Name: Kontrolowany mysi model posocznicy wielodrobnoustrojowej u noworodków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 54 s
Description: Poznaj metodę przygotowania zawiesiny treści ślepej i indukcji posocznicy u siedmiodniowych myszy. Ten protokół umożliwia badanie patofizjologii noworodków z użyciem modelu wielodrobnoustrojowej infekcji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Specjalne podziękowania dla Claire Harrison i Animal Care Facility w British Columbia Children's Hospital Research Institute (BCCHR) za ich wsparcie w pracy ze zwierzętami, a także dla dr Po-Yan Cheng za ich wskazówki i wkład w monitorowanie i dobrostan zwierząt.

<ol><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+causes+of+child+mortality+in+2000-13%2C+with+projections+to+inform+post-2015+priorities%3A+an+updated+systematic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national causes of child mortality in 2000-13, with projections to inform post-2015 priorities: an updated systematic analysis.</a> The Lancet. 385 (9966), 430-440 (2015).</li>
<li>Wynn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+mortality+and+altered+immunity+in+neonatal+sepsis+produced+by+generalized+peritonitis%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Increased mortality and altered immunity in neonatal sepsis produced by generalized peritonitis.</a> Shock. 28 (6), 675-683 (2007).</li>
<li>Fink, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Animal models of sepsis.</a> Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).</li>
<li>Wynn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+innate+immunity+predisposes+murine+neonates+to+poor+sepsis+outcome+but+is+reversed+by+TLR+agonists%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Defective innate immunity predisposes murine neonates to poor sepsis outcome but is reversed by TLR agonists.</a> Blood. 112 (5), 1750-1758 (2008).</li>
<li>Cuenca, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+CXC+ligand+10%2FCXC+receptor+3+signaling+in+the+murine+neonatal+response+to+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Critical role for CXC ligand 10/CXC receptor 3 signaling in the murine neonatal response to sepsis.</a> Infection and Immunity. 79 (7), 2746-2754 (2011).</li>
<li>Gentile, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+immunity+and+defects+in+the+neonatal+and+elderly+immune+response+to+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective immunity and defects in the neonatal and elderly immune response to sepsis.</a> Journal of Immunology. 192 (7), 3156-3165 (2014).</li>
<li>Cuenca, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+emergency+myelopoiesis+following+polymicrobial+sepsis+in+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Delayed emergency myelopoiesis following polymicrobial sepsis in neonates.</a> Innate Immunity. 21 (4), 386-391 (2015).</li>
<li>Gentile, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+emergency+myelopoiesis+and+survival+in+neonatal+sepsis+by+caspase-1%2F11+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Improved emergency myelopoiesis and survival in neonatal sepsis by caspase-1/11 ablation.</a> Immunology. 145 (2), 300-311 (2015).</li>
<li>Wynn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+IL-17A+attenuates+neonatal+sepsis+mortality+induced+by+IL-18%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Targeting IL-17A attenuates neonatal sepsis mortality induced by IL-18.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), E2627-E2635 (2016).</li>
<li>Fallon, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Program+Cell+Death+Receptor-1-Mediated+Invariant+Natural+Killer+T-Cell+Control+of+Peritoneal+Macrophage+Modulates+Survival+in+Neonatal+Sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Program Cell Death Receptor-1-Mediated Invariant Natural Killer T-Cell Control of Peritoneal Macrophage Modulates Survival in Neonatal Sepsis.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1469(2017).</li>
<li>Young, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+survival+after+induction+of+sepsis+by+cecal+slurry+in+PD-1+knockout+murine+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Improved survival after induction of sepsis by cecal slurry in PD-1 knockout murine neonates.</a> Surgery. 161 (5), 1387-1393 (2017).</li>
<li>Rincon, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjuvant+pretreatment+with+alum+protects+neonatal+mice+in+sepsis+through+myeloid+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Adjuvant pretreatment with alum protects neonatal mice in sepsis through myeloid cell activation.</a> Clinical & Experimental Immunology. 191 (3), 268-278 (2018).</li>
<li>Starr, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+cecal+slurry+preparation+protocol+with+improved+long-term+reproducibility+for+animal+models+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A new cecal slurry preparation protocol with improved long-term reproducibility for animal models of sepsis.</a> PLoS ONE. 9 (12), e115705(2014).</li>
<li>Hansen, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+in+milk+fat+globule-epidermal+growth+factor-factor+8+exacerbates+organ+injury+and+mortality+in+neonatal+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Deficiency in milk fat globule-epidermal growth factor-factor 8 exacerbates organ injury and mortality in neonatal sepsis.</a> Journal of Pediatric Surgery. 52 (9), 1520-1527 (2017).</li>
<li>Fujioka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+heme+oxygenase-1+attenuates+the+severity+of+sepsis+in+a+non-surgical+preterm+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22SHOCK%22%5BJournal%5D)">Induction of heme oxygenase-1 attenuates the severity of sepsis in a non-surgical preterm mouse model.</a> SHOCK. 47 (2), 242-250 (2017).</li>
<li>Al Asmari, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+quinacrine+against+glycerol-induced+acute+kidney+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Protective effect of quinacrine against glycerol-induced acute kidney injury in rats.</a> BMC Nephrology. 18, PMC5273840(2017).</li>
<li>Geng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+gene+expression+profiles+and+signaling+pathways+in+rhabdomyolysis-induced+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Differences in gene expression profiles and signaling pathways in rhabdomyolysis-induced acute kidney injury.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 8 (11), 14087-14098 (2015).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+depletion+ameliorates+glycerol-induced+acute+kidney+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron+Experimental+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice.</a> Nephron Experimental Nephrology. 128 (1-2), 21-29 (2014).</li>
<li>Nara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluations+of+lipid+peroxidation+and+inflammation+in+short-term+glycerol-induced+acute+kidney+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Pharmacology+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evaluations of lipid peroxidation and inflammation in short-term glycerol-induced acute kidney injury in rats.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 43 (11), 1080-1086 (2016).</li>
<li>Zager, R. A., Johnson, A. C. M., Lund, S., Hanson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+renal+failure%3A+determinants+and+characteristics+of+the+injury-induced+hyperinflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Acute renal failure: determinants and characteristics of the injury-induced hyperinflammatory response.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 291 (3), F546-F556 (2006).</li>
<li>Olfert, E. D., Godson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humane+Endpoints+for+Infectious+Disease+Animal+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Institute+for+Laboratory+Animal+Research+Journal%22%5BJournal%5D)">Humane Endpoints for Infectious Disease Animal Models.</a> Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 99-104 (2000).</li>
<li>Canadian Council on Animal Care. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+on%3A+choosing+an+appropriate+endpoint+in+experiments+using+animals+for+research%2C+teaching+and+testing%22">Guidelines on: choosing an appropriate endpoint in experiments using animals for research, teaching and testing</a>. , https://www.ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/Appropriate_endpoint.pdf (1998).</li>
<li>Nemzek, J. A., Xiao, H. Y., Minard, A. E., Bolgos, G. L., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humane+endpoints+in+shock+research%5BTitle%5D)+AND+%22SHOCK%22%5BJournal%5D)">Humane endpoints in shock research.</a> SHOCK. 21 (1), 17-25 (2004).</li>
<li>Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+approach+for+establishing+humane+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Institute+for+Laboratory+Animal+Research+Journal%22%5BJournal%5D)">A systematic approach for establishing humane endpoints.</a> Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 80-86 (2000).</li>
</ol>

Dr James Wynn otrzymuje wsparcie od National Institutes of Health (NIH)/National Institute of General Medical Sciences (R01GM128452) oraz NIH/Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) (R01HD089939).

Myszy noworodkowe po porodzie mają bardzo ograniczoną mobilność i nie są w stanie wyprostować się po umieszczeniu na plecach, nawet jeśli nie są kwestionowane. Do DOL 7, wieku myszy z wyzwaniem w tym modelu, zakres ruchu rozciągający się od Rights-Mobile do FTR-Mobile zaobserwowano u myszy bez wyzwania, z istotną różnicą, a mianowicie, że niekwestionowana mysz w tym wieku nie wykazywała zachowania FTR-letargiczne. Zaobserwowano, że tylko myszy z posocznicą wielodrobnoustrojową stały się ospałe FTR; Dlatego ta odpowiedź może być markerem ciężkości choroby. Zwracanie uwagi na odcięcie kąta 90° od poziomu dla ruchu bioder pozwala na konsekwentne i dokładne przypisanie ospałego lub ruchomego ruchu bioder u myszy. Wybrano przedział czasowy 4 s, aby sprawdzić, czy mysz może się wyprostować, ponieważ myszy bez wyzwań były w stanie konsekwentnie wyprostować się w tym przedziale czasowym. Unikano wielokrotnego pomiaru tej samej myszy, natomiast czas na wyprostowanie się i pomiar ruchomości bioder ograniczono do 4 s, aby uniknąć nadmiernego zmęczenia myszy, co w przeciwnym razie mogłoby wpłynąć na jej zdolność do pozyskiwania pożywienia i ciepła oraz mogłoby wpłynąć na jej rokowanie w sprawie poprawy. Zaobserwowano prostowanie się zarówno po lewej, jak i po prawej stronie, a wyższy z wyników wykorzystano do określenia, czy mysz znajdowała się w humanitarnym punkcie końcowym, ponieważ stwierdzono, że niektóre myszy wykazują FTR-Nonmobile po jednej stronie, ale mają większą mobilność po drugiej stronie i są w stanie ostatecznie wyzdrowieć.
System punktacji używany do oceny zdrowia myszy opierał się na zastosowaniu kategorycznych odcięć do tego, co jest spektrum ruchu, a zatem mógł być podatny na indywidualne odchylenia. Personel został przeszkolony razem, aby upewnić się, że każda osoba ocenia myszy tak samo; Jednak prawdopodobnie pozostanie pewien poziom subiektywności prowadzący do zmienności. Spójność punktacji oceniono, prosząc siedmiu badaczy, którzy wcześniej nie prowadzili monitorowania noworodków na myszach, aby poznali wymagania określone w tym protokole i filmie, a następnie niezależnie przypisali zachowania i określili humanitarny punkt końcowy. Zaobserwowano 97% dokładność przy punktacji przeprowadzonej na 60 myszach z prowizją, co sugeruje, że indywidualne uprzedzenia nie odgrywają znaczącej roli w przypisaniach behawioralnych tego modelu. Przedstawiony protokół monitorowania behawioralnego opiera się na obserwacjach zwierząt poddanych badaniu DOL 7, jednak myszy młodsze niż 6 dni w niekwestionowanym stanie zdrowia nie mogą konsekwentnie się naprawiać. W związku z tym opisane humanitarne kryteria punktu końcowego nie mogły być bezpośrednio zastosowane do młodszych myszy. Jeśli w tym modelu eksperymentalnym wykorzystuje się młodsze myszy lub jeśli stosuje się inny model prowokacyjny o różnej kinetyce choroby, należy opracować i pilotować odpowiednie humanitarne kryteria punktu końcowego, aby uniknąć eutanazji myszy, które w przeciwnym razie ostatecznie wyzdrowiałyby. System punktacji przedstawia solidną metodę poprawy klasyfikacji humanitarnych punktów końcowych, która po przetestowaniu i potwierdzeniu może potencjalnie zostać zastosowana w innych modelach.
Każde przygotowanie gnojowicy jelita ślepego lub użycie nowego szczepu myszy wymagało retitracji dawki gnojowicy jelita ślepego do podania w celu uzyskania podobnej dawki śmiertelnej. Każdy preparat został ustandaryzowany przez odczyt interesujący nas sam, a mianowicie przeżycie, a nie podający tę samą liczbę bakterii. Stężenie bakterii żywotnych w każdym preparatzie gnojowicy jelita ślepego różniło się nieznacznie, potencjalnie z powodu różnic w bakteriach komensalnych dawcy lub z powodu różnic w masie pozostawionej w sitku komórkowym gnojowicy jelita ślepego po filtracji. Podczas miareczkowania gnojowicy jelita ślepego pierwsze dwa mioty podzielono na dwie grupy, a każdej połowie miotu podano jedną z dwóch dawek, tak aby każda z dawek została przetestowana w dwóch miotach. Jeśli uzyskany wskaźnik przeżycia nie odpowiadał wymaganemu poziomowi, wówczas dawkę prowokacyjną zwiększano lub zmniejszano o 5%-10% i eksperyment powtarzano. Wykorzystano wiele miotów, aby uwzględnić różnice między miotami, które mogą powodować odporność lub zwiększoną podatność na sepsę w miocie. Ważne było dokładne mianowanie gnojowicy jelita ślepego przy każdym nowym przygotowaniu, aby zapewnić, że nowe miareczkowanie gnojowicy jelita ślepego było porównywalne z poprzednimi preparatami gnojowicy jelita ślepego. Zaobserwowano, że okresy nadmiernego hałasu i wibracji, szczególnie podczas zagęszczania asfaltu oraz budowy pobliskiego budynku i drogi, zwiększają naprężenia w zaporach. Wiązało się to ze zwiększonymi wskaźnikami kanibalizacji i wpłynęło na śmiertelność eksperymentów dotyczących przeżycia, dotykając nawet myszy bez wyzwań, co wskazuje, że mogą istnieć zewnętrzne wpływy na przeżycie noworodków, które również należy kontrolować.
Wcześniejsze metody przygotowania gnojowicy jelita ślepego obejmowały albo użycie świeżej gnojowicy jelita ślepego, albo przygotowanie zamrożonej gnojowicy jelita ślepego, przy użyciu różnych metod, w tym przechowywania w glicerolu, który nieuchronnie zostałby przeniesiony podczas wyzwania. Podczas gdy stosowanie świeżej gnojowicy jelita ślepego ma tę zaletę, że skład bakteryjny jest najbardziej zbliżony do oryginalnej zawartości jelita ślepego, istnieje ryzyko rozbieżności między poszczególnymi myszami-dawcami ze względu na zmienność bakterii komensalnych. Chociaż zostało to zminimalizowane dzięki użyciu dawców jelita ślepego od tego samego dostawcy z minimalnym czasem między przybyciem a postępem eksperymentu, może to stać się zbyt kosztowną opcją dla niektórych laboratoriów i stanowiło kolejne wyzwanie logistyczne związane z dostępnością myszy w tym samym wieku podczas rozpoczynania eksperymentu z gnojowicą jelita ślepego u nowonarodzonych myszy, które miały 7 dni. Zastosowano alternatywną metodę wykorzystania świeżej gnojowicy jelita ślepego, w której zawartość jelita ślepego wielu dorosłych dawców została zebrana, ponownie zawieszona w D5W, zamrożona w temperaturze -80 °C bez glicerolu i rozmrożona po jednej porcji na raz do eksperymentów. Wykorzystanie gnojowicy jelita ślepego dorosłego dawcy do badania sepsy noworodków może potencjalnie przenosić gatunki bakterii obecnych w gnojowicy jelita ślepego, na które nowonarodzona mysz nie była narażona, ale jest to strategia, która pozwala na badanie sepsy u noworodków myszy i była wykorzystywana do badania biologii noworodków myszy w ciągu ostatnich13 lat. Rozdział 14,15. Gnojowica jelita ślepego została rozcieńczona w D5W, aby zapewnić odżywienie bakteriom, co pozwoliło na ustanowienie aktywnej infekcji po wstrzyknięciu bakterii i miało na celu naśladowanie dostępności składników odżywczych w jamie otrzewnej podczas martwiczego zapalenia jelit. Glicerol nie został włączony jako środek stabilizujący w zamrażaniu bakterii ze względu na potencjalne negatywne skutki uboczne, które mogą wynikać z samego wstrzyknięcia glicerolu. Gdyby glicerol został zawarty w preparacie zawiesiny jelita ślepego, wówczas potencjalne uszkodzenia, które może wywołać sam glicerol, musiałyby zostać przetestowane poprzez włączenie wstrzyknięcia samego glicerolu (bez zawiesiny jelita ślepego) u myszy, co zwiększyłoby użycie myszy. Żywotność bakterii gnojowicy jelita ślepego badano po zamrożeniu gnojowicy jelita ślepego bez glicerolu i stwierdzono, że jest stała, bez zmian w stężeniu bakterii w oddzielnych podwielokrotnościach tego samego preparatu gnojowicy jelita ślepego przechowywanego w temperaturze -80 °C przez okres 6 miesięcy. Sugeruje to, że przechowywanie bez glicerolu jest wykonalne w celu zapewnienia spójnego wyniku biologicznego. Zastosowanie masowo przygotowanej mrożonej gnojowicy jelita ślepego pozwoliło również na wykorzystanie myszy hodowanych we własnym zakresie, zmniejszając koszty i wykorzystując samce myszy, które w przeciwnym razie byłyby nadmierne z hodowli, zmniejszając w ten sposób marnotrawstwo myszy.
Identyfikacja nieudanych wyzwań u myszy była ważna, aby uniknąć dodawania dodatkowego szumu do systemu. Po poddaniu się dootrzewnowemu wstrzyknięciu gnojowicy jelita ślepego, myszy obserwowano pod kątem obecności wybrzuszenia pod skórą, co wskazywało na nieudane wstrzyknięcie, które w rzeczywistości było podskórne. U myszy obserwowano nieszczelności w miejscu wstrzyknięcia, zarówno bezpośrednio po usunięciu igły, jak i po umożliwieniu im wykonania kroku po wstrzyknięciu, ponieważ myszy czasami (rzadko) przeciekały dopiero po przesunięciu kończyny miejsca wstrzyknięcia o krok. Obecność wybrzuszenia lub nieszczelności po wstrzyknięciu skutkowała usunięciem myszy z analizy. W końcu każdy z tych objawów może skutkować innym wynikiem z powodu nieprawidłowej ilości wstrzykniętej gnojowicy jelita ślepego, ponieważ zaobserwowano, że 5% różnica w dawce prowokacyjnej wpływa na późniejsze przeżycie.
Eksperymenty prowokacyjne z gnojowicą jelita ślepego często wymagały różnych docelowych dawek śmiertelnych przy różnych dawkach dostosowanych do masy. Z tego powodu objętość wtrysku może wynosić od zaledwie 20 μl do nawet 100 μl. Proporcjonalny błąd eksperymentalny związany z objętością martwej igły również zmienia się wraz z objętością wstrzyknięcia, co zwiększa trudność bezpośredniego porównania różnych dawek. Dzięki prostej modyfikacji polegającej na standaryzacji objętości iniekcji, to źródło wariancji jest usuwane z eksperymentu.
System monitorowania zachowania noworodków myszy zastosowany w tym protokole jest pierwszym w swoim rodzaju. Naukowcy, którzy zamierzają prowadzić etyczne badania na nowonarodzonych myszach, często borykają się z wyzwaniem braku zasobów do oceny dobrostanu zwierzęcia w tym wieku. Prezentowany intuicyjny i spójny system monitorowania zaczyna wypełniać tę lukę w wiedzy. Co ważne, to oparte na dowodach podejście nie tylko podnosi jakość uzyskanych danych doświadczalnych, ale jednocześnie zmniejsza cierpienie zwierząt doświadczalnych.

Sepsa jest główną przyczyną zgonów zakaźnych noworodków1. Ponieważ sepsa u noworodków jest słabo poznana, poczyniono niewielkie postępy zarówno w identyfikacji zagrożonych noworodków we wczesnym okresie choroby, jak i w opracowywaniu skutecznych metod leczenia lub profilaktyki. Wymaga to wykorzystania zwierzęcych modeli sepsy, aby lepiej zrozumieć ten proces i przetestować możliwe interwencje. Co więcej, dorosłe gryzonie różnie reagują na sepsę, ze statystycznie istotnymi różnicami w liczbie bakterii, które należy podać, aby uzyskać tę samą dawkę śmiertelną (LD) i różnicami w wynikającej z tego odpowiedzi gospodarza w porównaniu z noworodkami2. W związku z tym sepsa noworodkowa musi być badana u noworodków. W badaniach nad sepsą wykorzystano kilka modeli sepsy u dorosłych. Obejmują one prowokację dożylną z określonymi organizmami zaangażowanymi w sepsę u dorosłych ludzi lub podwiązanie i nakłucie jelita ślepego (CLP). CLP to endogenny model prowokacyjny, w którym jelito ślepe jest chirurgicznie izolowane, podwiązywane i nakłuwane, aby umożliwić wyciek treści jelitowej do otrzewnej, co ostatecznie prowadzi do ogólnoustrojowego rozprzestrzeniania się drobnoustrojów i ich produktów3. Jednak procedura chirurgiczna wymagana do ustalenia CLP jest śmiertelna dla nowonarodzonych zwierząt; w związku z tym konieczna jest alternatywna metoda, aby naśladować wielodrobnoustrojowe wyzwanie CLP w celu wywołania sepsy noworodków. Aby zaspokoić tę potrzebę, opracowano model gnojowicy jelita ślepego dla posocznicy wielodrobnoustrojowej u noworodków, w ramach którego zawartość jelita ślepego zwierząt jest zbierana, zawieszana w sterylnej dekstrozie 5% w wodzie (D5W) i wstrzykiwana dootrzewnowo nowonarodzonym myszom2. Od tego czasu stał się on coraz bardziej popularnym modelem do badania sepsy zarówno u nowonarodzonych, jak i dorosłych zwierząt i znacznie rozwinął mechanistyczny wgląd w proces choroby4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15.
Biorąc pod uwagę coraz częstsze korzystanie z tego modelu i pragnienie badaczy do bezpośredniego porównywania wyników w różnych publikacjach, istnieje potrzeba dokładnego opisania i ujednolicenia aspektów technicznych we wszystkich badaniach. Standaryzacja dotyczy trzech aspektów modelu, a mianowicie: i) przygotowania gnojowicy jelita ślepego, ii) przygotowania podwielokrotności prowokacji do wstrzyknięcia zwierzętom doświadczalnym oraz iii) definicji humanitarnego punktu końcowego, zgodnie z którym zwierzęta uznaje się za nieocalałe w doświadczeniach prowokacyjnych. W szczególności metody przygotowania gnojowicy cecal są często przywoływane w oryginalnym artykule wprowadzającym model2. Krótkie podsumowanie tego modelu jest takie, że treść jelita ślepego od dorosłych myszy została pobrana, zawieszona w sterylnym D5W do stężenia 80 mg/ml i wykorzystana w ciągu 2 godzin do wstrzyknięcia zwierzętom doświadczalnym. Ten oryginalny model wykorzystywał myszy w tym samym wieku, pochodzące z tego samego miejsca dostawcy, które były trzymane w odpowiednich placówkach badawczych przez mniej niż 2 tygodnie przed pobraniem zawartości jelita ślepego. Wykorzystanie myszy hodowanych we własnym zakresie, chociaż zmniejszyło koszty wynikające z regularnych dostaw od dostawców i pozwoliło na wykorzystanie nadmiaru myszy o szerszym zakresie płci i wieku, również znacznie zwiększyło zmienność między dawcami. To zmotywowało do opracowania alternatywnej techniki, w której zawartość jelita ślepego od wielu myszy została zebrana razem w celu przygotowania dużego bulionu, który następnie został podzielony na porcje i przechowywany w temperaturze -80 °C13. Ta alternatywna metoda została zaadaptowana przez wiele grup14,15. Adaptacja ta doprowadziła jednak do pewnych zmian technicznych, zarówno w zakresie stosowanych nośników pamięci (10% lub 15% glicerolu lub sam D5W), jak i strategii filtracji w celu usunięcia cząstek stałych (filtracja wielostopniowa przez filtr 860 μm, a następnie filtr 190 μm lub indywidualne filtracje przez filtry 100 μm lub 70 μm)13, 14,15. Wstrzyknięcie samego glicerolu może potencjalnie wyrządzić szkody, biorąc pod uwagę, że 25%-50% zastrzyków z glicerolu zostało wykorzystane jako model uszkodzenia nerek u gryzoni16,17,18,19,20. Aby uniknąć niezamierzonych skutków ubocznych glicerolu, preparat gnojowicy jelita ślepego dla myszy w tym badaniu zamraża się w D5W bez glicerolu i przeprowadza się testy żywotności bakterii podczas przechowywania w temperaturze -80 °C. Strategia filtracji zastosowana w tym badaniu to jedno przejście przez filtr 70 μm, który nie został bezpośrednio porównany z innymi wymienionymi strategiami filtracji.
Śmiertelne dawki wstrzykiwanej gnojowicy jelita ślepego mogą się różnić w zależności od placówki i powinny być dostosowane do pożądanej śmiertelności dla poszczególnych grup. Przy różnych dawkach prowokacyjnych, towarzyszące im objętości prowokacji zmieniają się w razie konieczności. Ten szczegół metodologiczny nie został jednak wcześniej zgłoszony. Co więcej, strategie standardowych procedur, takich jak wstrzyknięcie dootrzewnowe, są rzadko omawiane w literaturze, ale poszczególne techniki mogą wpływać na to, czy nowonarodzone myszy przeciekają po wstrzyknięciu i wpływać na ich końcowe wyniki.
Dobrostan zwierząt, w tym definicja humanitarnego punktu końcowego, jest centralnym aspektem tego modelu i każdego modelu infekcji i stanu zapalnego u gryzoni21. W 1998 roku Kanadyjska Rada ds. Opieki nad Zwierzętami (CCAC) opublikowała obszerne wytyczne dotyczące wyboru humanitarnego punktu końcowego, definiując humanitarny punkt końcowy jako "każdy rzeczywisty lub potencjalny ból, niepokój lub dyskomfort powinien być zminimalizowany lub złagodzony poprzez wybór najwcześniejszego punktu końcowego, który jest zgodny z naukowymi celami badania"22. Inni ostrzegają również, że humanitarne punkty końcowe muszą być ustalane w oparciu o uzasadnienie naukowe, a nie tylko subiektywną interpretację stanu zwierzęcia21. Chociaż istnieje wiele zasobów dotyczących klinicznych, behawioralnych i opartych na znakach kryteriów dotyczących humanitarnego punktu końcowego, nawet w kontekście infekcji i stanu zapalnego21,23,24, żadne z nich, w tym wytyczne CCAC dotyczące humanitarnego punktu końcowego22, wspomnij o nowonarodzonych myszach. W związku z tym obiektywnie i naukowo uzasadnione humanitarne punkty końcowe są znacznie trudniejsze do ustalenia dla nowonarodzonych zwierząt, biorąc pod uwagę zarówno ich ograniczone zdolności behawioralne, jak i brak dowodów na podstawie kryteriów takich jak utrata masy ciała, która jest powszechnie stosowana w przypadku dorosłych myszy. Obecnie kryteria humanitarnego punktu końcowego stosowane dla nowonarodzonych myszy w wieku od 5 do 12 dni w literaturze dotyczącej gnojowicy jelita ślepego odnoszą się do oryginalnego manuskryptu, który wprowadził model2. W niniejszej pracy pierwotnej definicja humanitarnego punktu końcowego dla nowonarodzonych zwierząt opierała się na dwóch kryteriach; Mianowicie, zaobserwowano, że położenie myszy poza gniazdem (rozproszenie) i brak plam mlecznych powodowały śmierć w ciągu kilku godzin. Kwestią komplikującą przypisanie humanitarnego punktu końcowego jest to, że plamy mleczne stają się trudne do zauważenia u szczepów myszy o ciemnej sierści, takich jak powszechnie stosowany szczep C57BL/6J, po pierwszym tygodniu życia, podczas gdy chore zwierzęta są monitorowane do 14. dnia życia (DOL). Co więcej, przy zastosowaniu tych kryteriów można znaleźć martwe zwierzęta po prowokacji (obserwacja własna; niepublikowana); W związku z tym konieczna jest bardziej rygorystyczna definicja humanitarnego punktu końcowego, aby złagodzić cierpienie zwierząt doświadczalnych i uniknąć śmiertelności w sytuacjach, w których wynik można było dokładnie określić wcześniej.
Wszystkie trzy aspekty metodologiczne modelu gnojowicy jelita ślepego są przedstawione w standardowej procedurze operacyjnej, szczegółowo opisującej przygotowanie gnojowicy jelita ślepego, metodę wstrzykiwania zwierząt doświadczalnych, która utrzymuje stałą objętość iniekcji między dawkami i zmniejsza ryzyko wycieków, oraz definicję humanitarnego punktu końcowego dla myszy w wieku od 7 do 12 dni w oparciu o system modelowania behawioralnego. Zebrano informacje behawioralne dotyczące wyników zdrowia myszy od ponad 240 zwierząt doświadczalnych i pogrupowano je według końcowego wyniku przeżycia, demonstrując opartą na dowodach definicję humanitarnego punktu końcowego. Cierpienie zwierząt doświadczalnych jest zmniejszane poprzez identyfikację konających noworodków myszy w najwcześniejszym możliwym punkcie czasowym, podczas gdy biologicznie istotne wyniki przeżycia można wywnioskować, obserwując kluczowe zmienne. Wizualna reprezentacja zarówno przygotowania gnojowicy jelita ślepego, jak i zachowań nowonarodzonych myszy będzie doskonałym źródłem informacji dla każdej grupy badającej sepsę lub nowonarodzonych zwierząt prowokacyjnych.

<table><tbody><tr><td>0,1 - 20 &mu; L końcówki do pipet</td><td>VWR</td><td>732-0799</td><td></td></tr><tr><td>1,8 ml Probówka do mikrowirówek</td><td>Costar</td><td>3621</td><td></td></tr><tr><td>100 - 1000 &mu; L końcówki do pipet</td><td>VWR</td><td>732-0801</td><td></td></tr><tr><td>1 - 200 &mu; L końcówki do pipet</td><td>VWR</td><td>732-0800</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Probówka wirówkowa</td><td>FroggaBio</td><td>TB15-25</td><td></td></tr><tr><td>23G1</td><td>igły Becton Dickinson</td><td>305145</td><td>tylko igła, a nie strzykawka, służąca do przypinania myszy do styropianu</td></tr><tr><td>28G 0,5 ml Strzykawka insulinowa</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Fiolka kriogeniczna</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówka wirówkowa</td><td>Fisher scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 5 ml</td><td>Costar</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>6 - 10-tygodniowe dorosłe myszy C57BL/6J</td><td>Jackson Laboratories</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>7 + jednodniowe myszy noworodkowe C57BL/6J</td><td>Wyhodowane w domu</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m Sitko do komórek</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Defibrynowana krew owcza</td><td>Dalynn</td><td>HS30-500</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroza 5% wody (D5W)</td><td>Baxter</td><td>JB0080</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze preparacyjne</td><td>VWR&</td><td>nbsp; 82027-386</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne, ostra końcówka</td><td>VWR&</td><td>nbsp; 82027-592</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne, ostra/końcówka</td><td>VWR</td><td>82027-594</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (HistoPrep 95% denaturowany alkohol etylowy)</td><td>Fisherbrand</td><td>HC11001GL</td><td>rozcieńczony do 70% podwójnie destylowaną wodą</td></tr><tr><td>Marker odporny na etanol; Marker laboratoryjny</td><td>VWR</td><td>52877-310</td><td></td></tr><tr><td>EZ Anesthesia Vaporizer</td><td>EZ Anesthesia</td><td>EZ-155</td><td></td></tr><tr><td>Germinator 500, Narzędzie chirurgiczne do sterylizacji na sucho (sterylizator gorących kulek)</td><td>Braintree Scientific</td><td>GER 5287-120V</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Fresenius Kabi</td><td>CP0406V2</td><td></td></tr><tr><td>Micro Spatula</td><td>Chemglass</td><td>CG-1983-12</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Drummond</td><td>4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>Klasyczna pipeta Rainin PR-1000</td><td>Rainin</td><td>17008653</td><td></td></tr><tr><td>Klasyczna pipeta Rainin PR-20</td><td></td><td>Pipeta klasyczna Rainin</td> 17008650 <td></td></tr><tr><td>Klasyczna pipeta Rainin PR-200</td> Waga <td>do 17008652</td><td></td><td>Rainin</td></tr><tr><td></td><td>Sartorius</td><td>BL 150 S</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki do próbek</td><td>VWR</td><td>82027-440 / 82027-442</td><td></td></tr><tr><td>Kwadratowa butelka do przechowywania 1000 ml</td><td>Corning</td><td>431433</td><td></td></tr><tr><td>Płyta styropianowa</td><td>Dowolna</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Sure-Seal Komora eutanazja myszy/szczura</td><td>Euthanex</td><td>EZ-178</td><td></td></tr><tr><td>Agar sojowy tryptyczny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22091-2,5KG</td><td></td></tr><tr><td>VX-200 Lab Vortex Mixer</td><td>Labnet International</td><td>S0200</td><td></td></tr><tr><td>waga papier</td><td>Fisherbrand</td><td>09-898-12B</td><td></td></tr></tbody></table>

kontrolowany mysi model posocznicy wielodrobnoustrojowej u noworodków

A Controlled Mouse Model for Neonatal Polymicrobial Sepsis

Sepsa noworodków pozostaje globalnym obciążeniem. Potrzebny jest model przedkliniczny do badań przesiewowych skutecznych interwencji profilaktycznych lub terapeutycznych. Posocznica wielodrobnoustrojowa u noworodków myszy może być wywołana przez wstrzyknięcie gnojowicy jelita ślepego dootrzewnowo 7 myszom i monitorowanie ich przez następny tydzień. Poniżej przedstawiono szczegółowe kroki niezbędne do wdrożenia tego modelu sepsy noworodków. Obejmuje to przygotowanie jednorodnego materiału gnojowicy jelita ślepego, rozcieńczenie go do dawki dostosowanej do masy ciała i ściółki, zarys harmonogramu monitorowania oraz definicję obserwowanych kategorii zdrowotnych stosowanych do określenia humanitarnych punktów końcowych. Wytwarzanie jednorodnego materiału gnojowicy jelita ślepego z połączonych dawców pozwala na podawanie go do wielu miotów w czasie, zmniejszając różnice między dawcami i zapobiegając stosowaniu potencjalnie toksycznego glicerolu. Zastosowana strategia monitorowania pozwala na przewidywanie wyników przeżycia i identyfikację myszy, które później dojdą do śmierci, co pozwala na wcześniejszą identyfikację humanitarnego punktu końcowego. Dwie główne cechy behawioralne są wykorzystywane do definiowania wyników zdrowotnych, a mianowicie zdolność nowonarodzonych myszy do prostowania się po umieszczeniu na plecach oraz ich poziom mobilności. Kryteria te mogą być potencjalnie stosowane do rozwiązywania problemów z humanitarnymi punktami końcowymi w innych badaniach chorób noworodków u myszy, o ile przeprowadzone zostanie badanie pilotażowe w celu potwierdzenia dokładności. Podsumowując, podejście to zapewnia ustandaryzowaną metodę modelowania sepsy u noworodków u myszy, zapewniając jednocześnie zasoby do oceny dobrostanu zwierząt wykorzystywane do definiowania wczesnych humanitarnych punktów końcowych dla zwierząt z wyzwaniami.

Żywotność zawiesiny treści kątniczej przechowywanej w -80 °C można badać w czasie poprzez seryjne rozcieńczanie i wysiewanie aliquotów zapasu zawiesiny treści kątniczej na agar sojowy z tryptonem z 5% krwią owczą, a następnie inkubację tlenową przez 24 h w 37 °C. Stwierdzono, że późniejsze przeliczanie liczby colony-forming unit (CFU) w preparacie zawiesiny treści kątniczej nie zmieniało się w okresie 6 miesięcy, a na żywotność nie wpłynęło przedłużone przechowywanie w -80 °C (Rycina 2). Każda mysz dawca dostarczyła średnio wystarczającej ilości zawiesiny treści kątniczej do zakażenia trzech do czterech miotów (dane nie pokazano).
Myszy, u których w 7. dniu życia (DOL 7) wywołano sepsę polimikrobową poprzez podanie zawiesiny treści kąkoliczki, zaczęły osiągać punkt końcowy etyczny w ciągu 12 h od podania czynnika, a sepsa polimikrobowa została w większości opanowana do 48 h po podaniu, co zaobserwowano na krzywej przeżycia Kaplana-Meiera opracowanej na podstawie danych od ponad 200 myszy (Rysunek 1A). Śmiertelność była zależna od podanej dawki czynnika, przy czym zmiana dawki o 5% skutkowała różnicą w przeżywalności wynoszącą około 15% (Rysunek 1B). Masę ciała myszy mierzono podczas każdej wizyty kontrolnej. Spadek masy ciała zaobserwowano u wszystkich zwierząt, przy czym w ciągu pierwszych 24 h po podaniu czynnika nie różnił się on między myszami, które ostatecznie przeżyły, a tymi, które nie przeżyły (Rysunek 1C). Po 24 h większość przeżywających zwierząt zaczęła odzyskiwać masę ciała, podczas gdy wszystkie zwierzęta, które nie przeżyły, nadal traciły na wadze i osiągały punkt końcowy etyczny. Jednak niewielka część przeżywających zwierząt, które zachowały odruch prostowania, również nadal traciła masę ciała lub nie zwiększała jej aż do końca eksperymentu, tracąc nawet do 20% początkowej masy ciała w ciągu 40 h od podania czynnika. Ze względu na nakładanie się spadku masy ciała u myszy, które przeżyły i tych, które nie przeżyły, zmiana masy ciała lub próg utraty wagi nie mogły zostać wykorzystane jako kryterium punktu końcowego etycznego, przy jednoczesnym zachowaniu celu dokładnego oddzielenia osobników przeżywających od nieprzeżywających.
Zachowanie myszy monitorowano zgodnie z protokołem oraz zgodnie z Tabelą 2. Przedstawiono migawki kategorii stanu zdrowia (Rycina 3A-C). Zdjęcia te ukazują różne kategorie stanu zdrowia myszy, którym nie udało się obrócić na brzuch po ułożeniu ich na grzbiecie, i wskazują różnicę między FTR-Mobile a FTR-Lethargic, co stanowi istotne rozróżnienie. Zdrowe myszy w tym wieku, niewrażone na czynnik wyzwalający, nie wykazują aktywności FTR-Lethargic; zatem kategoria ta jest markerem choroby i odpowiedzią na wyzwanie. Chore myszy wykazywały objawy FTR-Lethargic (Rycina 3B) i mogły regrować w stronę FTR-Nonmobile (Rycina 3C), gdzie górna noga pozostaje równolegle do dolnej nogi, przy minimalnym lub zerowym ruchu kołysania biodrem, co jest jednym z kryteriów humanitarnego punktu końcowego. Myszy mogły również dojść do regeneracji, zwiększając ruchomość bioder i przechodząc w stan FTR-Mobile (Rycina 3A). Wyniki odruchu prostowania i mobilności określano dla lewej i prawej strony każdej myszy, a najwyższy wynik wykorzystywano do ustalenia, czy mysz osiągnęła humanitarny punkt końcowy. Informacje behawioralne zebrano od ponad 240 zwierząt poddanych działaniu dawki letalnej 60 (LD60) zawiesiny treści ślepej kiszki i zaobserwowano 144 humanitarne punkty końcowe (Rycina 3D-F oraz Tabela 1). To podejście oparte na dowodach zostało wykorzystane do zdefiniowania i doprecyzowania humanitarnego punktu końcowego w czterech stadiach choroby, skategoryzowanych przez eksperymentatorów na podstawie zarówno różnic behawioralnych między osobnikami, które przeżyły, a tymi, które nie przeżyły, jak i ułamka osiągniętych humanitarnych punktów końcowych w każdym przedziale czasowym. Podczas wczesnych eksperymentów myszy FTR-Nonmobile, które nie wykazywały ruchu bioder, były konsekwentnie znajdowane martwe w ciągu 4-6 h od zaobserwowania tego zachowania. W zbiorze przedstawionych informacji wynik zdrowotny FTR-Nonmobile został użyty jako kryterium humanitarnego punktu końcowego. Od 12 do 21 h po wyzwaniu, podczas gdy myszy FTR-Nonmobile były uśmiercane, zarówno zwierzęta przeżywające, jak i nieprzeżywające wykazywały bardzo podobne wzorce behawioralne i nie można ich było rozróżnić w żaden inny sposób (Rycina 3D). Od 21 do 48 h po wyzwaniu większość przeżywających myszy odzyskała odruch prostowania, podczas gdy mniej niż 1% zaobserwowanych zachowań FTR występowało u zwierząt, które ostatecznie przeżyły eksperyment (Rycina 3E). Zatem myszy, którym nie udało się obrócić na brzuch z obu stron, stały się dodatkowym kryterium humanitarnego punktu końcowego w tym czasie. Między 12 a 20 h po wyzwaniu zaobserwowano 12,5% całkowitej liczby humanitarnych punktów końcowych, w porównaniu do 80,5% między 20 a 48 h oraz 7% po 48 h (Tabela 1). Cechą wyróżniającą myszy, które ostatecznie przeżyły, od tych, których stan pogorszył się do poziomu humanitarnego punktu końcowego, była utrata odruchu prostowania, niezależnie od mobilności bioder (Rycina 3F). Rzeczywiście, między 20 a 48 h po wyzwaniu łącznie 121 myszy nie zdołało obrócić się na brzuch z obu stron, z czego 116 z tych myszy ostatecznie osiągnęło humanitarny punkt końcowy (co stanowi 96% dokładności w identyfikacji myszy, które nie wyzdrowieją). Po 48 h od wyzwania zaobserwowano 11 myszy, którym nie udało się obrócić z obu stron, z czego 10 osiągnęło humanitarny punkt końcowy (dokładność 91%). Po 20 h od wyzwania liczba myszy, które utraciły odruch prostowania z obu stron, pozwala przewidzieć ostateczny wynik z dokładnością powyżej 90%; dlatego kryterium to dodano do kryteriów humanitarnego punktu końcowego, aby wcześniej identyfikować myszy niezdolne do regeneracji i zmniejszyć ich cierpienie (Tabela 1).
Częstotliwość monitorowania myszy zmienia się w czasie ze względu na różny wskaźnik śmiertelności po zakażeniu, co przedstawiono w Tabeli 1. Uznawano, że mysz osiągnęła humanitarny punkt końcowy w dowolnym momencie, jeśli nie była w stanie samodzielnie przyjąć pozycji wyprostowanej i wykazywała brak ruchomości bioder po obu stronach, lub jeśli mysz została znaleziona poza gniazdem, nie była w stanie samodzielnie przyjąć pozycji wyprostowanej i wykazywała letargiczne ruchy bioder. Przewidywano, że myszy w każdym z tych stanów nie będą w stanie ponownie dołączyć do miotu, a obserwacje wykazały, że w ciągu 4-6 h dochodzi u nich do stanu FTR-Nonmobile. Począwszy od 20 h po zakażeniu, dodano nowy humanitarny punkt końcowy, ponieważ przedstawione informacje wskazują, że zdecydowana większość myszy, u których występuje FTR po obu stronach, ostatecznie ulega chorobie.
Filmy, tabele i materiały przedstawione w niniejszym manuskrypcie stanowią efekywny zasób dydaktyczny w zakresie poprawnego przypisywania zachowań myszom poddanym badaniu. Siedmiu eksperymentatorów poproszono o obejrzenie filmu instruktażowego oraz zapoznanie się z protokołem i tabelami przed przypisaniem zachowań 60 zwierzętom poddanym badaniu. Identyfikacja kryteriów humanitarnego punktu końcowego była dokładna zarówno w rozróżnianiu myszy FTR-Nonmobile od myszy wykazujących inne zachowania (Rycina 4A), jak i myszy FTR od myszy zdolnych do samodzielnego obrócenia się w dopuszczalnym czasie (Rycina 4B).
<img alt="Wykresy analizy przeżywalności i zmiany masy ciała; krzywe Kaplana-Meiera, czas po wyzwaniu, prawdopodobieństwo przeżycia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58574/58574fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
Rysunek 1: Krzywa przeżywalności Kaplana-Meiera, miareczkowanie dawki zawiesiny treści kąkreczkowej oraz zmiana masy ciała po wyzwaniu zawiesiną treści kąkreczkowej. (A) Wynik przeżywalności noworodków myszy C57BL/6J po dostarczeniu wewnątrzbrzusznym zawiesiny treści kąkreczkowej w 7. dniu życia (DOL 7). Dane dla tego rysunku zostały połączone z niezależnych eksperymentów z zastosowaniem wielu dawek wyzwalających, z których w zakresie od 0,7 do 1,3 mg zawiesiny treści kąkreczkowej na gram masy ciała podano tym myszom. (B) Noworodki myszy poddane wyzwaniu dawką od 0,80 do 0,95 mg zawiesiny treści kąkreczkowej na gram masy ciała z jednej partii preparatu wykazują zależność dawka-odpowiedź między ilością podanej zawiesiny treści kąkreczkowej a procentem przeżycia.(C) Procentowa zmiana masy ciała w porównaniu do masy w momencie wyzwania, gdzie linia przerywana oznacza utratę 20% masy ciała od momentu wyzwania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58574/58574fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres rozrzutu z linią regresji przedstawiający wiek względem Log10 CFU na mL; R²=-0,02374, p=0,523." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58574/58574fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Stężenie CFU w zapasie zawiesiny treści kąkrecznicy przechowywanej w -80 °C nie zmienia się w okresie 6 miesięcy. Wpływ czasu przechowywania zawiesiny treści kąkrecznicy na stężenie CFU badano za pomocą regresji liniowej. Każdy punkt reprezentuje jedną alikwotę tej samej partii preparatu zawiesiny treści kąkrecznicy, poddanej rozcieńczeniom seryjnym i wysianej w okresie 6 miesięcy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58574/58574fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Badanie zachowania myszy z wykresami przedstawiającymi przeżywalność po wyzwaniu; wyniki analizy behawioralnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58574/58574fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Kategorie ruchomości bioder myszy, które nie potrafią się wyprostować, oraz zachowania zwierząt w różnych odstępach czasu po wyzwaniu. Myszy poddane wyzwaniu sepsą, po położeniu na plecach, wykazują oznaki zachorowania, które można mierzyć stopniem ruchu bioder. (A) Myszy z brakiem odruchu prostowania (FTR)-Mobilne wykazują ruch kołyszący bioder górnej kończyny przekraczający kąt 90° względem poziomu. (B) Myszy FTR-Letargiczne wykazują ruch kołyszący bioder, ale w żadnym momencie podczas 4 s monitorowania nie przekraczają kąta 90° względem poziomu. (C) Niektóre myszy FTR-Niemobilne będą prostować nogę, zginając ją w kolanie, ale wykażą bardzo niewielki (kąty mniejsze niż 10°) lub żaden ruch kołyszący bioder, a nogi pozostaną do siebie równoległe. (D) Zachowania zwierząt 12–21 h po wyzwaniu pokazują, że tylko zachowania FTR-Niemobilne odróżniają osobników przeżywających od nieprzeżywających. (E) Od 21 do 48 h po wyzwaniu tylko 4 z 592 obserwowanych zachowań FTR (0,67%) należą do osobników przeżywających, co pozwala odruchowi prostowania przewidywać ostateczny wynik i służyć jako nowe kryterium humanitarnego punktu końcowego. (F) Po 48 h od zakażenia 6 z 131 myszy (4,55%), które posiadały odruch prostowania, przeszło do grupy FTR i zostało uśpionych do końca eksperymentu, co uzasadnia prowadzenie ciągłego monitorowania w całym okresie rekonwalescencji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58574/58574fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Klasyfikacja odruchu prostowania szczeniąt; wykres słupkowy prawdziwych/fałszywych wyników pozytywnych/negatywnych według eksperymentatorów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58574/58574fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Materiały instruktażowe pozwalają na dokładną klasyfikację behawioralną przez niezależnych eksperymentatorów. Eksperymentatorzy przeszkoleni poprzez oglądanie filmu towarzyszącego temu protokołowi sklasyfikowali filmy z 60 noworodków myszy do różnych grup zdrowotnych. (A) Określono zdolność do rozróżnienia humanitarnego punktu końcowego; średnio 97% zachowań zostało prawidłowo zakwalifikowanych jako FTR-Nonmobile lub nie, podczas gdy tylko 1% myszy FTR-Nonmobile zostało błędnie zidentyfikowanych. Dwa procent myszy błędnie zidentyfikowano jako FTR-Nonmobile. (B) Identyfikacja drugiego kryterium humanitarnego punktu końcowego, polegająca na prawidłowym rozróżnieniu między myszami FTR a tymi, które mają zdolność do prostowania się w ciągu 4 s od położenia na plecach, została przypisana prawidłowo w 97% ocen, podczas gdy tylko 0,96% myszy błędnie przypisano do grupy prostujących się, a 2% myszy błędnie przypisano do grupy FTR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58574/58574fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stadium choroby</td>
			<td>A: Wysoka zapadalność, brak śmiertelności</td>
			<td>B: Wysoka zapadalność, niska śmiertelność</td>
			<td>C: wysoka zapadalność, wysoka śmiertelność</td>
			<td>D: niska zachorowalność, niska śmiertelność</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Godziny po ekspozycji na patogen</td>
			<td>0−12</td>
			<td>12−20</td>
			<td>20−48</td>
			<td>&gt;48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Częstotliwość monitorowania</td>
			<td>2 h po wyzwaniu</td>
			<td>co 4–6 h</td>
			<td>Co 4–6 h, co 8 h, bez nadzoru przez noc</td>
			<td>1–2 razy dziennie, w razie potrzeby częściej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Udział całkowitej liczby obserwowanych punktów końcowych humanitarnych </td>
			<td>0/144</td>
			<td>18/144</td>
			<td>116/144</td>
			<td>10/144</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Procent zaobserwowanych punktów końcowych z przyczyn humanitarnych</td>
			<td>0%</td>
			<td>12.5%</td>
			<td>80.5%</td>
			<td>7%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Kryteria humanitarnego punktu końcowego</td>
			<td colspan="2">1. FTR-Nieruchomy po obu stronach</td>
			<td colspan="2">1. FTR-Nieruchomy po obu stronach</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">2. Rozproszone z gniazda i wykazują letarg (FTR−Lethargic)</td>
			<td colspan="2">2. Rozproszenie z gniazda oraz stan FTR−letargiczny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">3. FTR po stronie lewej lub prawej (z dowolną punktacją mobilności)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Częstotliwość monitorowania i kryteria humanitarnych punktów końcowych w różnych stadiach choroby. Częstotliwość monitorowania, obserwowane humanitarne punkty końcowe, odsetek humanitarnych punktów końcowych oraz kryteria humanitarnych punktów końcowych w różnych stadiach choroby.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odruch prostowania</td>
			<td>Mobilność</td>
			<td>Czas do momentu odwrócenia na plecy</td>
			<td>Limit czasowy pomiaru zakresu ruchu (mobilny / letargiczny / nieruchomy)</td>
			<td>Kryteria oceny ruchomości</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Prawa</td>
			<td>Mobilny</td>
			<td rowspan="6">4 s </td>
			<td rowspan="3">Dodatkowe 8 s</td>
			<td>Myszy wykonują kilka kroków pod rząd, utrzymując pęd do przodu i badając otoczenie. Szczenię nie przewraca się.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Letargiczny</td>
			<td>Mysz jest w stanie zrobić krok, lecz zatrzymuje się i robi pauzę przed wykonaniem kolejnego. Szczenię może się przewrócić.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nieruchomy</td>
			<td>Mysz nie wykonuje żadnych kroków po odzyskaniu równowagi. Szczenię może upaść.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Błąd po prawej stronie</td>
			<td>Ruchomość stawów biodrowych</td>
			<td rowspan="3">Ten sam czas 4 s wykorzystano do pomiaru odruchu prostowania</td>
			<td>Energiczny ruch biodra z rotacją górnej części nogi poza 90° z pozycji poziomej przynajmniej raz w ciągu 4 s.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ociężałe biodra</td>
			<td>Ruch biodra do, lecz nie poza 90° z poziomu poziomego.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stawy biodrowe nieruchome</td>
			<td>Kończyny mogą poruszać się poprzez wyprost i zgięcie, jednak biodra nie rotują. Szczenię wygląda na bardzo chore. </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Tabela monitorowania i kryteria określania oceny stanu zdrowia myszy. Podane kryteria zostały wykorzystane do zdefiniowania grup kategorii zdrowia myszy oraz do zmniejszenia zmienności indywidualnej przy przypisywaniu ocen stanu zdrowia.

Ten protokół dostarcza niezbędnych kroków do ustalenia i oceny sepsy noworodków u 7-dniowych myszy.

Kontrolowany mysi model posocznicy wielodrobnoustrojowej u noworodków

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse ...

Model gnojowicy jelita ślepego dla sepsy wielodrobnoustrojowej jest potężnym narzędziem do analizy unikalnej patofizjologii noworodków. Może być zmienna, a humanitarne punkty końcowe nie są dobrze opisane. Tutaj przedstawiamy naszą wysoce ustandaryzowaną procedurę przygotowania gnojowicy jelita ślepego i wstrzykiwania zwierzętom doświadczalnym.Ponadto stosujemy podejście oparte na danych, aby zidentyfikować umierające młode w jak najwcześniejszym momencie. Zacznijmy od przygotowania mrożonego bulionu z gnojowicy jelitowej. Odbywa się to poprzez zebranie koncentu jelita ślepego od co najmniej pięciu dorosłych myszy, zawieszenie w sterylnej wodzie z dekstrozą i przechowywanie w temperaturze minus 80 do późniejszego wykorzystania.Możesz użyć samców lub samic, ale płeć, wiek i pochodzenie myszy w twoich eksperymentach powinny być stałe. Najpierw przygotujmy nasze narzędzia do sekcji. Należą do nich zestaw nożyczek i kleszczyków do skóry oraz drugi zestaw do narządów wewnętrznych.Włącz sterylizator z gorącymi kulkami co najmniej 30 minut przed użyciem. Zanurz narzędzia w 70% etanolu, a następnie zanurz je w sterylizatorze z gorącymi kulkami na co najmniej jedną minutę. Spryskaj matę ręczników papierowych 70% etanolem, a następnie wyjmij narzędzia ze sterylizatora, nie dotykając wysterylizowanej części narzędzia niesterylnymi uchwytami innych narzędzi.Połóż je na ręczniku papierowym, aby ostygły. Przeprowadź sekcję myszy w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przypnij nogi myszy do płyty styropianowej za pomocą igieł o rozmiarze 23, tak aby mysz była brzuchem do góry.Spryskaj brzuch 70% etanolem. Za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek przeciąć skórę, nożyczkami poluzować skórę od wyściółki otrzewnej i rozciąć prostokątny obszar od pachwiny do mostka i od lewej strony do prawej strony. Usuń sierść wokół otrzewnej.Przełącz się na nową parę sterylnych narzędzi, aby przeciąć otrzewną, również wykonując prostokątny otwór. Zidentyfikuj jelito ślepe, które powinno biegać od lewej strony do prawej strony w poprzek ciała. Zarąb tkankę łączną, aby zidentyfikować gałęzie jelita ślepego od jelit i odciąć jelito ślepe od jelit.Umieść go na wysterylizowanym arkuszu papieru do ważenia. Za pomocą sterylnych narzędzi przetnij oba końce jelita ślepego. Przytrzymaj środek jelita ślepego kleszczami i za pomocą płaskiej metalowej szpatułki delikatnie wypchnij zawartość jelita ślepego z końców ruchem tocznym.Zbierz zawartość i umieść ją w wstępnie zważonej 15-mililitrowej probówce wirówkowej. Zbierz zawartość jelita ślepego z maksymalnie pięciu myszy w tej samej probówce. Ponownie zważ probówkę po dodaniu całej zawartości.Aby obliczyć objętość wody dekstrozowej, którą należy dodać do zawartości jelita ślepego w każdej probówce, podziel wagę zawartości jelita ślepego w tubce przez żądane stężenie w miligramach na mililitr. Przechowywać porcję wody z dekstrozą na lodzie w celu ponownego zaparcia treści jelita ślepego. Dodaj wymaganą ilość wody dekstrozowej do 15-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej zawartość jelita ślepego.Obracaj rurkę pionowo i poziomo przez około 30 sekund. Obserwuj obecność cząstek stałych o średnicy powyżej kilku milimetrów, a jeśli są obecne, kontynuuj wirowanie, aż wszystkie cząstki znikną w widoczny sposób. Umieść 50-mililitrową probówkę wirówkową na lodzie, aby zebrać filtrat i zainstaluj na wierzchu sterylne sitko do komórek o średnicy 70 mikrometrów.Odpipetować cztery mililitry ponownie zawieszonej zawiesiny z jednej 15-mililitrowej probówki nad sitkiem komórkowym i do probówki zbiorczej. Ponownie zawiesić cząstki, pipetując w górę i w dół dwa do trzech razy. Delikatnie wyciśnij bąbelki, aby zwiększyć prędkość filtrowania, jednocześnie mieszając zawartość końcówką pipety, aż nie będzie już filtrowanej cieczy.Powinno to zająć około 30 sekund. Wymieniaj sitka między każdą tubką gnojowicy jelita ślepego, ale zbierz całą zawartość w tej samej 50-mililitrowej probówce zbiorczej. Jeśli twój zapas przekracza 40 mililitrów, wiruj go przez 15 sekund i umieść 20 mililitrów w nowej probówce wirówkowej.Podzielić gnojowicę na fiolki kriogeniczne po 500 mikrolitrów każda. Wirować gnojowicę między każdymi trzema fiolkami. Przechowywać główny bulion w fiolkach na lodzie.Przechowując podwielokrotności w temperaturze minus 80, stężenie jednostki tworzącej kolonie tlenowe w preparacie gnojowicy jelita ślepego nie zmienia się w okresie sześciu miesięcy. Teraz, gdy gnojowica jelita ślepego jest już przygotowana, możemy jej użyć do rzucenia wyzwania miotowi siedmio- lub ośmiodniowych myszy za pomocą dawki gnojowicy jelita ślepego dostosowanej do masy. Śmiertelność gnojowicy zależy od dawki.Będzie Pan/Pani musiał/a określić pożądaną dawkę śmiertelną w swoim zakładzie dla każdego nowego stada z nowym miareczkowaniem dawki. Na miot przygotowuje się jedną porcję do wstrzykiwania gnojowicy jelita ślepego. Normalizujemy inokulum do objętości 100 mikrolitrów, zaokrąglając do najbliższych 10 mikrolitrów dla każdego zwierzęcia w miocie.Przygotowanie podwielokrotności prowokacyjnej wymaga trzech obliczeń: wymaganej objętości gnojowicy, dodatkowej objętości wody dekstrozowej oraz zaokrąglonej objętości dla każdego młodego w miocie. Szczegółowe informacje na temat sposobu wykonania poszczególnych obliczeń można znaleźć w sekcji trzeciej protokołu. Ręczne wykonywanie tych obliczeń dla każdego eksperymentu może być czasochłonne i przyczyni się do błędu eksperymentalnego, dlatego wraz z protokołem można pobrać arkusz kalkulacyjny, w którym wprowadza się stężenie stada, pożądaną dawkę i wagę ściółki, a ilość gnojowicy, objętość wody dekstrozowej i rzeczywista objętość na młode są automatycznie zwracane.Możesz wydrukować ten arkusz i zabrać go ze sobą, gdy będziesz gotowy, aby rzucić wyzwanie swoim zwierzętom. Przygotować porcję do wstrzykiwań w komorze bezpieczeństwa biologicznego i przechowywać ją na lodzie. Przed załadowaniem strzykawki należy wymieszać probówkę mikrowirówki, przesuwając ją 20 razy.Szczenięta są prowokowane strzykawką insulinową o rozmiarze 28. Przed sporządzeniem gnojowicy należy wymieszać podwielokrotność, wdychając i wyrzucając od 300 do 500 mikrolitrów podwielokrotności prowokacyjnej do i z probówki mikrowirówki. Następnie należy pobrać około 150 mikrolitrów podwielokrotności prowokacyjnej.Powinna być większa niż objętość wstrzyknięcia dla każdego szczeniaka w wieku od siedmiu do ośmiu dni. Przesunąć strzykawkę, aby usunąć pęcherzyki z tłoka i lekko cofnąć strzykawkę, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Podczas tego procesu nie należy dotykać igły ani trzonka tłoka.Dozuj nadmiar gnojowicy jelita ślepego z powrotem do probówki mikrowirówki, aż obliczona ilość gnojowicy jelita ślepego dla myszy zostanie załadowana do strzykawki. Gnojowica jelita ślepego podaje się we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Wykonaj to zgodnie z protokołem w swojej placówce opieki nad zwierzętami.Aby zminimalizować przecieki, przechyl szczenię tak, aby było skierowane w dół i włóż igłę między nogę a narządy płciowe, utrzymując igłę płytko i podskórnie. Po wbiciu igły na około jeden centymetr należy naciskać w dół i do przodu, aż poczujesz, że igła przebija otrzewną, a następnie powoli wciskaj tłok. Ostrożnie wyjmij igłę, podążając tą samą trasą, którą wszedłeś, rozluźniając przy tym środkowy palec.Zanotuj wszelkie nieszczelności w notatniku laboratoryjnym i rozważ pominięcie zwierząt ze znacznymi wyciekami w wyniku końcowym. W tej sekcji przedstawimy różne poziomy zdrowia, które obserwujemy u myszy zmagających się z posocznicą wielodrobnoustrojową i odpowiadający im humanitarny punkt końcowy. W przypadku wszelkich zabiegów z udziałem nowonarodzonych myszy przenosimy materiał ściółkowy do nowej klatki.To przenosi zapach damy na twoje rękawiczki i zmniejsza stres u damy spowodowany wielokrotnym wchodzeniem do jej klatki. W nowej klatce budujemy drugie gniazdo, w którym trzymamy monitorowane młode do końca zabiegu lub monitorowania, kiedy cały miot jest gotowy do powrotu do klatki damy. Umieść mysz na jego plecach i monitoruj, aby w ciągu czterech sekund zrobić to w prawo.Jeśli to możliwe, poczekaj jeszcze osiem sekund, aby określić poziom mobilności. Mysz niekwestionowana lub odzyskująca zdrowie jest najczęściej w stanie naprawić i zbadać swoje otoczenie, wykonując wiele kroków z rzędu. Przegrupuj myszy, które są w stanie się wyprostować i podejmij kilka kroków, aby zbadać swoje środowisko jako ospałe.Te myszy mogą przewrócić się podczas robienia kroku i wyglądać na chwiejne na nogach. Mysz, która nie jest w stanie wyprostować się i ma ruch bioder przekraczający 90 stopni od poziomu, grupujemy jako nieruchomą w prawo. Ta mysz w końcu się poprawi, ale nie może w ciągu czterech sekund.Ze względu na ruchy bioder jest pogrupowany jako nieruchomy do prawostronnego. Szczenięta, które nie były w stanie się wyprostować i mają ruch bioder poniżej 90 stopni od poziomu, są grupowane jako niezdolne do prawo-letargiczne. Jest to kolejny przykład myszy, której biodra nie przekraczają 90 stopni od poziomu i jest zgrupowana jako niezbyt ospała.Szczenię, które nie jest prawostronne, będzie miało nogi, które mogą się trząść lub wibrować, ale nie będą poruszać biodrami. Kończyny mogą się wysuwać i chować, ale nie będą miały ruchu bocznego. Szczenię jest widocznie chore i osiągnęło humanitarny punkt końcowy.Jest to kolejny przykład nieudanego prawego szczeniaka nieruchomego. Jego biodra nie trzęsą się od lewej do prawej, ale jego łapy wibrują. Podczas obchodzenia się z klatką damy młode mogą zostać wyciągnięte z gniazda, jeśli dama karmiąca biegnie.Wymieniamy je, a następnie sprawdzamy, czy nie ma innych rozproszonych szczeniąt, które są z dala od swoich kolegów z gniazda. Jeśli te rozproszone szczenięta nie są w stanie letargu, znajdują się w humanitarnym punkcie końcowym. Oto krzywa przeżycia Kaplana-Meiera w naszym modelu sepsy.Punkty czasowe monitorowania znajdują się w załączonym SOP. W dowolnym momencie krzywej przeżycia, jeśli okaże się, że mysz nie jest w stanie poruszać się w prawo, znajduje się w humanitarnym punkcie końcowym i jest poddawana eutanazji. Między 12 a 21 godzinami po prowokacji myszy będą wyglądać na chore i około połowa myszy będzie w stanie wyprostować się po jednej stronie, podczas gdy druga połowa nie będzie w stanie wyprostować się po żadnej ze stron.Jest to przedział czasowy, w którym myszy zaczną odchylać się od oceny zdrowia i osiągną humanitarny punkt końcowy niepowodzenia w prawo-nieruchomy. Są to reprezentatywne wyniki ocen zdrowotnych zaobserwowanych w tym przedziale czasowym. W tym momencie nie można rozróżnić grup ocalałych i tych, którzy nie przeżyli, na podstawie ich punktów zdrowia.Na tym etapie choroby, od 21 do 48 godzin po prowokacji, obserwujemy najwyższy odsetek humanitarnych punktów końcowych. Zaobserwowaliśmy również, że zdecydowana większość myszy, które nie są w stanie wyprostować się po obu stronach, nie wyzdrowieje z choroby, która w związku z tym staje się nowym kryterium humanitarnego punktu końcowego obok kryteriów nieprawidłowego ruchu - nieruchliwych. Zaobserwowane oceny stanu zdrowia na tym etapie choroby skutkowały oddzieleniem osób, które przeżyły, od tych, którzy nie przeżyli.Zdecydowana większość myszy, które nie były w stanie wyprostować się po obu stronach, nie wyzdrowiała z choroby. Dane te potwierdzają, że nowym kryterium humanitarnego punktu końcowego, rozpoczynającym się po 21 godzinach od prowokacji, powinna być eutanazja wszystkich myszy, które nie wyjdą prawidłowo po obu stronach. W ciągu 48 godzin po wyzwaniu wiele myszy zacznie wykazywać większą aktywność i lepszy odruch prostowania.Mimo że odsetek humanitarnych punktów końcowych jest niższy w tym okresie, myszy mogą nadal zbaczać z kursu i stawać się bardziej chore, a także nadal wymagają monitorowania humanitarnego punktu końcowego. W tym czasie niektóre z tych myszy, które ostatecznie zostały zgrupowane jako nieocalałe, wykazywały zwiększoną aktywność w pewnym momencie, ale później radziły sobie gorzej i osiągnęły humanitarny punkt końcowy. Wymaga to ciągłego monitorowania chorych zwierząt ze zwiększoną częstotliwością, jeśli zaczynają one wykazywać gorsze wyniki zdrowotne.Niezależni eksperymentatorzy, którzy nie przeszli osobistego szkolenia i którzy oglądają tylko ten film instruktażowy, zostali przetestowani pod kątem zdolności do przypisania takiego samego wyniku, jak badacze korzystający z nagranych filmów testowych. Ten film instruktażowy zapewnia dokładną klasyfikację zachowań. Zdolność do przypisania prawidłowego wyniku do niepowodzenia prawostronnym myszom noworodkowym, która jest miarą humanitarnego punktu końcowego, została określona na 60 noworodkach myszy i średnio 97% zachowań zostało dokładnie rozróżnionych, a tylko 3% zostało błędnie zidentyfikowanych.Następnie przetestowano zdolność do różnicowania nowonarodzonych myszy, które nie były w stanie wyprostować się lub które były w stanie wyprostować się w ciągu czterech sekund. Jest to kolejna miara humanitarnego punktu końcowego i została dokładnie przypisana u 97% nowonarodzonych myszy, podczas gdy 3% młodych zostało nieprawidłowo przypisanych jako prawiejące. Oto reprezentatywne wyniki procentowej zmiany masy ciała myszy w porównaniu z czasem ich wyzwania.Średnia zmiana masy ciała między osobami, które przeżyły, a tymi, które nie przeżyły, zaczęła się rozdzielać po 24 godzinach od wyzwania, ale grupy w dużym stopniu się pokrywają. Byli tacy, którzy przeżyli, stracili ponad 20% wagi, ale nadal wyzdrowieli z choroby. Zmiana masy ciała nie była tak skuteczna w przewidywaniu wyniku w porównaniu z różnicami w wynikach zdrowotnych, dlatego nie jest używana jako kryterium określania, czy myszy znajdują się w humanitarnym punkcie końcowym.Podsumowując, powinieneś być teraz w stanie przygotować zapas mrożonej gnojowicy jelita ślepego, obliczyć dawkę dostosowaną do masy. A także wstrzykiwać i monitorować nowonarodzone myszy pod kątem humanitarnych punktów końcowych. Mamy nadzieję, że będzie to cenne źródło informacji dla Twoich badań nad myszami.

a-controlled-mouse-model-for-neonatal-polymicrobial-sepsis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Seman, B. G. i in. Model obrazowania noworodków sepsy bakteryjnej Gram-ujemnej. J. Vis. Exp. (2020)Film prezentuje model noworodkowej myszy do badania infekcji ogólnoustrojowej z użyciem zamkniętych bakterii bioluminescencyjnych. Noworodki są wstrzykiwane wysokodawkowymi lub niskodawkowymi zawiesinami bakteryjnymi i zwracane matce na opiekę poporodową. Otoczone bakterie unikają wczesnego wykrywania odpornościowego, rozprzestrzeniają się systemowo i są wizualizowane w czasie za pomocą...

Modelowanie infekcji u noworodkowych myszy z użyciem kapsulowanych bioluminescencyjnych bakterii

Tutaj opisana jest procedura przeprowadzania infekcji ogólnoustrojowej u noworodka szczura za pomocą kultur Escherichia coli K1. Ten nieinwazyjny zabieg pozwala na kolonizację przewodu pokarmowego, translokację patogenu do krążenia ogólnoustrojowego oraz inwazję ośrodkowego układu nerwowego w splocie naczyniówkowym.

Nieinwazyjny model neuropatogennego zakażenia Escherichia coli u nowonarodzonego szczura

Ten artykuł opisuje metodę generowania powtarzalnego uszkodzenia kompresyjnego rdzenia kręgowego (SCI) u noworodka myszy. Model ten stanowi korzystną platformę do badania mechanizmów plastyczności adaptacyjnej, które leżą u podstaw spontanicznej odbudowy funkcjonalnej.

Model urazu kompresyjnego rdzenia kręgowego u noworodków myszy

To badanie szczegółowo opisuje proces podawania precyzyjnych ilości probiotyków noworodkom myszy. Konfiguracja eksperymentalna została zoptymalizowana tak, aby obejmowała między innymi dawkowanie probiotyków, metody podawania i oznaczanie ilościowe bakterii w jelitach.

Badania probiotyczne na nowonarodzonych myszach z użyciem zgłębnika

Opracowaliśmy model zapalenia błony płodowej, aby symulować narażenie płodu na stan zapalny matki (FEMI) bez komplikacji związanych z żywymi organizmami, aby zbadać wpływ FEMI na rozwój przewodu pokarmowego potomstwa. Pozwala to na badanie mechanistycznych przyczyn rozwoju uszkodzenia jelit po zapaleniu błony płodowej.

Mysi model narażenia płodu na stan zapalny matki w celu zbadania wpływu ostrego zapalenia błony płodowej na rozwój jelit noworodka

Zakażenie noworodków myszy bioluminescencyjnym E. coli O1:K1:H7 powoduje infekcję septyczną ze znacznym zapaleniem płuc i patologią płuc. W tym miejscu opisano procedury modelowania i dalszego badania sepsy noworodków za pomocą podłużnego obrazowania przyżyciowego równolegle z wyliczaniem ogólnoustrojowych obciążeń bakteryjnych, profilowaniem stanu zapalnego i histopatologią płuc.

Noworodkowy model obrazowania posocznicy bakteryjnej Gram-ujemnej

Martwicze zapalenie jelit (NEC) jest najcięższą chorobą przewodu pokarmowego (GI), która często występuje u wcześniaków, szczególnie u niemowląt o bardzo niskiej masie urodzeniowej, z wysoką śmiertelnością i niejasną patogenezą. Przyczyna NEC może być związana z nieprawidłowościami w zakresie regulacji immunologicznej. Model zwierzęcy NEC jest niezbędnym narzędziem do badań immunologicznych nad chorobą NEC. Modele zwierzęce NEC zwykle wykorzystują nowonarodzone myszy C57BL/6J; Myszy...

Mysi model martwiczego zapalenia jelit u noworodków BALB/c

Wcześniaki (poród &lt; 37. tygodniu) to pilny globalny problem zdrowotny z nieoptymalnymi opcjami profilaktyki i leczenia. Przedstawiamy myszy model wcześnianego porodu wywołanego infekcją bakteryjną pochwy oraz opisujemy, jak analizować wynikającą z tego chorobność i śmiertelność noworodków.

Modelowanie wznoszącej się infekcji pochwy, przedwczesnych porodów i noworodkowej zachorowalności u myszy

Ten protokół opisuje noworodkowy model mysiego nektyzującego enterokolitisu (NEC) oraz późniejsze izolację komórek odpornościowych z blaszki właściwej jelita cienkiego noworodków.

Model myszy noworodkowej nekrotyzującego enterokolitu i izolacji lamina propria w celu profilaktyki komórek odpornościowych

Zapalenie otrzewnej wywołane stentem w okrężnicy wstępującej (Colon Ascendens Stent Peritonitis, CASP) jest wysoce ustandaryzowanym modelem polimikrobowej sepsy brzusznej u gryzoni. Niniejszy artykuł opisuje procedurę chirurgiczną CASP. Model CASP oraz jego warianty umożliwiają systematyczne badanie różnych zagadnień związanych z tematyką sepsy.

Zapalenie otrzewnej wywołane stentem w okrężnicy wstępującej (CASP) – standaryzowany model polimikrobowej sepsy brzusznej

Poznaj metodę przygotowania zawiesiny treści ślepej i indukcji posocznicy u siedmiodniowych myszy. Ten protokół umożliwia badanie patofizjologii noworodków z użyciem modelu wielodrobnoustrojowej infekcji.

Kontrolowany mysi model posocznicy wielodrobnoustrojowej u noworodków

Przeglądaj więcej filmów