Pomiar oddziaływań białek kulistych i nitkowatych za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i termoforezy w mikroskali (MST)

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie interakcji białkowych, takie jak to, czy białko wiąże się bezpośrednio z małą czy dużą cząsteczką. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to prosty i szybki sposób wykrywania bezpośrednich oddziaływań na poziomie atomowym. Włącz przepływ powietrza za pomocą polecenia eject ej.

Spowoduje to podniesienie próbki z magnesu. Teraz umieść próbkę w wirniku na magnesie w otworze. Wstaw za pomocą polecenia ij.

Zanim przejdziesz dalej, poczekaj, aż próbka osiądzie w magnesie. Utwórz nowy zestaw danych za pomocą polecenia edc i załaduj standardowe parametry NMR protonu, wybierając eksperyment ZGPR. Wypełnij pola NAZWA, numer eksperymentu i numer folderu przetworzonych danych.

Wybierz rozpuszczalnik w polu Ustaw rozpuszczalnik i kliknij Wykonaj getprosol, aby odczytać standardowe parametry zależne od głowicy sondy i rozpuszczalnika. Zablokuj próbkę w deuterowanym rozpuszczalniku za pomocą polecenia zamknij i poczekaj, aż zakończy zamiatanie i osiągnie blokadę. Skoryguj częstotliwość rezonansową magnesu, dostrajając próbkę za pomocą automatycznego polecenia strojenia atma.

Monitoruj krzywą chybotania, aż do zakończenia automatycznego strojenia. Podkładka pod pole magnetyczne za pomocą podkładki górnej. Shimming umożliwia dostosowanie się do pola magnetycznego.

Osiągnij jednorodność wokół próbki. Dobrą praktyką jest przechowywanie tego w wartościach za pomocą polecenia wsh i odczytywanie ich za pomocą rsh przed topshim, jeśli używasz tych samych lub podobnych próbek. Teraz dostosuj wzmocnienie odbiornika za pomocą polecenia rga, aby osiągnąć maksymalny stosunek sygnału do szumu.

Umieść środek widma na przesunięciu rezonansu wody i ustaw impuls protonowy 90 stopni na dużą moc za pomocą calibo1p1. Zbierz widmo protonów za pomocą polecenia zero go zg i przetwórz za pomocą efp. Obejmuje to mnożenie wykładnicze, swobodny rozpad indukcji obejmujący poszerzenie linii, transformację Fouriera FID i pk w celu zastosowania korekcji fazy.

Zastosuj aplikację automatycznej korekcji fazy i automatyczną korekcję linii bazowej absn przy użyciu opcji wielomianu bez integracji. Utwórz nowy zestaw danych dla eksperymentu SOFAST HMBC, wybierając pozycję SFHMQC3GPPH w eksperymencie. Skopiuj zoptymalizowane P1 i O1 z widma protonów i wypełnij impulsy zależne od P1 za pomocą polecenia getprosol 1H p1 plw1, gdzie p1 to zoptymalizowana wartość P1, a plw1 to poziom mocy dla P1. Teraz zoptymalizuj stałą CNST54, aby ustawić przesunięcie chemiczne amidu.

Zoptymalizuj również CNST55, aby zdefiniować szerokość pasma w celu objęcia interesujących nas obszarów spektralnych, co pozwala na optymalizację wzmocnienia odbiornika. Aby wybrać te parametry, wyodrębnij pierwszy FID z widma dwuwymiarowego i poszukaj obserwowanego sygnału, aby je zdefiniować. Ponadto zmieniaj opóźnienie relaksacji, liczbę skanów i fikcyjne skanowania, aby uzyskać akceptowalną czułość sygnału za pomocą polecenia gs, które umożliwia go i skanowanie w celu monitorowania jakości danych w czasie rzeczywistym.

Na koniec zarejestruj widma za pomocą Zero Go zg. Ustaw parametry przetwarzania na rozmiar bezpośrednich wymiarów F2 i pośrednich F1 widma, z opcjonalnym przewidywaniem liniowym w wymiarze pośrednim. Wybierz QSINE jako funkcję Window i wprowadź przesunięcie dzwonu sinusoidalnego o dwa, aby przetworzyć widmo dwuwymiarowe.

Wprowadź polecenie xfb, aby przetworzyć dane w obu kierunkach za pomocą funkcji okna i transformacji Fouriera. Użyj polecenia apk2d, aby przeprowadzić automatyczną korekcję fazy w obu kierunkach. Skoryguj linię bazową za pomocą funkcji automatycznej korekcji linii bazowej abs2 dla danych 2D.

Spowoduje to zastosowanie funkcji wielomianowej między wartościami ppm zdefiniowanymi w parametrach przetwarzania i wytworzy widmo 2D do dalszej analizy. Jeśli planujesz wykonanie przetwarzania szeregowego w celu porównania danych interakcji z inną cząsteczką, zapisz parametry przetwarzania za pomocą polecenia wpar i przywołaj je za pomocą rpar. Wprowadź polecenie pp, aby rozpocząć proces pobierania szczytów.

Zdefiniuj zakres ppm, minimalną intensywność i maksymalną liczbę szczytów na podstawie oczekiwanych szczytów. Następnie kliknij przycisk OK. Sprawdź wyniki poprzez oględziny. W razie potrzeby uruchom proces ponownie, aż wyniki będą zadowalające na podstawie jakości widm.

Wygeneruj listę szczytów za pomocą polecenia pp. Ta lista wartości szczytowych zawiera domyślnie informacje o wysokości i intensywności szczytu. Lista szczytów może być eksportowana do kolejnych widm i może być odczytywana przez inne programy.

Teraz obserwuj widma białka HSQC pod kątem zmian intensywności pików lub ruchu zmian chemicznych, które wskazują na interakcję z inną cząsteczką. Jeśli oddziałująca cząsteczka jest duża, spodziewaj się zmniejszenia intensywności pików wraz z zanikiem niektórych pików. Zaimportuj listę pików do następnego zestawu danych, klikając na zakładkę pików i wybierając import prawym przyciskiem myszy w oknie pików.

Wizualizuj piki w całym spektrum i w razie potrzeby przesuń je w nowe pozycje. Kliknij resetuj intensywność, aby wyświetlić pełną tabelę, aby wygenerować listę pików dla widma, które obejmuje intensywności. Ta lista szczytów przeniesie informacje o pozycji z zapisanej listy szczytów.

Wyeksportuj listy szczytów z różnych zestawów danych do arkusza kalkulacyjnego lub innego programu matematycznego w celu analizy, wybierając funkcję Eksportuj. Obliczyć zmianę intensywności pików za pomocą funkcji natężenie piku w widmie zespolonym, natężenie piku w widmie białkowym dla każdego piku. Wartości można przekonwertować na zmianę procentową przez pomnożenie przez 100.

Należy zauważyć, że objętości pików są również przydatne, chociaż intensywności pików są łatwiejsze do zmierzenia dla pików, które są umieszczone blisko siebie, jak to zwykle ma miejsce w przypadku białek o dużej gęstości i stosunkowo szerokich pikach. N15HSQC zostały pozyskane dla dzikiego typu E-PRD, a także mutanta R1914E, w obecności lub bez VimRodu. Widmo dzikiego typu E-PRD pokazuje oczekiwaną liczbę dobrze rozdzielonych pików, co wskazuje na prawidłowo pofałdowane białko.

W obecności VimRod widmo wykazuje rozległe poszerzenie linii i zanik pików, co odpowiada wiązaniu między E-PRD i VimRodem. Obserwuje się niewielkie zmiany między widmem mutanta R1914E w monoterapii i po dodaniu VimRodu, co wskazuje na brak wiązania z tym zmutowanym E-PRD. Tutaj porównano natężenia pików E-PRD w obecności i bez VimRodu i wykreślono je jako względne intensywności pików, aby wskazać zakres poszerzenia pików w kompleksie E-PRD.

Aby zwalidować i określić ilościowo wiązanie VimRod i E-PRD, przeprowadzono analizę MST przy użyciu His6-VimRod znakowanego fluorescencyjnym barwnikiem RED-tris-NTA jako celem, przy użyciu malejących stężeń liganda E-PRD. Dane dopasowano do standardowego modelu jednomiejscowego wiązania liganda i dano KD 25,7 plus minus 2,1 mikromola. Podejmując próbę wykonania tej procedury, należy pamiętać o zastosowaniu identycznych warunków pozyskiwania i przetwarzania.

będzie miał trudności z dostępem do próbek białek znakowanych izotopami w celu pobrania widm NMR. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię raka, infekcji lub choroby neurodegeneracyjnej, ponieważ obejmują one tworzenie interakcji białkowych, które są upośledzone w chorobie.