Jak określić ilościowo frakcję fotoaktywowanych białek fluorescencyjnych luzem i w żywych komórkach
7 stycznia 2019
Tutaj prezentujemy protokół, który obejmuje genetycznie sprzężone, spektralnie odrębne fotoaktywowalne i fluorescencyjne białka. Te fluorescencyjne chimery białkowe pozwalają na ilościowe określenie frakcji PA-FP, która jest fotoaktywowana, jako fluorescencyjna, tj. wydajność fotoaktywacji. Protokół ujawnia, że różne tryby fotoaktywacji dają różną skuteczność fotoaktywacji.
Przedstawiamy tutaj protokół, który obejmuje genetycznie sprzężone, spektralnie odrębne, fotoaktywowane i fluorescencyjne białka. Te wewnętrzne linijki umożliwiają ilościowe określenie frakcji PAFP, która jest aktywowana fotoaktywnie, aby była fluorescencyjna. Do tej pory nie była dostępna żadna metoda pozwalająca na ilościowe określenie ilości wyrażonego PAFP w komórkach żyjących, które są aktywowane fotoaktywem w celu fluorescencji. Przedstawione określenie ilościowe skuteczności fotoaktywacji jest przykładem dla PA-GFP i PA Cherry w żywych komórkach, ale w zasadzie ma szerokie zastosowanie i może być stosowane do dowolnego fotoaktywowanego białka fluorescencyjnego w dowolnych warunkach eksperymentalnych. Podczas pracy z genetycznie kodowanymi białkami fluorescencyjnymi bezwzględna ilość wyrażanych białek różni się w zależności od komórki i jest nieznana. Aby ustandaryzować ekspresję między komórkami, wprowadzamy wewnętrzne linijki genetycznie sprzężonych spektralnie odrębnych białek fluorescencyjnych. Poprzez sprzężenie informacji genetycznej fotoaktywowanego białka fluorescencyjnego z widmowo odrębnym, zawsze włączonym białkiem fluorescencyjnym, tworzone są wewnętrzne linijki, które nadal będą wyrażane do nieznanej całkowitej ilości, ale w stałej, znanej względnej ilości jeden do jednego. Aby rozpocząć konstruowanie plazmidów zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Również hodowla w standardowej linii komórkowej w pożywce perspektywicznej przy użyciu wersji wolnej od czerwieni fenolowej. Gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia eksperymentu, zbierz komórki za pomocą trypsyny bez czerwieni fenolowej, aby zmniejszyć kwitnienie tła. Po pobraniu należy napełnić pipetę o pojemności 2 ml zawiesiną komórek z konfluentnej kultury komórkowej wyhodowanej w kolbie do hodowli komórek T 12,5. Dodaj jedną kroplę do każdej komory ośmiokomorowego szkiełka szkiełkowego. Inkubować szkiełko w standardowych warunkach hodowli komórkowej przez 24 godziny. Następnie należy przetransfekować komórki za pomocą komercyjnych odczynników zgodnie z protokołem dystrybutorów. Transfekuj komórki za pomocą chimer GFP Cherry, PA-GFP Cherry i GFPPA Cherry. Następnie zwróć komórki do inkubatora, aby umożliwić ekspresję białka, fałdowanie i dojrzewanie. Po upływie łącznie 20 godzin od transfekcji przenieść komórki do etapu konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w nawilżoną i podgrzewaną komorę środowiskową wstępnie podgrzaną do 37 stopni
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół wykorzystujący genetycznie sprzężone, spektralnie odróżnialne białka fotoaktywowalne i fluorescencyjne. Chimery te umożliwiają ilościowe określenie wydajności fotoaktywacji frakcji PA-FP, która staje się fluorescencyjna, co wykazuje, że różne tryby fotoaktywacji dają zróżnicowaną wydajność.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Technologia białek fluorescencyjnych
- Techniki fotoaktywacji
Wprowadzenie
- Białka fluorescencyjne są niezbędnymi narzędziami w badaniach biologicznych.
- Fotoaktywowalne białka fluorescencyjne umożliwiają czasowo-przestrzenną kontrolę fluorescencji.
- Zrozumienie wydajności fotoaktywacji jest kluczowe dla uzyskania dokładnych wyników eksperymentalnych.
- Różne metody aktywacji mogą wpływać na sprawność tych białek.
Cel badania
- Opracowanie protokołu oceny wydajności fotoaktywacji.
- Porównanie efektów różnych trybów fotoaktywacji.
- Zwiększenie użyteczności chimer białek fluorescencyjnych w badaniach.
Zastosowane metody
- Genetyczne sprzęganie białek fotoaktywowalnych i fluorescencyjnych.
- Ilościowe oznaczenie frakcji fotoaktywowanej.
- Porównanie różnych technik fotoaktywacji.
- Analiza wydajności fotoaktywacji.
Główne wyniki
- Różne tryby fotoaktywacji skutkowały zróżnicowaną wydajnością.
- Protokół pozwolił na pomyślną kwantyfikację wydajności fotoaktywacji.
- Chimery białek fluorescencyjnych wykazały znaczny potencjał w zastosowaniach badawczych.
- Uzyskane spostrzeżenia mogą być pomocne w przyszłych badaniach z wykorzystaniem białek fotoaktywowalnych.
Wnioski
- Badanie dostarcza cennego protokołu dla badaczy.
- Zrozumienie wydajności fotoaktywacji jest kluczowe dla projektowania eksperymentów.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wynikach w celu optymalizacji wykorzystania białek fluorescencyjnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Kwantyfikacja wydajności fotoaktywacji białek fluorescencyjnych wypełnia istotną lukę w obrazowaniu żywych komórek, umożliwiając bardziej wiarygodną interpretację dynamicznego zachowania białek. Możliwość ta wspiera walidację celów oraz opracowywanie testów poprzez dostarczenie mierzalnego parametru określającego działanie sond fotoaktywowalnych. Zwiększenie pewności predykcyjnej w zakresie aktywacji sondy redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w aplikacjach następczych, takich jak przesiewanie fenotypowe i translacyjne badania biomarkerów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe określenie frakcji białek fotoaktywowalnych, które zostały pomyślnie aktywowane.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ratiometryczną kontrolę wewnętrzną w celu normalizacji zmienności ekspresji między poszczególnymi komórkami.
- Wartość prognostyczna: Wspiera identyfikację wiodących kandydatów poprzez umożliwienie porównania wydajności fotoaktywacji dla różnych wariantów białek lub warunków.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Generuje zestandaryzowane, ilościowe odczyty wydajności fotoaktywacji w celu optymalizacji analizy.
- Powtarzalność: Wykorzystuje genetycznie sprzężone wewnętrzne miary w celu zapewnienia spójnej ekspresji względnej w powtórzeniach eksperymentalnych.
- Skalowalność: Kompatybilność z formatami populacyjnymi oraz dla pojedynczych żywych komórek, co umożliwia integrację z procesami wysokoprzepustowego screeningu (high-content screening).
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie wydajności fotoaktywacji z odczytami funkcjonalnymi w układach istotnych dla danej choroby.
- Pewność prognostyczna: Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym etapie prac z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ilościowe wyniki fotoaktywacji.
- Zgodność z biomarkerami: Wspiera opracowywanie fotoaktywowalnych reporterów do podłużnego śledzenia w modelach przedklinicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od wczesnej walidacji celu, poprzez rozwój testów analitycznych, aż po ocenę przedkliniczną, szczególnie w przypadkach, gdy wymagana jest spatiotemporalna kontrola aktywności białek.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez ilościowe określanie frakcji aktywowanych sond fotoaktywowalnych w żywych komórkach.
- Screening: Umożliwia standaryzację testów dzięki pomiarom ratiometrycznym, niezależnym od absolutnych poziomów ekspresji.
- Analityka: Zapewnia ilościowe pomiary zmiennej zależnej (frakcja fotoaktywacji), co pozwala na porównanie trybów aktywacji.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez umożliwienie standaryzowanej oceny reporterów fotoaktywowalnych w modelach chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny dowolnej pary spektralnie odróżnialnych fotoaktywowalnych białek fluorescencyjnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie wydajności sond fotoaktywowalnych i redukuje liczbę wyników fałszywie ujemnych w testach opartych na aktywacji.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację pomiędzy laboratoriami a układami eksperymentalnymi.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) przy wyborze sond dzięki dostarczeniu ilościowych danych o wydajności aktywacji.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację narzędzi fotoaktywowalnych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zwalidowane wskaźniki wydajności.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy z zakresu klonowania molekularnego w celu wytworzenia genetycznie sprzężonych chimer białek fluorescencyjnych.
- Zależne od dostępu do konfokalnej lub szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej z możliwością fotoaktywacji.
- Wymaga standaryzacji parametrów obrazowania i protokołów fotoaktywacji pomiędzy użytkownikami.
- Wymaga walidacji funkcjonalności chimer oraz separacji spektralnej w docelowej linii komórkowej.
- Ograniczone do systemów, w których genetyczne sprzężenie fluoroforów nie upośledza funkcji lub lokalizacji białka.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
1:20
Cell Culture and Transfection
2:31
Imaging and Photoactivation
5:45
Imaging Analysis and Algorithm for Ratiometric Intensity-based Quantification of Photoactivation Efficiency
9:09
Results: Maximizing Photoactivation Efficiency
9:50
Conclusion
