Bezpośrednie wstrzyknięcie dooponowe rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusami u dorosłych myszy

Metoda ta ułatwia skuteczne dokanałowe dostarczanie transgenów wirusowych związanych z adenowirusem u obudzonych małych zwierząt w celu eksperymentalnego leczenia chorób ośrodkowego układu nerwowego, takich jak ALS. Główną zaletą tej metody jest to, że roztwór wirusa zawiera 1% chlorowodorek lidokainy, który po udanym wstrzyknięciu wywołuje przejściowy paraliż. Chociaż metoda ta zapewnia wizualny wskaźnik do oceny sukcesu zautomatyzowanej sytuacji dokanałowej, wystarczająca praktyka jest niezbędna do poprawy wskaźnika powodzenia porodu.

Przed rozpoczęciem zabiegu przymocuj igłę o rozmiarze 27 do strzykawki Hamiltona o pojemności 25 mikrolitrów i wyrównaj skośną końcówkę igły ze skalą wolumetryczną na strzykawce. Następnie ostrożnie załaduj do strzykawki 8 mikrolitrów 4 x 10 do 10. kopii genomu roztworu wirusa, uważając, aby uniknąć pęcherzyków. Następnie umieść obudzoną mysz w wieku od 30 do 70 dni o wadze od 12 do 30 gramów na łóżku w pozycji leżącej w kapturze bezpieczeństwa biologicznego i przykryj górną część ciała sterylną gazą, aby uspokoić mysz i uniknąć ugryzienia.

Mocno chwyć mysz za obręcz miedniczną kciukiem po jednej stronie, a palcem wskazującym i środkowym po drugiej, utrzymując napiętą skórę między obustronnymi obręczami miednicznej kciukiem i palcem wskazującym. Następnie ogol sierść między obustronnymi obręczami miednicy i wysterylizuj odsłoniętą skórę peelingiem na bazie jodu i 70% etanolu. W celu bezpośredniego dokanałowego podania roztworu wirusa związanego z adenowirusem, należy wykonać badanie dotykowe przestrzeni międzykręgowej wzdłuż linii środkowej między obustronnymi obręczami miednicy i za pomocą paznokcia wcisnąć wgłębienie w skórze, aby wskazać przestrzeń międzykręgową od L5 do L6.

Obróć lekko i delikatnie podstawę ogona, aby odsłonić linię środkową kręgosłupa i wyreguluj skos igły w kierunku głowy zwierzęcia. Trzymając mysz mocno zamocowaną na swoim miejscu, wyrównaj igłę wzdłuż linii środkowej kręgosłupa i delikatnie i pionowo włóż igłę w środek wgłębienia, utrzymując strzykawkę w środkowej płaszczyźnie strzałkowej. Gdy igła zetknie się z kością, powoli zmniejsz kąt do około 30 stopni i wsuń igłę w przestrzeń międzykręgową.

Nagłe machnięcie ogonem jest oznaką udanego wejścia w przestrzeń opony śródoponowej. Gdy igła wejdzie w przestrzeń międzykręgową, końcówka będzie mocno zaciśnięta. Wstrzyknąć roztwór wektora i utrzymać igłę w przestrzeni śródoponowej przez jedną minutę.

Następnie powoli wyjmuj igłę z obrotem, aby zminimalizować wyciek. Natychmiast oceń przejściowe osłabienie kończyn myszy, aby ocenić jakość wstrzyknięcia i przywróć mysz do klatki w celu odzyskania sił po paraliżu. W odpowiednim eksperymentalnym punkcie końcowym unieruchomić kończyny i głowę myszy, której wstrzyknięto zastrzyk, w pozycji leżącej na pokrywie pudełka z pianki i za pomocą nożyczek zdjąć i usunąć skórę od głowy do kości krzyżowej.

Przypnij czaszkę między oczami, przeciąć wzdłuż linii środkowej czaszki i poziomej linii nad móżdżkiem i otwórz czaszkę z każdej strony. Użyj pęsety, aby usunąć kość potyliczną i użyj nożyczek okulistycznych, aby obustronnie otworzyć kanał kręgowy. Odetnij żebra po obu stronach i ostrożnie usuń górną część kręgów.

Użyj zakrzywionej pęsety, aby podnieść mózg i przeciąć nerwy podstawy czaszki. Następnie ostrożnie wyekstrahuj cały mózg i rdzeń kręgowy i utrwal tkanki w 4% paraformaldehydzie przez 24 godziny. Pod koniec okresu utrwalania krioprotekcjonij mózg oraz rdzeń kręgowy w odcinku szyjnym i lędźwiowym w 30% roztworze sacharozy przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza, a następnie zanurz w związku o optymalnej temperaturze cięcia przed szybkim zamrożeniem w ciekłym azocie.

Następnie użyj kriostatu, aby uzyskać skrawki każdej tkanki o grubości 25 mikrometrów, przechowując zamrożone skrawki w 0,01 molowym PBS w temperaturze 4 stopni Celsjusza w miarę ich uzyskiwania. W celu analizy immunohistochemicznej tkanek należy wstępnie potraktować swobodnie pływające odcinki 1% nadtlenkiem wodoru przez 10 minut, a następnie przemyć 10-minutowym roztworem PBS. Następnie inkubować próbki w roztworze blokującym zawierającym 5% surowicy i 0,3% niejonowego detergentu w PBS przez 1 godzinę, a następnie znakować przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi, które są przedmiotem zainteresowania.

Następnego dnia przemyć skrawki 3 10-minutowymi płukaniami w PBS plus Tween i inkubować szkiełka z odpowiednimi biotynylowanymi przeciwciałami drugorzędowymi w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę po ostatnim płukaniu. Pod koniec inkubacji przemyć skrawki 3 razy w świeżym PBST, jak właśnie pokazano, i inkubować próbki z kompleksem peroksydazy biotyny nieskończoności przez 40 minut, a następnie zabarwić odpowiednim środkiem chromogennym. Zamontuj oznaczone sekcje na szklanych szkiełkach mikroskopowych i zanurz je w bezwodnym etanolu na 5 minut po całkowitym wyschnięciu zamontowanych sekcji.

Następnie namocz szkiełka w ksylenie na 10 minut i uszczelnij je odpowiednim medium montażowym. Następnie zobrazuj szkiełka za pomocą mikroskopu świetlnego wyposażonego w urządzenie sprzężone z ładunkiem przy powiększeniach 100, 200 i 400 razy. Barwienie immunologiczne eGFP odcinków tkanki rdzenia kręgowego szyjnego i lędźwiowego ujawnia niewielką lub żadną transdukcję w lędźwiowym rdzeniu kręgowym myszy z wynikiem osłabienia 0, nieznacznie zwiększoną transdukcję u myszy z wynikiem słabości 1 oraz silne i rozległe transdukcje u myszy z wynikiem słabości 4 lub 5.

Kwantyfikacja intensywności barwienia GFP skrawków tkanki rdzenia kręgowego u myszy wykazujących różne stopnie przejściowego osłabienia kończyn wskazuje, że nasilenie osłabienia po wstrzyknięciu roztworu wirusa ściśle koreluje z zakresem transdukcji rdzenia kręgowego. W mózgu silne sygnały eGFP są wykrywane w opuszce węchowej, grzbietowo-bocznej korze przedczołowej, zakręcie zębatym i strefie CA3 hipokampa, kory móżdżku i brzeżnych obszarach pnia mózgu, w tym w jądrze twarzowym, splocie naczyniówkowym i komórkach nabłonka wyściółki. Neurony ruchowe w rogach przednich są również silnie transdukowane na różnych poziomach rdzenia kręgowego.

Ponadto w korze mózgowej wykrywane są neurony GFP, w tym komórki piramidowe, a także różne typy komórek glejowych, w tym mikroglej, astrocyty i oligodendrocyty. Technika ta umożliwia naukowcom zajmującym się neurologią zbadanie terapeutycznych skutków bezpośredniego podawania dooponowego u małych przytomnych zwierząt na choroby ośrodkowego układu nerwowego.