></tbody></table>

pomiar oddziaływań białek kulistych i nitkowatych za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (nmr) i termoforezy w mikroskali (mst)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Białka nitkowate, takie jak wimentyna, zapewniają organizację w komórkach, tworząc strukturalne rusztowanie z miejscami, które wiążą białka zawierające powtórzenia plakinowe. W tym miejscu opisano protokół wykrywania i pomiaru takich oddziaływań przy użyciu domeny powtórzeń kulistych plakiny envoplakiny i spiralnej cewki wimentyny. Stanowi to podstawę do określenia, czy białko wiąże wimentynę (lub podobne białka nitkowate) oraz do pomiaru powinowactwa oddziaływania. Białko globularne, będące przedmiotem zainteresowania, znakuje się 15N i miareczkuje białkiem wimentyny w roztworze. Dwuwymiarowe widmo NMR jest pozyskiwane w celu wykrywania interakcji poprzez obserwację zmian w kształcie piku lub przesunięć chemicznych oraz w celu wyjaśnienia wpływu warunków roztworu, w tym poziomów soli, które wpływają na strukturę wimentyny czwartorzędowej. Jeśli białko będące przedmiotem zainteresowania wiąże nitkowaty ligand, oddziaływanie wiązania określa się ilościowo za pomocą MST przy użyciu oczyszczonych białek. Podejście to jest prostym sposobem na określenie, czy białko będące przedmiotem zainteresowania wiąże włókno i na ocenę, w jaki sposób zmiany, takie jak mutacje lub warunki roztworu, wpływają na interakcję.

Domena E-PRD (resztki 182-2014 sklonowane do pProEX-HTC) ludzkiego genu envoplakiny oraz domena VimRod (resztki 99-249 sklonowane do pET21a) ludzkiej vimentyny4 zostały wyekspresjonowane z tagami His6 i oczyszczone. Rycina 6 oraz Rycina 7 przedstawiają stopnie czystości białek VimRod (18,8 kDa) i E-PRD (21,8 kDa) uzyskane za pomocą tej metody oczyszczania białek. Usunięcie tagu His6 z konstrukcji E-PRD jest niezbędne do eksperymentów MST, ponieważ białko VimRod jest znakowane barwnikiem wiążącym tag His6, a każde białko E-PRD zachowujące tag His6 mogłoby konkurować o wiązanie tego barwnika. Druga kolumna IMAC po odcięciu tagu za pomocą proteazy TEV usuwa proteazę TEV, odcięty tag oraz wszelkie pozostałe, nieodcięte białka His6-E-PRD. Końcowym etapem doczyszczania jest chromatografia wykluczania żelowego. Mimo że oba białka mają podobną wielkość, VimRod eluuje z kolumny przy 51 mL, podczas gdy pik elucji E-PRD jest wyśrodkowany przy 72 mL, gdzie spodziewany byłby monomer białka tej wielkości. Pozorny wzrost wielkości VimRod wynika prawdopodobnie z jego charakterystyki jako białka w kształcie długiego włóknistego pręta, ponieważ eksperymenty z użyciem ultracentryfugi analitycznej wykazały, że VimRod występuje w formie monomeru4. Niższe wydajności białka uzyskuje się z kultur hodowanych w pożywce M9 niż z bogatego podłoża, co wynika z mniejszej ilości komórek produkowanych w pożywce minimalnej. Początkowy wzrost większych kultur startowych dla preparatów M9 w TB pozwala na zwiększenie wydajności komórek przy zachowaniu stopnia znakowania 15N niezbędnego dla eksperymentów NMR.
Widma 15N-1H HSQC zarejestrowano dla typu dzikiego oraz mutantu R1914E białka E-PRD w obecności lub w nieobecności VimRod (Rysunek 8A-8D). Widmo E-PRD na Rysunku 8A wykazuje oczekiwaną liczbę dobrze rozdzielonych sygnałów, co świadczy o prawidłowym sfałdowaniu białka. W obecności VimRod (Rysunek 8B) widmo wykazuje znaczne poszerzenie linii i zanikanie sygnałów, co odpowiada wiązaniu się E-PRD z VimRod. Wiązanie to zostaje zniesione w wyniku mutacji R1914E, co potwierdza porównanie Rysunku 8C i 8D. Po dodaniu VimRod do mutantu R1914E w widmie zaobserwowano niewielkie zmiany, co wskazuje na brak wiązania między tym mutantem E-PRD a VimRod. Intensywności sygnałów E-PRD w obecności i nieobecności VimRod zostały porównane i przedstawione jako względne intensywności sygnałów na Rysunku 8E, co wskazuje zakres poszerzenia sygnałów w kompleksie E-PRD. Mutant R1914E białka E-PRD (nie pokazano) zachował około 97% sygnałów o intensywności 20% lub wyższej w obecności VimRod, w porównaniu do około 20% dla typu dzikiego (Rysunek 8E). Reprezentuje to punktową mutację prowadzącą do utraty funkcji; przebadano również dodatkowe mutanty o efektach pośrednich4.
W celu walidacji i ilościowego oznaczenia wiązania VimRod i E-PRD przeprowadzono analizę MST, wykorzystując His6-VimRod znakowany fluorescencyjnym barwnikiem RED-tris-NTA jako cel, zmieszany z malejącymi stężeniami liganda E-PRD w zakresie od 1,28 mM do 39,1 nM. Wykonano trzy miareczkowania wiązania, a wyniki uśredniono i przedstawiono na Rysunku 9. Dane dopasowano do standardowego modelu wiązania liganda w jednym miejscu, co pozwoliło wyznaczyć wartość KD wynoszącą 25,7 ± 2,1 μM. Ocena wiązania pomiędzy VimRod i E-PRD metodą rezonansu plazmonowego powierzchni dała podobną wartość KD równą 19,1 ± 1,3 μM4.
<img alt="Konfiguracja NMR z parametrami do akwizycji widm protonowych; rozpuszczalnik H2O+D2O, konfiguracja eksperymentu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Zrzut ekranu z konfiguracji eksperymentu NMR. Wyświetlone okno służy do konfiguracji standardowego eksperymentu w celu zebrania zestawu danych HSQC. Parametry eksperymentu są odczytywane obok pola Experiment. Przedstawiony eksperyment ZGPR zostaje wybrany jako eksperyment początkowy, aby załadować standardowe parametry protonów zależne od rozpuszczalnika. Okno Title służy do wprowadzenia szczegółów eksperymentu w celu archiwizacji danych. Aby uzyskać widmo HSQC, eksperyment ZGPR zastępuje się eksperymentem SFHMQC3GPPH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Konfiguracja parametrów spektroskopii NMR; przesunięcie chemiczne H(N), szerokość pasma, opóźnienie relaksacyjne, skany wstępne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2: Dostrajanie parametrów eksperymentu NMR. Wyświetlone okno służy do wprowadzania podstawowych parametrów sekwencji impulsów NMR w celu optymalizacji sygnału. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Ustawienia spektroskopii NMR dla analizy widma, obejmujące korekcję okna, fazy i linii bazowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3: Przetwarzanie danych NMR. Przedstawiono parametry wykorzystywane do przetwarzania każdego z dwóch wymiarów widma NMR, przy czym strzałkami wskazano te, które są zazwyczaj dostrajane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Konfiguracja wyznaczania maksimów w interfejsie oprogramowania NMR; parametry analizy pików widma i eksportu danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rycina 4: Parametry wyznaczania maksimów sygnałów w widmach NMR. Parametry wykorzystywane do wyboru sygnałów NMR w przetworzonym widmie NMR przedstawiono wraz z wartościami typowymi. Należy dostosować zakres ppm, intensywność oraz liczbę sygnałów w celu optymalizacji widm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Tabela danych widma NMR zawierająca piki, częstotliwości i intensywności; zawiera menu do powiększania widma." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rycina 5: Reprezentatywna lista pików z intensywnościami. Każdemu wybranemu piku w widmie NMR przypisuje się numer, a jego 1H i 15Wyświetlane są przesunięcia chemiczne i intensywność sygnałów. Tą listą pików można następnie posłużyć się do porównania widm uzyskanych w obecności lub w nieobecności partnera oddziaływania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig5large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tej ilustracji, należy kliknąć tutaj.</a>
<img alt="Oczyszczanie białek: chromatogramy filtracji żelowej, objętości elucji, analiza frakcji metodą SDS-PAGE." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Oczyszczanie białka VimRod z oczkiem His6 za pomocą IMAC i S. A. Chromatogram elucji z kolumny IMAC wykazuje jeden główny pik białka VimRod. B. Chromatogram elucji z kolumny S wykazuje jeden główny pik. C. Elektroforeza SDS-PAGE frakcji zebranych w trakcie oczyszczania: standardy masy cząsteczkowej z masą podaną w kDa po lewej stronie żelu (M), lizat komórkowy (1), przepływ z kolumny IMAC (2), płukanie (3), połączone elucje (E1), połączone elucje z kolumny S (E2). Prążki widoczne przy wyższych masach cząsteczkowych w ścieżkach E1 i E2 są oligomerami czystego białka VimRod, co potwierdzono za pomocą western blotu (dane nie przedstawiono). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig6large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Oczyszczanie białek; SDS-PAGE, wykres chromatograficzny, wynik elektroforezy żelowej; masy cząsteczkowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 7"> 
Rysunek 7: Oczyszczanie E-PRD za pomocą IMAC i S. A. SDS-PAGE oczyszczania metodą IMAC przedstawiające standardy masy cząsteczkowej z masami podanymi w kDa po lewej stronie żelu (M), eluat z pierwszej kolumny IMAC (E1), produkty cięcia TEV (+TEV) oraz przepływ z drugiej kolumny IMAC (FT). B. Chromatogram z kolumny S wykazuje jeden główny pik. C. SDS-PAGE standardów masy cząsteczkowej (M) oraz frakcji z piku S. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="spektroskopia NMR; dwuwymiarowa korelacja przesunięć chemicznych protonów 1H-15N HSQC; cztery wykresy, jeden wykres słupkowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8: Widma HSQC typu dzikiego i mutanta R1914E E-PRD w obecności i przy braku VimRod. Widma HSQC wykazują dziki typ E-PRD (100 µM) w 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7 w obecności (A) lub w obecności 50 µM VimRod (B). Panele C i D przedstawiają widma HSQC mutanta R1914E (100µM) w obecności lub przy braku 50 µM odpowiednio VimRod. Na panelu E względne 1H-15Intensywności N pików E-PRD z wiązaniem VimRod lub bez niego przedstawiono jako funkcję numeru piku, który jest przypisany arbitralnie i nie opiera się na pozycji w sekwencji. Wartości te mogą służyć do zdefiniowania progu istotności dla redukcji intensywności piku po dodaniu liganda. W przypadku dostępności przypisań często można zauważyć, że wartości istotne odpowiadają obszarowi wiązania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig8large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wykres krzywej zależności dawka-odpowiedź, ΔFnorm względem [PRD], ilustrujący analizę oddziaływań biochemicznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 9"> 
Rysunek 9: Wiązanie E-PRD do VimRod. E-PRD rozcieńczono w serii rozcieńczeń dwukrotnych w zakresie od 1,28 mM do 39,1 nM i inkubowano z oznakowanym VimRod przed przeprowadzeniem analizy MST. Dane z trzech niezależnych analiz zostały połączone. Dane dopasowano do KD model dostarczający KD z 25.7 μM z KD poziom ufności ± 2.1 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig9large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Ilość</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fosforan sodu dwuzasadowy (bezwodny)</td>
			<td>6,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fosforan potasu jednowodny (bezwodny)</td>
			<td>3,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorek sodu</td>
			<td>0,5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>Do 950 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Pożywka M9 do znakowania izotopowego.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Odczynnik</td>
			<td >Ilość</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >15NH4Cl</td>
			<td >1.0 g</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Glukoza (lub glukoza 13C)</td>
			<td >2.0 g</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >1 M MgSO4</td>
			<td >2 mL</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >50 mM CaCl2</td>
			<td >4 mL</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >20 mg/mL tiamina</td>
			<td >1.0 mL</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >3 mM FeCl3</td>
			<td >40 µL</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Metal Mix (Tabela 3)</td>
			<td >50 µL</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >H2O</td>
			<td >do 50 mL</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 2. Mieszanka składników odżywczych do suplementacji pożywek M9.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Ilość</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mM ZnSO44</td>
			<td>323 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mM MnSO44</td>
			<td>75,5 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,7 mM H3BO3</td>
			<td>145 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,7 mM CuSO44</td>
			<td>5,9 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>Do 50 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3. Suplement mieszanki metali do wzbogacania pożywki MT Nutrient Mix.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Próbka</td>
			<td>1 mM E-PRD w buforze A1 (µL)</td>
			<td>1 mM VimRod w buforze A (µL)</td>
			<td>Bufor A (µL)</td>
			<td>200 µM DSS w D2O (µL)</td>
			<td>Bufor B2 (µL)</td>
			<td>Objętość całkowita (µL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samodzielna metoda e-PRD</td>
			<td>50</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>350</td>
			<td>500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-PRD + VimRod</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>350</td>
			<td>500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">1Bufor A: 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">2Bufor B: 23 mM Tris-HCl, 1,14 mM DTT, pH 7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4. Przygotowanie próbek do NMR.

Tutaj prezentujemy protokół produkcji i oczyszczania białek znakowanych stabilnymi izotopami, a następnie charakteryzację oddziaływań białko-białko za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i eksperymentów termoforezy w mikroskali (MST).

Pomiar oddziaływań białek kulistych i nitkowatych za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i termoforezy w mikroskali (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie interakcji białkowych, takie jak to, czy białko wiąże się bezpośrednio z małą czy dużą cząsteczką. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to prosty i szybki sposób wykrywania bezpośrednich oddziaływań na poziomie atomowym. Włącz przepływ powietrza za pomocą polecenia eject ej.Spowoduje to podniesienie próbki z magnesu. Teraz umieść próbkę w wirniku na magnesie w otworze. Wstaw za pomocą polecenia ij.Zanim przejdziesz dalej, poczekaj, aż próbka osiądzie w magnesie. Utwórz nowy zestaw danych za pomocą polecenia edc i załaduj standardowe parametry NMR protonu, wybierając eksperyment ZGPR. Wypełnij pola NAZWA, numer eksperymentu i numer folderu przetworzonych danych.Wybierz rozpuszczalnik w polu Ustaw rozpuszczalnik i kliknij Wykonaj getprosol, aby odczytać standardowe parametry zależne od głowicy sondy i rozpuszczalnika. Zablokuj próbkę w deuterowanym rozpuszczalniku za pomocą polecenia zamknij i poczekaj, aż zakończy zamiatanie i osiągnie blokadę. Skoryguj częstotliwość rezonansową magnesu, dostrajając próbkę za pomocą automatycznego polecenia strojenia atma.Monitoruj krzywą chybotania, aż do zakończenia automatycznego strojenia. Podkładka pod pole magnetyczne za pomocą podkładki górnej. Shimming umożliwia dostosowanie się do pola magnetycznego.Osiągnij jednorodność wokół próbki. Dobrą praktyką jest przechowywanie tego w wartościach za pomocą polecenia wsh i odczytywanie ich za pomocą rsh przed topshim, jeśli używasz tych samych lub podobnych próbek. Teraz dostosuj wzmocnienie odbiornika za pomocą polecenia rga, aby osiągnąć maksymalny stosunek sygnału do szumu.Umieść środek widma na przesunięciu rezonansu wody i ustaw impuls protonowy 90 stopni na dużą moc za pomocą calibo1p1. Zbierz widmo protonów za pomocą polecenia zero go zg i przetwórz za pomocą efp. Obejmuje to mnożenie wykładnicze, swobodny rozpad indukcji obejmujący poszerzenie linii, transformację Fouriera FID i pk w celu zastosowania korekcji fazy.Zastosuj aplikację automatycznej korekcji fazy i automatyczną korekcję linii bazowej absn przy użyciu opcji wielomianu bez integracji. Utwórz nowy zestaw danych dla eksperymentu SOFAST HMBC, wybierając pozycję SFHMQC3GPPH w eksperymencie. Skopiuj zoptymalizowane P1 i O1 z widma protonów i wypełnij impulsy zależne od P1 za pomocą polecenia getprosol 1H p1 plw1, gdzie p1 to zoptymalizowana wartość P1, a plw1 to poziom mocy dla P1. Teraz zoptymalizuj stałą CNST54, aby ustawić przesunięcie chemiczne amidu.Zoptymalizuj również CNST55, aby zdefiniować szerokość pasma w celu objęcia interesujących nas obszarów spektralnych, co pozwala na optymalizację wzmocnienia odbiornika. Aby wybrać te parametry, wyodrębnij pierwszy FID z widma dwuwymiarowego i poszukaj obserwowanego sygnału, aby je zdefiniować. Ponadto zmieniaj opóźnienie relaksacji, liczbę skanów i fikcyjne skanowania, aby uzyskać akceptowalną czułość sygnału za pomocą polecenia gs, które umożliwia go i skanowanie w celu monitorowania jakości danych w czasie rzeczywistym.Na koniec zarejestruj widma za pomocą Zero Go zg. Ustaw parametry przetwarzania na rozmiar bezpośrednich wymiarów F2 i pośrednich F1 widma, z opcjonalnym przewidywaniem liniowym w wymiarze pośrednim. Wybierz QSINE jako funkcję Window i wprowadź przesunięcie dzwonu sinusoidalnego o dwa, aby przetworzyć widmo dwuwymiarowe.Wprowadź polecenie xfb, aby przetworzyć dane w obu kierunkach za pomocą funkcji okna i transformacji Fouriera. Użyj polecenia apk2d, aby przeprowadzić automatyczną korekcję fazy w obu kierunkach. Skoryguj linię bazową za pomocą funkcji automatycznej korekcji linii bazowej abs2 dla danych 2D.Spowoduje to zastosowanie funkcji wielomianowej między wartościami ppm zdefiniowanymi w parametrach przetwarzania i wytworzy widmo 2D do dalszej analizy. Jeśli planujesz wykonanie przetwarzania szeregowego w celu porównania danych interakcji z inną cząsteczką, zapisz parametry przetwarzania za pomocą polecenia wpar i przywołaj je za pomocą rpar. Wprowadź polecenie pp, aby rozpocząć proces pobierania szczytów.Zdefiniuj zakres ppm, minimalną intensywność i maksymalną liczbę szczytów na podstawie oczekiwanych szczytów. Następnie kliknij przycisk OK. Sprawdź wyniki poprzez oględziny. W razie potrzeby uruchom proces ponownie, aż wyniki będą zadowalające na podstawie jakości widm.Wygeneruj listę szczytów za pomocą polecenia pp. Ta lista wartości szczytowych zawiera domyślnie informacje o wysokości i intensywności szczytu. Lista szczytów może być eksportowana do kolejnych widm i może być odczytywana przez inne programy.Teraz obserwuj widma białka HSQC pod kątem zmian intensywności pików lub ruchu zmian chemicznych, które wskazują na interakcję z inną cząsteczką. Jeśli oddziałująca cząsteczka jest duża, spodziewaj się zmniejszenia intensywności pików wraz z zanikiem niektórych pików. Zaimportuj listę pików do następnego zestawu danych, klikając na zakładkę pików i wybierając import prawym przyciskiem myszy w oknie pików.Wizualizuj piki w całym spektrum i w razie potrzeby przesuń je w nowe pozycje. Kliknij resetuj intensywność, aby wyświetlić pełną tabelę, aby wygenerować listę pików dla widma, które obejmuje intensywności. Ta lista szczytów przeniesie informacje o pozycji z zapisanej listy szczytów.Wyeksportuj listy szczytów z różnych zestawów danych do arkusza kalkulacyjnego lub innego programu matematycznego w celu analizy, wybierając funkcję Eksportuj. Obliczyć zmianę intensywności pików za pomocą funkcji natężenie piku w widmie zespolonym, natężenie piku w widmie białkowym dla każdego piku. Wartości można przekonwertować na zmianę procentową przez pomnożenie przez 100.Należy zauważyć, że objętości pików są również przydatne, chociaż intensywności pików są łatwiejsze do zmierzenia dla pików, które są umieszczone blisko siebie, jak to zwykle ma miejsce w przypadku białek o dużej gęstości i stosunkowo szerokich pikach. N15HSQC zostały pozyskane dla dzikiego typu E-PRD, a także mutanta R1914E, w obecności lub bez VimRodu. Widmo dzikiego typu E-PRD pokazuje oczekiwaną liczbę dobrze rozdzielonych pików, co wskazuje na prawidłowo pofałdowane białko.W obecności VimRod widmo wykazuje rozległe poszerzenie linii i zanik pików, co odpowiada wiązaniu między E-PRD i VimRodem. Obserwuje się niewielkie zmiany między widmem mutanta R1914E w monoterapii i po dodaniu VimRodu, co wskazuje na brak wiązania z tym zmutowanym E-PRD. Tutaj porównano natężenia pików E-PRD w obecności i bez VimRodu i wykreślono je jako względne intensywności pików, aby wskazać zakres poszerzenia pików w kompleksie E-PRD.Aby zwalidować i określić ilościowo wiązanie VimRod i E-PRD, przeprowadzono analizę MST przy użyciu His6-VimRod znakowanego fluorescencyjnym barwnikiem RED-tris-NTA jako celem, przy użyciu malejących stężeń liganda E-PRD. Dane dopasowano do standardowego modelu jednomiejscowego wiązania liganda i dano KD 25,7 plus minus 2,1 mikromola. Podejmując próbę wykonania tej procedury, należy pamiętać o zastosowaniu identycznych warunków pozyskiwania i przetwarzania.będzie miał trudności z dostępem do próbek białek znakowanych izotopami w celu pobrania widm NMR. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię raka, infekcji lub choroby neurodegeneracyjnej, ponieważ obejmują one tworzenie interakcji białkowych, które są upośledzone w chorobie.

measuring-interactions-globular-filamentous-proteins-nuclear-magnetic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film opisuje technikę spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego do badania interakcji białko-białko pomiędzy 15znakowanymi N dzikimi i zmutowanymi białkami envoplakiny a nieznakowanym białkiem wimentyny. Udana interakcja między envoplakiną typu dzikiego a wimentyną prowadzi do rozległego poszerzenia linii i zaniku pików w widmach NMR, podczas gdy brak interakcji między zmutowaną envoplakiną a wimentyną skutkuje dobrze rozdzielonymi pikami w widmach NMR.

Magnetyczny rezonans jądrowy do badania oddziaływań białko-białko na poziomie atomowym

Ten film demonstruje termoforezę w mikroskali do badania interakcji białko-lipid. Test wykrywa interakcję między cząsteczkami poprzez ilościowe określenie ruchu termoforetycznego białek znakowanych fluorescencyjnie w odpowiedzi na gradient temperatury. Cząsteczka fluorescencyjna jest mieszana z różnymi stężeniami niefluorescencyjnych cząsteczek lipidów, a mieszanina cząsteczek w roztworze jest ładowana do naczyń włosowatych. Do próbek w kapilarach stosuje się gradient temperatury, a ruch...

Termoforeza w mikroskali do badania interakcji białko-lipid w roztworze

Termoforeza w mikroskali (MST) może być szeroko stosowana do określania powinowactwa do wiązania bez oczyszczania docelowego białka z lizatów komórkowych. Protokół obejmuje nadekspresję białka połączonego z GFP, lizę komórek w warunkach niedenaturujących oraz wykrywanie sygnału MST w obecności różnych stężeń liganda.

Metoda oznaczania powinowactwa do wiązań bez oczyszczania białek za pomocą termoforezy w mikroskali

Termoforeza w mikroskali (MST) to czuła technologia do charakteryzowania interakcji aptamer-cel. Niniejszy manuskrypt opisuje protokół MST do charakteryzowania oddziaływań aptamer-małe cząsteczki.

Mapowanie miejsca wiązania aptameru na ATP za pomocą termoforezy w mikroskali

Struktury supramolekularnych zespołów białkowych w rozdzielczości atomowej mają duże znaczenie ze względu na ich kluczowe role w różnych zjawiskach biologicznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół do wykonywania wysokorozdzielczych badań strukturalnych nierozpuszczalnych i niekrystalicznych zespołów białek wielkocząsteczkowych za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w stanie stałym z wirowaniem pod magicznym kątem (MAS SSNMR).

Badania strukturalne układów makromolekularnych w skali atomowej za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w ciele stałym

Termoforeza w mikroskali szybko uzyskuje stałe wiązania przy niskich kosztach materiałowych. Na rynku dostępna jest termoforeza w mikroskali znakowana lub bezetykietowa; Jednak termoforeza bezznacznikowa nie jest w stanie zapewnić różnorodności pomiarów interakcji, które można wykonać przy użyciu etykiet fluorescencyjnych. Udostępniamy protokół dla znakowanych pomiarów termoforezy.

Zastosowanie termoforezy w mikroskali do pomiaru interakcji białko-lipid

Przedstawiono protokół zastosowania spektroskopii NMR wzmacniającej relaksację paramagnetyczną do wykrywania słabych i przejściowych interakcji między- i wewnątrzcząsteczkowych w białkach wewnętrznie nieuporządkowanych.

Wzmocnienie relaksacji paramagnetycznej do wykrywania i charakteryzowania samoasocjacji wewnętrznie nieuporządkowanych białek

Tutaj prezentujemy protokół szczegółowo opisujący pozyskiwanie, przetwarzanie i analizę serii eksperymentów NMR mających na celu scharakteryzowanie interakcji białko-glikan w roztworze. Przedstawiono najpopularniejsze metodologie oparte na ligandach i białkach, które niewątpliwie przyczyniają się do rozwoju glikobiologii strukturalnej i badań nad rozpoznawaniem molekularnym.

Rozplątywanie oddziaływań glikan-białko: magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) na ratunek

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) może scharakteryzować dynamikę strukturalną białka w sposób specyficzny dla reszt. Udostępniamy praktyczny protokół do rejestrowania eksperymentów z relaksacją NMR 15N R1 i R2 oraz eksperymentów z heterojądrowym efektem Overhausera (hetNOE) {1H}-15N, wrażliwych na skalę czasową od pikosekund do nanosekund.

NMR 15N Eksperymenty relaksacyjne do badania dynamiki strukturalnej białek z pikosekundy na nanosekundy

Ten protokół oparty na NMR bada słabe interakcje białko-glikan przy użyciu cyjanowiryny-N i D-mannozy. Łącząc metody wykrywania ligandów i białek, mapuje miejsca wiązania, wykrywa efekty allosteryczne i identyfikuje kompleksy spotkań. Podejście to obejmuje przygotowanie próbek i analizę danych, oferując strukturalne i dynamiczne spostrzeżenia cenne dla mechanizmów diagnostyki i rozpoznawania specyficznych dla glikanów.

Badanie interakcji białko-glikan: postępy w magnetycznym rezonansie jądrowym

Odkryj metodę pomiaru oddziaływań białek kulistych i nitkowatych za pomocą spektroskopii NMR i termoforezy MST. Protokół umożliwia szybką analizę wiązań na poziomie atomowym.

Pomiar oddziaływań białek kulistych i nitkowatych za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i termoforezy w mikroskali (MST) (Wideo) | JoVE Journal

Pomiar oddziaływań białek kulistych i nitkowatych za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i termoforezy w mikroskali (MST)

Przeglądaj więcej filmów