Cyfrowa analiza barwienia immunologicznego białka oddziałującego ZW10 w tkankach płuc człowieka

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu patomorfologii i immunohistochemii. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest wystarczająco szybsza i tworzy multimedia cyfrowe o wysokiej jakości. Zacznij od utrwalenia próbki tkanki kung o wymiarach trzy na trzy centymetry w 4% paraformaldehydzie przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.

Następnego dnia odwodnić tkankę w rosnących zanurzeniach etanolu w temperaturze pokojowej, a następnie trzykrotnie zanurzyć w 100% ksylenie przez 20 minut na zabieg. Po ostatnim zanurzeniu w ksylenie umieść tkankę w parafinie o temperaturze 63 stopni Celsjusza na 30 minut, a następnie drugie 45-minutowe zanurzenie w świeżej parafinie o temperaturze 63 stopni Celsjusza, a następnie zmień parafinę jeszcze raz na ostatnią godzinną inkubację. Gdy parafina ostygnie, za pomocą mikrotomu obrotowego należy pobrać pięć odcinków tkanki o grubości mikrometra próbki tkanki zatopionej w parafinie, przechwytując skrawki na szkiełkach pokrytych poli-L-lizyną o grubości 20 mikrogramów na mililitr

W celu odparafinowania umieść szkiełka w piekarniku o temperaturze 65 stopni Celsjusza na dwie godziny, a następnie zanurz w dimetylobenzenie na 15 minut i namocz w 100% ksylenie przez 15 minut, a następnie ponownie nawodnij szkiełka w malejącej serii zanurzenia w etanolu. W celu naprawy antygenu umieść szkiełka w pudełku naprawczym antygenu i dodaj do pudełka 300 mililitrów płynu naprawczego z kwasem cytrynowym. Podgrzej pudełko w kuchence mikrofalowej na dużej mocy przez dwie minuty, a następnie podgrzej na małej mocy, aby utrzymać wrzenie przez sześć minut.

Gdy szkiełka ostygną do temperatury pokojowej, umyj próbki tkanek trzema pięciominutowymi 0,01 molowymi PBS w wytrząsarce obrotowej o temperaturze pokojowej. Aby wyeliminować endogenną peroksydazę, inkubuj szkiełka z 3% nadtlenkiem wodoru w podwójnie destylowanej wodzie przez 30 minut w wilgotnym pudełku w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji umyć szkiełka, jak pokazano, i zatkać wszelkie niespecyficzne wiązania na każdej sekcji 100 mikrolitrami 10% koziej surowicy przez 39 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie oznacz tkanki 100 mikrolitrami przeciwciała anty-ZWINT na szkiełko w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, a następnie trzykrotnie przepłucz w 0,01 molowym PBS. Po ostatnim płukaniu inkubować szkiełka z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie trzy przemywania PBS 0,01 molowym. Po ostatnim praniu dodaj szkiełka do 300 mikrolitrów świeżego DAB na 10 minut, a następnie umyj 10-sekundowym myciem wodą z kranu o temperaturze pokojowej.

Liczniki barwią tkanki roztworem barwiącym hematoksylinę przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, a następnie myją w wodzie z kranu przez 15 minut, a następnie ponownie odwadniają tkankę w rosnącym zanurzeniu w etanolu, a następnie dwa 15-minutowe zanurzenia w ksylenie w temperaturze pokojowej. Po ostatnim zanurzeniu w 100% etanolu zamontuj sekcje z 15 mikrolitrami 5% ksylenu w neutralnym roztworze gumy i przykryj każdą próbkę tkanki szkłem nakrywkowym. W celu automatycznego skanowania przekrojów na całym szkiełku, najpierw pozostaw szkiełka do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 12 godzin, aby wysuszyć próbki tkanek.

Następnie w automatycznym skanerze całych slajdów wybierz ręcznie Brightfield i przejdź do interfejsu skanowania ręcznego. Popraw nazwy slajdów i wybierz ścieżkę przechowywania obrazów. Ustaw obszar skanowania i wybierz opcję Skanuj próbki za pomocą opcji Progi ustawione przez użytkownika.

Próg wynosi około 50 przy wartości rozszerzenia obszaru skanowania wynoszącej 200 mikrometrów. Ustaw wartość ostrości skanowania i wybierz tryb automatycznego ustawiania ostrości i pojedynczej warstwy, a następnie załaduj slajdy na stację roboczą i rozpocznij automatyczne skanowanie. Po zeskanowaniu wszystkich slajdów zapisz obrazy do późniejszej analizy.

Aby przeanalizować obrazy skrawków tkanki płucnej, otwórz oprogramowanie do analizy obrazów histopatologicznych i wybierz opcję Komputer lokalny, aby otworzyć plik z danymi skanowania. Wybierz odpowiedni poziom powiększenia i użyj opcji Przełącz korektę koloru, aby ustawić kolor na optymalny kontrast, a następnie zakreśl i nazwij obszary zainteresowania na każdym obrazie. Następnie w obszarze wtyczki wybierz opcję QC. Pojawi się kreator scenariuszy.

Wybierz opcję Density Quant (Ilość gęstości) i dostosuj pasek wykrywania. Dostosuj poziomy punktacji, aż intensywność barwienia zakreślonych obszarów będzie podobna do intensywności oryginalnych obrazów, a następnie zapisz i nazwij model jako nowy plik, a następnie zastosuj model do innych slajdów i wybierz opcję Wybrana adnotacja, aby oprogramowanie automatycznie obliczyło wynik APE dla obszarów zainteresowania na każdym obrazie. Cyfrowe skanowanie całego szkiełka skrawków tkanki płucnej guza i przyległych tkanek nienowotworowych z próbek niedrobnokomórkowego raka płuca daje cyfrowe obrazy o wysokiej jakości.

Wyniki APE obliczone na podstawie tych typów próbek raka płuc są zazwyczaj znacznie wyższe niż te określone dla sąsiednich tkanek nienowotworowych. Ponadto często określa się, że poziomy ekspresji ZWINT w skrawkach tkanki raka płaskonabłonkowego są znacznie wyższe niż te mierzone w próbkach tkanek abnocorakoraka. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o przygotowaniu wysokiej jakości guza lub obszarów guza podczas wykonywania badania patologicznego.

Po tej procedurze można wykonać inne metody mikroskopii, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania. Ani lub inna metoda badania patologicznego. Po tym technika utorowała drogę naukowcom zajmującym się skanowaniem patologicznym do zbadania diagnostyki cyfrowej w celach badawczych.

Nie zapominaj, że praca z paraformaldehydem może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak maski.