In vitro Metoda kontroli stężeń gazów halogenowych w hodowanych komórkach nabłonka pęcherzyków płucnych
23 października 2018
Opisujemy prosty protokół specjalnie zaprojektowany, aby osiągnąć precyzyjne i kontrolowane stężenia sewofluranu lub izofluranu in vitro, aby poprawić nasze zrozumienie mechanizmów związanych z nabłonkowym uszkodzeniem płuc i przetestować nowe terapie zespołu ostrej niewydolności oddechowej.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie w dziedzinie badań nad uszkodzeniem i naprawą płuc, takie jak testowanie chlorowcowanych leków wspomagających jako potencjalne nowe terapie zespołu ostrej niewydolności oddechowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że opiera się ona na bardzo prostej metodzie hodowli komórek i wystawiania ich na działanie czynników chlorowcowanych w celu osiągnięcia precyzyjnych i kontrolowanych stężeń. Do budowy hermetycznej komory należy użyć hermetycznego pudełka polipropylenowego o pojemności 6,5 litra.
Wywierć otwór o średnicy 2,5 centymetra w dolnej części bocznej ściany pudełka. Następnie włóż rurkę karbowaną z zielonym oznaczeniem, która posłuży jako rura doprowadzająca mieszaninę gazowo-powietrzną. I uszczelnij go silikonem.
Następnie wywierć drugi otwór o średnicy 2,5 centymetra w górnej części przeciwległej ściany bocznej. Włóż kolejną rurkę karbowaną z czerwonym znakiem i połącz ją z filtrem węglowym, który będzie służył jako rura odprowadzająca mieszankę gazowo-powietrzną. Następnie uszczelnij go silikonem.
Następnie wywierć ciasny otwór o średnicy czterech milimetrów w środku ściany. Włóż krótki przewód infuzyjny, który jest połączony na kolektorze z obracającą się blokadą męskiej przynęty. Podłącz go do analizatora gazów i uszczelnij silikonem.
Następnie umieść termometr cyfrowy w hermetycznej komorze. Pod laboratoryjnym okapem wyciągowym dostosuj obwód urządzenia anestezjologicznego, aby przełączyć przewód gazowy podtlenku azotu za pomocą dwutlenku węgla. Włóż podgrzany nawilżacz do rury między urządzeniem znieczulającym a hermetyczną komorą, aby podgrzać mieszaninę przepływu gazu do około 37 stopni Celsjusza.
Podłącz hermetyczną komorę z oznaczoną na zielono rurką falistą do niestandardowego obwodu maszyny anestezjologicznej. Następnie umieść szczelną komorę na płycie grzejnej ustawionej na 37 stopni Celsjusza. Umieść sześciodołkową płytkę zawierającą ludzkie komórki nabłonka pęcherzyków płucnych w hermetycznej komorze i zamknij pokrywę.
Reguluj natężenie przepływu gazu, aby szybko uzyskać 5% CO2. Następnie otwórz parownik środka chlorowcowanego i ustaw żądaną wartość procentową. Po osiągnięciu wartości docelowych zmniejsz natężenie przepływu świeżego gazu do jednego litra na minutę.
Hermetyczna komora może być utrzymywana przy takim natężeniu przepływu gazu tak długo, jak jest to konieczne do przeprowadzenia eksperymentu. Przebieg stężeń sewofluranu i izofluranu w pożywce był podobny w czasie. Natychmiast po ustaleniu wymaganego stężenia środka chlorowcowanego, stężenia wzrosły w ciągu pierwszej godziny.
Następnie osiągnięto plateau, które utrzymywało się do momentu zaprzestania podawania środka chlorowcowcowanego. Po przerwaniu podawania, stężenia zmniejszyły się w ciągu jednej godziny. Poniżej przedstawiono frakcje czynnika chlorowcowcowanego w czasie w hermetycznej komorze mierzone przez analizator gazów.
Procedura ta jest stosunkowo niedroga i bardzo łatwa do zastosowania, nawet jeśli naukowcy nigdy wcześniej nie manipulowali hermetyczną komorą. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak kwantyfikacja białek i RNA, immunofluorescencja, pomiar przepuszczalności białek i swobodnego transportu, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące specyficznego wpływu czynników chlorowcowanych podczas nabłonkowego uszkodzenia płuc i jego ustąpienia. Po opracowaniu technika ta może utorować drogę do badań w dziedzinie zespołu ostrej niewydolności oddechowej w celu dalszego zbadania mechanizmu związanego z nabłonkowym uszkodzeniem płuc podczas ARDS i przetestowania nowych terapii.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia prosty protokół uzyskiwania precyzyjnych stężeń sewofluranu lub izofluranu in vitro. Metoda ta ma na celu pogłębienie wiedzy na temat mechanizmów uszkodzenia nabłonka płuc oraz ocenę nowych terapii zespołu ostrej niewydolności oddechowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- medycyna oddechowa
- farmakologia
Wstęp
- Zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) jest stanem krytycznym wymagającym nowych podejść terapeutycznych.
- Środki halogenowane, takie jak sewofluran i izofluran, mogą mieć potencjał w leczeniu uszkodzeń płuc.
- Zrozumienie mechanizmów uszkodzenia płuc jest niezbędne do opracowania skutecznych metod leczenia.
- Niniejsze badanie koncentruje się na metodzie kontroli ekspozycji na te środki w warunkach laboratoryjnych.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnego protokołu do badania uszkodzenia i regeneracji płuc.
- Przetestowanie halogenowych substancji pomocniczych jako potencjalnych terapii w przypadku ARDS.
- Poprawa zrozumienia mechanizmów nabłonkowego uszkodzenia płuc.
Zastosowane metody
- Konstrukcja szczelnej komory z wykorzystaniem hermetycznego pudełka z polipropylenu.
- Wywiercenie otworu do doprowadzania mieszaniny gazów i jego uszczelnienie silikonem.
- Techniki hodowli komórkowej w celu poddania komórek działaniu czynników halogenowych.
- Osiągnięcie kontrolowanych stężeń sewofluranu lub izofluranu.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na precyzyjną kontrolę stężenia czynników halogenowanych.
- Ułatwia badanie mechanizmów uszkodzenia płuc in vitro.
- Stanowi platformę do testowania nowych terapii ARDS.
- Wykazuje prostotę i skuteczność protokołu.
Wnioski
- Opracowany protokół jest cennym narzędziem w badaniach nad urazami płuc.
- Otwiera on możliwości poszukiwania nowych opcji terapeutycznych w leczeniu ARDS.
- Konieczne są dalsze badania w celu walidacji wyników oraz zbadania zastosowań klinicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Metoda ta umożliwia precyzyjną kontrolę in vitro stężeń gazów halogenowych w celu badania mechanizmów uszkodzenia nabłonka płuc w ARDS. Stanowi ona powtarzalną platformę do oceny nowych terapii ukierunkowanych na uszkodzenie pęcherzyków płucnych i stan zapalny. Podejście to wspiera wczesną walidację celów terapeutycznych oraz redukcję ryzyka mechanistycznego w procesie odkrywania leków pulmonologicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących udziału czynników halogenowanych w szlakach powstawania uszkodzeń płuc.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ustandaryzowany system funkcjonalnej walidacji celów w odpowiedziach nabłonka na środki anestetyczne.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność przewidywań poprzez dostarczanie mierzalnych, rozdzielonych w czasie danych o stężeniu w pożywce hodowlanej.
Przesiewy i rozwój testów
- Gotowość do analizy: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do późniejszego przesiewania związków przy użyciu kontrolowanej ekspozycji na gazy.
- Powtarzalność: Zapewnienie stałych stężeń sewofluranu i izofluranu w medium, co umożliwia wiarygodną ocenę związków.
- Skalowalność: Wykorzystanie prostej, szczelnej konstrukcji komory, odpowiedniej dla formatów wielodołkowych płytek oraz powtarzanych eksperymentów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie w kontekście choroby: Modeluje uszkodzenie nabłonka pęcherzyków płucnych w warunkach fizjologicznych istotnych dla patofizjologii ARDS.
- Ciągłość translacyjna: Łączy wyniki in vitro z walidacją przedkliniczną poprzez określenie progów ekspozycji powiązanych z efektami biologicznymi.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Stanowi podstawę do podejmowania decyzji go/no-go poprzez ustalenie zależności między stężeniem a efektem w celu przesiewowego badania bezpieczeństwa i skuteczności.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od etapu potwierdzania oddziaływania na cel aż po optymalizację wiodących związków, w szczególności w przypadku terapii płuc celujących w szlaki zapalne i uszkadzające.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących agentów halogenowanych jako modulatorów mechanizmów uszkodzenia i naprawy nabłonka.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzację testów dzięki stabilnym, mierzalnym stężeniom gazów w fazie ciekłej w czasie.
- Analityka: Generuje ilościowe pomiary zmiennej zależnej (np. stężenie w medium mg/L) za pomocą spektrometrii mas gazów w celu porównania warunków.
- Badania translacyjne: Łączy dynamikę ekspozycji z efektami biologicznymi, wspierając ciągłość przedkliniczną zgodną z biomarkerami.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielokrotnego użytku, niskokosztową platformę do iteracyjnego testowania środków znieczulających lub terapii opartych na gazach w różnych projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w modelach uszkodzenia płuc poprzez zapewnienie kontrolowanych i powtarzalnych warunków ekspozycji na gazy.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki konstrukcji szczelnej komory oraz monitorowaniu gazów w czasie rzeczywistym.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną redukcję ryzyka w przypadku halogenowanych substancji pomocniczych przed kosztownymi badaniami in vivo.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów na leki pulmonologiczne z uwzględnieniem ryzyka poprzez zdefiniowane profilowanie zależności ekspozycja-odpowiedź.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórkowej na granicy faz powietrze-ciecz oraz w obsłudze systemów gazowych.
- Wymaga dostępu do obwodów aparatury anestezjologicznej, analizatorów gazów oraz spektrometrii mas w celu walidacji stężenia w medium.
- Wymaga standaryzacji protokołów ekspozycji, technik uszczelniania oraz kontroli parametrów środowiskowych (37°C, 5% CO2) pomiędzy zespołami.
- Wymaga rozważenia adaptacji metody dla różnych typów komórek, formatów płytek oraz czynników halogenowanych innych niż sewofluran i izofluran.
- Ograniczenia praktyczne obejmują limitowaną objętość komory oraz czas równoważenia (~1 godzina) niezbędny do osiągnięcia stężeń plateau w medium.
