Mikroagarowa elektroda mostkowa solna do analizy szybkości wymiany protonów w rekombinowanych białkach błonowych

Ta metoda może pomóc w badaniu białek błonowych, takich jak transportery i kanały. Informacje o utracie szybkości obrotu substratu porównujące aktywność i swoistość białek oraz różne stany fizjologiczne i patologiczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że minimalizuje potencjalną zmienność przesunięcia i warunki buforowe wolne od chlorków.

I znacznie zwiększa precyzję określania szybkości obrotu dzięki dokładniejszym pomiarom potencjału membrany. Zbierz elementy do pierwszych kroków. Należą do nich dwie końcówki do pipet mikrokapilarnych, ostre ostrze i suwmiarka.

Do elektrody należy mieć pod ręką srebrny drut, papier ścierny i trzymolowy roztwór chlorku potasu. Ponadto posiadają etanol i wodę do czyszczenia oraz zasilacz prądu stałego. Kontynuuj, pracując z dwiema końcówkami do mikropipet.

Zacznij od końcówki, która będzie zawierać bufor. Umieść drugą końcówkę obok pierwszej. Przesuń drugą końcówkę tak, aby po włożeniu jej wąska część sięgała co najmniej pięciu milimetrów w wąską część pierwszej.

Zaznacz pozycję, w której zostanie przymocowany pierwszy bufor zawierający końcówkę. Następnie użyj suwmiarki, aby zmierzyć długość elektrody mostka solnego z mikro-agarem. Użyj ostrza, aby przyciąć końcówkę na odpowiednią długość.

Oczyść ciętą powierzchnię etanolem, a następnie wodą. Następnie uzyskaj długość około ośmiu centymetrów srebrnego drutu na elektrodę. Wyczyść drut na chusteczkach etanolem, a następnie wodą.

Po oczyszczeniu użyj papieru ściernego, aby wygładzić powierzchnię na długości jednego centymetra na jednym końcu. Ten drut z wygładzonym końcem jest gotowy do powlekania elektrochemicznego. Umieść wygładzony koniec w roztworze chlorku potasu, a drugi koniec jest podłączony do zasilacza prądu stałego w celu powlekania.

Po pokryciu odłącz elektrodę i wyczyść ją wodą. Po wysuszeniu określ długość, która pozwoli mu wniknąć w końcówkę mikrokapilary tak głęboko, jak to możliwe. Przyciąć elektrodę od strony niepowlekanej na odpowiednią długość.

Teraz przejdź do przygotowania roztworu soli z agarozą. W kolbie zawierającej wodę rozpuścić chlorek potasu i użyć mieszadła magnetycznego w celu ułatwienia mieszania. Po wyjęciu mieszadła dodać agarozę do kolby.

Weź kolbę do kuchenki mikrofalowej i podgrzej ją, aby stopić agarozę w temperaturze około 100 stopni Celsjusza. Wyjmij go, aby wizualnie sprawdzić, czy agaroza jest całkowicie rozpuszczona. Po rozpuszczeniu agarozy powoli odpipetuj 10 mikrolitrów do mikrokapilary, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.

Ważne jest, aby ostrożnie odpipetować roztwór soli agarowej do końcówki mikrokapilarnej, szczególnie przy wysokich stężeniach agaru. Jeśli nie zostanie to zrobione prawidłowo, pęcherzyki powietrza łatwo wytwarzają się w końcówce i blokują przepływ elektryczny. Po wyjęciu końcówki z pipety wepchnij do niej elektrodę.

Upewnij się, że elektroda przenika przez roztwór soli. Gdy elektroda osiągnie temperaturę pokojową, podłącz ją do amperda referencyjna do amplifier. Podeprzyj elektrodę referencyjną, aby można ją było opuścić do plastikowego pojemnika z jednym mililitrem buforu.

Następnie zanurz elektrodę mostka solnego w roztworze. Zastosuj napięcie i sprawdź, czy jest reakcja prądowa, zanim przejdziesz dalej. Jeśli test zakończy się pomyślnie, odłącz elektrody.

W razie potrzeby przechowuj elektrodę mostka solnego, zanurzając ją w trzymolowym roztworze chlorku potasu. Następnie przygotuj bufor zawierający plastikową końcówkę. Weź końcówkę mikrokapilarną i zidentyfikuj punkt dwa centymetry od wąskiej części.

Użyj drutu grzejnego, aby zgiąć rurkę o 90 stopni w tej pozycji. Ostrym nożem przetnij rurkę pięć milimetrów od zagięcia. Oczyść obszar, który został przecięty, etanolem, a następnie wodą.

Zanim przejdziesz dalej, użyj mikroskopu świetlnego ze skalą, aby zmierzyć średnicę otworu na końcówce. Następnie przesuń pipetę tak, aby znalazła się w pobliżu pojemnika z rozpuszczalnikiem i innego pojemnika z buforem. Odpipetować trzy mikrolitry rozpuszczalnika do i z końcówki.

Następnie napełnij końcówkę pomiarową trzema mikrolitrami buforu. Teraz odzyskaj mostek solny z roztworu chlorku potasu. Podłącz końcówkę pomiarową z buforem do elektrody mostka solnego.

Podłącz elektrodę mostka solnego i elektrodę odniesienia do amplifier. W tym momencie zawiesić elektrodę mostka solnego w roztworze buforowym z elektrodą odniesienia. Reprezentacja konfiguracji dla eksperymentu znajduje się na tym schemacie.

Podczas eksperymentu membrana utworzy się na końcu buforu zawierającego pipetę. Zbierz dane, aby znaleźć pojemność membrany. W tym celu należy zastosować trójkątny sygnał napięcia przemiennego, aby utworzyć prostokątną odpowiedź prądu przemiennego.

Następnie znajdź przewodność i napięcie przy zerowym prądzie. Zautomatyzuj stosowanie rampy napięcia w zakresie od minus 50 do 50 miliwoltów i rejestruj prąd. Dopasuj funkcję liniową do danych.

Nachylenie to przewodność, punkt przecięcia x to napięcie o zerowym prądzie. Po zakończeniu zdejmij końcówkę pomiarową z mostka solnego. Napełnij nową końcówkę pomiarową buforem, dostosuj ją do innej wartości pH, aby ustawić gradient protonów w poprzek membrany.

Ponownie ustal zestaw eksperymentalny z nową końcówką pomiarową i elektrodami, aby powtórzyć pomiary. Oto reprezentatywne zapisy napięcia prądu w obecności gradientu pH. I przy braku gradientu pH.

Linie reprezentują liniowe dopasowanie do danych. Przesunięcie punktu przecięcia osi x dla różnych wartości pH jest przewidywane za pomocą równania Nernsta. Dane te reprezentują przesunięcie potencjału membrany w czasie dla standardowej elektrody chlorku srebra w kolorze białym i elektrody mostkowej z solą mikro-agarową w kolorze czarnym.

Elektroda mostkowa z soli agarowej była bardziej stabilna z maksymalnym przesunięciem mniejszym niż pięć miliwoltów w ciągu 300 sekund pomiaru. Na tym wykresie przesunięcia potencjału w funkcji gradientu pH widać, że dwie elektrody zachowują się znacznie inaczej wraz ze wzrostem gradientu pH. Szybkość obrotu protonów można znaleźć i porównać dla dwóch typów elektrod.

Oto liczby obrotu protonów wyznaczone dla mitochondrialnego białka rozprzęgającego jeden UCP1 mierzone przez elektrodę mostka solnego w porównaniu ze standardową elektrodą. Dostępne są również dane dla podobnie przygotowanego UCP3. Dawki wydają się bardziej precyzyjne w przypadku elektrody mostkowej z soli agarowej.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby upewnić się, że elektroda przenika przez roztwór soli agarowej. Most solny musi również zanurzyć się w roztworze buforowym. Na koniec upewnij się, że roztwór soli agarowej nie zawiera pęcherzyków powietrza.