Name: Cyfrowa analiza barwienia immunologicznego białka oddziałującego ZW10 w tkankach płuc człowieka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Poznaj metodę cyfrowej analizy barwienia immunohistochemicznego białka ZWINT w tkankach płuc człowieka. Technika ta zapewnia wysokiej jakości obrazy cyfrowe całych preparatów i niezawodne wyniki badań nad rakiem płuc.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt był wspierany przez Narodową Fundację Naturalną Chin (nr 81500151, 81400121, 81270607, 81541027 i 81501352) oraz Fundację Naturalną Prowincji Hubei (Chiny) (nr 2017CFB631). Autorzy wyrażają uznanie dla Guo Qin, Chang Min, Li Hui i ich kolegów z Wuhan Google Biological Technology Co., LTD za ich wsparcie techniczne. Autorzy dziękują również Muhammadowi Jamalowi za redakcję językową.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Szpitala Zhongnan Uniwersytetu Wuhan i Szpitala Renmin Uniwersytetu Wuhan.
1. Przygotowanie slajdów IHC
<ol>
	<li>Utrwalić próbkę tkanki płucnej, zanurzając fragment ludzkiej tkanki płucnej (około 3 x 3 cm) w 4% paraformaldehydzie w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na 24 godziny w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Odwodnić tkankę w 80%, 95% i 100% etanolu odpowiednio przez 15 minut, 20 minut i 20 minut w temperaturze pokojowej. Na koniec zanurz chusteczkę w 100% ksylenie 3x po 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>W celu zatopienia zanurzyć tkankę w parafinie (63 °C) na 30 minut. Zmienić parafinę i ponownie zanurzyć tkankę na kolejne 45 minut. Na koniec należy ponownie zmienić parafinę i zanurzyć w niej tkankę na dodatkowy 1 h.</li>
	<li>Za pomocą mikrotomu obrotowego pokrój tkankę na odcinki o grubości 5 μm i umieść je na szkiełkach pokrytych poli-L-lizyną o pojemności 20 μg/ml.</li>
	<li>W celu odparafinowania umieścić szkiełka w piecu o temperaturze 65 °C na 2 godziny, a następnie zanurzyć skrawki w dimetylobenzenie na 15 minut, a następnie namoczyć w 100% ksylenie przez 15 minut.</li>
	<li>Nawilżaj szkiełka z sekcjami tkanek 2x przez 5 minut w 100% etanolu, a następnie poddaj je działaniu seryjnie rozcieńczanego etanolu przez 5 minut w 95% etanolu, 5 minut w 80% etanolu, 5 minut w 70% etanolu i 5 minut w 50% etanolu.</li>
	<li>Wykonaj naprawę antygenu.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć płyn naprawczy z kwasem cytrynowym (20x) do 1x z podwójnie destylowanymH2O(ddH2O).</li>
		<li>Umieść szkiełka z sekcjami tkanek i 1x płynem naprawczym kwasu cytrynowego (300 ml) w pudełku naprawczym antygenu, a następnie podgrzej je w kuchence mikrofalowej z dużą mocą przez 2 minuty, a następnie podgrzej przy niskiej mocy, aby utrzymać wrzenie przez 6 minut.</li>
		<li>Pozwól sekcjom naturalnie ostygnąć do temperatury pokojowej.</li>
		<li>Zastąp płyn naprawczy kwasu cytrynowego 0,01 M PBS, umyj sekcje 3x, za każdym razem przez 5 minut, w wytrząsarce obrotowej w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyeliminuj endogenną peroksydazę.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 30% H2O2 do 3% za pomocą ddH2O, dodać do szkiełek (upewnić się, że pokrywa wszystkie tkanki) i inkubować szkiełka w mokrym pudełku w temperaturze pokojowej przez 30 min. 
		Uwaga: Mokre pudełko to plastikowe pudełko o wymiarach 10 x 15 cm, które może zawierać wodę.</li>
		<li>Umyj szkiełka 3x, za każdym razem przez 5 minut, 0,01 M PBS w wytrząsarce obrotowej w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zablokuj niespecyficzny antygen.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć skoncentrowaną normalną surowicę kozią do 10% surowicy koziej za pomocą PBS z 0,1% Tween 20 (PBST).</li>
		<li>Dodać 10% koziej surowicy do szkiełek i inkubować je w mokrym pudełku w temperaturze 37 °C przez 30 min. 
		Uwaga: Surowica kozia powinna pokrywać wszystkie tkanki w szkiełkach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poplamić tkanki.
	<ol>
		<li>Inkubować szkiełka z króliczym przeciwciałem anty-ludzkim anty-ZWINT (1:50) w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Umyj szkiełka 3 razy, za każdym razem przez 5 minut, 0,01 M PBST (1 ml 0,1% Tween 20 w 1,000 ml PBS) w wytrząsarce obrotowej w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Inkubować szkiełka z przeciwciałem drugorzędowym (system wykrywania przeciwciał przeciw królikom, 1:200) przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Umyć szkiełka 3x, za każdym razem przez 5 minut, 0,01 M PBST w wytrząsarce obrotowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby uwidocznić barwienie immunologiczne, dodaj szkiełka do 300 μl świeżej 3,3-diaminobenzydyny, a następnie umyj szkiełka wodą z kranu o temperaturze pokojowej. 
	Uwaga: Stopień zabarwienia jest monitorowany pod mikroskopem (powiększenie 10X - 40X).</li>
	<li>Przeciwplamić tkankę. Szkiełka należy barwić roztworem barwiącym hematoksylinę przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie myć szkiełka wodą z kranu przez 15 minut 
	Uwaga: Jądro pod mikroskopem wydaje się niebieskie (powiększenie 10X - 40X). Jeśli stopień zabarwienia na niebiesko jest silniejszy, można zastosować różnicowanie alkoholu solnego przez 3 - 5 sekund, a następnie spłukać tkankę z powrotem do niebieskiego koloru wodą z kranu przez 15 minut, aby ułatwić wyraźne zabarwienie tkanki.</li>
	<li>Odwadniać szkiełka przez 5 minut w 50% etanolu, 5 minut w 70% etanolu, 2x w 80% etanolu przez 5 minut, 5 minut w 95% etanolu, a na koniec 2x po 5 minut w 100% etanolu w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Aby uzyskać przezroczystość, zanurz skrawki tkanki w zbiorniku zawierającym 100% ksylenu na 15 minut i przenieś skrawki do innego zbiornika zawierającego 100% ksylenu na 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Do uszczelnienia weź 50 - 100 μl neutralnej gumy i dodaj 5% ksylenu do mieszanki (unikaj mieszania w bąbelkach). Dodać 15 μl wyżej wymienionej mieszaniny do skrawków tkanki płucnej. Uszczelnij folię szkłem nakrywkowym i delikatnie wyciśnij bąbelki.</li>
</ol>
2. Automatyczne skanowanie slajdów IHC na całej powierzchni
<ol>
	<li>Pozostaw uszczelnione szkiełka do wyschnięcia na 12 godzin w temperaturze pokojowej, aby je wysuszyć.</li>
	<li>Wybierz opcję Jasne pole ręcznie i przejdź do interfejsu skanowania ręcznego.</li>
	<li>Popraw nazwy slajdów i wybierz ścieżkę przechowywania obrazów.</li>
	<li>Ustaw obszar skanowania i wybierz opcję Skanuj próbki przy użyciu progów ustawionych przez użytkownika. Próg wynosi około 50 przy wartości rozszerzalności obszaru skanowania 200 μm.</li>
	<li>Ustaw wartość ostrości skanowania, wybierz ostrość automatycznie — w zakresie od 1050 do 2650 — a na koniec wybierz tryb jednowarstwowy.</li>
	<li>Załaduj slajdy IHC na stację roboczą i rozpocznij automatyczne skanowanie. 
	Uwaga: Upewnij się, że prowadnice nie są uszkodzone. Utrzymuj szkiełka w czystości i półprzezroczyste oraz unikaj kurzu, konfetti i nadmiaru pozostałości szczeliwa na slajdach. Szkiełko podstawowe i szkiełko nakrywkowe powinny być pozbawione śladów. Nie czyścić szkiełek ksylenem. Rozmiar szkiełek podano w tabeli 1.</li>
	<li>Automatycznie skanuj cały wycinek tkanki na szkiełku z powiększeniem 20x, 40x lub 100x.</li>
	<li>Zbierz i zapisz obrazy po zakończeniu skanowania całego slajdu.</li>
</ol>
3. Analiza slajdów za pomocą oprogramowania do obrazowania
<ol>
	<li>Uruchom oprogramowanie do analizy obrazu histopatologicznego i wybierz opcję Komputer lokalny.</li>
	<li>Otwórz plik, w którym przechowywane są dane skanowania.</li>
	<li>Wybierz odpowiedni poziom powiększenia z zakresu od 2X do 40X.</li>
	<li>Dostosuj kolor, aby ustawić optymalny kontrast za pomocą opcji Przełącz regulację koloru.</li>
	<li>Ręcznie zakreśl i nazwij interesujące Cię części na każdym obrazie. 
	Uwaga: Na przykład możesz zakreślić jeden obszar i nazwać go obszarem guza</li>.
	<li>Wybierz Wtyczki i kontrola jakości. W tym momencie pojawi się kreator scenariuszy.</li>
	<li>Wybierz opcję Density quant (Kwantowa gęstość) i dostosuj pasek wykrywania. 
	Uwaga: Ten proces należy wykonać ostrożnie. Pasek tolerancji niebieskiego służy do regulacji koloru jądra komórkowego. Pasek tolerancji brązu służy do dostosowywania nasycenia koloru wypełnienia na obrazie. Wyniki obrazów po korektach powinny być zgodne z oryginalnymi odpowiednikami.</li>
	<li>Dostosuj poziomy punktacji, aby intensywność barwienia zakreślonych obszarów była zbliżona do intensywności oryginalnych obrazów. 
	Uwaga: Ciemnobrązowy oznacza silny pozytyw, brązowawo-żółty jest umiarkowanie pozytywny, jasnożółty jest słabo pozytywny, a biały jest negatywny.</li>
	<li>Zapisz i nazwij model jako plik. Zastosuj model do innych slajdów i wybierz opcję Wybrana adnotacja".</li>
	<li>Pozwól oprogramowaniu automatycznie obliczyć wskaźnik H dla zakreślonych obszarów na obrazie.</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja wyników za pomocą systemu punktacji H9,10
<ol>
	<li>Oblicz procentowy udział barwienia immunologicznego i intensywność barwienia (0: negatywny, 1+: słaby, 2+: umiarkowany, 3+: silny).</li>
	<li>Użyj systemu punktacji (H-score), aby obliczyć patologiczne nachylenie guza i sąsiednich obszarów nienowotworowych. 
	Uwaga: Wynik H = (% komórek o słabej intensywności x 1) + (% komórek o umiarkowanej intensywności x 2) + (% komórek o dużej intensywności x 3). Dlatego maksymalny wynik H wynosi 300, jeśli 100% komórek jest oznaczanych ilościowo z dużą intensywnością.</li>
</ol>

<ol><li>Endo, H., Ikeda, K., Urano, T., Horie-Inoue, K., Inoue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terf%2FTRIM17+stimulates+degradation+of+kinetochore+protein+ZWINT+and+regulates+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Terf/TRIM17 stimulates degradation of kinetochore protein ZWINT and regulates cell proliferation.</a> The Journal of Biochemistry. 151 (2), 139-144 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Zwint-1+specifies+localization+of+Zeste+White+10+to+kinetochores+and+is+essential+for+mitotic+checkpoint+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human Zwint-1 specifies localization of Zeste White 10 to kinetochores and is essential for mitotic checkpoint signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (52), 54590-54598 (2004).</li>
<li>Lin, Y. T., Chen, Y., Wu, G., Lee, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hec1+sequentially+recruits+Zwint-1+and+ZW10+to+kinetochores+for+faithful+chromosome+segregation+and+spindle+checkpoint+control%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Hec1 sequentially recruits Zwint-1 and ZW10 to kinetochores for faithful chromosome segregation and spindle checkpoint control.</a> Oncogene. 25 (52), 6901-6914 (2006).</li>
<li>Ying, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Zwint+predicts+poor+prognosis+and+promotes+the+proliferation+of+hepatocellular+carcinoma+by+regulating+cell-cycle-related+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22OncoTargets+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Zwint predicts poor prognosis and promotes the proliferation of hepatocellular carcinoma by regulating cell-cycle-related proteins.</a> OncoTargets and Therapy. 11, 689-702 (2018).</li>
<li>Yuan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatic+analysis+of+prognostic+value+of+ZW10+interacting+protein+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22OncoTargets+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Bioinformatic analysis of prognostic value of ZW10 interacting protein in lung cancer.</a> OncoTargets and Therapy. 11, 1683-1695 (2018).</li>
<li>Higgins, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+and+challenges+of+digital+pathology+and+whole+slide+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Applications and challenges of digital pathology and whole slide imaging.</a> Biotechnic & Histochemistry. 90 (5), 341-347 (2015).</li>
<li>Webster, J. D., Dunstan, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-slide+imaging+and+automated+image+analysis%3A+considerations+and+opportunities+in+the+practice+of+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).</li>
<li>Al-Janabi, S., Huisman, A., van Diest, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+pathology%3A+current+status+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Digital pathology: current status and future perspectives.</a> Histopathology. 61 (1), 1-9 (2012).</li>
<li>Bonomi, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+biomarkers+for+response+to+EGFR-directed+monoclonal+antibodies+for+advanced+squamous+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Predictive biomarkers for response to EGFR-directed monoclonal antibodies for advanced squamous cell lung cancer.</a> Annals of Oncology. 29 (8), 1701-1709 (2018).</li>
<li>Villalobos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERCC1+assessment+in+upfront+treatment+with+and+without+cisplatin-based+chemotherapy+in+stage+IIIB%2FIV+non-squamous+non-small+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Oncology%22%5BJournal%5D)">ERCC1 assessment in upfront treatment with and without cisplatin-based chemotherapy in stage IIIB/IV non-squamous non-small cell.</a> Medical Oncology. 35 (7), 106(2018).</li>
<li>Griffin, J., Treanor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+pathology+in+clinical+use%3A+where+are+we+now+and+what+is+holding+us+back%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Digital pathology in clinical use: where are we now and what is holding us back?</a> Histopathology. 70 (1), 134-145 (2017).</li>
<li>Huisman, A., Looijen, A., van den Brink, S. M., van Diest, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+a+fully+digital+pathology+slide+archive+by+high-volume+tissue+slide+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">Creation of a fully digital pathology slide archive by high-volume tissue slide scanning.</a> Human Pathology. 41 (5), 751-775 (2010).</li>
<li>Gray, A., Wright, A., Jackson, P., Hale, M., Treanor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+histochemical+stains+using+whole+slide+imaging%3A+development+of+a+method+and+demonstration+of+its+usefulness+in+laboratory+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Quantification of histochemical stains using whole slide imaging: development of a method and demonstration of its usefulness in laboratory quality control.</a> Journal of Clinical Pathology. 68 (3), 192-199 (2015).</li>
<li>Hofman, F. M., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry.</a> Current Protocols in Immunology. 103, Unit 21.4 (2013).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+Methods+of+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Principles and Methods of Immunohistochemistry.</a> Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).</li>
<li>Otali, D., Fredenburgh, J., Oelschlager, D. K., Grizzle, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standard+tissue+as+a+control+for+histochemical+and+immunohistochemical+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">A standard tissue as a control for histochemical and immunohistochemical staining.</a> Biotechnic & Histochemistry. 91 (5), 309-326 (2016).</li>
<li>Clarke, E. L., Treanor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colour+in+digital+pathology%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Colour in digital pathology: a review.</a> Histopathology. 70 (2), 153-163 (2017).</li>
<li>Potts, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+pathology+in+drug+discovery+and+development%3A+multisite+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Digital pathology in drug discovery and development: multisite integration.</a> Drug Discovery Today. 14 (19-20), 935-941 (2009).</li>
<li>Tabata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-slide+imaging+at+primary+pathological+diagnosis%3A+Validation+of+whole-slide+imaging-based+primary+pathological+diagnosis+at+twelve+Japanese+academic+institutes%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology+International%22%5BJournal%5D)">Whole-slide imaging at primary pathological diagnosis: Validation of whole-slide imaging-based primary pathological diagnosis at twelve Japanese academic institutes.</a> Pathology International. 67 (11), 547-554 (2017).</li>
<li>Saco, A., Bombi, J. A., Garcia, A., Ramírez, J., Ordi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Status+of+Whole-Slide+Imaging+in+Education%5BTitle%5D)+AND+%22Pathobiology%22%5BJournal%5D)">Current Status of Whole-Slide Imaging in Education.</a> Pathobiology. 83 (2-3), 79-88 (2016).</li>
<li>Griffin, J., Treanor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+pathology+in+clinical+use%3A+where+are+we+now+and+what+is+holding+us+back%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Digital pathology in clinical use: where are we now and what is holding us back?</a> Histopathology. 70 (1), 134-145 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Skanowanie całych preparatów staje się gorącym tematem ze względu na solidne skanowanie i produkcję wysokiej jakości obrazów do celów klinicznych i badawczych 11,12,13. Obrazy mogą być tworzone przez mikroskopy skaningowe w ciągu kilku minut 11,12,13. Stosując tę metodologię, uzyskaliśmy wysokiej jakości obrazy dla szkiełek ZWINT IHC i ...

Białko oddziałujące ZW10 (ZWINT) jest niezbędnym składnikiem kompleksu kinetochorowego, który jest zaangażowany w punkt kontrolny wrzeciona mitotycznego1,2,3. Doniesiono, że wyczerpanie ZWINT prowadzi do nieprawidłowej przedwczesnej segregacji chromosomów1,2,3. Ostatnie badania sugerują, że ZWINT bierze udział w patogenezie wielu nowotworów poprzez promowanie proliferacji komórek nowotworowych4,5. Wcześniej informowaliśmy o nadekspresji ZWINT w raku płuc5. Powszechnie przyjmuje się, że analiza preparatów przez patologów przy użyciu CLM jest czasochłonna i nie jest ilościowa6,7,8. Co więcej, pogorszenie stanu przechowywanych szkiełek może uniemożliwić wycofanie wcześniej utworzonych szkiełek. Pojawiająca się metoda komputerowego, cyfrowego obrazowania całego preparatu (WSI) może przezwyciężyć te ograniczenia6,7,8.
W tym celu opisujemy metodologię barwienia immunologicznego ZWINT w tkankach ludzkiego raka płuc, połączoną z cyfrowym skanowaniem całego slajdu i analizą obrazu opartą na oprogramowaniu. Główną zaletą tej metodologii jest uzyskanie wyników zgodnych z CLM. Technologia ta może być szeroko stosowana w obszarach patologicznej oceny barwienia hematoksyliną-eozyną (H&E) i IHC, fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH), mikromacierzy tkankowych (TMA) oraz odkrywania i opracowywania leków.

<table><tbody><tr><td>Pannoramic MIDI</td><td>3D HISTECH</td><td>Kat: PMIDI-040709</td><td>Zautomatyzowany cyfrowy skaner slajdów z niezwykłym zestawem funkcji: pojemność 12 slajdów, skanowanie fluorescencyjne i wiele innych.</td></tr><tr><td>QuantCenter</td><td>3D HISTECH</td><td>Pobrane z oficjalnej strony internetowej firmy</td><td>Framework dla aplikacji do analizy obrazu firmy 3DHISTCH.</td></tr><tr><td>LEICA RM2235</td><td>Leica Microsystems</td><td>Cat: 14050038604</td><td>Zwiększona precyzja nowych akcesoriów zwiększy wygodę zbliżania się do noża, a także orientacji próbki.</td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało anty-ludzkie anty-ZWINT</td><td>Abcam</td><td>Kot: ab197794</td><td>Analiza immunohistochemiczna ZWINT w ludzkiej tkance płucnej.</td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne przeciw królikowi</td><td>Wuhan Goodbio Technology</td><td>Cat:GB23303-1</td><td>Przeciwciało drugorzędowe do barwienia IHC.</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Wuhan Goodbio Technology</td><td>Cat:G0002</td><td>Roztwór zawierający bufor fosforanowy.</td></tr><tr><td>OLYMPUS CX23</td><td>OLYMPUS</td><td>Cat:6M87620</td><td>Mikroskop do wykrywania H& Prowadnice E lub IHC.</td></tr><tr><td>Odczynnik chemiczny Dimethylbenzene</td><td>Shanghai Lingfeng</td><td>Kategoria: 1330-20-7</td><td>Bezbarwny, łatwopalny płyn stosowany jako rozpuszczalnik i środek klarujący w przygotowywaniu skrawków tkanek do badań mikroskopowych.</td></tr><tr><td>Roztwór do barwienia hematoksyliny</td><td>Wuhan Servicetechnologia bio</td><td>Kot: G1039</td><td>Jest powszechnie stosowany do badań histologicznych, często barwi jądra komórek na niebiesko.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Baitg</td><td>Cat:2005-64-5</td><td>Jest to niejonowy środek powierzchniowo czynny typu polisorbatowego powstały w wyniku etoksylacji sorbitanu przed dodaniem kwasu laurynowego. Jest stosowany jako środek odstraszający i emulgujący w zastosowaniach farmakologicznych.</td></tr><tr><td>Płyn naprawczy z kwasem cytrynowym</td><td>Technologia Wuhan Servicebio</td><td>Cat: G1202</td><td>Is służy do naprawy antygenu po utrwaleniu podczas procedury IHC.</td></tr><tr><td>LEICA ASP200s</td><td>Leica</td><td>Cat: 14048043626</td><td>Został zaprojektowany do rutynowych i badawczych badań histopatologicznych do 200 kaset.</td></tr><tr><td>LEICA Arcadia H Leica Cat</td><td></td><td>: 14039354103</td><td>Jest to podgrzewana stacja do zatapiania parafiny, która pozwala na prostą obsługę i precyzyjną kontrolę, co skutkuje lepszą jakością, płynnym przepływem pracy i niezawodnością.</td></tr><tr><td>LEICA Arcadia C</td><td>Leica</td><td>Cat: 14039354102</td><td>Jest to zimna płyta mieszcząca ponad 60/65 kaset na dużej powierzchni roboczej. Został zaprojektowany z adaptacyjnym modułem sterującym środowiskiem, aby zapewnić, że temperatura robocza jest zawsze stabilizowana na poziomie -6&deg;C.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie CaseViewer</td><td>3DHISTECH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cyfrowa analiza barwienia immunologicznego białka oddziałującego zw10 w tkankach płuc człowieka

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

Celem tego badania jest wprowadzenie metodologii barwienia immunologicznego tkanek płuc ludzkich, a następnie cyfrowego skanowania całego preparatu i analizy obrazu. Skanowanie cyfrowe to szybki sposób skanowania stosu slajdów i tworzenia obrazów cyfrowych o wysokiej jakości. Może dawać wyniki zgodne z konwencjonalną mikroskopią świetlną (CLM) przez patologów. Co więcej, dostępność obrazów cyfrowych sprawia, że ten sam slajd może być jednocześnie obserwowany przez wiele osób. Co więcej, cyfrowe obrazy preparatów mogą być przechowywane w bazie danych, co pozwala uniknąć długotrwałego niszczenia szkiełek. Ograniczenia tej techniki są następujące. Po pierwsze, potrzebna jest wysokiej jakości przygotowana tkanka, a oryginalna immunohistochemia (IHC) szkiełkuje bez żadnych uszkodzeń i nadmiaru pozostałości szczeliwa. Po drugie, obszary guza lub nienowotworowe powinny być określone przez doświadczonych patologów przed analizą za pomocą oprogramowania, aby uniknąć nieporozumień dotyczących guza lub obszarów nienowotworowych podczas oceniania. Po trzecie, operator musi kontrolować odwzorowanie kolorów w całym procesie digitalizacji w obrazowaniu całego slajdu.

Za pomocą metody IHC zmierzyliśmy poziomy ekspresji ZWINT w 28 parach próbek niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC) (tkanki nowotworowej i sąsiadujących tkankach nienowotworowych), w tym w 14 rakach płaskonabłonkowych (SCC) i 14 gruczolakach (ADC). Cyfrowe skanowanie całych preparatów pozwoliło na uzyskanie wysokiej jakości obrazów cyfrowych (Rycina 1A). Wyniki wykazały, że wskaźnik H-score dla raka płuca był znacząco wyższy niż dla sąsiadujących tkanek nien...

Białko oddziałujące ZW10 (ZWINT) uczestniczy w punkcie kontrolnym wrzeciona mitotycznego i patogenezie raka. W tym miejscu przedstawiamy metodologię barwienia immunologicznego ZWINT w tkankach ludzkiego raka płuca, a następnie cyfrowe skanowanie całych preparatów i analizę obrazu. Ta metodologia może zapewnić wysokiej jakości obrazy cyfrowe i wiarygodne wyniki.

Cyfrowa analiza barwienia immunologicznego białka oddziałującego ZW10 w tkankach płuc człowieka

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu patomorfologii i immunohistochemii. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest wystarczająco szybsza i tworzy multimedia cyfrowe o wysokiej jakości. Zacznij od utrwalenia próbki tkanki kung o wymiarach trzy na trzy centymetry w 4% paraformaldehydzie przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.Następnego dnia odwodnić tkankę w rosnących zanurzeniach etanolu w temperaturze pokojowej, a następnie trzykrotnie zanurzyć w 100% ksylenie przez 20 minut na zabieg. Po ostatnim zanurzeniu w ksylenie umieść tkankę w parafinie o temperaturze 63 stopni Celsjusza na 30 minut, a następnie drugie 45-minutowe zanurzenie w świeżej parafinie o temperaturze 63 stopni Celsjusza, a następnie zmień parafinę jeszcze raz na ostatnią godzinną inkubację. Gdy parafina ostygnie, za pomocą mikrotomu obrotowego należy pobrać pięć odcinków tkanki o grubości mikrometra próbki tkanki zatopionej w parafinie, przechwytując skrawki na szkiełkach pokrytych poli-L-lizyną o grubości 20 mikrogramów na mililitr.W celu odparafinowania umieść szkiełka w piekarniku o temperaturze 65 stopni Celsjusza na dwie godziny, a następnie zanurz w dimetylobenzenie na 15 minut i namocz w 100% ksylenie przez 15 minut, a następnie ponownie nawodnij szkiełka w malejącej serii zanurzenia w etanolu. W celu naprawy antygenu umieść szkiełka w pudełku naprawczym antygenu i dodaj do pudełka 300 mililitrów płynu naprawczego z kwasem cytrynowym. Podgrzej pudełko w kuchence mikrofalowej na dużej mocy przez dwie minuty, a następnie podgrzej na małej mocy, aby utrzymać wrzenie przez sześć minut.Gdy szkiełka ostygną do temperatury pokojowej, umyj próbki tkanek trzema pięciominutowymi 0,01 molowymi PBS w wytrząsarce obrotowej o temperaturze pokojowej. Aby wyeliminować endogenną peroksydazę, inkubuj szkiełka z 3% nadtlenkiem wodoru w podwójnie destylowanej wodzie przez 30 minut w wilgotnym pudełku w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji umyć szkiełka, jak pokazano, i zatkać wszelkie niespecyficzne wiązania na każdej sekcji 100 mikrolitrami 10% koziej surowicy przez 39 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie oznacz tkanki 100 mikrolitrami przeciwciała anty-ZWINT na szkiełko w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, a następnie trzykrotnie przepłucz w 0,01 molowym PBS. Po ostatnim płukaniu inkubować szkiełka z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie trzy przemywania PBS 0,01 molowym. Po ostatnim praniu dodaj szkiełka do 300 mikrolitrów świeżego DAB na 10 minut, a następnie umyj 10-sekundowym myciem wodą z kranu o temperaturze pokojowej.Liczniki barwią tkanki roztworem barwiącym hematoksylinę przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, a następnie myją w wodzie z kranu przez 15 minut, a następnie ponownie odwadniają tkankę w rosnącym zanurzeniu w etanolu, a następnie dwa 15-minutowe zanurzenia w ksylenie w temperaturze pokojowej. Po ostatnim zanurzeniu w 100% etanolu zamontuj sekcje z 15 mikrolitrami 5% ksylenu w neutralnym roztworze gumy i przykryj każdą próbkę tkanki szkłem nakrywkowym. W celu automatycznego skanowania przekrojów na całym szkiełku, najpierw pozostaw szkiełka do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 12 godzin, aby wysuszyć próbki tkanek.Następnie w automatycznym skanerze całych slajdów wybierz ręcznie Brightfield i przejdź do interfejsu skanowania ręcznego. Popraw nazwy slajdów i wybierz ścieżkę przechowywania obrazów. Ustaw obszar skanowania i wybierz opcję Skanuj próbki za pomocą opcji Progi ustawione przez użytkownika.Próg wynosi około 50 przy wartości rozszerzenia obszaru skanowania wynoszącej 200 mikrometrów. Ustaw wartość ostrości skanowania i wybierz tryb automatycznego ustawiania ostrości i pojedynczej warstwy, a następnie załaduj slajdy na stację roboczą i rozpocznij automatyczne skanowanie. Po zeskanowaniu wszystkich slajdów zapisz obrazy do późniejszej analizy.Aby przeanalizować obrazy skrawków tkanki płucnej, otwórz oprogramowanie do analizy obrazów histopatologicznych i wybierz opcję Komputer lokalny, aby otworzyć plik z danymi skanowania. Wybierz odpowiedni poziom powiększenia i użyj opcji Przełącz korektę koloru, aby ustawić kolor na optymalny kontrast, a następnie zakreśl i nazwij obszary zainteresowania na każdym obrazie. Następnie w obszarze wtyczki wybierz opcję QC. Pojawi się kreator scenariuszy.Wybierz opcję Density Quant (Ilość gęstości) i dostosuj pasek wykrywania. Dostosuj poziomy punktacji, aż intensywność barwienia zakreślonych obszarów będzie podobna do intensywności oryginalnych obrazów, a następnie zapisz i nazwij model jako nowy plik, a następnie zastosuj model do innych slajdów i wybierz opcję Wybrana adnotacja, aby oprogramowanie automatycznie obliczyło wynik APE dla obszarów zainteresowania na każdym obrazie. Cyfrowe skanowanie całego szkiełka skrawków tkanki płucnej guza i przyległych tkanek nienowotworowych z próbek niedrobnokomórkowego raka płuca daje cyfrowe obrazy o wysokiej jakości.Wyniki APE obliczone na podstawie tych typów próbek raka płuc są zazwyczaj znacznie wyższe niż te określone dla sąsiednich tkanek nienowotworowych. Ponadto często określa się, że poziomy ekspresji ZWINT w skrawkach tkanki raka płaskonabłonkowego są znacznie wyższe niż te mierzone w próbkach tkanek abnocorakoraka. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o przygotowaniu wysokiej jakości guza lub obszarów guza podczas wykonywania badania patologicznego.Po tej procedurze można wykonać inne metody mikroskopii, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania. Ani lub inna metoda badania patologicznego. Po tym technika utorowała drogę naukowcom zajmującym się skanowaniem patologicznym do zbadania diagnostyki cyfrowej w celach badawczych.Nie zapominaj, że praca z paraformaldehydem może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak maski.

digital-analysis-immunostaining-zw10-interacting-protein-human-lung

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Użycie myszy reporterowych w połączeniu z barwieniem całego wierzchowca i sekcji, mikroskopią i testami in vivo ułatwia analizę mechanizmów leżących u podstaw normalnego wzorca dróg oddechowych. Tutaj opisujemy, w jaki sposób techniki te przyczyniły się do analizy sygnalizacji Wnt podczas rozwoju tchawicy.

Badanie sygnalizacji Wnt podczas wzorcowania przewodzenia dróg oddechowych

Komórki odpornościowe rezydujące w płucach, w tym komórki dendrytyczne (DC) u ludzi, są kluczowe dla obrony przed wziewnymi patogenami i alergenami. Jednak ze względu na niedobór ludzkiej tkanki płucnej badania są ograniczone. W pracy przedstawiono protokoły przetwarzania biopsji wewnątrzoskrzelowych błony śluzowej człowieka do badania DC płuc z wykorzystaniem immunohistochemii i cytometrii przepływowej.

Ludzkie komórki dendrytyczne płuc: dystrybucja przestrzenna i identyfikacja fenotypowa w biopsjach wewnątrzoskrzelowych z wykorzystaniem immunohistochemii i cytometrii przepływowej

Z punktu widzenia zasady 3R, modele oddechowe jako alternatywa dla badań na zwierzętach ewoluują. Zwłaszcza w odniesieniu do oceny ryzyka związanego z substancjami oddechowymi brakuje odpowiednich testów. W tym miejscu opisujemy zastosowanie precyzyjnie wyciętych ludzkich wycinków płuc do oceny substancji unoszących się w powietrzu.

Ocena cytotoksycznego i immunomodulującego działania substancji w precyzyjnie pokrojonych ludzkich wycinkach płuc

Szczegółowy protokół dla sześciomarkerowego multipleksowego panelu immunofluorescencyjnego jest zoptymalizowany i wykonany, przy użyciu automatycznego barwnika dla bardziej spójnych wyników i krótszego czasu zabiegu. Podejście to może być bezpośrednio zaadaptowane przez dowolne laboratorium do badań immunoonkologicznych.

Zautomatyzowany multipleksowy panel immunofluorescencyjny do badań immunoonkologicznych na próbkach tkanek raka utrwalonego formaliną

Myszy narażone na działanie ozonu i endotoksyn bakteryjnych wykazują rozległą śmierć komórek, w tym neutrofili. Zaobserwowaliśmy adaptacje komórkowe, takie jak zakłócenie blaszek cytoszkieletu, zwiększona ekspresja komórkowa podjednostki syntazy ATP kompleksu V β i angiostatyny w płukaniu oskrzelowo-pęcherzykowym, supresja odpowiedzi immunologicznej płuc i opóźniona rekrutacja neutrofili.

Wizualizacja adaptacji komórek płuc podczas połączonego ozonu i ostrego mysiego uszkodzenia płuc wywołanego ozonem i LPS

Ten eksperymentalny protokół opisuje i optymalizuje metodę barwienia metodą immunohistochemii multipleksowej (IHC), głównie poprzez optymalizację warunków inkubacji przeciwciał jednokanałowych i dostosowanie ustawień przeciwciał i kanałów do rozwiązania problemów autofluorescencji i przesłuchu kanałowego w tkankach raka płuc pochodzenia klinicznego.

Multipleksowe barwienie immunohistochemiczne tkanki raka płuc zatopionej w parafinie

Opracowaliśmy technikę przetwarzania tkanek wykorzystującą wibratomę i tkankę płucną zatopioną agarozą do generowania skrawków płuc, co pozwala na uzyskanie obrazów architektury płuc w wysokiej rozdzielczości. Zastosowaliśmy barwienie immunofluorescencyjne, aby obserwować przestrzenną ekspresję białek przy użyciu specyficznych markerów strukturalnych płuc.

Zautomatyzowane cięcie wibratomiczne tkanki płucnej zatopionej w agarozie do multipleksowego obrazowania fluorescencyjnego

Ten protokół opisuje metodę obrazowania rezydentnych komórek T CD8 infiltrujących nowotwór, oznaczonych fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami w wycinkach ludzkiego guza płuc. Technika ta umożliwia analizę migracji limfocytów T CD8 w czasie rzeczywistym przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Ex vivo Obrazowanie rezydentnych limfocytów T CD8 w wycinkach ludzkiego guza płuc za pomocą mikroskopii konfokalnej

Model zwierzęcy jest potrzebny do rozszyfrowania roli krążących komórek nowotworowych (CTC) w promowaniu kolonizacji płuc podczas przerzutów raka. W tym miejscu opracowaliśmy i z powodzeniem przeprowadziliśmy test in vivo, aby przetestować wymóg składania polimerycznej fibronektyny (polyFN) na CTC w celu kolonizacji płuc.

Opracowanie testu kolonizacji płuc do wizualizacji krążących komórek nowotworowych w tkankach płuc

Rękopis opisuje cyfrowy test PCR oparty na chipie, który wykrywa rzadki wariant transkryptu CDH1 (CDH1a) w świeżo zamrożonych tkankach normalnych i nowotworowych pobranych od pacjentów z rakiem żołądka.

Wykrywanie rzadkiego wariantu transkryptu CDH1 w świeżo mrożonych tkankach raka żołądka za pomocą cyfrowego PCR opartego na chipie

Poznaj metodę cyfrowej analizy barwienia immunohistochemicznego białka ZWINT w tkankach płuc człowieka. Technika ta zapewnia wysokiej jakości obrazy cyfrowe całych preparatów i niezawodne wyniki badań nad rakiem płuc.

Cyfrowa analiza barwienia immunologicznego białka oddziałującego ZW10 w tkankach płuc człowieka

Przeglądaj więcej filmów