Name: Jak określić ilościowo frakcję fotoaktywowanych białek fluorescencyjnych luzem i w żywych komórkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Poznaj metodę ilościowego oznaczania frakcji fotoaktywowanych białek fluorescencyjnych w żywych komórkach. Protokół wykorzystuje genetycznie sprzężone białka PA-GFP i PA-Cherry, umożliwiając precyzyjną analizę efektywności fotoaktywacji w badaniach neurobiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować laboratorium Dorigo i Neuroscience Imaging Service w Stanford University School of Medicine za dostarczenie sprzętu i przestrzeni dla tego projektu.

1. Budowa plazmidu
<ol>
	<li>Generuj dwukolorowe sondy fuzyjne. Użyj wektora ekspresji komórek ssaków (patrz Spis materiałów), w którym mCherry112 i PA-mCherry113 zostały wstawione z miejscami restrykcji AgeI i BsrGI.</li>
	<li>Zamów niestandardowe oligonukleotydy w celu amplifikacji monomerycznych wariantów eGFP i PA-eGFP zawierających mutację A206K, tj. mEGFP i PA-mEGFP14 bez kodonu stop jako fragment SalI-BamHI. Użyj N-końcowego startera 5'-AAT, TAA, CAG, TGG, ACG, ATG, GTG, AGC, AAG, GGC, GAG, G 3', i C-końcowego startera, 5'-AAT, ATA, TGG, ATC, CCG, CTT, GTA, CAG, CTC, CAT, GC, 3' i wstaw ten fragment SalI-BamHI do miejsca wielokrotnego klonowania wektora wyrażenia. W ten sposób powstanie łącznik pięciu aminokwasów RNPPV między zielonym i czerwonym białkiem fluorescencyjnym. W pozostałej części tego artykułu będziemy odnosić się do chimer fluoroforowych jako GFP - Wiśnia, PA-GFP - Wiśnia i GFP - PA - Wiśnia. 
	Uwaga: Sprzężenie fluoroforów i tworzenie wewnętrznych linijek do oceny wydajności fotoaktywacji można wykonać za pomocą dowolnej spektralnie odrębnej pary fluoroforów, np. superfolder PA-GFP 15/ PA-TagRFP 16, itd. Wiele fotoaktywowalnych białek fluorescencyjnych pochodzi z GFP. W związku z tym przedstawiona powyżej sekwencja startera może być wykorzystana do wielu białek fluorescencyjnych do skonstruowania chimery fluoroforowej w wektorze ekspresji komórki ssaków.</li>
</ol>
2. Hodowla komórkowa i transfekcja
<ol>
	<li>Użyj dowolnej standardowej linii komórkowej, takiej jak HeLa, NRK, Cos-7 lub określonej linii komórkowej, która ma być wykorzystana do określonych eksperymentów fotoaktywacyjnych. Użyj DMEM (uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą i 2 mM glutaminą) i trypsyny bez czerwieni fenolowej (patrz Tabela materiałów) w celu zmniejszenia fluorescencji tła.</li>
	<li>Odłącz komórki zlewającej się hodowli trypsyną, policz liczbę komórek w zawiesinie komórkowej za pomocą komory Neubauera i wysiewaj 5 000 – 10 000 komórek na studzienkę. Alternatywnie należy użyć 1 kropli z pipety o pojemności 2 ml zawiesiny komórek o pojemności 10 ml z konfluentnej kultury komórkowej wyhodowanej w kolbie do hodowli komórek T 25 lub 3 kropli z 5 ml zawiesiny komórek z konfluentnej kultury wyhodowanej w kolbie do hodowli komórek T 12,5.</li>
	<li>Hoduj komórki w 8-dołkowych komorach ze szkłem nakrywkowym #1.0 (patrz tabela materiałów) do fluorescencji mikroskopii żywych komórek.</li>
	<li>Komórki transfekcyjne 24 godziny po posiewie przy użyciu dostępnych w handlu odczynników (patrz Tabela materiałów) zgodnie z protokołem dystrybutora z chimerami GFP - Cherry, PA-GFP - Cherry i GFP - PA-Cherry.</li>
	<li>Obrazowanie komórek po łącznie 20 godzinach od transfekcji, aby umożliwić ekspresję białka, fałdowanie i dojrzewanie.</li>
</ol>
3. Obrazowanie i fotoaktywacja
<ol>
	<li>Komórki obrazowania w nawilżonej i ogrzewanej komorze środowiskowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby zbuforować pożywkę komórkową o fizjologicznym pH i uczynić ją niezależną od CO2, dodaj 20 mM HEPES lub użyj gazu CO2 ustawionego na przepływ 5%.</li>
	<li>Po pierwsze, komórki obrazu wyrażające GFP-konstrukt wiśniowy. Ustawia parametry, które definiują zintegrowane w czasie natężenie lasera na piksel w obrazie konfokalnym, tj. czas przebywania piksela w mikrosekundach, transmisję akustyczno-optycznego filtra przestrajalnego (AOTF) w procentach i zoom cyfrowy. 
	Uwaga: Użycie 60-krotnego obiektywu i 3-krotnego zoomu cyfrowego umożliwia obrazowanie komórki w całości, zapewniając jednocześnie wystarczające powiększenie. Ustaw czas przebywania pikseli na 2-4 μs i transmisję AOTF dla lasera 488 nm i 561 nm tak, aby obrazy pokazywały dobry stosunek sygnału do szumu bez wybielania i bez pikseli wskazujących na nasycenie intensywności fluorescencji.</li>
	<li>Obraz, przy użyciu ustawionej mocy lasera, transmisji AOTF, czasu przebywania pikseli i zoomu cyfrowego, 15-20 komórek wyrażających GFP-Cherry.</li>
	<li>Następnie obraz z tą samą ustawioną mocą lasera, czasem przebywania pikseli, transmisją AOTF i komórkami zoomu cyfrowego wyrażającymi GFP - PA-Cherry i PA-GFP - Cherry. Wyszukaj komórki wyrażające ekspresję odpowiednio w kanale zielonym lub czerwonym. Unikaj długiej ekspozycji komórek podczas poszukiwania komórek wykazujących ekspresję, aby nie wybielać białek fluorescencyjnych.</li>
	<li>Skonfiguruj miniszereg czasowy z jednym obrazem przed aktywacją i trzema obrazami po aktywacji. Obrazy po aktywacji pomogą zidentyfikować potencjalne przejściowe stany ciemności spowodowane ekspozycją na światło UV. 
	Uwaga: W naszych rękach zmiany w wykrywanej intensywności fluorescencji spowodowane przejściowymi stanami ciemnymi wynosiły <1% i można je pominąć, ale te ciemne stany powinny być oceniane dla każdej konfiguracji eksperymentalnej.</li>
	<li>Aby określić skuteczność fotoaktywacji, tj. frakcję PA-FP, która jest włączona jako fluorescencyjna, w konkretnych eksperymentach fotoaktywacyjnych, które zostały już ustalone, zastosuj te same ustawienia fotoaktywacji do 15-20 komórek, które wyrażają wprowadzone tutaj wewnętrzne linijki i przystąp do analizy obrazu (sekcja 4). Jeśli zaczynasz organizować eksperymenty z fotoaktywacją, znajdź tutaj kilka różnych ustawień opartych na naszych eksperymentalnych doświadczeniach z PA-GFP i PA-Cherry; Zmodyfikuj w razie potrzeby.
	<ol>
		<li>W celu natychmiastowej fotoaktywacji PA-GFP i PA-Cherry za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (CLSM), należy zastosować 90 μW światła laserowego 405 nm odpowiednio w 3 lub 5 iteracjach. 
		Uwaga: Dzięki naszej mikroskopijnej konfiguracji, wykorzystującej 38% transmisję AOTM i czas przebywania pikseli 2 μs, zmierzyliśmy moc lasera 405 nm w trybie skanowania liniowego na soczewce obiektywu. Przy tych ustawieniach około 8% i 16% ekspresji PA-GFP i PA-Cherry może być fotoaktywowane w celu uzyskania fluorescencji. Cała seria miareczkowania z wykorzystaniem CLSM do natychmiastowej fotoaktywacji została opublikowana wcześniej17.</li>
		<li>Jeśli wyższa frakcja fotoaktywowanych fluoroforów PA-GFP i PA-Cherry jest korzystna, np. w celu uzyskania wyższego stosunku sygnału do szumu, a fotoaktywacja nie musi być natychmiastowa, zastosuj światło laserowe o mocy 40 μW 405 nm z czasem przebywania piksela 2 μs i transmisją AOTF na 650 iteracji. Następnie fotoaktywacja zajmie do 4 minut, a nie tylko 1-2 sekundy, ale skuteczność fotoaktywacji dla PA-GFP wyniesie 29% zamiast 8%, co pozwoli na uzyskanie wyższego stosunku sygnału do szumu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jeśli dostępny jest mozaikowy system oświetlenia cyfrowego, który zawiera układy mikroluster w przestrzennym modulatorze światła, światło laserowe 405 nm może być użyte do fotoaktywacji w szerokim polu. Pozwala to na sprawną fotoaktywację w ciągu milisekund. 
	Uwaga: Przy mocy lasera 1,6 mW mierzonej na soczewce obiektywu i czasie naświetlania 250 ms, 29% PA-GFP może być fotoaktywowane do fluorescencji.</li>
	<li>Obraz z dowolnie ustawionymi parametrami fotoaktywacji 15-20 komórek eksprymujących odpowiednio PA-GFP-Cherry i GFP—PA-Cherry.</li>
	<li>Ponieważ pH, reaktywne formy tlenu i inne czynniki środowiskowe mogą wpływać na wydajność fotoaktywacji, ważna może być ocena skuteczności fotoaktywacji PA-FP w odpowiednim subkomórkowym mikrośrodowisku, w którym znajduje się białko będące przedmiotem zainteresowania. Poprzez sprzężenie chimer fluoroforowych z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania, tak jak zrobili to autorzy z białkiem błony plazmatycznej VSVG 18, można ocenić skuteczność fotoaktywacji w określonym kompartmencie subkomórkowym będącym przedmiotem zainteresowania.</li>
</ol>
4. Analiza obrazu i algorytm ratiometrycznej oceny efektywności fotoaktywacji na podstawie intensywności
<ol>
	<li>Analizę obrazu można przeprowadzić za pomocą platform przetwarzania obrazów typu open source ImageJ lub Fiji. Określ intensywność fluorescencji tła w komórkach nietransfekowanych w kanale zielonym (B1) i czerwonym (B2). Unikaj obszarów okołojądrowych lub innych obszarów wykazujących zwiększoną autofluorescencję.</li>
	<li>Aby określić intensywność fluorescencji w transfekowanej komórce, obrysuj ciało komórki za pomocą narzędzia do zaznaczania odręcznego. Ponownie, unikaj obszarów okołojądrowych lub innych obszarów wykazujących autofluorescencję.</li>
	<li>Odejmij tło od zmierzonej intensywności fluorescencji w każdym kanale. 
	IG = IGreen_measured – B1 
	IR = IRed_measured – B2</li>
	<li>Użyj konstruktu GFP-Cherry, aby obliczyć stosunek czerwieni do zieleni (RtoGr) i skorygować wygaszanie donorów z powodu transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET). Wydajność FRET E została określona na 0,3 w poprzednich eksperymentach dla konstruktu GFP-Cherry przy użyciu tego samego łącznika aminokwasów między dwoma fluoroforami18. 
	RtoGr = (IRed_measured – B2) / (IGreen_measured – B1) 
	RtoGrcorr = RtoGr * (1 – E) 
	Uwaga: W tym podejściu opartym na intensywności wygaszanie donorów dla mEGFP i PA-mGFP może być różne ze względu na możliwe odrębne właściwości spektralne, które nie zostały scharakteryzowane. Szybkość FRET (kET) i odległość Foerstera (R0) zależą od wydajności kwantowej donora, która nie została określona dla mEGFP i PA-mGFP.</li>
	<li>Użyj konstruktu GFP-PA-Cherry, aby ocenić frakcję fotoaktywowanego PA-Cherry. Określ oczekiwaną intensywność fluorescencji PA-Cherry, mnożąc zmierzoną niegaszoną intensywność zielonej fluorescencji konstruktu GFP-PA-Cherry przed fotoaktywacją ze skorygowanym stosunkiem czerwieni do zieleni (korr RtoGr). 
	IRed_expected = (IGreen_measured – B1) * RtoGrcorr 
	Uwaga: Jak wskazano powyżej, jasność molekularna zawsze włączonego FP i fotoaktywowanego FP może się różnić. Zobacz Dyskusję, aby uzyskać więcej informacji na temat sposobu uwzględniania tych różnic.</li>
	<li>Obliczyć skuteczność fotoaktywacji PA-Cherry jako ułamek zmierzonej intensywności czerwonej fluorescencji po fotoaktywacji i oczekiwanej intensywności fluorescencji w kanale czerwonym. 
	(FPA-Wiśnia) = (IRed_measured – B2) / IRed_expected</li>
	<li>Użyj konstruktu PA-GFP-Cherry, aby ocenić frakcję fotoaktywowanego PA-GFP. Określ oczekiwaną intensywność fluorescencji PA-GFP, dzieląc zmierzoną intensywność czerwonej fluorescencji konstruktu PA-GFP-Cherry przed fotoaktywacją przez stosunek czerwieni do zieleni (RtoGr). W tym przypadku RtoGr nie musi być korygowany o hartowanie dawcy, ponieważ GFP i PA-GFP podlegają hartowaniu dawcy do tej samej ilości. 
	IGreen_expected = (IRed_measured – B2) / RtoGr</li>
	<li>Obliczyć skuteczność fotoaktywacji PA-GFP jako ułamek zmierzonej intensywności zielonej fluorescencji po fotoaktywacji i oczekiwanej intensywności fluorescencji w kanale zielonym. 
	(FPA-GFP) = (IGreen_measured – B1) / IGreen_expected</li>
</ol>

<ol><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).</li>
<li>Renz, M., Lippincott-Schwartz, J. Ch. 9. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRenz%2C+M+%22The+Fluorescent+Protein+Revolution+Series+in+Cellular+and+Clinical+Imaging%22">The Fluorescent Protein Revolution Series in Cellular and Clinical Imaging</a>. Day, R. N., Davidson, M. W. , CRC Press. 201-228 (2014).</li>
<li>Shcherbakova, D. M., Sengupta, P., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photocontrollable+fluorescent+proteins+for+superresolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Photocontrollable fluorescent proteins for superresolution imaging.</a> Annual Review of Biophysics. , 303-329 (2014).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li>
<li>Henderson, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+the+photoactivatable+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of the photoactivatable green fluorescent protein.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (12), 4176-4177 (2009).</li>
<li>Subach, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivation+mechanism+of+PAmCherry+based+on+crystal+structures+of+the+protein+in+the+dark+and+fluorescent+states%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Photoactivation mechanism of PAmCherry based on crystal structures of the protein in the dark and fluorescent states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21097-21102 (2009).</li>
<li>Wiedenmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EosFP%2C+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (45), 15905-15910 (2004).</li>
<li>Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mKikGR%2C+a+monomeric+photoswitchable+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein.</a> PLoS One. 3 (12), e3944(2008).</li>
<li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
<li>Subach, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+mCherry+for+high-resolution+two-color+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy.</a> Nature Methods. 6 (2), 153-159 (2009).</li>
<li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li>
<li>Slocum, J. D., Webb, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Double+Decarboxylation+in+Superfolder+Green+Fluorescent+Protein+Leads+to+High+Contrast+Photoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">A Double Decarboxylation in Superfolder Green Fluorescent Protein Leads to High Contrast Photoactivation.</a> Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (13), 2862-2868 (2017).</li>
<li>Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+monomeric+photoactivatable+red+fluorescent+protein+for+two-color+super-resolution+sptPALM+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6481-6491 (2010).</li>
<li>Renz, M., Wunder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+rulers+to+assess+fluorescent+protein+photoactivation+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Internal rulers to assess fluorescent protein photoactivation efficiency.</a> Cytometry A. , (2017).</li>
<li>Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+the+asialoglycoprotein+receptor+deciphered+by+ensemble+FRET+imaging+and+single-molecule+counting+PALM+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), E2989-E2997 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Do tej pory nie istniała żadna metoda pozwalająca na zbiorcze określenie frakcji PA-FP wyrażanej w żywych komórkach, która jest fotoaktywowana jako fluorescencyjna. Przedstawiony protokół może być stosowany dla dowolnej spektralnie odrębnej pary białek fluorescencyjnych. Chociaż podejście to zostało tutaj zilustrowane w przypadku nieodwracalnych PA-FP PA-GFP i PA-Cherry, w zasadzie ma również zastosowanie do białek fotokonwertowalnych. Widmowo odrębne białko fluorescencyjne musi być jednak starannie dobrane, aby zminimal...

W 2002 roku opisano pierwsze szeroko stosowane białka fluorescencyjne fotoaktywowane (PA-GFP1) i fotokonwertowalne (Kaede2). Te białka fluorescencyjne zakreślacza optycznego zmieniają swoje właściwości widmowe po naświetleniu światłem UV, tj. stają się jasne (fotoaktywowane białka fluorescencyjne, tj. PA-FP) lub zmieniają kolor (fotokonwertowalne FP). Do tej pory opracowano kilka odwracalnych i nieodwracalnych fotoaktywowalnych i fotokonwertowalnych białek fluorescencyjnych3,4. W badaniach zespołowych lub masowych zakreślacze optyczne były używane do badania dynamiki całych komórek lub białek oraz połączeń przedziałów subkomórkowych. Co więcej, zakreślacze optyczne umożliwiły stosowanie technik obrazowania w superrozdzielczości opartych na pojedynczych cząsteczkach, takich jak PALM5 i FPALM6.
Chociaż procesyfotochemiczne podczas fotoaktywacji lub -konwersji zostały opisane dla wielu rozświetlaczy optycznych, a nawet struktury krystalograficzne przed i po fotoaktywacji zostały udostępnione7,8, podstawowe zdjęciefizyczne Mechanizm fotoaktywacji i konwersji nie jest do końca poznany. Co więcej, do tej pory istnieją tylko przybliżone szacunki wydajności fotoaktywacji i -konwersji, czyli frakcji białek fluorescencyjnych wyrażonych w rzeczywistości, które są fotokonwertowane lub fotoaktywowane na fluorescencyjne. Opisano badania zespołowe in vitro, w których określono ilościowo przesunięcie widm absorpcji oraz ilość natywnego i aktywowanego białka w żelu9,10,11.
Tutaj prezentujemy protokół z wykorzystaniem chimer białek fluorescencyjnych do oceny frakcji fotoaktywowanych białek fluorescencyjnych w większości i w żywych komórkach. Za każdym razem, gdy pracujemy z genetycznie kodowanymi białkami fluorescencyjnymi, bezwzględna ilość wyrażanego białka różni się w zależności od komórki i jest nieznana. Jeśli jedna komórka wykazująca ekspresję PA-FP wykazuje jaśniejszy sygnał po fotoaktywacji niż inna komórka, nie można odróżnić, czy ten jaśniejszy sygnał jest spowodowany wyższą ekspresją PA-FP, czy bardziej wydajną fotoaktywacją PA-FP. Aby ustandaryzować poziom ekspresji w komórkach, wprowadzamy wewnętrzne linijki genetycznie sprzężonych spektralnie odrębnych białek fluorescencyjnych. Poprzez sprzężenie informacji genetycznej fotoaktywowanego białka fluorescencyjnego z widmowo odrębnymi, zawsze włączonymi białkami fluorescencyjnymi, tworzone są wewnętrzne linijki, które nadal będą wyrażane w nieznanej całkowitej ilości, ale w stałej i znanej względnej ilości 1:1. Strategia ta pozwala na ilościową charakterystykę różnych schematów fotoaktywacji światła UV, tj. ocenę względnej ilości PA-FP, które mogą być fotoaktywowane za pomocą różnych trybów fotoaktywacji, a tym samym pozwala na zdefiniowanie schematów fotoaktywacji, które są bardziej skuteczne niż inne. Ponadto strategia ta pozwala w zasadzie na ocenę bezwzględnej kwantyfikacji fotoaktywowanej frakcji PA-FP. W tym celu ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że prezentowane badania zespołowe są oparte na intensywności, co sprawia, że analiza jest bardziej złożona, jak określono w niniejszym protokole. Parametry określające zmierzoną intensywność fluorescencji, tj. różna jasność molekularna, widma absorbancji i emisji oraz efekty FRET, muszą być brane pod uwagę przy porównywaniu intensywności fluorescencji różnych białek fluorescencyjnych.
Przedstawiona ilościowa kwantyfikacja efektywności fotoaktywacji oparta na intensywności jest przykładem dla PA-GFP i PA-Cherry w żywych komórkach, ale w zasadzie ma szerokie zastosowanie i może być użyta dla dowolnego fotoaktywowanego białka fluorescencyjnego w dowolnych warunkach eksperymentalnych.

<table><tbody><tr><td>pEGFP-N1 wektor ekspresji komórek ssaków</td><td>Clontech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM bez czerwieni fenolowej</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11054020</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna bez czerwieni fenolowej</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Komory 8-dołkowe LabTek #1.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12565470</td><td></td></tr><tr><td>Fugene 6</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr></tbody></table>

jak określić ilościowo frakcję fotoaktywowanych białek fluorescencyjnych luzem i w żywych komórkach

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Fotoaktywowane i konwertowalne białka fluorescencyjne (PA-FPs) zostały użyte w mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek do analizy dynamiki komórek i zespołów białkowych. Do tej pory nie była dostępna żadna metoda ilościowego określania ilościowo i w żywych komórkach, ile ekspresji PA-FP jest fotoaktywowanych do fluorescencji.
Tutaj prezentujemy protokół obejmujący wewnętrzne linijki, tj. genetycznie sprzężone spektralnie odrębne (fotoaktywowane) białka fluorescencyjne, aby ratiometrycznie określić frakcję wszystkich PA-FP wyrażonych w komórce, które są włączone jako fluorescencyjne. Korzystając z tego protokołu, pokazujemy, że różne tryby fotoaktywacji dawały różną wydajność fotoaktywacji. Krótka fotoaktywacja o dużej mocy za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (CLSM) skutkowała do czterech razy niższą wydajnością fotoaktywacji niż setki ekspozycji na niskim poziomie zastosowanych przez CLSM lub krótki impuls zastosowany przez oświetlenie szerokokątne. Chociaż protokół ten został tutaj zilustrowany dla (PA-)GFP i (PA-)Cherry, w zasadzie można go zastosować do dowolnej spektralnie odrębnej pary fotoaktywowanych lub fotokonwertowalnych białek fluorescencyjnych i dowolnej konfiguracji eksperymentalnej.

Przedstawiony tutaj protokół obrazuje ratiometryczną kwantyfikację frakcji białek fluorescencyjnych, które zostają fotoaktywowane do stanu fluorescencji (Rycina 1). Frakcja ta różni się w zależności od trybu fotoaktywacji.
Typowy wynik uzyskano, stosując krótkotrwałą fotoaktywację o wysokiej mocy z wykorzystaniem konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego (CLSM), co przedstawiono na <strong cla...

Tutaj prezentujemy protokół, który obejmuje genetycznie sprzężone, spektralnie odrębne fotoaktywowalne i fluorescencyjne białka. Te fluorescencyjne chimery białkowe pozwalają na ilościowe określenie frakcji PA-FP, która jest fotoaktywowana, jako fluorescencyjna, tj. wydajność fotoaktywacji. Protokół ujawnia, że różne tryby fotoaktywacji dają różną skuteczność fotoaktywacji.

Jak określić ilościowo frakcję fotoaktywowanych białek fluorescencyjnych luzem i w żywych komórkach

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Przedstawiamy tutaj protokół, który obejmuje genetycznie sprzężone, spektralnie odrębne, fotoaktywowane i fluorescencyjne białka. Te wewnętrzne linijki umożliwiają ilościowe określenie frakcji PAFP, która jest aktywowana fotoaktywnie, aby była fluorescencyjna. Do tej pory nie była dostępna żadna metoda pozwalająca na ilościowe określenie ilości wyrażonego PAFP w komórkach żyjących, które są aktywowane fotoaktywem w celu fluorescencji. Przedstawione określenie ilościowe skuteczności fotoaktywacji jest przykładem dla PA-GFP i PA Cherry w żywych komórkach, ale w zasadzie ma szerokie zastosowanie i może być stosowane do dowolnego fotoaktywowanego białka fluorescencyjnego w dowolnych warunkach eksperymentalnych. Podczas pracy z genetycznie kodowanymi białkami fluorescencyjnymi bezwzględna ilość wyrażanych białek różni się w zależności od komórki i jest nieznana. Aby ustandaryzować ekspresję między komórkami, wprowadzamy wewnętrzne linijki genetycznie sprzężonych spektralnie odrębnych białek fluorescencyjnych. Poprzez sprzężenie informacji genetycznej fotoaktywowanego białka fluorescencyjnego z widmowo odrębnym, zawsze włączonym białkiem fluorescencyjnym, tworzone są wewnętrzne linijki, które nadal będą wyrażane do nieznanej całkowitej ilości, ale w stałej, znanej względnej ilości jeden do jednego. Aby rozpocząć konstruowanie plazmidów zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Również hodowla w standardowej linii komórkowej w pożywce perspektywicznej przy użyciu wersji wolnej od czerwieni fenolowej. Gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia eksperymentu, zbierz komórki za pomocą trypsyny bez czerwieni fenolowej, aby zmniejszyć kwitnienie tła. Po pobraniu należy napełnić pipetę o pojemności 2 ml zawiesiną komórek z konfluentnej kultury komórkowej wyhodowanej w kolbie do hodowli komórek T 12,5. Dodaj jedną kroplę do każdej komory ośmiokomorowego szkiełka szkiełkowego. Inkubować szkiełko w standardowych warunkach hodowli komórkowej przez 24 godziny. Następnie należy przetransfekować komórki za pomocą komercyjnych odczynników zgodnie z protokołem dystrybutorów. Transfekuj komórki za pomocą chimer GFP Cherry, PA-GFP Cherry i GFPPA Cherry. Następnie zwróć komórki do inkubatora, aby umożliwić ekspresję białka, fałdowanie i dojrzewanie. Po upływie łącznie 20 godzin od transfekcji przenieść komórki do etapu konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w nawilżoną i podgrzewaną komorę środowiskową wstępnie podgrzaną do 37 stopni

how-to-quantify-fraction-photoactivated-fluorescent-proteins-bulk

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejszy protokół opisuje ogólne podejście do przeprowadzania fotokonwersji białek fluorescencyjnych przy użyciu konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego. Opisujemy procedury fotokonwersji oczyszczonych próbek białek, a także optycznego uwydatniania z użyciem dwóch sond w żywych komórkach z wykorzystaniem mOrange2 i Dronpa.

Fotokonwersja oczyszczonych białek fluorescencyjnych i optyczne wyróżnianie z użyciem podwójnej sondy w żywych komórkach

Niniejszy protokół opisuje sposób obrazowania oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem testu bliskości opartego na FRET.

Obrazowanie oddziaływań białko-białko in vivo

Wykorzystując system obrazowania z dwufotonową mikroskopią o rozdzielczości spektralnej, uzyskano mapy wydajności transferu energii rezonansowej Förstera (FRET) na poziomie pikseli dla komórek ekspresujących receptory błonowe, w których przypuszcza się tworzenie kompleksów homo-oligomerycznych. Na podstawie map wydajności FRET możliwe jest oszacowanie informacji stechiometrycznych dotyczących badanego kompleksu oligomeru.

In vivo ilościowe oznaczanie oddziaływań receptorów sprzężonych z białkiem G z wykorzystaniem spektroskopowo rozdzielczej mikroskopii dwufotonowej

Badania biomolekuł in vivo są kluczowe dla zrozumienia funkcji molekularnej w kontekście biologicznym. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę pozwalającą na internalizację biomolekuł fluorescencyjnych, takich jak DNA czy białka, do żywych mikroorganizmów. Przedstawiono i omówiono również analizę danych in vivo zarejestrowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Internalizacja i obserwacja biomolekuł fluorescencyjnych w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji

Dokładna kwantyfikacja zdarzeń związanych z transportem pęcherzykowym często dostarcza kluczowych informacji na temat ról poszczególnych białek i skutków mutacji. W pracy przedstawiono metody wykorzystania superekliptycznej pHluoryny, wrażliwego na pH wariantu GFP, jako narzędzia do ilościowego oznaczania zdarzeń endocytarnych w żywych komórkach za pomocą ilościowej mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej.

Zastosowania pHluorin do ilościowej, kinetycznej i wysokoprzepustowej analizy endocytozy u pączkujących drożdży

Znakowanie domeny zewnątrzkomórkowej białka błonowego za pomocą wrażliwego na pH fluoroforu, superekliptycznej pHluoryny (SEP), pozwala na określenie subkomórkowej lokalizacji, ekspresji i transportu. Obrazowanie białek znakowanych SEP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) umożliwia ilościowe określenie poziomów białek w obwodowej ER i błonie plazmatycznej.

Wykorzystanie receptorów znakowanych pHluoryną do monitorowania lokalizacji subkomórkowej i transportu

Ten manuskrypt opisuje metodę wizualizacji i ilościowego określania zlokalizowanych zdarzeń translacji w subkomórkowych przedziałach. Podejście zaproponowane w tym manuskrypcie wymaga podstawowego systemu obrazowania konfokalnego i odczynników oraz jest szybkie i opłacalne.

Immunofluorescencja ilościowa do pomiaru globalnej translacji zlokalizowanej

Opisujemy, jak techniki mikro- i fotomanipulacji, takie jak FRAP i fotoaktywacja, umożliwiają określenie parametrów ruchliwości i czasoprzestrzennej dynamiki białek w migrujących komórkach. Odczyty eksperymentalne obejmują dynamikę subkomórkową i obrót regulatorów ruchliwości lub leżącego u podstaw cytoszkieletu aktynowego.

Techniki mikromanipulacji pozwalające na analizę dynamiki morfogenetycznej i obrotu regulatorów cytoszkieletu

Efferocytoza, fagocytarne usuwanie komórek apoptotycznych, jest niezbędna do utrzymania homeostazy i jest ułatwiana przez receptory i szlaki sygnałowe, które pozwalają na rozpoznawanie, wchłanianie i internalizację komórek apoptotycznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół mikroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania efferocytozy i aktywności efferocytarnych szlaków sygnałowych.

Kwantyfikacja efektozy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych komórek

Ten protokół opisuje podejście oparte na spektroskopii fluktuacji fluorescencji, mające na celu badanie interakcji między białkami pośredniczącymi w interakcjach komórka-komórka, tj. białkami zlokalizowanymi w połączeniach komórkowych, bezpośrednio w żywych komórkach. Zapewniamy szczegółowe wytyczne dotyczące kalibracji, akwizycji i analizy przyrządów, w tym korekty możliwych źródeł artefaktów.

Test spektroskopii fluktuacji fluorescencji interakcji białko-białko na styku komórka-komórka

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) pomiędzy dwiema cząsteczkami fluoroforu może być wykorzystany do badania interakcji białek w żywej komórce. W tym miejscu przedstawiono protokół pomiaru FRET w żywych komórkach poprzez wykrywanie uczulonej emisji akceptora i wygaszanie cząsteczki donorowej za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.

Ocena interakcji białek w żywych komórkach z emisją uwrażliwioną na FRET

Poznaj metodę ilościowego oznaczania frakcji fotoaktywowanych białek fluorescencyjnych w żywych komórkach. Protokół wykorzystuje genetycznie sprzężone białka PA-GFP i PA-Cherry, umożliwiając precyzyjną analizę efektywności fotoaktywacji w badaniach neurobiologicznych.

Jak określić ilościowo frakcję fotoaktywowanych białek fluorescencyjnych luzem i w żywych komórkach

Przeglądaj więcej filmów