Name: Inżynieria genomu oparta na CRISPR-Cas9 do generowania modeli reporterowych Jurkat dla zakażenia HIV-1 z wybranymi miejscami integracji prowirusa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 27 s
Description: Poznaj metodę CRISPR-Cas9 do tworzenia modeli reporterowych Jurkat dla HIV-1 z określonymi miejscami integracji prowirusa. Technika ta umożliwia badanie wpływu integracji na ekspresję genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Britta Weseloh i Bettina Abel za pomoc techniczną. Dziękujemy również Arne Düsedau i Janie Hennesen (platforma technologiczna cytometrii przepływowej, Heinrich Pette Institut) za wsparcie techniczne.

<ol><li>Hughes, S. H., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+Integration+Sites+Tell+Us+about+HIV+Persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">What Integration Sites Tell Us about HIV Persistence.</a> Cell Host and Microbe. 19 (5), 588-598 (2016).</li>
<li>Marini, B., Kertesz-Farkas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+architecture+dictates+HIV-1+integration+site+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection.</a> Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).</li>
<li>Cesana, D., Santoni de Sio, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1-mediated+insertional+activation+of+STAT5B+and+BACH2+trigger+viral+reservoir+in+T+regulatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">HIV-1-mediated insertional activation of STAT5B and BACH2 trigger viral reservoir in T regulatory cells.</a> Nature Communications. 8 (1), 498(2017).</li>
<li>Cohn, L. B., Silva, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Integration+Landscape+during+Latent+and+Active+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Integration Landscape during Latent and Active Infection.</a> Cell. 160 (3), 420-432 (2015).</li>
<li>Han, Y., Lassen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+CD4%2B+T+cells+from+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV-1%29-infected+individuals+carry+integrated+HIV-1+genomes+within+actively+transcribed+host+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes.</a> Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).</li>
<li>Ikeda, T., Shibata, J., Yoshimura, K., Koito, A., Matsushita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+HIV-1+integration+at+the+BACH2+locus+in+resting+CD4%2B+T+cell+populations+during+effective+highly+active+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Recurrent HIV-1 integration at the BACH2 locus in resting CD4+ T cell populations during effective highly active antiretroviral therapy.</a> The Journal of Infectious Diseases. 195 (5), 716-725 (2007).</li>
<li>Wagner, T. A., Mclaughlin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+of+cells+with+HIV+integrated+into+cancer+genes+contributes+to+persistent+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Proliferation of cells with HIV integrated into cancer genes contributes to persistent infection.</a> Science. 345 (6196), 570-573 (2014).</li>
<li>Maldarelli, F., Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+HIV+integration+sites+are+linked+to+clonal+expansion+and+persistence+of+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells.</a> Science. 345 (6193), 179-183 (2014).</li>
<li>Jordan, A., Bisgrove, D., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+reproducibly+establishes+a+latent+infection+after+acute+infection+of+T+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">HIV reproducibly establishes a latent infection after acute infection of T cells in vitro.</a> The EMBO Journal. 22 (8), 1868-1877 (2003).</li>
<li>Mack, K. D., Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+insertions+within+and+proximal+to+host+cell+genes+are+a+common+finding+in+tissues+containing+high+levels+of+HIV+DNA+and+macrophage-associated+p24+antigen+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Acquired+Immune+Deficiency+Syndromes%22%5BJournal%5D)">HIV insertions within and proximal to host cell genes are a common finding in tissues containing high levels of HIV DNA and macrophage-associated p24 antigen expression.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 33 (3), 308-320 (2003).</li>
<li>Byrne, S. M., Ortiz, L., Mali, P., Aach, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-kilobase+homozygous+targeted+gene+replacement+in+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Multi-kilobase homozygous targeted gene replacement in human induced pluripotent stem cells.</a> Nucleic Acids Research. 43 (3), 1-12 (2014).</li>
<li>ZhangLab. CRISPR Genome Engineering Toolbox: Target Sequence Cloning Protocol. Addgene website. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf">https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf</a> (2013).</li>
<li>Moser, F. Addgene. Gibson Assembly Protocol. Addgene website. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/">https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/</a> (2009).</li>
<li>Addgene Plasmid Cloning by PCR. Addgene website. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/">https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/</a> (2014).</li>
<li>Addgene Plasmid Cloning by Restriction Enzyme Digest (aka Subcloning). Addgene website. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/subcloning/ ">https://www.addgene.org/protocols/subcloning/ </a> (2013).</li>
<li>Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCTop%3A+An+intuitive%2C+flexible+and+reliable+CRISPR-Cas9+target+prediction+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+%28PLoS%29+ONE%22%5BJournal%5D)">CCTop: An intuitive, flexible and reliable CRISPR-Cas9 target prediction tool.</a> Public Library of Science (PLoS) ONE. 10 (4), (2015).</li>
<li>Lange, U. C., Bialek, J. K., Walther, T., Hauber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pinpointing+recurrent+proviral+integration+sites+in+new+models+for+latent+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Pinpointing recurrent proviral integration sites in new models for latent HIV-1 infection.</a> Virus Research. 249, (2018).</li>
<li>Bialek, J. K., Dunay, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+HIV-1+Latency+Reversal+Using+CRISPR-Cas9-Derived+Transcriptional+Activator+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Targeted HIV-1 Latency Reversal Using CRISPR-Cas9-Derived Transcriptional Activator Systems.</a> PloS ONE. 11 (6), e0158294(2016).</li>
<li>Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+CRISPR-Cas9+design+tools+and+the+effect+of+target+site+accessibility+on+Cas9+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Examination of CRISPR-Cas9 design tools and the effect of target site accessibility on Cas9 activity.</a> Experimental Physiology. 103 (4), 456-460 (2018).</li>
<li>Jensen, K. T., Fløe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+accessibility+and+guide+sequence+secondary+structure+affect+CRISPR-Cas9+gene+editing+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Chromatin accessibility and guide sequence secondary structure affect CRISPR-Cas9 gene editing efficiency.</a> FEBS Letters. 591 (13), 1892-1901 (2017).</li>
<li>Simonetti, F. R., Sobolewski, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonally+expanded+CD4+%2B+T+cells+can+produce+infectious+HIV-1+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Clonally expanded CD4 + T cells can produce infectious HIV-1 in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (7), 1883-1888 (2016).</li>
<li>Chen, H. C., Martinez, J. P., Zorita, E., Meyerhans, A., Filion, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position+effects+influence+HIV+latency+reversal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Position effects influence HIV latency reversal.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (1), 47-54 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy protokół generowania modeli reporterowych Jurkat pochodzących z HIV-1 z wybranymi miejscami integracji prowirusa przy użyciu inżynierii genomu opartej na CRISPR-Cas9.
Kilka punktów protokołu wymaga szczególnej uwagi na etapie planowania. Po pierwsze, locus, który ma być docelowy, powinien być starannie wybrany, ponieważ niektóre loci mogą być łatwiejsze do namierzenia niż inne (np. w zależności od statusu chromatyny regionu i samej sekwencji docelowej). Powtarz...

Integracja DNA prowirusa z genomem gospodarza po zakażeniu jest kluczowym krokiem w cyklu życia ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV). Po integracji HIV utrzymuje się poprzez ustanowienie opóźnienia w długożyciowych podzbiorach limfocytów T CD4 +, takich jak limfocyty T CD4 + pamięci. Integracja wirusa HIV wydaje się być nielosowa1,2. W kilku badaniach wykryto szereg gorących punktów genomowych z rekurencyjnie zintegrowanym prowirusowym DNA poprzez sekwencjonowanie miejsc integracji u osób zakażonych ostro i przewlekle2,3,4,5,6,7,8. Co ciekawe, w niektórych z tych miejsc integracji ten sam locus wykryto w dużej części zainfekowanych komórek, co prowadzi do wniosku, że integracja w nawracających miejscach może pozytywnie wpłynąć na ekspansję klonalną1.
Aby poszerzyć nasze zrozumienie znaczenia powtarzających się miejsc integracji, należy rozważyć wybór miejsca integracji prowirusowej. Jednak kilka aspektów technicznych utrudnia badanie wyboru miejsca integracji HIV i jego konsekwencji. Szeroko stosowane modele hodowli komórkowych dla latencji HIV, takie jak linie komórkowe JLat, nie odzwierciedlają klinicznie istotnych nawracających miejsc integracji9. Badania nad pierwotnymi komórkami pochodzącymi od pacjentów z jednej strony umożliwiają opisanie krajobrazu miejsc integracji za pomocą sekwencjonowania, ale nie pozwalają na analizy funkcjonalne. Zgodnie z naszą wiedzą, nie jest dostępny odpowiedni model eksperymentalny do funkcjonalnej analizy wybranych klinicznie istotnych miejsc integracji.
Tutaj prezentujemy szczegółowy proces generowania nowych modeli infekcji HIV przy użyciu technologii inżynierii genomu opartej na CRISPR-Cas9. Opisany tutaj przepływ pracy może być wykorzystany do wygenerowania linii komórek reporterowych pochodzących z limfocytów T, które modelują zakażenie wirusem HIV, przenosząc genomicznie zintegrowany reporter prowirusowy w wybranym miejscu integracji. Służą one zatem jako nowe narzędzia do badania, w jaki sposób miejsce integracji prowirusa może wpływać na biologię HIV i jak prowirus reaguje na różne strategie leczenia (np. indukowalność przez czynniki odwracające utajenie). Nasza metoda wykorzystuje zalety inżynierii genomowej opartej na CRISPR-Cas9, w której integracja sekwencji reporterowej przez rekombinację homologiczną jest ułatwiona przez wywołane nukleazą Cas9 pęknięcie podwójnej nici w miejscu docelowym. Miejsca docelowe do integracji są wybierane w zależności od odległości opisanych miejsc nawracającej integracji z badań na osobach zakażonych wirusem HIV oraz obecności odpowiednich motywów PAM dla inżynierii genomu za pośrednictwem Cas9.
W naszych przykładowych wynikach skupiliśmy się na locus genu BACH2, który koduje regulator transkrypcji BTB And CNC Homology 2. U osób przewlekle zakażonych wirusem HIV poddawanych terapii antyretrowirusowej, BACH2 jest jednym z loci wykazujących wzbogacenie zintegrowanych sekwencji HIV-13,6,7,8,10. Wybraliśmy minimalny reporter pochodzący od HIV składający się z długiego powtórzenia końcowego pochodzącego z HIV-1 (LTR), sekwencji kodującej tdTomato i sygnału poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu (BGH) (PA), który skierowaliśmy do dwóch określonych miejsc w intronie 5 BACH2. Przedstawiony protokół jest zoptymalizowany pod kątem komórek Jurkat, ludzkiej linii komórek zawiesinowych pochodzących z limfocytów T CD4 +, ale można zastosować inne linie komórkowe i odpowiednio dostosować protokół. Przedstawiamy szczegółowy proces wyboru miejsca docelowego, budowy wektora docelowego z ramionami homologicznymi, celowania reportera w wybrane miejsce genomowe za pośrednictwem CRISPR-Cas9, generowania i selekcji linii klonalnych oraz kompleksowej weryfikacji nowo wygenerowanych, docelowych linii komórek reporterowych.

<table><tbody><tr><td>pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td>wektor do ekspresji SpCas9 i gRNA</td></tr><tr><td>pMK</td><td>GeneArt</td><td></td> wektor <td>ekspresyjny ssaków do klonowania</td></tr><tr><td>cDNA3.1</td><td>Wektor ekspresji ssaków</td><td>Invitrogen</td><td>V79020</td> do klonowania</tr><tr><td>BbsI</td><td>New England Biolabs</td><td>Enzym restrykcyjny</td><td>R0539S</td></tr><tr><td>NEBuilder Hifi DNA Zestaw do klonowania montażowego</td><td>New England Biolabs</td><td>E5520S</td><td>Zestaw do klonowania montażowego używany do generowania wektorów docelowych</td></tr><tr><td>TaqPlus Precision PCR System</td><td>Agilent Technologies</td><td>600210</td><td>Polimeraza DNA z aktywnością korekcyjną stosowana do amplifikacji ramion homologicznych (krok 1.2.2.2), weryfikacji miejsca integracji i sekwencji reporterowej (kroki 3.3.3 i 3.3.5), generowania sondy genomowej dla Southern blot (krok 3.4.1.5) i analizy zdarzeń niedocelowych (krok 3.5.4)</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka do hodowli tkankowej (okrągłodenna)</td> Płytki do hodowli tkankowych <td>TPP</td><td>92097</td><td>do rozcieńczania</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Phusion High-Fidelity</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530 L</td><td>Polimeraza DNA stosowana do wykrywania zdarzeń docelowych (krok 2.4.2) i generowania sondy specyficznej dla reportera dla Southern blot (krok 3.4.1.4)</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9170</td><td>dimetylosulfotlenek jako PCR dodatek</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2) Roztwór</td><td>New England Biolabs</td><td>B9021S</td><td>MgCl2 jako dodatek do PCR</td></tr><tr><td>Roztwór deoksynukleotydu (dNTP) Mieszanina New</td><td>England Biolabs</td><td>N0447S</td><td>dNTP z 10 mM każdego nt do reakcji PCR</td></tr><tr><td>5PRIME HotMasterMix</td><td>5PRIME</td><td>2200400</td><td>gotowa do użycia mieszanina PCR używana do przesiewowego PCR (krok 3.2.11)</td></tr><tr><td>QIAamp DNA blood mini kit</td><td>Qiagen</td><td>51106</td><td>Zestaw do izolacji i oczyszczania DNA</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Zestaw do oczyszczania</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>PCR Zestaw do oczyszczania</td></tr><tr><td>RPMI 1640 bez glutaminy</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td><td>Lonza</td><td>BE12-167F</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu Republika Południowej Afryki Opłata</td><td>PAN Biotech</td><td>P123002</td><td>suplement pożywki</td></tr> <tr><td>do hodowli komórkowychL-glutamina</td><td>Biochrom</td><td>K 0282</td><td>pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>suplement Penicylina/Streptomycyna 10.000 U/mL/ 10.000 &mikro; g/mL</td><td>Biochrom</td><td>A 2212</td><td>suplement pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Gibco Opti-MEM Reduced Serum Media</td> Pożywka do hodowli komórkowych <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985062</td><td>o obniżonym stężeniu w surowicy zoptymalizowana pod kątem transfekcji</td></tr><tr><td>TransIT-Jurkat</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR2125</td><td>odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>12-mirysianianu 13-octan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139-1MG</td><td> odczynnik</td></tr><tr><td>Jonomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634-1MG</td><td>odczynnik do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Jednostka filtrująca napędzana strzykawką, membrana PES, 0,22 i mikro; m</td> Jednostka filtrująca <td>Millex</td><td>SLGP033RB</td><td>do filtracji sterylnej</td></tr><tr><td>Inkubator Heracell 150i</td><td>Termo Fisher Naukowy</td><td></td><td>inkubator kultur tkankowych</td></tr><tr><td>51026280 Amershan Hybond-N+</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN1520B</td><td>dodatnio naładowana membrana nylonowa do blottingu DNA i RNA</td></tr><tr><td>Stratalinker 1800</td><td>Stratagene</td><td>400072</td><td>UV Crosslinker</td></tr><tr><td>High Prime</td><td>Zestaw Roche</td><td>11585592001</td><td>do znakowania DNA radioaktywnym dCTP przy użyciu losowych oligonukleotydów jako starterów ilustruje</td></tr><tr><td>Mikrokolumny ProbeQuant G-50</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9034-08</td><td>chromatograficzne kolumny spinowe do oczyszczania znakowanego DNA</td></tr></tbody></table>

inżynieria genomu oparta na crispr-cas9 do generowania modeli reporterowych jurkat dla zakażenia hiv-1 z wybranymi miejscami integracji prowirusa

CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites

Ludzki wirus niedoboru odporności (HIV) integruje swoje prowirusowe DNA nielosowo z genomem komórki gospodarza w powtarzających się miejscach i gorących punktach genomu. W niniejszym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół generowania nowych modeli in vitro zakażenia wirusem HIV z wybranymi miejscami integracji genomowej z wykorzystaniem technologii inżynierii genomu opartej na CRISPR-Cas9. Dzięki tej metodzie wybrana sekwencja reporterowa może zostać zintegrowana z docelowym, wybranym locus genomowym, odzwierciedlającym klinicznie istotne miejsca integracji.
W protokole opisany jest projekt reportera pochodzącego od HIV oraz wybór miejsca docelowego i sekwencji gRNA. Wektor celujący z ramionami homologicznymi jest konstruowany i transfekowany do limfocytów T Jurkat. Sekwencja reporterowa jest ukierunkowana na wybrane miejsce genomowe za pomocą rekombinacji homologicznej, ułatwionej przez pęknięcie podwójnej nici za pośrednictwem Cas9 w miejscu docelowym. Klony pojedynczych komórek są generowane i badane pod kątem zdarzeń docelowych za pomocą cytometrii przepływowej i PCR. Wybrane klony są następnie namnażane, a prawidłowe celowanie jest weryfikowane za pomocą PCR, sekwencjonowania i Southern blot. Analizowane są potencjalne zdarzenia niezgodne z celem inżynierii genomu za pośrednictwem CRISPR-Cas9.
Korzystając z tego protokołu, można wygenerować nowe systemy hodowli komórkowych, które modelują zakażenie wirusem HIV w klinicznie istotnych miejscach integracji. Chociaż generowanie klonów jednokomórkowych i weryfikacja prawidłowej integracji sekwencji reporterowej jest czasochłonne, uzyskane linie klonalne są potężnymi narzędziami do funkcjonalnej analizy wyboru miejsca integracji prowirusa.

W tym reprezentatywnym eksperymencie zdecydowaliśmy się na skierowanie minimalnego reportera pochodnego od HIV-1, składającego się z LTR, sekwencji kodującej tdTomato oraz sekwencji sygnału polyA, do dwóch loci w intronie 5 genu BACH217. Loci do targetowania wybrano na podstawie bliskości do opublikowanych powtarzalnych miejsc integracji zidentyfikowanych w różnych badaniach nad pierwotnymi limfocytami T od pacjentów zakażonych HIV2,</s...

Prezentujemy proces inżynierii genomu do generowania nowych modeli in vitro dla zakażenia HIV-1, które podsumowują integrację prowirusową w wybranych miejscach genomu. Ukierunkowanie na osoby zgłaszające pochodzące od wirusa HIV jest ułatwione dzięki manipulacji genomem specyficznej dla danego miejsca za pośrednictwem CRISPR-Cas9. Dostępne są szczegółowe protokoły generowania klonów pojedynczych komórek, badań przesiewowych i weryfikacji prawidłowego celowania.

Inżynieria genomu oparta na CRISPR-Cas9 do generowania modeli reporterowych Jurkat dla zakażenia HIV-1 z wybranymi miejscami integracji prowirusa

Human immunodeficiency virus (HIV) integrates its proviral DNA non-randomly into the host cell genome at recurrent sites and genomic hotspots. Here we ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na pytanie, w jaki sposób integracja prowirusa HIV wpływa na androgyniczną ekspresję genów i dlaczego pewne miejsca integracji genomu są wybierane w komórkach niedawno zakażonych wirusem HIV. Główną zaletą tej techniki jest to, że można wyprodukować modele zakażenia wirusem HIV in vitro, które przenoszą reportery prowirusowe ukierunkowane na wybrane miejsca integracji przy użyciu inżynierii genomu opartej na CRISPR/Cas9. Procedurę zademonstrują doktorant Thomas Walther i Julia Białek, doktorant z mojego laboratorium.Zacznij od użycia UCSC Genome Browser do ekstrakcji in silico sekwencji genomowej pożądanego locus genomowego, który ma być docelowy. Aby wybrać przewodnikowe RNA 20 nukleotydów do celowania w wybrane locus genomowe, użyj narzędzia internetowego E-CRISP. Następnie wybierz Homo Sapiens Genome Reference Consortium Human Genome:Build 38.Odnieś się do genomu jako organizmu i wprowadź 2 000 par zasad sekwencji genomowej, obejmującej żądane locus genomu, które zostało wcześniej wyekstrahowane. Rozpocznij wyszukiwanie przewodnika RNA przy użyciu ustawień aplikacji pożywki z dowolnym PAM, dowolnymi pięcioma zasadami pierwszymi, niedocelowymi tolerancjami niezgodności oraz wykluczonymi intronami i wyspami CPG. Z wyświetlonej listy z możliwymi projektami przewodnika RNA wybierz przewodnik RNA z wysokim wynikiem swoistości i wydajności, który jest jak najbardziej zbliżony do pożądanego locus genomu, który ma być docelowy.Otwórz przeglądarkę NCBI Blast, aby przestrzelić wybraną sekwencję przewodnika RNA w stosunku do genomu referencyjnego. Aby sprawdzić unikalność wybranego miejsca wiązania przewodnika-RNA, najpierw wybierz człowieka jako genom, a następnie wprowadź sekwencję przewodnika-RNA jako sekwencję zapytania. Następnie wybierz bardzo podobne sekwencje lub Mega Blast jako program, aby upewnić się, że sekwencja przewodnika RNA jest unikalna.Następnie wybierz in-silico 1 000 par zasad, przed i za sekwencją przewodnika RNA z sekwencji genomowej wyekstrahowanej na początku. Użyj tych wybranych 1 000 par zasad, w górę i w dół strumienia, jako ramion homologii pięciokrotnej i trzypierwszej do konstruowania wektorów docelowych i przylegania sekwencji reporterowej, która ma być celowana. Na 24 godziny przed transfekcją limfocytów T jurkata należy przygotować jedną pełną 6-dołkową płytkę komórek do pojedynczego eksperymentu celowania.Na początek umieść 1 250 000 komórek w 2,5 mililitrze RPMI 1640 z suplementami i bez antybiotyków na studzienkę. Następnego dnia dodać do mikrogramów kołowego wektora celowniczego i dwóch mikrogramów plazmidu ekspresyjnego Cas9 i prowadzącego RNA na studzienkę, do 250 mikrolitrów komercyjnej pożywki RPMI zoptymalizowanej pod kątem transfekcji, w probówce reakcyjnej i dobrze wymieszać przez wirowanie. Następnie powoli dodaj 12 mikrolitrów środka do transfekcji do pożywki DNA, nie dotykając ścianki probówki.Przesuń probówkę i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj mieszaninę kroplami do jednego dołka komórek. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.A 72 godziny po transfekcji wyciągnij transfekowane komórki, policz je i przygotuj do wzbogacenia przez FACS. Po potwierdzeniu zdarzeń docelowych w mieszanej populacji komórek docelowych, rozpocznij generowanie klonów pojedynczych komórek, przygotowując wcześniej pożywkę kondycjonowaną przez jurkat, zbierając RPMI z antybiotykami ze zdrowych, nieleczonych limfocytów T jurkata. Odwirować probówki przez 5 minut przy stężeniu 300 G i przefiltrować supernatant za pomocą strzykawki o pojemności 25 mililitrów, używając filtra 0,22 mikrometra do nowych, 50-mililitrowych probówek stożkowych.Policz docelowe komórki uprzednio wzbogacone FACS, 10 do 14 dni po ekspansji, a następnie rozcieńcz je w RPMI antybiotykami do stężenia 100 000 komórek na mililitr. Rozcieńczyć 100 mikrolitrów tego rozcieńczenia komórek 9,9 mililitra pożywki, aby uzyskać 1,000 komórek na mililitr. Następnie rozcieńczyć jeden mililitr tego rozcieńczenia dziewięcioma mililitrami pożywki do stężenia 100 komórek na mililitr.Aby pokryć 96 dołków, aby zawierały jedną komórkę na studzienkę, delikatnie wymieszaj jeden mililitr roztworu o objętości 100 komórek na mililitr z pięcioma mililitrami pożywki i czterema mililitrami świeżej pożywki w sterylnym zbiorniku na odczynniki. Następnie za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 100 mikrolitrów odpowiedniego rozcieńczenia komórek na dołek nowych 96-dołkowych płytek o okrągłym dnie, aby uzyskać rozcieńczenie jednej i dwóch komórek na studzienkę. Ułóż 96 dołków i przykryj każdy stos sześciodołkową płytką zawierającą trzy mililitry PBS na studzienkę.Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżanym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla przez trzy tygodnie. Po zakończonej inkubacji wizualnie potwierdź obecność wyhodowanych kolonii za pomocą mikroskopii świetlnej z czterokrotnym powiększeniem i oznacz studzienki wyhodowanymi koloniami. Delikatnie zawiesić ponownie komórki jednej z dobrze zaznaczonych przez pipetowanie.Przenieść 100 mikrolitrów tej zawiesiny komórek do jednego dołka świeżo przygotowanej 96-dołkowej okrągłej płytki dennej ze 100 mikrolitrami RPMI z antybiotykami, na studzienkę i powtórzyć dla wszystkich zaznaczonych studzienek, delikatnie wymieszać pipetując. Aby zduplikować płytkę, przenieś 100 mikrolitrów tej zawiesiny komórek na drugą pustą, 96-dołkową płytkę z okrągłym dnem i powtórz ten proces dla wszystkich oznaczonych studzienek. Na koniec napełnij puste studzienki 200 mikrolitrami RPMI antybiotykami.Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po inkubacji zduplikowanej płytki przez 24 do 48 godzin, zduplikuj ją ponownie, dodając 100 mikrolitrów RPMI z antybiotykami do każdej studzienki. Użyj pipety wielokanałowej, aby delikatnie wymieszać i przenieś 100 mikrolitrów do każdego dołka nowej 96-dołkowej płytki z okrągłym dnem.Umieść jedną z tych dwóch zduplikowanych płytek w inkubatorze. Użyj drugiej z nowych zduplikowanych płytek do cytometrii przepływowej, najpierw dodając pięć mikrolitrów PMA/Ionomycin Master Mix na dołek, aby stymulować komórki. Inkubować przez 24 godziny i przygotować komórki do cytometrii przepływowej, jak opisano w tekście.Bramkuje dowolne żywe pojedyncze komórki na podstawie rozmiaru w rozproszeniu do przodu i na boki. Analiza ekspresji fluorescencyjnego genu reporterowego za pomocą cytometrii przepływowej. Aby przebadać klony pojedynczych komórek metodą PCR, zaprojektuj startery P5 i P6 do badania przesiewowego PCR w oparciu o wybraną sekwencję reporterową, aby amplifikować od 500 do 800 par zasad sekwencji reporterowej.W przypadku PCR z kontrolą pozytywną zaprojektuj startery P7 i P8, które amplifikują 630 par zasad niedocelowego locus genomowego typu dzikiego. Zaprojektuj trzecią parę starterów, która wzmacnia od 500 do 600 par zasad szkieletu wektora docelowego jako kontrolę dla niespecyficznej integracji sekwencji szkieletowych wektora docelowego. Gdy klony na drugiej zduplikowanej płytce wystarczająco urosną, przygotuj je do badania przesiewowego PCR, najpierw odwirowując płytkę przez 10 minut w temperaturze 300 G w temperaturze pokojowej.Ostrożnie zdjąć supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Przemyć komórki 100 mikrolitrami PBS przez delikatne pipetowanie, odwirowując płytkę przez pięć minut w temperaturze 300 G w temperaturze pokojowej. Usuń PBS i dodaj 200 mikrolitrów buforu do lizy na studzienkę.Delikatnie odpipetować do wymieszania i przenieść zawiesinę na nową płytkę do PCR. Uszczelnij płytkę folią parafinową i inkubuj przez godzinę w temperaturze 55 stopni Celsjusza w termocyklerze. Po odwirowaniu resztek komórkowych z maksymalną prędkością przez 10 minut, przenieść supernatant na nową płytkę do PCR.Dodaj 10 mikrolitrów tego lizatu komórkowego do każdej studzienki 96-dołkowej płytki PCR wypełnionej 110 mikrolitrami destylowanego H2O na studzienkę. Następnie inkubować przez 10 minut w temperaturze 99 stopni Celsjusza w termocyklerze, aby dezaktywować proteinazę K. Użyj 2 mikrolitrów tego lizatu komórkowego jako matrycy i użyj komercyjnej mieszanki wzorcowej PCR do badań przesiewowych, kontroli i PCR szkieletu. Uruchom PCR przez 38 do 40 cykli amplifikacji PCR w formacie 96-dołkowym.Użyj pięciu mikrolitrów produktów PCR i uruchom je na 1,5% żelu TAE z agarozy, aby przeanalizować i połączyć wyniki cytometrii przepływowej i PCR, aby potwierdzić klony pojedynczych komórek. Ekspresję genu reporterowego po indukcji PMA/jonomycyny potwierdzono zarówno za pomocą cytometrii przepływowej, jak i PCR w 4 do 12% komórek, w zależności od miejsca integracji. Analiza PCR genomowego DNA przy użyciu starterów dla pięcio- i trzypierwszorzędnego skrzyżowania integracyjnego potwierdza, że wystąpiły zdarzenia celowania.Po badaniach przesiewowych klonów pojedynczych komórek pod kątem prawidłowego celowania za pomocą cytometrii przepływowej obserwowano klony z wysoką, niską i zerową ekspresją fluorescencyjnych genów reporterowych. Klony pojedynczych komórek potwierdzono również metodą PCR przy użyciu starterów specyficznych dla reportera i starterów kontrolnych. Klony, u których potwierdzono pozytywny wynik w przesiewowym PCR, zostały wykorzystane i poddane dalszej analizie pod kątem prawidłowego celowania przez Southern blot, przy użyciu sondy specyficznej dla reportera i wiązania sondy genomowej na zewnątrz reportera.Tylko część wykazała prawidłowe rozmiary prążków w analizie Southern blot i heterozygycznie zintegrowała reportera, co pokazuje, że ważne jest zweryfikowanie wyników PCR za pomocą Southern blot. Klony analizowano również przez sekwencjonowanie, aby dodatkowo potwierdzić pozytywne klony jednokomórkowe. Sekwencjonowanie miejsca docelowego: allel homologiczny, w którym reporter nie uległ integracji, ujawniło mutacje indukowane przez Cas9.Po opanowaniu, generowanie linii reporterskich HIV może zostać zrealizowane w ciągu dwóch do trzech miesięcy. Przed przystąpieniem do targetowania ważne jest, aby poświęcić wystarczająco dużo czasu na wybór strony integracyjnej i odpowiedniego reportera, w zależności od pytania badawczego, z którym chcesz się zmierzyć. Osoby zgłaszające mogą na przykład uwzględnić różne elementy regulacyjne dotyczące HIV, jeśli jest to pożądane.Zgodnie z tą procedurą, linie komórkowe mogą być na przykład wykorzystane do przetestowania wpływu różnych czynników zwiększających opóźnienia na aktywność transkrypcyjną reporterowego LTR, w zależności od jego miejsca integracji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować linie reporterowe HIV specyficzne dla miejsca integracji w celu projektowania przewodnikowych RNA i wektora docelowego, wykonywania inżynierii genomu opartej na CRISPR / Cas9 w komórkach jurkat, produkcji klonów pojedynczych komórek i wybierania prawidłowo ukierunkowanych klonów za pomocą FACS i badań przesiewowych PCR. Nie zapominaj, że jeśli zdecydujesz się na współpracę z kompetentnym reporterem HIV odpowiedzialnym za replikację, musisz pracować w warunkach bezpieczeństwa BSL3.

crispr-cas9-based-genome-engineering-to-generate-jurkat-reporter

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Obecne strategie walki z HIV-1 dążą do zahamowania cyklu życiowego wirusa, lecz nie eliminują skutecznie infekcji. W niniejszej pracy wykazujemy, że zmodyfikowana rekombinaza może efektywnie wycinać zintegrowane prowiralne DNA HIV-1 z genomu zainfekowanych komórek.

Wywiad: Wycinanie prowiralnego DNA HIV-1 przy użyciu ewoluowanej rekombinazy

Narzędzia do edycji genomu, takie jak system CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (związany z CRISPR), znacznie poprawiły skuteczność celowania w geny w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych (hiPSC). Niniejszy manuskrypt opisuje protokół generowania specyficznego dla linii reportera hiPSC przy użyciu rekombinacji homologicznej wspomaganej systemem CRISPR/Cas.

Wydajne generowanie reporterów knockin specyficznych dla linii neuronowej hiPSC przy użyciu systemu podwójnej nickazy CRISPR/Cas9 i Cas9

System CRISPR/Cas9 oferuje potencjał, aby uczynić ukierunkowaną edycję genomu dostępną i przystępną cenowo dla społeczności naukowej. Protokół ten ma na celu zademonstrowanie, jak tworzyć wirusy, które znokautują interesujący nas gen za pomocą systemu CRISPR/Cas9, a następnie wstrzykną je stereotaktycznie do mózgu dorosłej myszy.

Projektowanie, pakowanie i dostarczanie wysokomianowych CRISPR Retro i lentiwirusów poprzez iniekcję stereotaktyczną

Opisujemy protokół amplifikacji miejsc integracji retrowirusowej z genomowego DNA zakażonych komórek, sekwencjonowania amplifikowanych połączeń wirus-gospodarz, a następnie mapowania tych sekwencji do genomu referencyjnego. Opisujemy również techniki ilościowego określania rozmieszczenia miejsc integracji w odniesieniu do różnych adnotacji genomowych za pomocą BEDTools.

Amplifikacja, sekwencjonowanie nowej generacji i mapowanie genomowego DNA miejsc integracji retrowirusowej

Zgrupowany, regularnie rozmieszczony, krótki powtórzeń palindromicznych/system białka związanego z CRISPR 9 (CRISPR/Cas9) stanowi obiecujące narzędzie dla inżynierii genetycznej i otwiera możliwość celowej integracji transgenów. Opisujemy strategię opartą na łączeniu końców za pośrednictwem homologii (HMEJ) dla efektywnej ukierunkowanej integracji DNA in vivo i celowanych terapii genowych przy użyciu CRISPR/Cas9.

Ukierunkowana integracja in vivo za pośrednictwem CRISPR/Cas9 przy użyciu strategii opartej na łączeniu końcowym za pośrednictwem homologii

Opisujemy strategię produkcji wektorów lentiwirusowych z niedoborem integrazy (IDLV) jako nośników dostarczania CRISPR/Cas9 do komórek. Dzięki zdolności do pośredniczenia w szybkiej i niezawodnej edycji genów w komórkach, IDLV stanowią bezpieczniejszą i równie skuteczną platformę wektorową do dostarczania genów w porównaniu z wektorami kompetentnymi do integrazy.

Protokół wytwarzania wektorów lentiwirusowych z niedoborem integrazy do nokautu genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w dzielących się komórkach

Opisujemy test oparty na komórkach, który informuje o fuzji HIV-1 poprzez ekspresję białka zielonej fluorescencji wykrywalnego za pomocą cytometrii przepływowej lub mikroskopii fluorescencyjnej. Może być stosowany do testowania inhibitorów wnikania wirusa (szczególnie na etapie fuzji) w systemach infekcji bezkomórkowych i międzykomórkowych.

Wysokoprzepustowy test fuzji błony wirusowej aktywowanej Cre-Lox w celu identyfikacji inhibitorów fuzji błony wirusowej HIV-1

Ukierunkowana edycja epigenomu DNA reprezentuje potężne podejście terapeutyczne. Protokół ten opisuje produkcję, oczyszczanie i koncentrację wektorów lentiwirusowych typu "wszystko w jednym" zawierających transgen CRISPR-dCas9-DNMT3A do zastosowań w edycji epigenomu w neuronach pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC).

Platforma wektorów lentiwirusowych do efektywnego dostarczania narzędzi do edycji epigenomu do modeli chorób pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Opisane są protokoły wysoce efektywnej edycji genomu mysich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) przez system CRISPR/Cas9 w celu szybkiego rozwoju mysich systemów modelowych z modyfikacjami genów specyficznymi dla układu krwiotwórczego.

Edycja genomu za pośrednictwem lentiwirusowego CRISPR/Cas9 w celu badania komórek krwiotwórczych w modelach chorobowych

Tutaj udostępniamy szczegółowy, krok po kroku protokół inżynierii genomowej opartej na CRISPR/Cas9 pierwotnych ludzkich limfocytów B do nokautowania genów (KO) i knock-in (KI) w celu zbadania biologicznych funkcji genów w komórkach B i rozwoju terapii komórek B.

Inżynieria genomu pierwotnych ludzkich komórek B przy użyciu CRISPR/Cas9

Przedstawiamy protokół retrowirusowej transdukcji przewodnikowego RNA do pierwotnych limfocytów T od transgenicznych myszy Cas9, zapewniając efektywną alternatywę dla edycji genów w badaniu różnicowania Th17.

Retrowirusowe celowanie genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w badaniu różnicowania Th17 in vitro

Poznaj metodę CRISPR-Cas9 do tworzenia modeli reporterowych Jurkat dla HIV-1 z określonymi miejscami integracji prowirusa. Technika ta umożliwia badanie wpływu integracji na ekspresję genów.

Inżynieria genomu oparta na CRISPR-Cas9 do generowania modeli reporterowych Jurkat dla zakażenia HIV-1 z wybranymi miejscami integracji prowirusa (Wideo) | JoVE Journal

Inżynieria genomu oparta na CRISPR-Cas9 do generowania modeli reporterowych Jurkat dla zakażenia HIV-1 z wybranymi miejscami integracji prowirusa

Przeglądaj więcej filmów