Name: Bezpośrednie wstrzyknięcie dooponowe rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusami u dorosłych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Poznaj technikę bezpośredniego wstrzyknięcia dooponowego rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusami u dorosłych myszy. Metoda z lidokainą umożliwia precyzyjną ocenę skuteczności transfekcji w badaniach nad chorobami OUN.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana z grantu z Departamentu Zasobów Ludzkich i Zabezpieczenia Społecznego Prowincji HEBEI (CY201605) oraz grantu z Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Hebei (H2017206101), i jesteśmy bardzo wdzięczni dr za Guangping Gao, który dostarczył AAV dla tego badania.

Myszy FVB/NJ zostały wyhodowane w obiekcie dla zwierząt Key Laboratory of Hebei Neurology. Wszystkie eksperymenty na myszach zostały zatwierdzone przez Komisję Etyczną Drugiego Szpitala Uniwersytetu Medycznego w Hebei i przeprowadzone zgodnie z przepisami dotyczącymi zarządzania zwierzętami laboratoryjnymi ogłoszonymi przez Ministerstwo Nauki i Technologii Chińskiej Republiki Ludowej.
1. Przygotowanie 20% roztworu podstawowego chlorowodorku lidokainy
<ol>
	<li>Odważyć 2 g chlorowodorku lidokainy. Dodaj 5-6 ml sterylnej wody i delikatnie wymieszaj. Zwiększ objętość do 10 ml sterylną wodą.</li>
	<li>1.2 Przefiltruj roztwór podstawowy przez filtry 0,2 mikrona. Poddzielić roztwór podstawowy, 1 ml na 1,5 ml probówki mikrowirówkowej i uszczelnić go folią uszczelniającą. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Bezpośrednie dokanałowe podawanie AAV u obudzonych myszy
<ol>
	<li>Przetrzyj obszar roboczy sterylną gazą z 70% etanolem i przygotuj wymagane materiały, jak wspomniano w Tabeli 1.</li>
	<li>Przygotować 100 μl kompleksu chlorowodorku lidokainy AAVrh.10/1%, dodając 95 μl roztworu podstawowego rAAVrh10 (5 x10 12 kopii genomu/ml) do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 200 μl i dodać 5 μl 20% roztworu podstawowego chlorowodorku lidokainy. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół. Następnie przechowywać roztwór wirusa na lodzie (4 °C). 
	UWAGA: Zostanie użyte 8 μL na mouse4.</li>
	<li>Przygotowanie strzykawki z roztworem AAV do wstrzykiwań
	<ol>
		<li>Zmontować strzykawkę Hamiltona o pojemności 25 μl z igłą 27 G i wyrównać skośną końcówkę igły ze skalą objętościową na strzykawce.</li>
		<li>Delikatnie pobrać 8 μl z 4 x10 10 kopiami genomu roztworu wirusa do strzykawki. Upewnij się, że usunąłeś pęcherzyki powietrza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie mouse 
	UWAGA: W tym badaniu wykorzystano samce lub samice myszy FVB/NJ (w wieku 30–70 dni). W masce operowano iniekcję IT.
	<ol>
		<li>Wysterylizuj obszar roboczy w okapie z 70% etanolem. Połóż obudzoną mysz (samiec lub samicę, 30–70 dni, waga 13–20 g) na łóżku w pozycji leżącej w kapturze. Przykryj górną część ciała sterylną gazą, aby uspokoić mysz i uniknąć ugryzienia.</li>
		<li>Przymocuj zwierzę, chwytając odpowiednio i mocno za obręcz miednicy kciukiem po jednej stronie i palcem wskazującym/środkowym po drugiej stronie. Utrzymuj napiętą skórę między obustronnymi obręczami miednicznej kciukiem i palcem wskazującym. Przytrzymaj delikatnie górną część ciała zwierzęcia dłonią.</li>
		<li>Ogol futro na grzbiecie między obustronnymi obręczami miednicy, a następnie wysterylizuj powierzchnię skóry peelingiem na bazie jodku i 70% etanolem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Iniekcja dokanałowa12
	<ol>
		<li>Wyczuć przestrzeń międzykręgową wzdłuż środkowej linii między obustronnymi obręczami miednicy kciukiem lub palcem wskazującym drugiej ręki i naciśnij wgłębienie paznokciem, aby wskazać przestrzeń międzykręgową L5-L6 (zlokalizuj miejsce wstrzyknięcia).</li>
		<li>Obróć lekko i delikatnie podstawę ogona, aby wskazać linię środkową kręgosłupa. Przed wstrzyknięciem wyregulować skos igły w kierunku głowy zwierzęcia (wspomniano w kroku 2.3.1).</li>
		<li>Upewnij się, że zwierzęta są mocno zamocowane i wyrównaj igłę wzdłuż linii środkowej kręgosłupa.</li>
		<li>Delikatnie i pionowo (lub lekko przechylić pod kątem 70–80°) w miejscu przecięcia wgłębienia i utrzymać strzykawkę w środkowej płaszczyźnie strzałkowej. Powoli zmniejsz kąt do około 30°, gdy łączy się z kością, a następnie wsuń igłę w przestrzeń międzykręgową. 
		nuta: Ewidentny nagły ruch ogonem jest oznaką udanego wejścia w przestrzeń opony śródoponowej. Gdy igła wejdzie do przestrzeni międzykręgowej, końcówka igły będzie mocno zaciśnięta. Igła 27 G użyta w tym badaniu nadaje się do podawania IT u myszy, ale nie u szczurów.</li>
		<li>Wstrzyknąć roztwór wektorowy (wspomniany w kroku 2.2). Uruchomić stoper i wstrzyknąć 8 μl roztworu wektorowego z prędkością 1 μl/4 s. Zachowaj igłę około 1 minutę po zakończeniu porodu. Wyjmij igłę, delikatnie obracając, aby uniknąć wycieku.</li>
		<li>Oceń przejściowe osłabienie kończyn myszy natychmiast po podaniu, aby ocenić jakość iniekcji4. 
		nuta: Standard jest następujący4. Ocena 0: brak słabości; Ocena 1: niewielkie osłabienie kończyn tylnych bez nieprawidłowości chodu; Wynik 2: umiarkowane osłabienie kończyn tylnych z wyraźnymi nieprawidłowościami chodu; Wynik 3: całkowity paraliż kończyn tylnych; Wynik 4: całkowity paraliż kończyn tylnych, duszność i umiarkowane osłabienie kończyn przednich; i wynik 5: całkowity paraliż wszystkich czterech kończyn i wyraźna duszność.</li>
		<li>Przenieś mysz z powrotem do klatki, aby odzyskać siły po paraliżu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprzątanie
	<ol>
		<li>Przepłukać strzykawkę 1 ml jałowej wody. Posortuj materiały laboratoryjne i zbierz wszystkie jednorazowe materiały do sterylizacji w autoklawie. Wyczyść ławkę 70% etanolem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie tkanek do barwienia immunohistochemicznego
<ol>
	<li>Pobieranie tkanek
	<ol>
		<li>Znieczulenie myszy po 21 dniach od wstrzyknięcia 3% hydratem chloralu (0,1 ml/10 g) głęboko przez wstrzyknięcie dootrzewnowe.</li>
		<li>Perfuzja przezsercowa z 20 ml lodowatego 0,01 M PBS (NaCl 147 mM; NaH2PO4 1,9 mM; K2HPO4 8,1 mM, pH 7,4) najpierw, następnie 4% lodowaty paraformaldehyd (w 0,01 M PBS) z pompą (10 ml/min przez 1 min, następnie 5 ml/min przez 9 min). 
		ostrożność: Paraformaldehyd jest rakotwórczy i toksyczny. Używaj go tylko w dygestoria w rękawiczkach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozwarstwienie rdzenia kręgowego i mózgu
	<ol>
		<li>Przymocuj kończyny i głowę każdego zwierzęcia w pozycji leżącej na piankowej pokrywie pudełka za pomocą igieł strzykawkowych, a następnie zdejmij i usuń skórę z głowy do kości krzyżowej nożyczkami.</li>
		<li>Przytnij czaszkę między oczami, przeciąć wzdłuż środkowej trasy czaszki i poziomej linii na móżdżku, a następnie otwórz czaszkę z każdej strony.</li>
		<li>Podnieś kość potyliczną pęsetą i obustronnie otwórz kanał kręgowy nożyczkami okulistycznymi. Odetnij żebra po obu stronach i ostrożnie usuń górną połowę kręgów.</li>
		<li>Podnieś mózg zakrzywioną pęsetą i odetnij nerwy podstawy czaszki, a następnie ostrożnie wypreparuj cały mózg i rdzeń kręgowy. Po utrwaleniu tkanek w 4% paraformaldehydzie przez 24 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie plastrów tkanek
	<ol>
		<li>Krioprotektoratuj mózg oraz rdzeń kręgowy w odcinku szyjnym i lędźwiowym w 30% roztworze sacharozy przez noc w temperaturze 4 °C. Osadź tkankę w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i szybko zamroź ciekłym azotem.</li>
		<li>Przeciąć tkankę o ciśnieniu 25 μm za pomocą kriostatu i przechowywać zamrożone skrawki w 0,01 M PBS w temperaturze 4 °C do użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Immunohistochemia
<ol>
	<li>Wstępnie potraktować swobodnie pływające sekcje w 1% H2O2 przez 10 minut, a następnie myć w PBS przez 10 minut. Inkubować w roztworze blokującym zawierającym 5% surowicy i 0,3% niejonowego detergentu w PBS przez 1 godzinę.</li>
	<li>Inkubować plastry z odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze 4 °C. Płukać skrawki w PBST (0,2% Tween 20 w PBS) przez 30 minut (3 razy po 10 minut każda).</li>
	<li>Inkubować plastry z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym biotyny w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Myć w PBST przez 30 minut (3 razy po 10 minut każdy).</li>
	<li>Skrawki inkubować z kompleksem peroksydazy biotyny o powinowactwie przez 40 minut i barwić środkiem achromogennym. Zamontuj sekcje na szkiełkach i dokładnie wysusz.</li>
	<li>Namocz szkiełka w bezwodnym etanolu na 5 minut i ksylenie na 10 minut, a następnie uszczelnij szkiełka medium montażowym. Na koniec zobrazuj szkiełka za pomocą mikroskopu wyposażonego w urządzenie ze sprzężeniem ładunkowym (CCD) przy powiększeniach 100x, 200x i 400x.</li>
</ol>

<ol><li>Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+adeno-associated+viral+vectors+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76(2014).</li>
<li>Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22001604">Viral vectors for gene delivery to the central nervous system.</a> Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+CNS+transduction+of+adult+mice+by+intravenously+delivered+rAAVrh.8+and+rAAVrh.10+and+nonhuman+primates+by+rAAVrh.10%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10.</a> Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Single+Injection+of+Recombinant+Adeno-Associated+Virus+into+the+Lumbar+Cistern+Delivers+Transgene+Expression+Throughout+the+Whole+Spinal+Cord%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord.</a> Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).</li>
<li>Hastie, E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+at+50%3A+a+golden+anniversary+of+discovery%2C+research%2C+and+gene+therapy+success--a+personal+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success--a personal perspective.</a> Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).</li>
<li>Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-Associated+Virus-Based+Gene+Therapy+for+CNS+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases.</a> Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).</li>
<li>Tanguy, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+AAVrh10+provides+higher+transgene+expression+than+AAV9+in+the+brain+and+the+spinal+cord+of+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36(2015).</li>
<li>Federic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+spinal+motor+neuron+transduction+following+intrathecal+delivery+of+AAV9+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs.</a> Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).</li>
<li>Ayers, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+and+efficient+transduction+of+spinal+cord+and+brain+following+neonatal+AAV+injection+and+potential+disease+modifying+effect+in+ALS+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice.</a> Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+Intrathecal+Injection+of+rAAVrh10+Enhances+its+Transduction+of+Spinal+Cord+and+Therapeutic+Efficacy+in+a+Mutant+SOD1+Model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS.</a> Neuroscience. 365, 192-205 (2017).</li>
<li>Borel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+rAAVrh10+Mediated+SOD1+Silencing+in+Adult+SOD1%28G93A%29+Mice+and+Nonhuman+Primates%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates.</a> Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).</li>
<li>Fairbanks, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+delivery+of+analgesics+in+experimental+models+of+pain+and+analgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).</li>
<li>Hylden, J. L., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+morphine+in+mice%3A+a+new+technique%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Intrathecal morphine in mice: a new technique.</a> European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+spinal+cord+transduction+by+intrathecal+injection+of+rAAV+delivers+efficacious+RNAi+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scAAV9-VEGF+prolongs+the+survival+of+transgenic+ALS+mice+by+promoting+activation+of+M2+microglia+and+PI3K%2FAkt+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway.</a> Brain Research. 1648, Pt A 1-10 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Technicznie rzecz biorąc, istnieje kilka krytycznych kroków podczas wstrzykiwania IT u obudzonych myszy. Po pierwsze, odpowiedni gest i zdecydowana kontrola myszy przez cały czas trwania operacji jest warunkiem wstępnym udanego porodu. Po drugie, najtrudniejszym punktem jest wyczucie przestrzeni międzykręgowej końcówką igły, ponieważ nie należy wkładać zbyt głęboko bez oporu ani nie wkładać na siłę pod silnym oporem w przypadku zranienia zwierząt lub zgięcia końcówki igły. Po trzecie, chociaż przejściowy paraliż spowodow...

AAV może pośredniczyć w długotrwałej i powszechnej ekspresji genów w transdukcji OUN z niewielkimi skutkami ubocznymi, i dlatego stał się jednym z najbardziej obiecujących narzędzi terapii genowej w leczeniu chorób OUN, w tym stwardnienia zanikowego bocznego (ALS), choroby Huntingtona (HD), choroby Alzheimera (AD), lizosomalnych chorób spichrzeniowych (LSD), choroby Gauchera (GD) i ceroidowej lipofuscynozy neuronalnej (NCL)1. Obecnie wyizolowano ponad 100 serotypów AAV od ludzi i zwierząt. Spośród nich co najmniej 12 zostało wykorzystanych w badaniach przedklinicznych i klinicznych, w tym najczęściej stosowane wektory genów, takie jak AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 i rAAVrh.101,2,3,4,5,6.
Różne choroby OUN wymagają różnych strategii dostarczania AAV ze względu na różne dotknięte regiony OUN i typy komórek. Regiony OUN i typy komórek, które może transdukować AAV, różnią się w zależności od serotypu, a także metody dostarczania. Na przykład wykazano, że rAAVrh10 transdukuje głównie astrocyty, gdy jest dostarczany przez ogólnoustrojowe wstrzyknięcie dożylne (IV), podczas gdy transdukuje zarówno neurony, jak i glej, gdy jest dostarczany przez wstrzyknięcie dooponowe4,7. Dodatkowo wstrzyknięcie miąższu powodowało miejscową transdukcję w okolice miejsca wstrzyknięcia, natomiast wstrzyknięcie do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) poprzez wstrzyknięcie dokomorowe lub dooponowe powodowało rozległą transdukcję OUN8. Badania wykazały również skuteczność terapeutyczną terapii genowej dostarczanej przez AAV w chorobach neurodegeneracyjnych przez administrację IT9,10,11. W chorobach, które wpływają na szerokie obszary OUN, takich jak ALS, wykazano, że wstrzyknięcie dooponowe do płynu mózgowo-rdzeniowego obejmuje większość obszarów dotkniętych chorobą mniejszą dawką w porównaniu z metodą dostarczania ogólnoustrojowego4,10. Ostatnie badania wykazały również, że nakłucie lędźwiowe może być stosowane do wstrzykiwania AAV w mysich modelach ALS, co pozwala uniknąć potencjalnych urazów związanych z laminektomią i cewnikowaniem dooponowym4.
Eksperymentalne bezpośrednie nakłucie lędźwiowe zostało po raz pierwszy użyte do dostarczania środków, zwłaszcza znieczulających, do rdzenia kręgowego w celu analgezji i znieczulenia w 1885 roku12,13. W tym raporcie ilustrujemy metodę wstrzykiwania IT nakłucia lędźwiowego u dorosłych myszy za pomocą 1% chlorowodorku lidokainy, miejscowego środka znieczulającego pochodzącego z amidu, w roztworze do wstrzykiwań w celu oceny i monitorowania jakości wstrzyknięcia. Udane wstrzyknięcia charakteryzowały się przejściowym paraliżem wywołanym lidokainą, podczas gdy nieudane wstrzyknięcia nie wykazywały tego zachowania. Sklasyfikowaliśmy poziom przejściowego osłabienia jako jeden z pięciu stopni, które pomagają przewidzieć skuteczność wtrysku. Na koniec pokazujemy, że poziom transdukcji rAAVrh10 można przewidzieć na podstawie stopnia paraliżu. Dlatego ta dokanałowa metoda dostarczania AAV może być wykorzystana do zwiększenia dostarczania genów za pośrednictwem AAV w eksperymentalnej terapii chorób OUN.

<table><tbody><tr><td>Myszy FVB / NJ</td><td>Charles River Laboratories Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monohydrat chlorowodorku lidokainy</td><td>HEOWNS</td><td>73-78-9</td><td></td></tr><tr><td>Rdzeń wektora wirusowego AAV Centrum Terapii Genowej w Szkole</td><td></td><td></td>Medycznej Uniwersytetu Massachusetts<td></td></tr><tr><td>25 i mikro; L&nbsp; Strzykawka Hamilton/igła 27-30 G</td><td>GASTIGHT</td><td>1702</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T compond</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>H 2O 2</td><td>SHUI HUAN PAI</td><td></td><td></td></tr> 170401 <tr><td>Kozia surowica</td><td>Solarbio</td><td>S9070</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>LIFE SCIENCES</td><td>T8200</td><td></td></tr><tr><td>Królik anty-GFP</td><td>Life tech</td><td>G10362</td><td>Rozcieńczenie 1:333</td></tr><tr><td>Drugie przeciwciało (koza-anty królik)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>111-005-144</td><td>Rozcieńczenie 1:1,000</td></tr><tr><td>ODCZYNNIK VECTATAIN ABC</td><td>Vector Lab</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB Zestaw substratów peroksydazy</td><td>Vector Lab</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże montażowe do fluorescencji z DAPI</td><td>Vectorshield</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Yong Da Chemical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; 2H2O</td><td>Yong Da Chemical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 12H2O</td><td>Yong Da Chemiczny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyd</td><td>Yong Da Chemiczne</td><td>307699</td><td></td></tr><tr><td>adhezyjne Szkiełka mikroskopowe</td><td>CITOGLAS</td><td>17083</td><td>25 mm x 75 mm</td></tr><tr><td>SUPER-SLIP MICRO-GLAS</td><td>Electro Micro Microscopy Siences</td><td>72236-60</td><td>24 mm x 60 mm</td></tr><tr><td>15 mL Probówka wirówkowa</td><td>CORNING</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>96 dołek klaster hodowli komórkowych</td><td>Coster</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowy klaster hodowli komórkowych</td><td>Coster</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>WEN ZHI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Wei AN 05171112</td><td></td><td>8 cm x 10 cm x 12 cm 1</td></tr><tr><td>mL strzykawka</td><td>Hong Da</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtubes</td><td>Plazmed</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipet&nbsp;</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peppet końcówki</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centirifuge</td><td>eppendorf</td><td>5427R</td><td></td></tr><tr><td>Regerator</td><td>Haier</td><td>BCD-539WT</td><td></td></tr><tr><td>Filtr</td><td>MILLEX GP</td><td>R4PA42342</td><td></td></tr><tr><td>Pompa</td><td>LongerPump</td><td>BT-100-2J/YZ1515X</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom do zamrażania</td><td>Leica</td><td>CM1520</td><td></td></tr></tbody></table>

bezpośrednie wstrzyknięcie dooponowe rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusami u dorosłych myszy

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Dokanałowe (IT) wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem (AAV) wzbudziło znaczne zainteresowanie terapią genową OUN ze względu na jej bezpieczeństwo, nieinwazyjność i doskonałą skuteczność transdukcji w OUN. Poprzednie badania wykazały terapeutyczną moc terapii genowej dostarczanej przez AAV w zaburzeniach neurodegeneracyjnych przez administrację IT. Odnotowano jednak wysokie wskaźniki nieprzewidywalnych awarii spowodowanych ograniczeniami technicznymi administracji IT u małych zwierząt. W tym przypadku ustaliliśmy system punktacji, aby wskazać stopień powodzenia nakłucia lędźwiowego u małych zwierząt poprzez dodanie 1% chlorowodorku lidokainy do roztworu do wstrzykiwań. Dalej pokazujemy, że zakres przejściowego osłabienia po wstrzyknięciu może przewidywać skuteczność transdukcji AAV. W związku z tym ta metoda iniekcji IT może być wykorzystana do optymalizacji badań terapeutycznych w mysich modelach chorób OUN, które dotykają szerokie obszary OUN.

Myszy wykazywały różny stopień przejściowego osłabienia bezpośrednio po wstrzyknięciu dojamowym (IT) roztworu AAV w 1% lidokainy hydrochlorku, co wynikało z różnej jakości wykonania iniekcji dokanałowej. Zgodnie z opracowanym przez nas półilościowym systemem oceny 5-stopniowej, zbadaliśmy wzorce transdukcji AAV u myszy z różnym stopniem wywołanego lidokainą osłabienia kończyn (wynik 0, n = 2; wynik 1, n = 1; wynik 4, n = 4; wynik 5, n = 3). Immunobarwienie EGFP rdzeni kręgosłupa wykazało ...

Tutaj prezentujemy technikę bezpośredniego wstrzykiwania dokanałowego przy użyciu 1% chlorowodorku lidokainy w roztworze wirusa, aby zapewnić efektywne dostarczanie wirusa związanego z adenowirusem małym zwierzętom i ustanowić system punktacji do przewidywania skuteczności transdukcji w ośrodkowym układzie nerwowym w zależności od stopnia przejściowego osłabienia wywołanego przez lidokainę.

Bezpośrednie wstrzyknięcie dooponowe rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusami u dorosłych myszy

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Metoda ta ułatwia skuteczne dokanałowe dostarczanie transgenów wirusowych związanych z adenowirusem u obudzonych małych zwierząt w celu eksperymentalnego leczenia chorób ośrodkowego układu nerwowego, takich jak ALS. Główną zaletą tej metody jest to, że roztwór wirusa zawiera 1% chlorowodorek lidokainy, który po udanym wstrzyknięciu wywołuje przejściowy paraliż. Chociaż metoda ta zapewnia wizualny wskaźnik do oceny sukcesu zautomatyzowanej sytuacji dokanałowej, wystarczająca praktyka jest niezbędna do poprawy wskaźnika powodzenia porodu.Przed rozpoczęciem zabiegu przymocuj igłę o rozmiarze 27 do strzykawki Hamiltona o pojemności 25 mikrolitrów i wyrównaj skośną końcówkę igły ze skalą wolumetryczną na strzykawce. Następnie ostrożnie załaduj do strzykawki 8 mikrolitrów 4 x 10 do 10. kopii genomu roztworu wirusa, uważając, aby uniknąć pęcherzyków. Następnie umieść obudzoną mysz w wieku od 30 do 70 dni o wadze od 12 do 30 gramów na łóżku w pozycji leżącej w kapturze bezpieczeństwa biologicznego i przykryj górną część ciała sterylną gazą, aby uspokoić mysz i uniknąć ugryzienia.Mocno chwyć mysz za obręcz miedniczną kciukiem po jednej stronie, a palcem wskazującym i środkowym po drugiej, utrzymując napiętą skórę między obustronnymi obręczami miednicznej kciukiem i palcem wskazującym. Następnie ogol sierść między obustronnymi obręczami miednicy i wysterylizuj odsłoniętą skórę peelingiem na bazie jodu i 70% etanolu. W celu bezpośredniego dokanałowego podania roztworu wirusa związanego z adenowirusem, należy wykonać badanie dotykowe przestrzeni międzykręgowej wzdłuż linii środkowej między obustronnymi obręczami miednicy i za pomocą paznokcia wcisnąć wgłębienie w skórze, aby wskazać przestrzeń międzykręgową od L5 do L6.Obróć lekko i delikatnie podstawę ogona, aby odsłonić linię środkową kręgosłupa i wyreguluj skos igły w kierunku głowy zwierzęcia. Trzymając mysz mocno zamocowaną na swoim miejscu, wyrównaj igłę wzdłuż linii środkowej kręgosłupa i delikatnie i pionowo włóż igłę w środek wgłębienia, utrzymując strzykawkę w środkowej płaszczyźnie strzałkowej. Gdy igła zetknie się z kością, powoli zmniejsz kąt do około 30 stopni i wsuń igłę w przestrzeń międzykręgową.Nagłe machnięcie ogonem jest oznaką udanego wejścia w przestrzeń opony śródoponowej. Gdy igła wejdzie w przestrzeń międzykręgową, końcówka będzie mocno zaciśnięta. Wstrzyknąć roztwór wektora i utrzymać igłę w przestrzeni śródoponowej przez jedną minutę.Następnie powoli wyjmuj igłę z obrotem, aby zminimalizować wyciek. Natychmiast oceń przejściowe osłabienie kończyn myszy, aby ocenić jakość wstrzyknięcia i przywróć mysz do klatki w celu odzyskania sił po paraliżu. W odpowiednim eksperymentalnym punkcie końcowym unieruchomić kończyny i głowę myszy, której wstrzyknięto zastrzyk, w pozycji leżącej na pokrywie pudełka z pianki i za pomocą nożyczek zdjąć i usunąć skórę od głowy do kości krzyżowej.Przypnij czaszkę między oczami, przeciąć wzdłuż linii środkowej czaszki i poziomej linii nad móżdżkiem i otwórz czaszkę z każdej strony. Użyj pęsety, aby usunąć kość potyliczną i użyj nożyczek okulistycznych, aby obustronnie otworzyć kanał kręgowy. Odetnij żebra po obu stronach i ostrożnie usuń górną część kręgów.Użyj zakrzywionej pęsety, aby podnieść mózg i przeciąć nerwy podstawy czaszki. Następnie ostrożnie wyekstrahuj cały mózg i rdzeń kręgowy i utrwal tkanki w 4% paraformaldehydzie przez 24 godziny. Pod koniec okresu utrwalania krioprotekcjonij mózg oraz rdzeń kręgowy w odcinku szyjnym i lędźwiowym w 30% roztworze sacharozy przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza, a następnie zanurz w związku o optymalnej temperaturze cięcia przed szybkim zamrożeniem w ciekłym azocie.Następnie użyj kriostatu, aby uzyskać skrawki każdej tkanki o grubości 25 mikrometrów, przechowując zamrożone skrawki w 0,01 molowym PBS w temperaturze 4 stopni Celsjusza w miarę ich uzyskiwania. W celu analizy immunohistochemicznej tkanek należy wstępnie potraktować swobodnie pływające odcinki 1% nadtlenkiem wodoru przez 10 minut, a następnie przemyć 10-minutowym roztworem PBS. Następnie inkubować próbki w roztworze blokującym zawierającym 5% surowicy i 0,3% niejonowego detergentu w PBS przez 1 godzinę, a następnie znakować przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi, które są przedmiotem zainteresowania.Następnego dnia przemyć skrawki 3 10-minutowymi płukaniami w PBS plus Tween i inkubować szkiełka z odpowiednimi biotynylowanymi przeciwciałami drugorzędowymi w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę po ostatnim płukaniu. Pod koniec inkubacji przemyć skrawki 3 razy w świeżym PBST, jak właśnie pokazano, i inkubować próbki z kompleksem peroksydazy biotyny nieskończoności przez 40 minut, a następnie zabarwić odpowiednim środkiem chromogennym. Zamontuj oznaczone sekcje na szklanych szkiełkach mikroskopowych i zanurz je w bezwodnym etanolu na 5 minut po całkowitym wyschnięciu zamontowanych sekcji.Następnie namocz szkiełka w ksylenie na 10 minut i uszczelnij je odpowiednim medium montażowym. Następnie zobrazuj szkiełka za pomocą mikroskopu świetlnego wyposażonego w urządzenie sprzężone z ładunkiem przy powiększeniach 100, 200 i 400 razy. Barwienie immunologiczne eGFP odcinków tkanki rdzenia kręgowego szyjnego i lędźwiowego ujawnia niewielką lub żadną transdukcję w lędźwiowym rdzeniu kręgowym myszy z wynikiem osłabienia 0, nieznacznie zwiększoną transdukcję u myszy z wynikiem słabości 1 oraz silne i rozległe transdukcje u myszy z wynikiem słabości 4 lub 5.Kwantyfikacja intensywności barwienia GFP skrawków tkanki rdzenia kręgowego u myszy wykazujących różne stopnie przejściowego osłabienia kończyn wskazuje, że nasilenie osłabienia po wstrzyknięciu roztworu wirusa ściśle koreluje z zakresem transdukcji rdzenia kręgowego. W mózgu silne sygnały eGFP są wykrywane w opuszce węchowej, grzbietowo-bocznej korze przedczołowej, zakręcie zębatym i strefie CA3 hipokampa, kory móżdżku i brzeżnych obszarach pnia mózgu, w tym w jądrze twarzowym, splocie naczyniówkowym i komórkach nabłonka wyściółki. Neurony ruchowe w rogach przednich są również silnie transdukowane na różnych poziomach rdzenia kręgowego.Ponadto w korze mózgowej wykrywane są neurony GFP, w tym komórki piramidowe, a także różne typy komórek glejowych, w tym mikroglej, astrocyty i oligodendrocyty. Technika ta umożliwia naukowcom zajmującym się neurologią zbadanie terapeutycznych skutków bezpośredniego podawania dooponowego u małych przytomnych zwierząt na choroby ośrodkowego układu nerwowego.

direct-intrathecal-injection-recombinant-adeno-associated-viruses

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym materiale przedstawiamy metodę wewnątrzczaszkowej iniekcji wektorów AAV w celu fluorescencyjnego znakowania neuronów i gleju w korze wzrokowej.

Wewnątrzczaszkowe wstrzykiwanie wektorów wirusowych opartych na wirusach adeno-zależnych

Źródło: Li, D., et al. Bezpośrednie wstrzyknięcie dooponowe rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusami u dorosłych myszy. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia procedurę dokanałowego wstrzykiwania wirusów związanych z adenowirusem (AAV) do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) obudzonej myszy, obejmującą przygotowanie strzykawki, wyrównanie kręgosłupa i precyzyjne wprowadzenie igły. Metoda ta weryfikuje celowane dostarczanie genów, potwierdzając jej potencjał w terapiach OUN.

Dokanałowe podawanie wirusów w modelu mysim w leczeniu chorób ośrodkowego układu nerwowego

Źródło:Pourshafie, N., et al. Ogólnoustrojowe dostarczanie mikroRNA przy użyciu rekombinowanego serotypu 9 wirusa związanego z adenowirusem w leczeniu chorób nerwowo-mięśniowych u gryzoni. J. Vis. Exp. (2018).W tym filmie mysz z rdzeniowym i opuszkowym zanikiem mięśni lub dotknięta SBMA przechodzi wstrzyknięcie do żyły ogonowej rekombinowanych wektorów AAV (wektorów związanych z adeno) przenoszących plazmid kodujący terapeutyczne mikroRNA. Wektor wytwarza mikroRNA, które wiąże się ze zmutowanym...

Wstrzykiwanie rekombinowanych wektorów związanych z adenowirusem w mysim modelu rdzeniowego i opuszkowego zaniku mięśni

Źródło: Grames, M. S., et al. Metody i wskazówki dotyczące dożylnego podawania szczurom wirusa związanego z adenowirusem oraz ocena transdukcji ośrodkowego układu nerwowego. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje wstrzyknięcie do żyły ogonowej rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (AAV) u szczurów. Po wstrzyknięciu do żyły ogonowej bocznej wirus dostaje się do krwiobiegu, krąży w sercu i dociera do mózgu, gdzie dostaje się do neuronów i ułatwia produkcję białka docelowego do zastosowań...

 Dożylne podawanie rekombinowanych wektorów wirusa związanego z adenowirusem w modelu szczurzym 

Tutaj demonstrujemy technikę rozległej transdukcji neuronalnej poprzez dokomorowe wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem do mózgu noworodka myszy.  Metoda ta zapewnia szybki i łatwy sposób na osiągnięcie trwającej całe życie ekspresji transgenów dostarczanych przez wirusa.

Śródmózgowe wstrzyknięcie wirusa do mózgu nowonarodzonego myszy w celu trwałej i rozległej transdukcji neuronalnej

Celem obecnego badania było opracowanie i potwierdzenie siły działania oraz bezpieczeństwa dostarczania genów za pośrednictwem wirusa AAV9 (ang. spinal adeno-associated virus 9) za pośrednictwem metody u dorosłych myszy.

Dostarczanie wektorów subpialnego wirusa Adeno-associated 9 (AAV9) u dorosłych myszy

Obecny protokół przedstawia instrukcje krok po kroku dotyczące wykonywania iniekcji dokanałowych u noworodków myszy w celu edycji genów i dostarczania leków.

Wstrzyknięcie dooponowe nowonarodzonej myszy w celu edycji genomu i dostarczania leków

Opisano procedurę chirurgiczną polegającą na wykonaniu zastrzyków do spłuczki lędźwiowej młodego szczura. Podejście to zostało wykorzystane do dokanałowego dostarczania wektorów terapii genowej, ale przewiduje się, że podejście to może być stosowane w różnych terapiach, w tym komórkach i lekach.

Podanie wektorowe dokanałowo u młodych szczurów przez wstrzyknięcie do spłuczki lędźwiowej

Tutaj szczegółowo opisujemy zoptymalizowany protokół wstrzykiwania bocznych żył ogonowych myszy w celu systemowego podawania wirusa związanego z adenowirusem (AAV) dorosłym myszom. Dodatkowo opisujemy protokoły powszechnie stosowanych testów do oceny transdukcji AAV.

Konsekwentne dostarczanie wirusa związanego z adenowirusem poprzez boczne wstrzyknięcie żyły ogonowej u dorosłych myszy

Wstrzyknięcie dooponowe lędźwiowe stanowi translacyjnie istotną drogę podania dla dostarczania terapii genowej do ośrodkowego układu nerwowego. Ten kompleksowy, ustandaryzowany protokół wstrzyknięć dooponowych w odcinek lędźwiowy u noworodków, młodych i dorosłych myszy i szczurów ma na celu pomóc naukowcom w przyjęciu tej techniki do przedklinicznych badań nad terapią genową.

Lędźwiowe wstrzyknięcie dooponowe wektorów terapii genowej do celowania w ośrodkowy układ nerwowy u myszy i szczurów

Opisano nową technikę powszechnego dostarczania wirusa związanego z adenowirusem, która wykorzystuje infuzję wirusa podpajęczynówkowego. Metoda ta nie tylko zapewnia szeroką transdukcję mysich neuronów kory nowej w warstwach powierzchownych, ale także powoduje selektywną ekspresję transgenu w neuronach piramidowych warstwy piątej, nawet przy użyciu nieselektywnego promotora.

Rozległa transdukcja mysich neuronów kory nowej przez wstrzyknięcie subbaraczynoidu AAV2

Poznaj technikę bezpośredniego wstrzyknięcia dooponowego rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusami u dorosłych myszy. Metoda z lidokainą umożliwia precyzyjną ocenę skuteczności transfekcji w badaniach nad chorobami OUN.

Bezpośrednie wstrzyknięcie dooponowe rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusami u dorosłych myszy

Przeglądaj więcej filmów