Name: Wychwytywanie i identyfikacja białek wiążących RNA za pomocą strategii wychwytywania interaktomu RNA wspomaganej chemią kliknięcia (CARIC) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Poznaj metodę CARIC do identyfikacji białek wiążących RNA w komórkach HeLa. Ta technika chemii kliknięcia umożliwia kompleksową analizę interakcji białek z RNA kodującym i niekodującym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin Granty 91753206, 21425204 i 21521003 oraz przez Narodowy Kluczowy Projekt Badawczo-Rozwojowy 2016YFA0501500.

<ol><li>Djebali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+transcription+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape of transcription in human cells.</a> Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).</li>
<li>Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+census+of+human+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">A census of human RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).</li>
<li>Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+in+Mendelian+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins in Mendelian disease.</a> Trends in Genetics. 29 (5), 318-327 (2013).</li>
<li>Nussbacher, J. K., Batra, R., Lagier-Tourenne, C., Yeo, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+in+neurodegeneration%3A+Seq+and+you+shall+receive%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins in neurodegeneration: Seq and you shall receive.</a> Trends in Neuroscience. 38 (4), 226-236 (2015).</li>
<li>Jazurek, M., Ciesiolka, A., Starega-Roslan, J., Bilinska, K., Krzyzosiak, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+proteins+that+bind+to+specific+RNAs+-+focus+on+simple+repeat+expansion+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Identifying proteins that bind to specific RNAs - focus on simple repeat expansion diseases.</a> Nucleic Acids Research. 44 (19), 9050-9070 (2016).</li>
<li>Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brave+new+world+of+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A brave new world of RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).</li>
<li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Molecular Cell. 46 (5), 674-690 (2012).</li>
<li>Beckmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+proteomes+from+yeast+to+man+harbour+conserved+enigmRBPs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs.</a> Nature Communications. 6, 10127-10135 (2015).</li>
<li>Conrad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+interactome+capture+of+the+human+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Serial interactome capture of the human cell nucleus.</a> Nature Communications. 7, 11212-11222 (2016).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+identification+of+RNA-binding+domains+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive identification of RNA-binding domains in human cells.</a> Molecular Cell. 63 (4), 696-710 (2016).</li>
<li>Kwon, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+repertoire+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 20 (9), 1122-1130 (2013).</li>
<li>Liepelt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+RNA-binding+proteins+in+macrophages+by+interactome+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of RNA-binding proteins in macrophages by interactome capture.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 15 (8), 2699-2714 (2016).</li>
<li>Liao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardiomyocyte+RNA-binding+proteome%3A+Links+to+intermediary+metabolism+and+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The cardiomyocyte RNA-binding proteome: Links to intermediary metabolism and heart disease.</a> Cell Reports. 16 (5), 1456-1469 (2016).</li>
<li>Mitchell, S. F., Jain, S., She, M. P., Parker, R. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nsmb/journal/v20/n1/abs/nsmb.2468.html">Global analysis of yeast mRNPs.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 127-133 (2013).</li>
<li>Matia-González, A. M., Laing, E. E., Gerber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+mRNA-binding+proteomes+in+eukaryotic+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Conserved mRNA-binding proteomes in eukaryotic organisms.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 22 (12), 1027-1033 (2015).</li>
<li>Despic, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+RNA-protein+interactions+underlie+the+zebrafish+maternal-to-zygotic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamic RNA-protein interactions underlie the zebrafish maternal-to-zygotic transition.</a> Genome Research. 27 (7), 1184-1194 (2017).</li>
<li>Wessels, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+of+the+early+fly+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome of the early fly embryo.</a> Genome Research. 26 (7), 1000-1009 (2016).</li>
<li>Sysoev, V. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+changes+of+the+RNA-bound+proteome+during+the+maternal-to-zygotic+transition+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Global changes of the RNA-bound proteome during the maternal-to-zygotic transition in Drosophila.</a> Nature Communications. 7, 12128(2016).</li>
<li>Reichel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+planta+determination+of+the+mRNA-binding+proteome+of+Arabidopsis+etiolated+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">In planta determination of the mRNA-binding proteome of Arabidopsis etiolated seedlings.</a> Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).</li>
<li>Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+repertoire+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana.</a> Scientific Reports. 6, 29766-29778 (2016).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV+crosslinked+mRNA-binding+proteins+captured+from+leaf+mesophyll+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts.</a> Plant Methods. 12, 42-53 (2016).</li>
<li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+of+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biology. 17, 147-164 (2016).</li>
<li>Lueong, S., Merce, C., Fischer, B., Hoheisel, J. D., Erben, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+regulatory+networks+in+Trypanosoma+brucei%3A+insights+into+the+role+of+the+mRNA-binding+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Gene expression regulatory networks in Trypanosoma brucei: insights into the role of the mRNA-binding proteome.</a> Molecular Microbiology. 100 (3), 457-471 (2016).</li>
<li>Nandan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+identification+of+mRNA-binding+proteins+of+Leishmania+donovani+by+interactome+capture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comprehensive identification of mRNA-binding proteins of Leishmania donovani by interactome capture.</a> PLoS ONE. 12 (1), e0170068(2017).</li>
<li>Jankowsky, E., Harris, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+nonspecificity+in+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).</li>
<li>Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+discovery+of+coding+and+noncoding+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide discovery of coding and noncoding RNA-binding proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), E3879-E3887 (2018).</li>
<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li>
<li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).</li>
<li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+micro-purification%2C+enrichment%2C+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), e47(2015).</li>
<li>Grammel, M., Hang, H., Conrad, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+reporters+for+monitoring+RNA+synthesis+and+poly%28A%29+tail+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Chemical reporters for monitoring RNA synthesis and poly(A) tail dynamics.</a> ChemBioChem. 13 (8), 1112-1115 (2012).</li>
<li>Curanovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+profiling+of+stimulus-induced+polyadenylation+in+cells+using+a+poly%28A%29+trap%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Global profiling of stimulus-induced polyadenylation in cells using a poly(A) trap.</a> Nature Chemical Biology. 9 (11), 671-673 (2013).</li>
<li>Zheng, Y. X., Beal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+evaluation+of+an+alkyne-modified+ATP+analog+for+enzymatic+incorporation+into+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (7), 1799-1802 (2016).</li>
<li>Nainar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+incorporation+of+azide+functionality+into+cellular+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Metabolic incorporation of azide functionality into cellular RNA.</a> ChemBioChem. 17 (22), 2149-2152 (2016).</li>
<li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+the+interactome+of+newly+transcribed+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Capturing the interactome of newly transcribed RNA.</a> Nature Methods. 15 (3), 213-220 (2018).</li>
<li>Holmqvist, E., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins in bacteria.</a> Nature Reviews Microbiology. , Published online (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Utrzymanie prawidłowej integralności RNA jest jednym z kluczy do udanych eksperymentów CARIC. Przy odpowiednich ligandach Cu(I) i ostrożnej pracy degradacja RNA może być znacznie zmniejszona, chociaż zaobserwowano częściową degradację. Współczynniki substytucji EU i 4SU w próbkach eksperymentalnych wynoszą odpowiednio 1,18% i 0,46% (dane nie pokazane). W przypadku nienaruszonych RNA o długości 2,000 nt, ~90% RNA zawiera co najmniej jeden EU i jeden 4SU. W przypadku częściowo zdegradowanych RNA o długości 1,000 nt, ~70% R...

Ludzki genom jest transkrybowany na różne typy kodujących i niekodujących RNA (ncRNA), w tym mRNA, rRNA, tRNA, małe jądrowe RNA (snRNA), małe jądrowe RNA (snoRNA) i długie niekodujące RNA (lncRNAs)1. Większość z tych RNA posiada ubranie RBP i funkcjonuje jako cząsteczki rybonukleoproteiny (RNP)2. Dlatego kompleksowa identyfikacja RBP jest warunkiem wstępnym zrozumienia sieci regulacyjnej między RNA a RBP, która jest związana z różnymi chorobami człowieka3,4,5.
W ciągu ostatnich kilku lat byliśmy świadkami ogromnego wzrostu liczby RBP odkrytych w różnych systemach eukariotycznych2,6, w tym human7,8,9,10,11, mouse12,13,14, drożdże9,15,16, danio pręgowany17, Drosophila melanogaster18,19, Caenorhabditis elegans16, Arabidopsis thaliana20,21,22oraz ludzkie pasożyty23,24,25. Postępy te zostały ułatwione dzięki strategii wychwytywania RBP opracowanej przez Castello i wsp.7 oraz Baltz et al.8 w 2012 roku, który łączy sieciowanie in vivo UV RNA i jego oddziałujących białek, wychwytywanie oligo(dT) poli(A) RNA oraz profilowanie proteomiczne oparte na spektrometrii mas (MS). Jednak biorąc pod uwagę fakt, że poli(A) występuje głównie na dojrzałych mRNA, które stanowią tylko ~3% - 5% transkryptomu eukariotycznego26, ta szeroko stosowana strategia nie jest w stanie wychwycić RBP oddziałujących z RNA innymi niż poli(A), w tym większość ncRNA i pre-mRNA.
Tutaj przedstawiamy szczegółowe procedury niedawno opracowanej strategii przechwytywania w całym transkryptomie zarówno poli(A), jak i niepoli(A) RBPs27. Strategia ta, określana jako CARIC, łączy sieciowanie UV in vivo i znakowanie metaboliczne RNA za pomocą fotoaktywowanych i "klikalnych" analogów nukleozydów (które zawierają bioortogonalną grupę funkcyjną, która może uczestniczyć w reakcji kliknięcia), 4-tiourydyny (4SU) i 5-etynylurydyny (UE). Kroki, które są kluczowe dla uzyskania idealnych wyników dzięki strategii CARIC, to skuteczne znakowanie metaboliczne, sieciowanie UV i reakcja kliknięcia oraz utrzymanie integralności RNA. Ponieważ Cu(I) stosowany jako katalizator w reakcji kliknięcia może powodować fragmentację RNA, niezbędny jest ligand Cu(I), który może zmniejszyć fragmentację RNA. Opisujemy, jak przeprowadzać skuteczne reakcje klikania w lizatach komórkowych bez powodowania poważnej degradacji RNA.
Chociaż przechwytywanie i identyfikacja RBP tylko w komórkach HeLa jest opisana w tym protokole, strategia CARIC może być stosowana do różnych typów komórek i ewentualnie do organizmów żywych. Oprócz wychwytywania RBP, protokół ten zapewnia również usprawnione procedury krok po kroku dotyczące przygotowania próbki SM oraz identyfikacji i kwantyfikacji białek, co może być pomocne dla tych, którzy nie są zaznajomieni z eksperymentami proteomicznymi.

<table><tbody><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Surowica bydlęca płodu)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina i Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>UE (5-etynylourydyna)</td> <td>Wuhu Huaren Co.</td><td>CAS: 69075-42-9</td><td></td></tr><tr><td>4SU (4-tiourydyna)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>T4509</td><td></td></tr><tr><td>10 i razy; PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Sieciownik UVP</td><td></td><td>CL-1000</td><td>Wyposażony w lampę UV 365 nm</td></tr><tr><td>DEPC (pirowęglan dietylu)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5758</td><td>Do uzdatniania wody. Wysoce toksyczny!</td></tr><tr><td>Trójkąt i kropka środkowa; HCl, pH 7,5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>62476</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Biodee</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88265</td><td>Jedna tabletka na 50 ml buforu do lizy.</td></tr><tr><td>LDS (dodecylosiarczan litu)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9781</td><td></td></tr><tr><td>15-mL rurka ultrafiltracyjna (odcięcie 10 kDa)</td><td>Milipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>0,5-mL ultrafiltracyjna rurka (odcięcie 10 kDa)</td><td>Millipore</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna Kulki magnetyczne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88816</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (dimetylosulfotlenek)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>41639</td><td></td></tr><tr><td>Azide-biotyna</td><td>Click Narzędzia chemiczne</td><td>AZ104</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan miedzi(II)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1297</td><td></td></tr><tr><td>THPTA [Tris(3-hydroksypropylotriazolylo)amina]</td><td>Sigma Aldrich</td><td>762342</td><td></td></tr><tr><td>Askorbinian sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Azide-Cy5</td><td>Kliknij Narzędzia chemiczne</td><td>AZ118</td><td></td></tr><tr><td>Bufor próbek LDS (4& razy;)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>10% żel bis-Tris</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0301BOX</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>RNaza A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R6513</td><td></td></tr><tr><td>SDS (dodecylosiarczan sodu)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15525017</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Brij-97 [Polioksyetyleno(20) eter oleilowy]J</td><td>& K</td><td>315442</td><td></td></tr><tr><td>Trietanoloamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900257</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna agaroza</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20353</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Sarkosyl (N-Lauroilsarkozyna sól sodowa)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>61743</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td></td><td></td><td>Wersja: 1.5.5.1</td></tr></tbody></table>

wychwytywanie i identyfikacja białek wiążących rna za pomocą strategii wychwytywania interaktomu rna wspomaganej chemią kliknięcia (caric)

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Kompleksowa identyfikacja białek wiążących RNA (RBP) jest kluczem do zrozumienia potranskrypcyjnej sieci regulacyjnej w komórkach. Szeroko stosowana strategia wychwytywania RBP wykorzystuje poliadenylację [poli(A)] docelowych RNA, która występuje głównie na eukariotycznych dojrzałych mRNA, pozostawiając większość białek wiążących RNA innych niż poli(A) niezidentyfikowanych. W tym miejscu opisujemy szczegółowe procedury niedawno opisanej metody zwanej wychwytywaniem interaktomu RNA wspomaganego chemią kliknięcia (CARIC), która umożliwia wychwytywanie RBP poli(A), jak i nie-poli(A) w całym transkryptomie poprzez połączenie znakowania metabolicznego RNA, sieciowania UV in vivo i znakowania bioortogonalnego.

Przedstawiono reprezentatywne wyniki etapów kontroli jakości. Wyniki obejmują obrazy z analizy fluorescencji w żelu opisanej w kroku 2.3.2 (Rysunek 1), analizę western blot opisaną w kroku 4.1.3 (Rysunek 2A) oraz analizę barwienia srebrem opisaną w kroku 4.2.2 (Rysunek 2B). Etapy kontroli jakości są kluczowe dla optymalizacji protokołów CARIC. Zawsze należy uwzględniać kontrole jakości podczas przygo...

Przedstawiono szczegółowy protokół stosowania strategii CARIC (ang. click chemistry-assisted RNA-interactome capture) do identyfikacji białek wiążących się zarówno z kodującymi, jak i niekodującymi RNA.

Wychwytywanie i identyfikacja białek wiążących RNA za pomocą strategii wychwytywania interaktomu RNA wspomaganej chemią kliknięcia (CARIC)

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Ta metoda, CARIC, może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rekreacji genów po transkrypcji, dostarczając kompleksowego spisu białek wiążących RNA. Główną zaletą CARIC jest jego zdolność do wychwytywania białek związanych z różnymi rodzajami RNA, takimi jak mRNA i niekodujące RNA. Metoda ta może być stosowana w różnych typach i organizmach do badania interakcji białek RNA w pracy.Po pierwsze, hoduj komórki HeLa w suplementowanym DMEM w temperaturze 37 stopni Celsjusza w pięcioprocentowej atmosferze CO2. Gdy komórki osiągną około 80 procent konfluencji, zastąp pożywkę hodowlaną na każdym naczyniu 15 mililitrami podgrzanej, świeżej pożywki. Dodaj 15 mikrolitrów 100 milimolowych UE do każdego naczynia do końcowego stężenia jednego milimola.W przypadku próbek eksperymentalnych i bez kontroli UV dodaj 7,5 mikrolitra 100 milimolowych czterech SU do każdej potrawy. Przykryj naczynia folią i hoduj komórki przez 16 godzin, stosując poprzednie warunki. Następnie dodaj połowę poprzedniej ilości EU i/lub czterech SU do odpowiednich płytek i kontynuuj hodowlę przez kolejne dwie godziny.Aby rozpocząć sieciowanie in vivo, usuń pożywkę hodowlaną i umyj każde naczynie trzy razy PBS, używając pięciu mililitrów PBS na mycie. Usuń resztki PBS tak bardzo, jak to możliwe. W przypadku próbek eksperymentalnych i bez czterech próbek kontrolnych SU, umieść naczynia na lodzie ze zdjętą pokrywką.Użyj środka sieciującego UV, aby naświetlić komórki światłem UV o długości 365 nanometrów i w odległości dwóch ligli na centymetr kwadratowy. W przypadku próbek kontrolnych bez promieniowania UV umieść naczynia na lodzie i chroń je przed światłem. Następnie dodaj jeden mililitr buforu prelizy do każdego naczynia.Użyj gumowego podnośnika komórek, aby zeskrobać komórki i zebrać zawiesinę prelizy w 15-mililitrowej probówce. Dodać bufor prelityczny do probówki zawierającej zawiesinę z dwóch szalek, dostosowując całkowitą objętość do sześciu mililitrów. Następnie dodać równą objętość buforu do rlizy.Przepuść lizat komórkowy przez strzykawkę z wąską igłą kilka razy, aż lizat będzie klarowny i jednorodny. Inkubować lizat w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnymi obrotami przez godzinę. Następnie rozcieńczyć lizat w 20 objętościach buforu rozcieńczającego i podzielić go na 15 mililitrowych frakcji w 15-mililitrowych probówkach nieprzepuszczalnych, odcięcie molekularne 10 kilodaltonów.Za pomocą wahadłowego rotatora kubełkowego obracaj rurki pod kątem 4000 razy G i czterech stopni Celsjusza przez około 15 minut, aż każda frakcja zostanie skoncentrowana do objętości mniejszej niż jeden mililitr. Dodać 14 mililitrów buforu rozcieńczającego do każdej zagęszczonej frakcji lizatu i powtórzyć proces zatężania. Następnie połącz frakcje i zagęść je do objętości sześciu mililitrów, stosując opisany wcześniej proces zatężania.Najpierw przygotuj mieszaninę reakcyjną zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dodaj tę mieszaninę reakcyjną do sześciu mililitrów wstępnie oczyszczonego lizatu i dobrze wymieszaj. Dodaj 162,5 mikrolitra odczynnika redukującego i dobrze wymieszaj.Inkubować w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 800 obr./min przez dwie godziny. Następnie wygasić reakcję, dodając pięć milimolowych EDTA i inkubując na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie podziel mieszaninę reakcyjną na dwie 50-mililitrowe probówki, z których każda zawiera cztery objętości wstępnie schłodzonego metanolu i inkubuj w temperaturze minus 30 stopni Celsjusza przez 30 minut.Wirować w temperaturze 4000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut. Odrzucić supernatant i dodać od jednego do dwóch mililitrów wstępnie schłodzonego metanolu do osadu. Pigazuj w górę iw dół, aby rozbić granulkę, upewniając się, że pelety są całkowicie zawieszone bez widocznych kawałków.Powtórzyć proces wirowania i ponownego zawieszania dwukrotnie. Następnie ostrożnie wyciągnij resztki metanolu tak bardzo, jak to możliwe, uważając, aby nie naruszyć granulki. Dodać 10 mililitrów buforu do rozpuszczania i pipetować w górę iw dół, aby rozpuścić osad.Wirować w temperaturze 4000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Następnie przenieś supernatant do nowej probówki, upewniając się, że zebrałeś 20 mikrolitrów próbki do kontroli jakości. Oczyszczoną i rozpuszczoną próbkę przenieść do przygotowanych kulek agarozy streptawidyny.Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym obracaniem przez noc. Obracaj koraliki 4000 razy G przez pięć minut. Przenieś supernatant do nowej probówki, upewniając się, że zebrałeś 20 mikrolitrów próbki do kontroli jakości.Przemyć kulki 10 mililitrami buforu do przemywania A. Inkubować z delikatnymi obrotami przy 12 obr./min i w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie wiruj koraliki 4000 razy G przez pięć minut. Usunąć sklarowany osad i powtórzyć proces mycia i wirowania jeszcze raz.Powtórz ten proces mycia dla bufora myjącego B i buforu myjącego C, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie umyj kulki 10 mililitrami 50-milimolowego chlorowodorku Tris. Obracaj koraliki w dół 4000 razy G przez pięć minut.Usunąć supernatant i równomiernie rozdzielić kulki między dwie probówki do mikrowirówek po 1,5 metra. Aby rozpocząć wymykanie się wychwyconym RNP, dodaj 400 mikrolitrów przygotowanego buforu elucyjnego biotyny do 400 mikrolitrów umytych, osiadłych kulek. Inkubować na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 1500 obr./min w temperaturze pokojowej przez 20 minut.Następnie inkubować na wytrząsarce orbitalnej z blokiem grzewczym przy 1500 obr./min i 65 stopniach Celsjusza przez 10 minut. Odwirować kulki w temperaturze 7800 razy G przez jedną minutę i zebrać wymykający się RNP. Dodaj 400 mikrolitrów świeżego buforu elucyjnego biotyny do kulek.Powtórz proces inkubacji i wirowania, aby zebrać drugą elucję i połączyć dwie eluty w jednej 15-mililitrowej probówce. Następnie dodać trzy objętości buforu rozcieńczającego do połączonych elucji RNP, aby zmniejszyć stężenie SDS. Używając ultrarurki filtracyjnej o pojemności 0,5 mililitra, skoncentruj próbkę do około 40 mikrolitrów, jak opisano w protokole tekstowym.Dodaj 0,5 mikrograma na mikrolitr RNazy A i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny, aby uwolnić RBP z usieciowanej RNazy. Zbierz dwa mikrolitry RBP w celu kontroli jakości. Podczas optymalizacji protokołów CARIC kluczowe znaczenie mają etapy kontroli jakości.Reprezentatywna kontrola jakości próbek oznaczonych etykietą "kliknij" jest przeprowadzana za pomocą analiz fluorescencyjnych w żelu. Tylko podwójnie znakowana próbka wykazuje silne pasmo rozmazu o wysokiej masie cząsteczkowej, które reprezentuje sygnał usieciowanych RNP. Sygnał RNP jest znoszony przez pominięcie czterech SU lub EU.It może być również zniesiony przez trawienie za pomocą RNazy, A.In niektórych przypadkach obserwuje się silne rozmazane prążki w próbce kontrolnej bez czterech SU.To pasmo reprezentuje znakowaną nieusieciowaną RNazę, która w większości przypadków ulega degradacji podczas innaturyzacji cieplnej. Kontrola jakości danych sondy powinowactwa jest oceniana za pomocą analizy western blot, która pokazuje sygnały biotyny w próbkach zarówno przed, jak i po pulldown. Analiza barwienia srebrem wychwyconych RBP ujawnia, że w przypadku komórek HeLa ogólna całkowita skuteczność wychwytywania wynosi od 0,05 do 0,1 procent białek wejściowych.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że RNazy są wrażliwe na rybonukleazy. Utrzymuj środowisko eksperymentalne tak czyste, jak to możliwe, aby zmniejszyć degradację RNazy. Po tej procedurze można przeprowadzić identyfikację almake białek za pomocą spektrometrii mas w celu ujawnienia białek wiążących żelazo.Po opracowaniu, technika CARIC utoruje drogę do bardziej wszechstronnego zrozumienia regulacji OT transkrypcji postalnej w działaniu.

capture-identification-rna-binding-proteins-using-click-chemistry

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Transkrypty RNA podlegają rozległej regulacji potranskrypcyjnej, w której pośredniczy wiele trans-działających białek wiążących RNA (RBP). W tym miejscu przedstawiamy uogólnioną metodę precyzyjnej identyfikacji w skali całego transkryptomu miejsc wiązania RNA RBP.

PAR-CliP - metoda identyfikacji miejsc wiązania białek wiążących RNA w całym transkryptomie

Ten film demonstruje test in vitro do ekstrakcji RNA w celu identyfikacji białek wiążących RNA (RBP), które oddziałują z sekwencjami elementów bogatych w adenylan-urydylan (ARE) w mRNA. Docelowe RBP z lizatu komórkowego miesza się z sondą RNA w celu utworzenia kompleksów RNA-białko. Kompleksy izoluje się poprzez oczyszczanie powinowactwa z wykorzystaniem powinowactwa znacznika destiobiotyny sondy RNA do kulki magnetycznej znakowanej streptawidyną.

Test ściągania białka RNA w celu wyizolowania białek wiążących RNA poprzez ekstrakcję powinowactwa

W tym filmie opisujemy systematyczną ewolucję ligandów metodą wykładniczego wzbogacania (SELEX) w celu identyfikacji specyficznych sekwencji wiążących RNA dla docelowego białka. Białko jest inkubowane z dużą pulą randomizowanych sekwencji RNA, a sekwencje RNA wiążące białka są izolowane, amplifikowane PCR i sekwencjonowane w celu zidentyfikowania ich miejsc wiązania białek.

Test wiązania in vitro oparty na SELEX w celu identyfikacji interakcji RNA-białko

Protokół pull-down RNA jest tutaj zoptymalizowany do wykrywania interakcji między białkami wiążącymi RNA (RBP) a niekodującymi i kodującymi RNA. Fragment RNA z receptora androgenowego (AR) został wykorzystany jako przykład, aby zademonstrować, jak odzyskać jego RBP z listanu pierwotnych brązowych adipocytów.

Wykrywanie białek wiążących RNA metodą in vitro RNA pull-down w hodowli adipocytów

Interakcje RNA-białko leżą u podstaw wielu procesów komórkowych. W tym miejscu opisujemy metodę in vivo do izolowania specyficznego RNA i identyfikowania nowych białek, które są z nim związane. Może to rzucić nowe światło na to, w jaki sposób RNA są regulowane w komórce.

Izolacja nowych białek wiążących RNA metodą RaPID

Opisujemy protokół do identyfikacji białek wiążących RNA i mapowania ich regionów wiążących RNA w żywych komórkach za pomocą fotosieciowania za pośrednictwem UV i spektrometrii mas.

Przygotowanie próbki do identyfikacji regionów wiążących RNA w oparciu o spektrometrię mas

Tutaj prezentujemy protokół wzbogacania endogennych miejsc wiązania RNA lub "śladów" kompleksów RNA:białko (RNP) z komórek ssaków. Podejście to obejmuje dwie immunoprecypitacje podjednostek RNP i dlatego nazywa się immunoprecypitacją RNA w tandemie (RIPiT).

Identyfikacja śladów RNA:Kompleksy białkowe poprzez immunoprecypitację RNA w tandemie, a następnie sekwencjonowanie (RIPiT-Seq)

Tutaj prezentujemy zmodyfikowany protokół CLIP-seq o nazwie FbioCLIP-seq z tandemowym oczyszczaniem FLAG-biotyna w celu określenia celów RNA białek wiążących RNA (RBP) w komórkach ssaków.

Profilowanie interakcji białko-RNA w całym transkryptomie poprzez sieciowanie krzyżowe i immunoprecypitację za pośrednictwem tandemowego oczyszczania FLAG-biotyna

Kinetyczne sieciowanie i analiza cDNA to metoda, która pozwala badać dynamikę interakcji białko-RNA w żywych komórkach w wysokiej rozdzielczości czasowej. Tutaj protokół jest szczegółowo opisany, w tym wzrost komórek drożdży, sieciowanie UV, zbieranie, oczyszczanie białek i etapy przygotowania biblioteki sekwencjonowania nowej generacji.

Monitorowanie dynamiki interakcji białko-RNA in vivo w wysokiej rozdzielczości czasowej przy użyciu χCRAC

Tutaj prezentujemy zoptymalizowaną metodę in vitro do odkrywania, ilościowego i walidacji interaktorów białkowych specyficznych sekwencji RNA, przy użyciu całkowitego ekstraktu białkowego z komórek ludzkich, kulek streptawidyny pokrytych biotynylowanym RNA oraz analizy spektrometrii mas.

Zoptymalizowana ilościowa analiza typu pull-down białek wiążących RNA przy użyciu krótkiego biotynylowanego RNA

Poznaj metodę CARIC do identyfikacji białek wiążących RNA w komórkach HeLa. Ta technika chemii kliknięcia umożliwia kompleksową analizę interakcji białek z RNA kodującym i niekodującym.

Wychwytywanie i identyfikacja białek wiążących RNA za pomocą strategii wychwytywania interaktomu RNA wspomaganej chemią kliknięcia (CARIC) (Wideo) | JoVE Journal

Wychwytywanie i identyfikacja białek wiążących RNA za pomocą strategii wychwytywania interaktomu RNA wspomaganej chemią kliknięcia (CARIC)

Przeglądaj więcej filmów