Nowa prosta metoda pomiaru lipofilowości (logP) przy użyciu spektroskopii ¹⁹F NMR

Opracowaliśmy prostą metodę pomiaru lipofilowości związków gorączkowych za pomocą fluorowego NMR, który jest wystarczająco gryzący, aby się rozmnażać, mierzymy niewielkie różnice w lipofilowości. Metoda ta może być stosowana do systematycznego badania wpływu powstawania związków organicznych na rozwiązane zmieniające się zmiany lipofilowości, co jest przedmiotem zainteresowania w ogólnej chemii medycznej. Zaletą tej metody jest to, że związki nie muszą być reaktywne, a także nie muszą być całkowicie czyste.

Nie ma potrzeby dokładnego pomiaru masy lub objętości ani ustalania krzywych kalibracyjnych. Należy wybrać odpowiedni związek odniesienia i unikać zanieczyszczenia krzyżowego podwielokrotności w fazie pobierania próbek. W tym filmie zademonstrujemy odpowiednie umiejętności praktyczne w zakresie pobierania próbek, uszczelniania probówek NMR i prawidłowego korzystania z oprogramowania NMR do przetwarzania danych.

Dodać 6,0 miligramów związku X i 3,0 miligramów związku odniesienia do 10 mililitrowej kolby w kształcie gruszki. Rozpuść związki w około dwóch mililitrach n-oktanolu klasy HPLC i dodaj dwa mililitry wody klasy HPLC. Umieść kolby w pojemniku o kontrolowanej temperaturze nad płytką mieszającą i podłącz do agregatu chłodniczego z recyrkulacją.

Mieszaj dwufazową mieszaninę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez dwie godziny, z prędkością mieszania ustawioną na 600 obr./min. Zrównoważyć mieszaninę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez noc, aby umożliwić całkowite rozdzielenie faz. Przymocować kolbę do stojaka na retortę za pomocą zacisku.

Weź porcję około 0,70 do 0,85 mililitra zarówno z warstw wody, jak i n-oktanolu, używając jednomililitrowych jednorazowych plastikowych strzykawek z długimi igłami. W celu pobrania porcji wody należy pobrać około 0,02 mililitra powietrza do strzykawki przed włożeniem igły do mieszanki. Przesuwając igłę przez górną warstwę n-oktanolu do warstwy wody, delikatnie wypchnij powietrze, aby zapobiec przedostawaniu się roztworu n-oktanolu do igły.

Usuń długą igłę z mieszanki. Wyrzuć niewielką ilość próbki wody, pozostawiając około 0,6 mililitra próbki w strzykawce. Ostrożnie przetrzyj igłę suchą chusteczką i wstrzyknij około 0,5 mililitra próbki wody do czystej probówki NMR.

Szybko zamknij probówkę NMR za pomocą nakrętki. W przypadku próbki n-oktanolu należy usunąć długą igłę z warstwy n-oktanolu. Wyrzuć niewielką ilość próbki n-oktanolu, pozostawiając około 0,6 mililitra próbki w strzykawce.

Po dokładnym przetarciu igły suchą chusteczką, wstrzyknąć około 0,5 mililitra próbki n-oktanolu do czystej probówki NMR. Szybko zamknij probówkę NMR za pomocą nakrętki. Sprawdź wzrokowo zarówno n-oktanol, jak i próbki wody pod kątem zanieczyszczeń z drugiej fazy.

Do każdej probówki NMR dodaj 0,1 mililitra deuterowanego rozpuszczalnika NMR, który miesza się zarówno z n-oktanolem, jak i wodą, aby umożliwić blokadę sygnału podczas akwizycji NMR. W przypadku związków o niskiej temperaturze wrzenia należy uszczelnić probówki NMR za pomocą lampy lutowniczej, a po schłodzeniu odwrócić rurkę, aby sprawdzić, czy nie ma wycieków. Ostrożnie odwróć zapieczętowane lub nieuszczelnione probówki NMR 20 razy, aby uzyskać jednorodny roztwór do eksperymentów F19 NMR.

Przeprowadź eksperymenty NMR z fluorem odsprzężonym z protonami, aby zidentyfikować przesunięcia chemiczne związku X i związku odniesienia zarówno w próbkach NMR n-oktanolu, jak i wody. Użyj standardowych ustawień parametrów NMR zgodnie z listą w protokole tekstowym. Zmierz czas relaksacji sieci spinowej (T1) dla diagnostycznych jąder fluoru za pomocą sekwencji odzyskiwania inwersji.

Zmierz poziom odpowiedniego czasu opóźnienia impulsu na podstawie uzyskanych wartości T1 w celu dokładnej ilościowej integracji NMR. Uruchom szybkie widmo F19 H1, aby skonfigurować parametry początkowe. Zmierz szerokość impulsu 90 stopni, a następnie ustaw parametr dla eksperymentu pomiarowego T1 i uruchom eksperyment pomiaru T1 przy użyciu sekwencji odzyskiwania inwersji.

Ponownie przeprowadź eksperymenty NMR z fluorem odsprzężonym z protonami z dostosowanymi ustawieniami parametrów. Ustaw D1 i wyśrodkuj punkt przesunięcia częstotliwości między dwoma diagnostycznymi sygnałami fluoru, tak aby oba jądra mogły być jednakowo wzbudzone. Ustaw również szerokość widmową na 300 PPM i ustaw liczbę stanów nieustalonych na 64.

Dostosuj te wartości, jeśli wymagany jest wyższy stosunek sygnału do szumu. Przetwarzaj uzyskane dane za pomocą procesora ACD NMR Academic Edition lub innego niestandardowego oprogramowania do przetwarzania NMR. Otwórz plik danych NMR.

Następnie otwórz folder pdata, a następnie folder 1. Usuń plik 1r. Wróć do pliku danych NMR i przeciągnij plik FID do okna ACD NMR Processor (Procesor ACD NMR).

Kliknij przycisk funkcji okna, wybierz wykładniczy, ustaw wartość poszerzenia linii na dwa i kliknij przycisk OK. Teraz kliknij przycisk wypełniania zerem, zwiększ liczbę punktów do czterokrotności pierwotnej liczby punktów, klikając mały przycisk obok liczby, a następnie kliknij przycisk w porządku. Wybierz przycisk transformaty Fouriera.

Następnie kliknij przycisk fazy, a następnie kliknij przycisk fazy myszy. Kliknij i przytrzymaj lewy przycisk myszy, a następnie kontynuuj przesuwanie myszy do przodu lub do tyłu, aż główny szczyt widma zostanie prawidłowo zgrupowany. Teraz kliknij i przytrzymaj prawy przycisk myszy i przesuń mysz do przodu lub do tyłu, aż inne szczyty widma zostaną prawidłowo zgrupowane.

Następnie odblokuj przycisk fazowania myszy i powiększ obszar widmowy z pikami fluoru. Kliknij przycisk dostrajanie, w razie potrzeby wykonaj korekcję fazy, zgodnie z wcześniejszym opisem, a następnie kliknij przycisk zaznaczenia. Kliknij przycisk linii bazowej, a następnie przycisk opcji.

Wybierz uśrednianie widma dla modeli automatycznych, w razie potrzeby dostosuj liczbę punktów dla połowy szerokości pola. Kliknij przycisk OK, automatycznie, a następnie kliknij przycisk zaznaczenia. Następnie kliknij integrację, zintegruj diagnostyczne piki fluoru i kliknij przycisk zaznaczenia.

Na koniec uzyskaj współczynniki integracji z próbek n-oktanolu i wody NMR i użyj ich w równaniu obliczeniowym logP, aby uzyskać wartość logP związku X. Używając 2, 2, 2-trifluoroetanolu jako związku odniesienia, uzyskano wartość logP 0,75 dla dwóch fluoroetanoli, a wartość logP dodatnią 1,20 stwierdzono dla 3, 3, 3, 2, 2-pentafluoropropanol. Następnie ponownie oznaczono lipofilowość dwóch fluoroetanolu, ale z 3, 3, 3, 2, 2-pentafluoropropanolem jako punktem odniesienia. Zmierzona wartość logP wynosiła 0,76, co oznaczało różnicę tylko 0,01 jednostki logP w porównaniu z wartością zmierzoną przy użyciu 2-2-2-trifluoroetanolu jako odniesienia.

Podobnie dla cis-2, 3-difluro-1, 4-butano-diolu różnica w zmierzonych wartościach logP przy użyciu dwóch fluoroetanolu i jego izomeru trans jest bardzo mała. Świadczy to o dobrej odtwarzalności i o tym, że wybór związku referencyjnego nie ma wpływu na pomiar logP. Dodatkowe wybrane przykłady są pokazane tutaj.

Wszystkie te nieaktywne w promieniowaniu UV związki alofatyczne, od węglowodanów fluorowanych po fluorohydryny, można łatwo zmierzyć tą metodą. Inne metody oparte na proto-NMR mogą być stosowane, jeśli twój związek nie zawiera fluoru, a jeśli związek zawiera UV Chromofor, wówczas pomiar logP można przeprowadzić przy użyciu kwantyfikacji UV. Zmierzono lipofilowość szerokiej gamy aktywnych fluorohydryn i węglowodanów deoksyfluonowanych bez promieniowania UV.

Uzyskaną bibliotekę danych wykorzystano do ustalenia trendów i zasad wpływu fluorowania alifatycznego na lipofilowość. Oktanol i woda stanowią minimalne zagrożenie dla bezpieczeństwa. Oczywiście zawsze należy brać pod uwagę mierzone zagrożenia i związek odniesienia.