Kontrolowany mysi model posocznicy wielodrobnoustrojowej u noworodków

Model gnojowicy jelita ślepego dla sepsy wielodrobnoustrojowej jest potężnym narzędziem do analizy unikalnej patofizjologii noworodków. Może być zmienna, a humanitarne punkty końcowe nie są dobrze opisane. Tutaj przedstawiamy naszą wysoce ustandaryzowaną procedurę przygotowania gnojowicy jelita ślepego i wstrzykiwania zwierzętom doświadczalnym.

Ponadto stosujemy podejście oparte na danych, aby zidentyfikować umierające młode w jak najwcześniejszym momencie. Zacznijmy od przygotowania mrożonego bulionu z gnojowicy jelitowej. Odbywa się to poprzez zebranie koncentu jelita ślepego od co najmniej pięciu dorosłych myszy, zawieszenie w sterylnej wodzie z dekstrozą i przechowywanie w temperaturze minus 80 do późniejszego wykorzystania.

Możesz użyć samców lub samic, ale płeć, wiek i pochodzenie myszy w twoich eksperymentach powinny być stałe. Najpierw przygotujmy nasze narzędzia do sekcji. Należą do nich zestaw nożyczek i kleszczyków do skóry oraz drugi zestaw do narządów wewnętrznych.

Włącz sterylizator z gorącymi kulkami co najmniej 30 minut przed użyciem. Zanurz narzędzia w 70% etanolu, a następnie zanurz je w sterylizatorze z gorącymi kulkami na co najmniej jedną minutę. Spryskaj matę ręczników papierowych 70% etanolem, a następnie wyjmij narzędzia ze sterylizatora, nie dotykając wysterylizowanej części narzędzia niesterylnymi uchwytami innych narzędzi.

Połóż je na ręczniku papierowym, aby ostygły. Przeprowadź sekcję myszy w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przypnij nogi myszy do płyty styropianowej za pomocą igieł o rozmiarze 23, tak aby mysz była brzuchem do góry.

Spryskaj brzuch 70% etanolem. Za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek przeciąć skórę, nożyczkami poluzować skórę od wyściółki otrzewnej i rozciąć prostokątny obszar od pachwiny do mostka i od lewej strony do prawej strony. Usuń sierść wokół otrzewnej.

Przełącz się na nową parę sterylnych narzędzi, aby przeciąć otrzewną, również wykonując prostokątny otwór. Zidentyfikuj jelito ślepe, które powinno biegać od lewej strony do prawej strony w poprzek ciała. Zarąb tkankę łączną, aby zidentyfikować gałęzie jelita ślepego od jelit i odciąć jelito ślepe od jelit

Umieść go na wysterylizowanym arkuszu papieru do ważenia. Za pomocą sterylnych narzędzi przetnij oba końce jelita ślepego. Przytrzymaj środek jelita ślepego kleszczami i za pomocą płaskiej metalowej szpatułki delikatnie wypchnij zawartość jelita ślepego z końców ruchem tocznym.

Zbierz zawartość i umieść ją w wstępnie zważonej 15-mililitrowej probówce wirówkowej. Zbierz zawartość jelita ślepego z maksymalnie pięciu myszy w tej samej probówce. Ponownie zważ probówkę po dodaniu całej zawartości.

Aby obliczyć objętość wody dekstrozowej, którą należy dodać do zawartości jelita ślepego w każdej probówce, podziel wagę zawartości jelita ślepego w tubce przez żądane stężenie w miligramach na mililitr. Przechowywać porcję wody z dekstrozą na lodzie w celu ponownego zaparcia treści jelita ślepego. Dodaj wymaganą ilość wody dekstrozowej do 15-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej zawartość jelita ślepego.

Obracaj rurkę pionowo i poziomo przez około 30 sekund. Obserwuj obecność cząstek stałych o średnicy powyżej kilku milimetrów, a jeśli są obecne, kontynuuj wirowanie, aż wszystkie cząstki znikną w widoczny sposób. Umieść 50-mililitrową probówkę wirówkową na lodzie, aby zebrać filtrat i zainstaluj na wierzchu sterylne sitko do komórek o średnicy 70 mikrometrów.

Odpipetować cztery mililitry ponownie zawieszonej zawiesiny z jednej 15-mililitrowej probówki nad sitkiem komórkowym i do probówki zbiorczej. Ponownie zawiesić cząstki, pipetując w górę i w dół dwa do trzech razy. Delikatnie wyciśnij bąbelki, aby zwiększyć prędkość filtrowania, jednocześnie mieszając zawartość końcówką pipety, aż nie będzie już filtrowanej cieczy.

Powinno to zająć około 30 sekund. Wymieniaj sitka między każdą tubką gnojowicy jelita ślepego, ale zbierz całą zawartość w tej samej 50-mililitrowej probówce zbiorczej. Jeśli twój zapas przekracza 40 mililitrów, wiruj go przez 15 sekund i umieść 20 mililitrów w nowej probówce wirówkowej.

Podzielić gnojowicę na fiolki kriogeniczne po 500 mikrolitrów każda. Wirować gnojowicę między każdymi trzema fiolkami. Przechowywać główny bulion w fiolkach na lodzie.

Przechowując podwielokrotności w temperaturze minus 80, stężenie jednostki tworzącej kolonie tlenowe w preparacie gnojowicy jelita ślepego nie zmienia się w okresie sześciu miesięcy. Teraz, gdy gnojowica jelita ślepego jest już przygotowana, możemy jej użyć do rzucenia wyzwania miotowi siedmio- lub ośmiodniowych myszy za pomocą dawki gnojowicy jelita ślepego dostosowanej do masy. Śmiertelność gnojowicy zależy od dawki.

Będzie Pan/Pani musiał/a określić pożądaną dawkę śmiertelną w swoim zakładzie dla każdego nowego stada z nowym miareczkowaniem dawki. Na miot przygotowuje się jedną porcję do wstrzykiwania gnojowicy jelita ślepego. Normalizujemy inokulum do objętości 100 mikrolitrów, zaokrąglając do najbliższych 10 mikrolitrów dla każdego zwierzęcia w miocie.

Przygotowanie podwielokrotności prowokacyjnej wymaga trzech obliczeń: wymaganej objętości gnojowicy, dodatkowej objętości wody dekstrozowej oraz zaokrąglonej objętości dla każdego młodego w miocie. Szczegółowe informacje na temat sposobu wykonania poszczególnych obliczeń można znaleźć w sekcji trzeciej protokołu. Ręczne wykonywanie tych obliczeń dla każdego eksperymentu może być czasochłonne i przyczyni się do błędu eksperymentalnego, dlatego wraz z protokołem można pobrać arkusz kalkulacyjny, w którym wprowadza się stężenie stada, pożądaną dawkę i wagę ściółki, a ilość gnojowicy, objętość wody dekstrozowej i rzeczywista objętość na młode są automatycznie zwracane.

Możesz wydrukować ten arkusz i zabrać go ze sobą, gdy będziesz gotowy, aby rzucić wyzwanie swoim zwierzętom. Przygotować porcję do wstrzykiwań w komorze bezpieczeństwa biologicznego i przechowywać ją na lodzie. Przed załadowaniem strzykawki należy wymieszać probówkę mikrowirówki, przesuwając ją 20 razy.

Szczenięta są prowokowane strzykawką insulinową o rozmiarze 28. Przed sporządzeniem gnojowicy należy wymieszać podwielokrotność, wdychając i wyrzucając od 300 do 500 mikrolitrów podwielokrotności prowokacyjnej do i z probówki mikrowirówki. Następnie należy pobrać około 150 mikrolitrów podwielokrotności prowokacyjnej.

Powinna być większa niż objętość wstrzyknięcia dla każdego szczeniaka w wieku od siedmiu do ośmiu dni. Przesunąć strzykawkę, aby usunąć pęcherzyki z tłoka i lekko cofnąć strzykawkę, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Podczas tego procesu nie należy dotykać igły ani trzonka tłoka.

Dozuj nadmiar gnojowicy jelita ślepego z powrotem do probówki mikrowirówki, aż obliczona ilość gnojowicy jelita ślepego dla myszy zostanie załadowana do strzykawki. Gnojowica jelita ślepego podaje się we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Wykonaj to zgodnie z protokołem w swojej placówce opieki nad zwierzętami.

Aby zminimalizować przecieki, przechyl szczenię tak, aby było skierowane w dół i włóż igłę między nogę a narządy płciowe, utrzymując igłę płytko i podskórnie. Po wbiciu igły na około jeden centymetr należy naciskać w dół i do przodu, aż poczujesz, że igła przebija otrzewną, a następnie powoli wciskaj tłok. Ostrożnie wyjmij igłę, podążając tą samą trasą, którą wszedłeś, rozluźniając przy tym środkowy palec.

Zanotuj wszelkie nieszczelności w notatniku laboratoryjnym i rozważ pominięcie zwierząt ze znacznymi wyciekami w wyniku końcowym. W tej sekcji przedstawimy różne poziomy zdrowia, które obserwujemy u myszy zmagających się z posocznicą wielodrobnoustrojową i odpowiadający im humanitarny punkt końcowy. W przypadku wszelkich zabiegów z udziałem nowonarodzonych myszy przenosimy materiał ściółkowy do nowej klatki.

To przenosi zapach damy na twoje rękawiczki i zmniejsza stres u damy spowodowany wielokrotnym wchodzeniem do jej klatki. W nowej klatce budujemy drugie gniazdo, w którym trzymamy monitorowane młode do końca zabiegu lub monitorowania, kiedy cały miot jest gotowy do powrotu do klatki damy. Umieść mysz na jego plecach i monitoruj, aby w ciągu czterech sekund zrobić to w prawo.

Jeśli to możliwe, poczekaj jeszcze osiem sekund, aby określić poziom mobilności. Mysz niekwestionowana lub odzyskująca zdrowie jest najczęściej w stanie naprawić i zbadać swoje otoczenie, wykonując wiele kroków z rzędu. Przegrupuj myszy, które są w stanie się wyprostować i podejmij kilka kroków, aby zbadać swoje środowisko jako ospałe.

Te myszy mogą przewrócić się podczas robienia kroku i wyglądać na chwiejne na nogach. Mysz, która nie jest w stanie wyprostować się i ma ruch bioder przekraczający 90 stopni od poziomu, grupujemy jako nieruchomą w prawo. Ta mysz w końcu się poprawi, ale nie może w ciągu czterech sekund.

Ze względu na ruchy bioder jest pogrupowany jako nieruchomy do prawostronnego. Szczenięta, które nie były w stanie się wyprostować i mają ruch bioder poniżej 90 stopni od poziomu, są grupowane jako niezdolne do prawo-letargiczne. Jest to kolejny przykład myszy, której biodra nie przekraczają 90 stopni od poziomu i jest zgrupowana jako niezbyt ospała.

Szczenię, które nie jest prawostronne, będzie miało nogi, które mogą się trząść lub wibrować, ale nie będą poruszać biodrami. Kończyny mogą się wysuwać i chować, ale nie będą miały ruchu bocznego. Szczenię jest widocznie chore i osiągnęło humanitarny punkt końcowy

Jest to kolejny przykład nieudanego prawego szczeniaka nieruchomego. Jego biodra nie trzęsą się od lewej do prawej, ale jego łapy wibrują. Podczas obchodzenia się z klatką damy młode mogą zostać wyciągnięte z gniazda, jeśli dama karmiąca biegnie.

Wymieniamy je, a następnie sprawdzamy, czy nie ma innych rozproszonych szczeniąt, które są z dala od swoich kolegów z gniazda. Jeśli te rozproszone szczenięta nie są w stanie letargu, znajdują się w humanitarnym punkcie końcowym. Oto krzywa przeżycia Kaplana-Meiera w naszym modelu sepsy.

Punkty czasowe monitorowania znajdują się w załączonym SOP. W dowolnym momencie krzywej przeżycia, jeśli okaże się, że mysz nie jest w stanie poruszać się w prawo, znajduje się w humanitarnym punkcie końcowym i jest poddawana eutanazji. Między 12 a 21 godzinami po prowokacji myszy będą wyglądać na chore i około połowa myszy będzie w stanie wyprostować się po jednej stronie, podczas gdy druga połowa nie będzie w stanie wyprostować się po żadnej ze stron.

Jest to przedział czasowy, w którym myszy zaczną odchylać się od oceny zdrowia i osiągną humanitarny punkt końcowy niepowodzenia w prawo-nieruchomy. Są to reprezentatywne wyniki ocen zdrowotnych zaobserwowanych w tym przedziale czasowym. W tym momencie nie można rozróżnić grup ocalałych i tych, którzy nie przeżyli, na podstawie ich punktów zdrowia.

Na tym etapie choroby, od 21 do 48 godzin po prowokacji, obserwujemy najwyższy odsetek humanitarnych punktów końcowych. Zaobserwowaliśmy również, że zdecydowana większość myszy, które nie są w stanie wyprostować się po obu stronach, nie wyzdrowieje z choroby, która w związku z tym staje się nowym kryterium humanitarnego punktu końcowego obok kryteriów nieprawidłowego ruchu - nieruchliwych. Zaobserwowane oceny stanu zdrowia na tym etapie choroby skutkowały oddzieleniem osób, które przeżyły, od tych, którzy nie przeżyli.

Zdecydowana większość myszy, które nie były w stanie wyprostować się po obu stronach, nie wyzdrowiała z choroby. Dane te potwierdzają, że nowym kryterium humanitarnego punktu końcowego, rozpoczynającym się po 21 godzinach od prowokacji, powinna być eutanazja wszystkich myszy, które nie wyjdą prawidłowo po obu stronach. W ciągu 48 godzin po wyzwaniu wiele myszy zacznie wykazywać większą aktywność i lepszy odruch prostowania.

Mimo że odsetek humanitarnych punktów końcowych jest niższy w tym okresie, myszy mogą nadal zbaczać z kursu i stawać się bardziej chore, a także nadal wymagają monitorowania humanitarnego punktu końcowego. W tym czasie niektóre z tych myszy, które ostatecznie zostały zgrupowane jako nieocalałe, wykazywały zwiększoną aktywność w pewnym momencie, ale później radziły sobie gorzej i osiągnęły humanitarny punkt końcowy. Wymaga to ciągłego monitorowania chorych zwierząt ze zwiększoną częstotliwością, jeśli zaczynają one wykazywać gorsze wyniki zdrowotne.

Niezależni eksperymentatorzy, którzy nie przeszli osobistego szkolenia i którzy oglądają tylko ten film instruktażowy, zostali przetestowani pod kątem zdolności do przypisania takiego samego wyniku, jak badacze korzystający z nagranych filmów testowych. Ten film instruktażowy zapewnia dokładną klasyfikację zachowań. Zdolność do przypisania prawidłowego wyniku do niepowodzenia prawostronnym myszom noworodkowym, która jest miarą humanitarnego punktu końcowego, została określona na 60 noworodkach myszy i średnio 97% zachowań zostało dokładnie rozróżnionych, a tylko 3% zostało błędnie zidentyfikowanych.

Następnie przetestowano zdolność do różnicowania nowonarodzonych myszy, które nie były w stanie wyprostować się lub które były w stanie wyprostować się w ciągu czterech sekund. Jest to kolejna miara humanitarnego punktu końcowego i została dokładnie przypisana u 97% nowonarodzonych myszy, podczas gdy 3% młodych zostało nieprawidłowo przypisanych jako prawiejące. Oto reprezentatywne wyniki procentowej zmiany masy ciała myszy w porównaniu z czasem ich wyzwania.

Średnia zmiana masy ciała między osobami, które przeżyły, a tymi, które nie przeżyły, zaczęła się rozdzielać po 24 godzinach od wyzwania, ale grupy w dużym stopniu się pokrywają. Byli tacy, którzy przeżyli, stracili ponad 20% wagi, ale nadal wyzdrowieli z choroby. Zmiana masy ciała nie była tak skuteczna w przewidywaniu wyniku w porównaniu z różnicami w wynikach zdrowotnych, dlatego nie jest używana jako kryterium określania, czy myszy znajdują się w humanitarnym punkcie końcowym.

Podsumowując, powinieneś być teraz w stanie przygotować zapas mrożonej gnojowicy jelita ślepego, obliczyć dawkę dostosowaną do masy. A także wstrzykiwać i monitorować nowonarodzone myszy pod kątem humanitarnych punktów końcowych. Mamy nadzieję, że będzie to cenne źródło informacji dla Twoich badań nad myszami.