Odzyskiwanie biocytyny i rekonstrukcje 3D wypełnionych interneuronów CA2 w hipokampie

Ta metoda może pomóc w klasyfikacji podtypów neuronów i poszerzyć naszą wiedzę na temat funkcjonalnej mapy obwodów korowych. Protokół ten został zoptymalizowany w celu zachowania ultrastruktury neuronów i uzyskania doskonałej regeneracji zarówno dendrytycznych, jak i aksonalnych altan dendrytycznych, co pozwala na wysokiej jakości rekonstrukcje. Na końcu zapisu elektrofizjologicznego przenieść wycinek zawierający zarejestrowaną komórkę do małego naczynia z ACSF.

Podczas pracy pod wyciągiem rozwałkuj plasterek na mały kawałek dobrej jakości bibuły filtracyjnej i umieść kolejny kawałek zwilżonej bibuły filtracyjnej na plasterku. Umieść chusteczkę w małym plastikowym pojemniku zawierającym od 5 do 10 mililitrów roztworu utrwalającego i przechowuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia przenieś tkankę z pojemnika z roztworem utrwalającym do pojemnika z dwoma mililitrami 0,1-molowego buforu fosforanowego w celu spłukania i odetnij nadmiar tkanki ostrzem skalpela.

Usuń nadmiar tkanki, umieszczając plasterek na szalce Petriego, a nadmiar tkanki odetnij ostrzem skalpela. Przenieś przyciętą tkankę na czystą szalkę Petriego, upewniając się, że leży płasko, bez fałd i zagnieceń. Usuń nadmiar buforu za pomocą suchego pędzla.

Przykryj tkankę ciepłym roztworem żelatyny i umieść szalkę Petriego na zamrożonym bloku, aby szybko schłodzić roztwór. Następnie przesuwamy naczynie z żelatyną do 4 stopni Celsjusza na 30 do 60 minut. W dygestorium użyj ostrza skalpela, aby wyciąć mały blok o wymiarach 1 x 1 centymetr zawierający tkankę zatopioną w żelatynie.

Podnieś blok za pomocą małej szpatułki i ostrożnie przenieś do świeżego roztworu utrwalającego. Pozostawić na co najmniej 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po tym drugim utrwaleniu umyj blok żelatyny w pięciu mililitrach PB trzy razy.

Po umyciu osusz blok za pomocą kawałka chusteczki papierowej. Następnie użyj niewielkiej ilości kleju cyjanoakrylowego, aby przykleić blok, zorientowany tkanką u góry, na ciężarówkę z wibratomem za pomocą super kleju. Pokrój plasterek o grubości 50 mikronów za pomocą wibratomu i ostrożnie umieść każdą część w szklanej fiolce zawierającej 10 procent sacharozy.

Po podziale na sekcje ostrożnie pobrać fragment z fiolki i umieścić go płasko w pokrywie szalki Petriego. Następnie użyj świeżego ostrza skalpela, aby usunąć żelatynę z całego przekroju. Umieść skrawki w fiolce zawierającej 2 mililitry świeżej 10-procentowej sacharozy w PB i mieszaj przez 10 minut, aby rozpocząć proces krioprotekcji.

Po krioochronie ułóż sekcje płasko na małym prostokącie folii aluminiowej za pomocą pędzla. Usuń nadmiar płynu z sekcji i ostrożnie złóż folię do paczki. Trzymaj folię aluminiową blisko powierzchni ciekłego azotu, nie dotykając powierzchni przez 30 sekund.

A następnie pozwól sekcjom całkowicie się rozmrozić przez około 30 sekund. Powtórz rozmrażanie zamrażania jeszcze dwa razy. Usuń wszystkie skrawki z folii za pomocą pędzla i umieść je w szklanej fiolce zawierającej dwa mililitry PB, aby zmyć nadmiar sacharozy pod ciągłym mieszaniem.

Po barwieniu immunologicznym do obrazowania fluorescencyjnego umieścić szkiełko w szklanej szalce Petriego zawierającej PBS i ostrożnie usunąć szkiełko nakrywkowe. Następnie zmyj skrawki szkiełka delikatnymi impulsami PBS z pipety Pasteura. Umieścić skrawki w czystej szklanej fiolce zawierającej PBS.

Przeprowadź reakcję HRP Avidin, najpierw inkubując skrawki w kompleksie biotyny Avidin lub ABC przez co najmniej dwie godziny w celu amplifikacji produktu reakcji HRP. Następnie myj skrawki PBS 3 razy przez 10 minut, a następnie dwukrotnie buforem tris przez 10 minut. Po usunięciu ostatniego płukania buforem tris, szybko dodaj jedną kroplę ośmioprocentowego roztworu chlorku niklu do roztworu diaminobenzydyny lub roztworu DAB.

Następnie odpipetuj roztwór do wtłaczania i wyjmowania, aby wymieszać i szybko dodaj jeden mililitr tego roztworu na sekcje. Inkubuj sekcje w tym roztworze przez 15 minut. Następnie dodaj 10 mikrolitrów 1% nadtlenku wodoru do roztworu DAB.

Pozwól, aby reakcja postępowała w ciemności pod ciągłym mieszaniem przez około jedną do dwóch minut, aż komórki zostaną oznaczone. W dygestorium umieścić mały okrąg bibuły filtracyjnej na szalce Petriego i zwilżyć go PB. Podnieś skrawki pojedynczo ze szklanej fiolki za pomocą pędzla i ostrożnie ułóż je płasko na papierze. Przykryj skrawki kolejnym zwilżonym okręgiem bibuły filtracyjnej i usuń nadmiar buforu, delikatnie dotykając bibułą o powierzchnię.

Nałóż osiem lub dziewięć kropli jednoprocentowego tetratlenku osmu w PB na górny papier. Przykryj naczynie i trzymaj w dygestoriach przez co najmniej 30 minut, ale nie dłużej niż 1 godzinę. Po spłukaniu, zamontowaniu i nakryciu odcinków, odwodnić przez serię 50-procentowych, 70-procentowych, 95-procentowych i 100-procentowych roztworów alkoholu.

Po etapie odwadniania przenieś skrawki do szklanej fiolki zawierającej 100% etanolu na wytrząsarce na około pięć minut. Zastąp roztwór alkoholu tlenkiem propylenu i myj trzy razy przez pięć minut. Po ostatnim myciu trzymaj około dwóch mililitrów tlenku propylenu w fiolce i dodaj żywicę w stosunku 1:1.

Upewnij się, że żywica jest rozpuszczona i utrzymuj sekcje w ciągłym mieszaniu przez 30 minut. Po 30 minutach za pomocą drewnianego patyczka umieść każdą sekcję w aluminiowej planszecie zawierającej żywicę epoksydową i inkubuj przez noc. Następnego dnia połóż planszetę na gorącym talerzu na około 10 minut.

Następnie podnieś każdą sekcję drewnianym patyczkiem i umieść na czystej szkiełku. Po przeniesieniu wszystkich skrawków na szkiełko należy obejrzeć szkiełko pod mikroskopem preparacyjnym, aby sprawdzić orientację plastrów i nałożyć na nie szkiełko nakrywkowe. Utwardzać w piekarniku przez 48 godzin w temperaturze 56 stopni Celsjusza.

Użyj obiektywu o małym powiększeniu, aby ustawić ostrość na sekcji głównej zawierającej korpus komórki. Następnie użyj obiektywu 100x, skup się na ciele komórki i kliknij na środku, aby zaznaczyć punkt odniesienia. Aby obrysować somę w 3D za pomocą obiektywu 100x, wybierz kontur z zakładki śledzenia i wybierz kontur ciała komórki.

Użyj joysticka, aby przesunąć ostrość na samą górę korpusu komórki. Umieść punkty, klikając wokół obwodu części, która jest aktualnie aktywna. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Zamknij kontur, aby zakończyć ten pierwszy kontur.

Powtarzaj ten proces w różnych pozycjach z, aż dojdziesz do dolnej części korpusu komórki. Aby prześledzić altanę dendrytyczną, wybierz dendryt lub dendryt wierzchołkowy w menu neuronów. Najpierw narysuj krótki początkowy segment dla każdego dendrytu za pomocą kółka przewijania myszy, aby dostosować średnicę kursora do średnicy dendrytu.

Śledź wzdłuż każdego dendrytu. Po osiągnięciu węzła w drzewie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz z menu rozwijanego węzeł bifurkacyjny lub węzeł trifurkacyjny. Aby zidentyfikować pasujące punkty między dendrytami w sekcji, które pasują do ukończonej sekcji, kliknij kartę przenoszenia i wybierz punkty dopasowania.

Wybierz liczbę punktów potrzebnych do dopasowania, a następnie naciśnij przycisk OK. Kliknij zakończenie ukończonej gałęzi, a następnie kliknij gałąź. Powtórz to dla każdego punktu meczowego. Po prześledzeniu wszystkich dendrytów każdej sekcji, prześledź akson przy użyciu tego samego procesu Pokazano tutaj rekonstrukcję komórki koszowej CA2 z ograniczoną trzpieniem dendrytycznym i aksonalnym za pomocą rurki ciągnącej.

Dendryty są w kolorze czarnym, a akson w kolorze czerwonym. Jest to przykładowy obraz komórki koszyczkowej wypełnionej biocytyną zgodnie z opisanym tutaj protokołem Avidin HRP. Pokazano tutaj film przedstawiający rekonstrukcję neuronalną 3D komórki koszyczkowej CA2.

Dendryty są w kolorze ciemnoróżowym, a akson w kolorze białym. Wreszcie, ten obraz pokazuje dendrogram komórki koszowej CA2. Osiągnięcie biegłości w tym protokole zajmie trochę czasu.

Jednak to zoptymalizowane podejście może generować obrazy o wysokiej rozdzielczości złożonych struktur korowych i hipokampa in vitro.