Name: Odzyskiwanie biocytyny i rekonstrukcje 3D wypełnionych interneuronów CA2 w hipokampie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Poznaj metodę rekonstrukcji 3D interneuronów CA2 w hipokampie po zapisach elektrofizjologicznych. Technika immunofluorescencji zachowuje ultrastrukturę neuronów, umożliwiając szczegółową analizę morfologii dendrytów i aksonów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie otrzymało finansowanie od Novartis Pharma (Bazylea) i Rady Badań Medycznych przyznane Prof. Alexowi Thomsonowi, Radzie Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych (BBSRC- BB/G008639/1), Towarzystwu Fizjologicznemu, Programowi Ramowemu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji na mocy Szczegółowej Umowy o Grant nr 720270 (Projekt Ludzki Mózg SGA1) oraz na podstawie Szczegółowej Umowy o Grant nr 785907 (Projekt Ludzki Mózg SGA2). Jesteśmy niezmiernie wdzięczni prof. Alex Thomson za ustanowienie protokołu w innych regionach kory mózgowej, zapewnienie finansowania i za jej ciągłe wsparcie dla tego projektu. Wkład wniesiony przez członków laboratorium, którzy pomogli zoptymalizować protokół odzyskiwania i zrekonstruować neurony CA2, jest wdzięczny: J. Deuchars, H. Pawelzik, D. I. Hughes, A. P. Bannister, K. Eastlake, H. Trigg, N. A. Botcher.

<ol><li>Klausberger, T., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+diversity+and+temporal+dynamics%3A+the+unity+of+hippocampal+circuit+operations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations.</a> Science. 321, 53-57 (2008).</li>
<li>DeFelipe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+classification+and+nomenclature+of+cortical+GABAergic+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).</li>
<li>Bezaire, M. J., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+CA1+local+circuits%3A+knowledge+base+for+interneuron-pyramidal+cell+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of CA1 local circuits: knowledge base for interneuron-pyramidal cell connectivity.</a> Hippocampus. 23, 751-785 (2013).</li>
<li>Katona, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior-dependent+activity+patterns+of+GABAergic+long-range+projecting+neurons+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Behavior-dependent activity patterns of GABAergic long-range projecting neurons in the rat hippocampus.</a> Hippocampus. 27, 359-377 (2017).</li>
<li>Ali, A. B., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitating+pyramid+to+horizontal+oriens-alveus+interneurone+inputs%3A+dual+intracellular+recordings+in+slices+of+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Facilitating pyramid to horizontal oriens-alveus interneurone inputs: dual intracellular recordings in slices of rat hippocampus.</a> Journal of Physiology. 507, 185-199 (1998).</li>
<li>Ali, A. B., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+alpha+5+subunit-containing+GABAA+receptors+mediate+IPSPs+elicited+by+dendrite-preferring+cells+in+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex.</a> Cerebral Cortex. 18, 1260-1271 (2008).</li>
<li>Ali, A. B., Bannister, A. P., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+correlations+between+action+potential+duration+and+the+properties+of+synaptic+connections+in+layer+4+interneurones+in+neocortical+slices+from+juvenile+rats+and+adult+rat+and+cat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Robust correlations between action potential duration and the properties of synaptic connections in layer 4 interneurones in neocortical slices from juvenile rats and adult rat and cat.</a> Journal of Physiology. 580, 149-169 (2007).</li>
<li>Pawelzik, H., Bannister, A. P., Deuchars, J., Ilia, M., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+bistratified+cell+IPSPs+and+basket+cell+IPSPs+by+pentobarbitone+sodium%2C+diazepam+and+Zn2%2B%3A+dual+recordings+in+slices+of+adult+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modulation of bistratified cell IPSPs and basket cell IPSPs by pentobarbitone sodium, diazepam and Zn2+: dual recordings in slices of adult rat hippocampus.</a> European Journal of Neuroscience. 11, 3552-3564 (1999).</li>
<li>Pawelzik, H., Hughes, D. I., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4176080/">Physiological and morphological diversity of immunocytochemically defined parvalbumin-and cholecystokinin-positive interneurones in CA1 of the adult rat hippocampus.</a> Journal of Comparative Neurology. 443, 346-367 (2002).</li>
<li>Thomson, A. M., Lamy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maps+of+neocortical+local+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional maps of neocortical local circuitry.</a> Frontiers of Neuroscience. 1, 19-42 (2007).</li>
<li>Kepecs, A., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+cell+types+are+fit+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interneuron cell types are fit to function.</a> Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).</li>
<li>Wilent, W. B., Nitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrete+Place+Fields+of+Hippocampal+Formation+Interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Discrete Place Fields of Hippocampal Formation Interneurons.</a> Journal of Neurophysiology. 97, 4152-4161 (2007).</li>
<li>Hirsch, J. A., Martinez, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+processing+in+the+visual+cortical+column%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Laminar processing in the visual cortical column.</a> Current Opinion in Neurobiology. 16 (4), 377-384 (2006).</li>
<li>Kay, K., Sosa, M., Chung, J. E., Karlsson, M. P., Larkin, M. C., Frank, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hippocampal+network+for+spatial+coding+during+immobility+and+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A hippocampal network for spatial coding during immobility and sleep.</a> Nature. 531, 185-190 (2016).</li>
<li>Yu, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+hippocampal-cortical+memory+representations+for+experiences+associated+with+movement+versus+immobility%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Distinct hippocampal-cortical memory representations for experiences associated with movement versus immobility.</a> eLife. 6, e27621(2017).</li>
<li>Markram, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+and+Simulation+of+Neocortical+Microcircuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reconstruction and Simulation of Neocortical Microcircuitry.</a> Cell. 163, 456-492 (2015).</li>
<li>Van Geit, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BluePyOpt%3A+Leveraging+Open+Source+Software+and+Cloud+Infrastructure+to+Optimise+Model+Parameters+in+Neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">BluePyOpt: Leveraging Open Source Software and Cloud Infrastructure to Optimise Model Parameters in Neuroscience.</a> Frontiers in Neuroinformatics. 10, 17(2016).</li>
<li>Gal, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rich+cell-type-specific+network+topology+in+neocortical+microcircuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rich cell-type-specific network topology in neocortical microcircuitry.</a> Nature Neuroscience. 20, 1004-1013 (2017).</li>
<li>Thomson, A. M., West, D. C., Wang, Y., Bannister, A. P. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/cercor/article/12/9/936/383201">Synaptic connections and small circuits involving excitatory and inhibitory neurons in layers 2-5 of adult rat and cat neocortex: triple intracellular recordings and biocytin labeling in vitro.</a> Cerebral Cortex. 12, 936-953 (2002).</li>
<li>Mercer, A., West, D. C., Morris, O. T., Kirchhecker, S., Kerkhoff, J. E., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+connections+made+by+presynaptic+cortico-cortical+pyramidal+cells+in+layer+6+of+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Excitatory connections made by presynaptic cortico-cortical pyramidal cells in layer 6 of the neocortex.</a> Cerebral Cortex. 15, 1485-1496 (2005).</li>
<li>West, D. C., Mercer, A., Kirchhecker, S., Morris, O. T., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer+6+cortico-thalamic+pyramidal+cells+preferentially+innervate+interneurons+and+generate+facilitating+EPSPs%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Layer 6 cortico-thalamic pyramidal cells preferentially innervate interneurons and generate facilitating EPSPs.</a> Cerebral Cortex. 16, 200-211 (2006).</li>
<li>Bannister, A. P., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+properties+of+excitatory+synaptic+connections+involving+layer+4+pyramidal+cells+in+adult+rat+and+cat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Dynamic properties of excitatory synaptic connections involving layer 4 pyramidal cells in adult rat and cat neocortex.</a> Cerebral Cortex. 17, 2190-2203 (2007).</li>
<li>Mercer, A., Trigg, H. L., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+neurons+in+the+CA2+subfield+of+the+adult+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Characterization of neurons in the CA2 subfield of the adult rat hippocampus.</a> Journal of Neuroscience. 27 (7), 7329-7338 (2007).</li>
<li>Mercer, A., Eastlake, K., Trigg, H. L., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+circuitry+involving+parvalbumin-positive+basket+cells+in+the+CA2+region+of+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Local circuitry involving parvalbumin-positive basket cells in the CA2 region of the hippocampus.</a> Hippocampus. 22 (1), 43-56 (2012).</li>
<li>Mercer, A., Botcher, N. A., Eastlake, K., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SP-SR+interneurones%3A+a+novel+class+of+neurones+of+the+CA2+region+of+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">SP-SR interneurones: a novel class of neurones of the CA2 region of the hippocampus.</a> Hippocampus. 22 (8), 1758-1769 (2012).</li>
<li>Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemistry+and+electron+microscopy%3A+The+Preservation+of+Cellular+Ultrastructure+and+Enzymatic+Activity+by+Aldehyde+Fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytochemistry and electron microscopy: The Preservation of Cellular Ultrastructure and Enzymatic Activity by Aldehyde Fixation.</a> Journal of Cell Biology. 17, 19-58 (1963).</li>
<li>Somogyi, P., Takagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+note+on+the+use+of+picric+acid-paraformaldehyde-glutaraldehyde+fixative+for+correlated+light+and+electron+microscopic+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A note on the use of picric acid-paraformaldehyde-glutaraldehyde fixative for correlated light and electron microscopic immunocytochemistry.</a> Neuroscience. 7, 1779-1783 (1982).</li>
<li>Hughes, D. I., Bannister, A. P., Pawelzik, H., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+immunofluorescence%2C+peroxidase+labelling+and+ultrastructural+analysis+of+interneurones+following+prolonged+electrophysiological+recordings+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Double immunofluorescence, peroxidase labelling and ultrastructural analysis of interneurones following prolonged electrophysiological recordings in vitro.</a> Journal of Neuroscience Methods. 101, 107-116 (2000).</li>
<li>Botcher, N. A., Falck, J. E., Thomson, A. M., Mercer, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4176080/">Distributions of interneurones in the CA2 region of the rat hippocampus.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 104(2014).</li>
<li>Mercer, A., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cornu+Ammonis+Regions-Antecedents+of+Cortical+Layers%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Cornu Ammonis Regions-Antecedents of Cortical Layers?</a> Frontiers in Neuroanatomy. 11, 83(2017).</li>
<li>Blackman, A. V., Grabuschnig, S., Legenstein, R., Sjöström, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+manual+neuronal+reconstruction+from+biocytin+histology+or+2-photon+imaging%3A+morphometry+and+computer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">A comparison of manual neuronal reconstruction from biocytin histology or 2-photon imaging: morphometry and computer modeling.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 65(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zapisy elektrofizjologiczne in vitro (ryc. 1 Ac,d i Bc,d) w połączeniu z procedurami histochemicznymi i immunohistochemicznymi umożliwiają ujawnienie szczegółowej morfologii, zawartości białka wiążącego wapń i tożsamości zarejestrowanych dorosłych interneuronów korowych. W regionie CA2 technika ta pozwoliła po raz pierwszy na zbadanie obwodów lokalnych i ujawniła podklasy interneuronów, które nie zostały wcześniej opisane w CA1 lub CA3: szerokie komórki koszykowe dendrytyczne i aksonalne (ryc. 1B), komórki dwuwarstwowe i interneurony SP-SR.
Opisany tutaj protokół został zoptymalizowany w celu zachowania ultrastruktury neuronów i uzyskania doskonałej regeneracji zarówno altan dendrytycznych (w tym kolców), jak i aksonalnych. Kluczowe kroki obejmują zastosowanie techniki podwójnej fiksacji w celu zwiększenia kontrastu w mikroskopii świetlnej26 oraz dodanie aldehydu glutarowego i roztworu kwasu pikrynowego do roztworu utrwalającego w celu zwiększenia penetracji przeciwciał i zachowania ultrastruktury neuronalnej27. Delikatna przepuszczalność zamrażania i rozmrażania zapewnia lepsze zachowanie drobnej struktury, a osmyfikacja i osadzanie żywicy zmniejszają skurcz w płaszczyźnie Z28. Ponadto wizualizacja bardzo drobnych struktur (na przykład drobnych aksonów z małymi bulionami) jest ulepszona poprzez inkubację skrawków zH2O2i NaBH4 w celu zmniejszenia barwienia tła. Kontrast można również zwiększyć poprzez dodanie NiCl2 do reakcji HRP.
Opisana tutaj procedura histologiczna zapewnia doskonałe wyniki pod względem odtwarzalności i wiarygodności. Jednak czas trwania zapisów elektrofizjologicznych określi jakość barwienia biocytyną/fluorescencyjną, przy czym krótsze zapisy zwykle wiążą się ze słabym barwieniem aksonów. Wybór protokołów zapisu (zapisy wewnątrzkomórkowe z użyciem ostrych elektrod vs. zaciskanie plam na całych komórkach) może również wpływać na zatrzymywanie biocytyny i zachowanie dokładnej anatomii.
Chociaż doceniane są opisane tutaj trudności w zachowaniu drobnej struktury podczas przetwarzania histologicznego oraz czas potrzebny na rekonstrukcję przy 100-krotnym powiększeniu (1-4 tygodnie w zależności od złożoności aksonu), metoda ta daje dokładne odwzorowanie średnic dendrytycznych i aksonalnych. Stosowanie mniej wymagających protokołów w celu ujawnienia znakowania biocytyną jest zrozumiałe, jednak często uniemożliwiają one wyraźną wizualizację drobnych gałęzi aksonalnych. Detergenty, które ułatwiają wnikanie Avidin-HRP w celu ujawnienia biocytyny i przeciwciał, są często konieczne w grubych odcinkach, ale mogą zakłócić drobną strukturę. Neurobiolodzy nieustannie poszukują półautomatycznych metod rekonstrukcji, ale na razie i szczególnie w przypadku aksonów biocytyna-HRP z ręczną rekonstrukcją pozostaje złotym standardem31.
Bardzo szczegółowe rekonstrukcje neuronów, zwłaszcza dokładne rysunki bulionów i węzłów aksonalnych, obecność lub brak mieliny, a bardziej ogólnie rysunek kompletnej altany aksonalnej, z odwzorowaniem dokładnych zmian średnicy aksonu na całej jego długości, dostarczają dalszych informacji do dokładnej identyfikacji odrębnego typu interneuronu. Chociaż wiele interneuronów może nie pasować dokładnie do określonej klasy, opisana powyżej technika dostarcza skorelowanych danych na temat właściwości elektrofizjologicznych neuronów, krótkotrwałej plastyczności związanej z określonym typem połączenia i szczegółowych rekonstrukcji neuronów, co pozwala na szczegółowe zbadanie schematu połączeń, na przykład w regionie CA2.
Drobna, szczegółowa struktura jest często upraszczana w modelach obliczeniowych. Chociaż jest to zrozumiałe, powoduje to utratę informacji, które mogą okazać się krytyczne w przyszłości. Analiza szczegółowych rekonstrukcji 3D z równoległymi danymi synaptycznymi pozwoli na dodanie kolejnych kryteriów klasyfikacji międzyneuronalnej. Dane mogą być deponowane w repozytoriach publicznych i wykorzystywane przez osoby zajmujące się modelowaniem do obliczeniowego badania wpływu sporadycznych zmian średnicy aksonów i mielinizacji na propagację potencjału czynnościowego.

Kora i hipokamp są strukturami o takiej złożoności, że klasyfikacja podtypów neuronalnych1,2,3,4, mapy połączeń między nimi5,6,7,8,9,10,11 i jak ten obwód wspiera funkcje poznawcze12,13,14,15 są nadal przedmiotem intensywnych badań i są przedmiotem ciągłej debaty. Na przykład, aby zrozumieć szczegóły i złożoność obwodów oraz skoordynować dane uzyskane z wielu różnych badań, niezwykle pomocna jest umiejętność zdefiniowania i opisania komponentów, ale pozostaje kwestią dyskusyjną, ile istnieje różnych klas neuronów, a nawet czy możliwe jest zdefiniowanie wszystkich neuronów jako należących do określonej klasy. Opracowywane są narzędzia obliczeniowe, które mogą budować i testować obwody o różnym stopniu złożoności16,17,18, ale kluczowe dla tych przedsięwzięć jest potrzeba szczegółowych badań typów komórek i właściwości połączeń między nimi. Duża ilość informacji na temat lokalnych obwodów kory nowej dorosłych szczurów została już zebrana przy użyciu opisanego tutaj protokołu10,19,20,21,22. Chociaż "schemat połączeń" jest daleki od kompletności, pojawiły się pewne wyraźne wzorce lub zasady. Co więcej, chociaż niektóre szczegóły się różnią, zasady te są wspólne dla dwóch gatunków ssaków (szczura i kota) i w kilku regionach kory nowej, co pozwala na rozwój podstawowych elementów budulcowych, które prawdopodobnie będą miały równie duże zastosowanie w ludzkiej korze nowej. Opisana tutaj technika służy do poszerzenia naszej wiedzy na temat funkcjonalnej mapy obwodów korowych poprzez identyfikację neuronów presynaptycznych i postsynaptycznych zaangażowanych w połączenia w regionach, które nie były wcześniej szczegółowo badane, przy użyciu protokołu, który pozwala na doskonałe zachowanie tkanek i niezwykłe odzyskiwanie barwienia w tkance mózgowej dorosłej osoby. Dane dotyczące obwodów lokalnych w CA2 i właściwości neuronalnych w tej subdziedzinie zostały zebrane tą metodą poprzez połączenie wewnątrzkomórkowych zapisów elektrofizjologicznych (sparowane zapisy z ostrymi mikroelektrodami) z wypełnieniem biocytyną, immunofluorescencją, procedurami histologicznymi i bardzo szczegółowymi rekonstrukcjami neuronów, co pozwala na bezpośrednie porównanie z sąsiednimi regionami CA23,24,25.
Technika opisana w tym artykule została opracowana na przestrzeni lat w celu uzyskania szczegółowej anatomii neuronów, co pozwala na prawidłową klasyfikację komórek oraz wysokiej jakości i dokładne rekonstrukcje zarówno ich dendrytycznych jak i aksonalnych altan, danych, które można skorelować z danymi elektrofizjologicznymi zebranymi z sparowanych nagrań za pomocą ostrych elektrod. Protokół histologiczny został zoptymalizowany w celu zachowania ultrastruktury neuronów i uzyskania doskonałej regeneracji zarówno altan dendrytycznych (w tym kolców), jak i aksonalnych. Na przykład, zasada techniki podwójnej fiksacji, polegająca po pierwsze zanurzeniu w roztworze utrwalającym, a następnie po utrwaleniu w tetratlenku osmu, daje dobry kontrast dla mikroskopii świetlnej26. Niewielka ilość aldehydu glutarowego i roztworu kwasu pikrynowego jest dodawana do roztworu utrwalającego, aby zwiększyć penetrację przeciwciał i zachować ultrastrukturę komórek, jak sugerowano w poprzednim badaniu27. Przepuszczalność wycinków mózgu przy użyciu metody zamrażania i rozmrażania w połączeniu z krioochroną sacharozą, a nie tradycyjnym detergentem, zapewnia również optymalną konserwację tkanek do szczegółowej analizy morfologicznej zarejestrowanych komórek. Ponadto wizualizacja, szczególnie bardzo drobnych struktur, jest poprawiona dzięki zmniejszeniu barwienia tła, z inkubacją z nadtlenkiem wodoru (H2O2) i borowodorkiem sodu (NaBH 4). Dodanie chlorku niklu (NiCl2) do reakcji peroksydazy chrzanowej (HRP) w celu uzyskania produktu reakcji czarnego pigmentu również zwiększa kontrast.
Poniższy protokół opisuje procedury stosowane w celu zapewnienia doskonałego zachowania tkanek i bardzo szczegółowych neuronalnych rekonstrukcji 3D po wewnątrzkomórkowych zapisach in vitro. Opis przygotowania plastrów, wewnątrzkomórkowych sparowanych zapisów z użyciem ostrych elektrod oraz późniejszych procedur histologicznych stosowanych w naszym laboratorium został już wcześniej opisany28. Chociaż protokół ma zastosowanie do komórek wypełnionych wewnątrzkomórkowo biocytyną w warstwach o grubości 450–500 μm, ten sam protokół można zastosować po zapisach całych komórek. Jednak użycie cieńszych plastrów spowoduje mniej kompletną rekonstrukcję komórek.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało przeciwko kwasowi awidyno-7-amino-4-metylokomaryno-3-octowemu (Avidin-AMCA) - 20,8 mg/ml&nbsp;</td><td>Laboratoria wektorowe</td><td>A2008</td><td></td></tr><tr><td>Biocytyna&nbsp; &ge; 98% (TLC)</td><td>Sigma</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>3,5 diaminobenzydyna (DAB) tabletka, Aby przygotować 5 ml</td><td>Sigma</td><td>D4293</td><td></td></tr><tr><td>Żywica epoksydowa Durcupan A</td><td>Sigma</td><td>44611</td><td></td></tr><tr><td>Żywica epoksydowa Durcupan B</td><td>Sigma</td><td>44612</td><td></td></tr><tr><td>Żywica epoksydowa Durcupan C</td><td>Sigma</td><td>44613</td><td></td></tr><tr><td>Żywica epoksydowa Durcupan D</td><td>Sigma</td><td>44614</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, puriss. p.a., absolutny, &ge; 99,8%</td><td>Sigma</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma</td><td>48723</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór aldehydu glutarowego, klasa I, 25 % w H2O</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol, &ge; 99%&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Kozia surowica</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-mysia izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) - 14,3 mg / ml</td><td>Sigma</td><td>F2653</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-królik Texas Red (TR) - 3,3 mg / ml</td><td>Invitrogen</td><td>T2767</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru, 30% roztwór</td><td>Sigma</td><td>H-1009</td><td></td></tr><tr><td>Olejek immersyjny, lepkość 1.250 cSt (lit.)</td><td>Sigma</td><td>I0890</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek niklu (NiCl2 . 6H2O)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>N5756</td><td></td></tr><tr><td>Tetratlenek osmu, do mikroskopii elektronowej, 4% w H2O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, klasa odczynnika, krystaliczny&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Kwas pikrynowy, zwilżony wodą, &ge; 98%</td><td>Sigma</td><td>197378</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy 1 M</td><td>Sigma</td><td>P3619</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek propylenu (C3H6O), 99%</td><td>Alfa Aesar&nbsp;</td><td>30765</td><td></td></tr><tr><td>Tetrawodoroboran sodu</td><td>VWR</td><td>27885.134</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher scientific</td><td>S/8600/53</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek trizma, &ge; 99.0%</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Baza Trizma, &ge; 99,9%</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Antifade Medium montażowe, , współczynnik załamania światła 1,45&nbsp;</td><td>Laboratoria Vector</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC HRP kit</td><td>Laboratoria Vector</td><td>PK6100</td><td></td></tr><tr><td>Zastosowany sprzęt&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Agar Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C4A Miseczki aluminiowe&nbsp;</td><td>GA-MA & WSPÓLNICY, INC.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Leica DMR&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-Cite 120PC Q&nbsp; fluorescencyjne źródło światła&nbsp;</td><td>Technologie Excelitas&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy aparat mikroskopowy Leica DFC450&nbsp;</td><td>Mikrosystemy Leica&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rapidograph rysik techniczny 0,18mm&nbsp;</td><td>Londyńskie centrum</td><td></td><td></td>graficzne</tr><tr><td>0,18 mm Końcówka do rapidografu</td><td>Londyńskie centrum</td><td></td><td></td>graficzne</tr><tr><td>Rapidograph pióro do rysowania technicznego 0,25 mm&nbsp;</td><td>Londyńskie centrum</td><td></td><td></td>graficzne</tr><tr><td>Końcówka rapidografu 0,25 mm</td><td>Londyńskie centrum</td><td></td><td></td>graficzne</tr><tr><td>System Neurolucida wraz ze stacją roboczą PC, sceną, kamerą i joystic do sterowania sceną XYZ</td><td>Microbrighfield (MBF) Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida wersja oprogramowania 2017</td><td>Microbrighfield (MBF) Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CorelDRAW graphics Suite X5</td><td>Corel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do edycji wideo&nbsp;</td><td>Adobe Premiere Pro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szklane fiolki 14 ml</td><td>Fisher scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

odzyskiwanie biocytyny i rekonstrukcje 3d wypełnionych interneuronów ca2 w hipokampie

Biocytin Recovery and 3D Reconstructions of Filled Hippocampal CA2 Interneurons

Jak aktywność sieci korowej przetwarza informacje, ma znaczenie dla dużej liczby podstawowych i klinicznych pytań naukowych. Opisany tutaj protokół identyfikuje podstawowe elementy składowe tego obwodu. Dogłębne badania regionów kory mózgowej ostatecznie dostarczą innym naukowcom komponentów obwodów potrzebnych do zrozumienia, w jaki sposób mózg pozyskuje, przetwarza i przechowuje informacje oraz co idzie nie tak w chorobie, podczas gdy dane elektrofizjologiczne i morfologiczne są szeroko wykorzystywane przez neurobiologów obliczeniowych do budowy sieci modelowych, które badają przetwarzanie informacji. Przedstawiony tutaj protokół opisuje, w jaki sposób komórki wypełnione biocytyną zapisane w regionie CA2 hipokampa są odzyskiwane, a następnie rekonstruowane w 3D. Dodatkowo w protokole opisano wykazanie zawartości białka wiążącego wapń lub peptydu w zarejestrowanych interneuronach.

Neurony w obszarze CA2 hipokampa wypełniono biocytyną po dokonaniu rejestracji elektrofizjologicznych (Ryciny 1Ac, Ad oraz 1Bc, Bd). Przezcięcia utrwalono przez noc po zakończeniu rejestracji, a charakterystykę neurochemiczną i morfologiczną neuronów przeprowadzono zgodnie z protokołem opisanym w niniejszym opracowaniu.
Zawartość białek wiążących wapń lub ogólną zawartość białek w wypełnionych interneuronach określono poprzez inkubację skrawków najpierw z przeciwciałami pierwszorzędowymi, a następnie z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami wtórnymi. Wybór użytych przeciwciał pierwszorzędowych zależał od charakterystyki wyładowań interneuronów podczas rejestracji. Do wizualizacji wypełnionego biocytyną interneuronu zastosowano Avidin-AMCA, natomiast do charakterystyki neurochemii interneuronów wykorzystano przeciwciała przeciwko mysi znakowane fluoresceiną izotiocyjanianem (FITC) oraz kozie przeciwciała przeciwko królicze znakowane Texas Red (TR) (Rysunek 1Bb).
Po wizualizacji fluorescencyjnej zastosowano protokół HRP w celu uwidocznienia biocytyny (Rysunek 1Ab). Następnie, przy użyciu oprogramowania do rekonstrukcji neuronów, wykonano trójwymiarowy rysunek szczegółowej anatomii interneuronów CA2 (Rysunek 2 oraz Rysunek 3a). W Filmie przedstawiono rekonstrukcję 3D komórki koszyczkowej zarejestrowanej i wypełnionej w obszarze CA2. Rekonstrukcje neuronalne uznano za kompletne, jeśli zarówno drzewo dendrytyczne, jak i aksonalne mieściły się w obrębie skrawka o grubości 450-50 μm. Słabe barwienie drzewa aksonalnego oceniano na podstawie obecności uciętych gałęzi z otwartymi końcami na górnej lub dolnej krawędzi skrawka lub w przypadku barwienia ograniczonego do początkowego segmentu aksonu i bardzo proksymalnych gałęzi. Rysunek 4 przedstawia przykłady prawidłowego i słabego barwienia HRP po wizualizacji biocytyny.
Analizę morfometryczną rekonstrukcji 3D (Rycina 3>) można przeprowadzić w celu wykazania złożoności rozgałęzień, powierzchni soma oraz powierzchni i objętości drzew dendrytycznych i aksonalnych.
<img alt="Morfologia i elektrofizjologia neuronów, komórki koszykowe obszaru CA2, schematy, dane o aktywności, analiza synaptyczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1: Rekonstrukcje neuronalne dwóch typów komórek koszyczkowych zarejestrowanych i wypełnionych w obszarze CA2 hipokampa oraz skorelowane dane elektrofizjologiczne uzyskane po rejestracjach wewnątrzkomórkowych in vitroRysunek ten został zmodyfikowany na podstawie wcześniejszych badań23,24SO warstwa orientacyjna, SP warstwa piramidalna, SR warstwa promienista, SLM warstwa lakunarnie molekularna. (A) Aa: Rekonstrukcja komórki koszykowej CA2 z ograniczonym drzewem dendrytycznym i aksonalnym, wykonana za pomocą rurki rysunkowej (10X). Dendryty zaznaczono kolorem czarnym, a akson kolorem czerwonym. Ab: Obraz komórki koszykowej wypełnionej biocytyną po zastosowaniu opisanego tutaj protokołu z użyciem awidyny-HRP. Ac: Reprezentatywny zapis odpowiedzi napięciowych na wstrzyknięcie prądu hiperpolaryzującego i depolaryzującego w komórce koszykowej CA2 z ograniczonym drzewem dendrytycznym i aksonalnym. Ad: Przykład połączeń między komórką piramidalną CA2 a komórką koszykową o wąskim drzewie, zarejestrowany przy użyciu elektrod ostrych. Średnie złożone potencjały postsynaptyczne pobudzające (EPSP) wykazują krótkotrwałą depresję serii, widoczną podczas odpowiedzi na serie trzech impulsów. (B) Ba: Rekonstrukcja 2D komórki koszykowej obszaru CA2 o rozległych drzewach dendrytycznych i aksonalnych wykonana za pomocą rurki rysunkowej (10X). Drzewo dendrytyczne tej komórki koszykowej (kolor czarny) rozciągało się promieniście przez wszystkie warstwy obszaru CA2 oraz poziomo w warstwach SO i SP obszarów CA2 i CA3. Jeden dendryt poziomy sięgał również obszaru CA1. Akson (kolor czerwony) rozciągał się do obszarów CA3 i CA1. Bb: Wypełniona biocytyną (barwienie AMCA) komórka koszykowa była immunoreaktywna wobec PV (barwienie FITC) i immunonegatywna wobec CB (barwienie Texas-Red). Bc: Reprezentatywny zapis odpowiedzi napięciowych na wstrzyknięcie prądu hiperpolaryzującego i depolaryzującego w komórce koszykowej obszaru CA2 o rozległym drzewie dendrytycznym i aksonalnym. Bd: Średnie wartości kompozytowe EPSP wykazują krótkotrwałe ułatwienie widoczne podczas odpowiedzi na serie trzech impulsów. Przykłady innych typów interneuronów zarejestrowanych w obszarze CA2 można znaleźć w poprzednich badaniach.25,30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Żółte modelowanie struktury 3D; schematy (A: wykres konturowy, B: powierzchnia, C: analiza sieci neuronowej)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Trójwymiarowa rekonstrukcja ciała komórki. (A) Trójwymiarowe śledzenie konturów ciała komórki. Widok różnych konturów odrysowanych na różnych poziomach osi z podczas ogniskowania na ciele komórki. (B) Widok 3D różnych konturów. (C) Widok 3D ciała komórki pod innym kątem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat mapowania neuronalnego, wykres rozgałęzień dendrytycznych, histogram analizy rozkładu rozgałęzień." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3: Analizy morfometryczne trójwymiarowych rekonstrukcji neuronów. (ARekonstrukcja 3D wąskiej komórki koszykowej obszaru CA2. Każda gałąź dendrytyczna jest reprezentowana innym kolorem (zielonym, niebieskim, czerwonym i różowym), a akson zaznaczono kolorem jasnoniebieskim.B) Dendrogram komórki koszykowej przedstawiający liczbę rozgałęzień dendrytycznych i długość każdego segmentu znajdującego się w obrębie sfer koncentrycznych względem somy i w 100 μm odległości od somy. Kolory na dendrogramie odpowiadają kolorom dendrytów w punkcie A. (C) Przykład analizy morfometrycznej przeprowadzonej na komórkach piramidalnych obszaru CA2 (zaadaptowano z wcześniejszego badania23). Liczbę odgałęzień dendrytycznych nanieścono na wykres w funkcji odległości od somy komórek piramidalnych obszaru CA2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy porównujący struktury neuronalne z oznakowanymi obszarami; analiza wizualna szczegółów komórkowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rycina 4: Przykłady prawidłowego (A) i nieprawidłowego (B) barwienia HRP. (AOdzyskanie biocytyny ujawniło bardzo dobrze wypełniony interneuron w obszarze CA2. Ciało komórkowe (CB) jest ciemno barwione i ma wyraźne kontury. Dendryty mają strukturę paciorkowatą i wykazują obecność kolców (oznaczonych czerwonymi gwiazdkami). Drzewo aksonalne (A) jest gęste i wykazuje obecność małych zakończeń presynaptycznych (boutons).B) Przykład słabego barwienia dendrytów i aksonów dwóch komórek piramidowych w obszarze CA2. Barwienie ciał komórkowych (CB) jest blade i nie posiada wyraźnego obrysu. Słabe barwienie często wiąże się z krótszymi rejestracjami elektrofizjologicznymi, co skutkuje obecnością bardzo niewielkiej liczby wypełnionych biocytyną gałęzi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Wideo 1: Rekonstrukcja 3D neuronu typu komórki koszykowej obszaru CA2 z ograniczonym drzewem dendrytycznym (nazywanej również komórką koszykową CA2 o wąskim drzewie) z somą w stratum pyramidale, dendrytami obejmującymi wszystkie warstwy oraz aksonem w stratum pyramidale obszaru CA2 oraz sąsiednich warstwach stratum oriens i radiatum. Bardzo niewielka liczba odgałęzień dotarła do proksymalnego stratum oriens oraz stratum pyramidale obszaru CA3. Komórka ta została wypełniona biocytyną po rejestracjach elektrofizjologicznych, a przekroje przetworzono z użyciem awidyny-HRP zgodnie z protokołem opisanym w niniejszym opracowaniu. Ze względu na przecinanie, odzyskano jedynie fragment aksonu w obrębie głębokości skrawka, natomiast dendryty pozostały nienaruszone. Dendryty są koloru ciemnoróżowego, a akson białego. Granice warstw i regionów zostały dodane na początku filmu. Rekonstrukcja 3D: Georgia Economides – wideo 3D: Svenja Falk. Film został nagrany za pomocą oprogramowania do rekonstrukcji neuronów, zgodnie z opisem w kroku 2.17, i zmontowany w programie do edycji wideo. Link do filmu:30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/Figure_3.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stosowane roztwory </td>
			<td>Skład/Instrukcje</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór utrwalający</td>
			<td>4% paraformaldehyd, 0,2% nasycony roztwór kwasu pikrynowego, 0,025% roztwór glutaraldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym (PB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor fosforanowy 0,1 M pH 7,6</td>
			<td>Dodać 10 ml 1 M buforu fosforanowego (roztwór zapasowy) do 90 ml wody destylowanej </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor fosforanowy (PBS) pH 7,4/7,5</td>
			<td>Do 90 ml wody destylowanej dodać 10 ml 0,1 M buforu fosforanowego, 0,2 g KCl oraz 8,76 g NaCl.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bufor TRIS pH 7,5</td>
			<td>Rozpuścić 5,72 g chlorowodorku Trisu oraz 1,6 g zasady Trisu w 50 ml wody destylowanej. Następnie uzupełnić objętość wody destylowanej do 1 l.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buforowy roztwór utrwalający z glutaraldehydem i paraformaldehydem</td>
			<td>4% paraformaldehydu, 0,2% nasycony roztwór kwasu pikrynowego, 0,025% roztwór glutaraldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roztwór ABC </td>
			<td>Roztwór należy przygotować co najmniej 30 minut przed użyciem z zestawu ABC. Do 2,5 ml PBS dodać 1 kroplę roztworu A i 1 kroplę roztworu B.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>żywicą epoksydowa Durcupan: </td>
			<td>Aby przygotować 20 doniczek: 20 g komponentu A, 20 g komponentu B, 0,6 g komponentu C i 0,4 g komponentu D- </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Aby chronić wagę przed rozlaniem substancji, należy przykryć talerzyk kółkiem z papieru filtracyjnego. Odważ starannie odczynniki do zlewki z dzióbkiem w proporcjach określonych powyżej. Wymieszaj dokładnie, energicznie mieszając dwoma drewnianymi pręcikami przez co najmniej 5 min. Mieszanina powinna przybrać ciemnobrązowy kolor i jednolitą gęstość. Umieść zlewkę w piecu w temperaturze ~50 °C przez maksymalnie 10 min, aby usunąć jak najwięcej pęcherzyków powietrza. UWAGA: Jeśli zlew zostanie pozostawiony w piekarniku na dłużej niż 10 min, żywica zacznie polimeryzować. Przelej żywicę do plastikowych pojemników lub strzykawek o pojemności 5 ml, opisz je datą i przechowuj w -20 °C zamrażarka gotowa do użycia.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Tabela roztworów.

Opisany tutaj protokół opisuje analizę immunofluorescencyjną, odzyskiwanie biocytyny i wysokiej jakości rekonstrukcje interneuronów CA2 w hipokampie po wewnątrzkomórkowych zapisach elektrofizjologicznych in vitro, co pozwala na badanie charakterystyki neuronów i ostatecznie anatomii neuronalnej.

Odzyskiwanie biocytyny i rekonstrukcje 3D wypełnionych interneuronów CA2 w hipokampie

How cortical network activity processes information is of importance to a large number of basic and clinical scientific questions. The protocol described ...

Ta metoda może pomóc w klasyfikacji podtypów neuronów i poszerzyć naszą wiedzę na temat funkcjonalnej mapy obwodów korowych. Protokół ten został zoptymalizowany w celu zachowania ultrastruktury neuronów i uzyskania doskonałej regeneracji zarówno dendrytycznych, jak i aksonalnych altan dendrytycznych, co pozwala na wysokiej jakości rekonstrukcje. Na końcu zapisu elektrofizjologicznego przenieść wycinek zawierający zarejestrowaną komórkę do małego naczynia z ACSF.Podczas pracy pod wyciągiem rozwałkuj plasterek na mały kawałek dobrej jakości bibuły filtracyjnej i umieść kolejny kawałek zwilżonej bibuły filtracyjnej na plasterku. Umieść chusteczkę w małym plastikowym pojemniku zawierającym od 5 do 10 mililitrów roztworu utrwalającego i przechowuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia przenieś tkankę z pojemnika z roztworem utrwalającym do pojemnika z dwoma mililitrami 0,1-molowego buforu fosforanowego w celu spłukania i odetnij nadmiar tkanki ostrzem skalpela.Usuń nadmiar tkanki, umieszczając plasterek na szalce Petriego, a nadmiar tkanki odetnij ostrzem skalpela. Przenieś przyciętą tkankę na czystą szalkę Petriego, upewniając się, że leży płasko, bez fałd i zagnieceń. Usuń nadmiar buforu za pomocą suchego pędzla.Przykryj tkankę ciepłym roztworem żelatyny i umieść szalkę Petriego na zamrożonym bloku, aby szybko schłodzić roztwór. Następnie przesuwamy naczynie z żelatyną do 4 stopni Celsjusza na 30 do 60 minut. W dygestorium użyj ostrza skalpela, aby wyciąć mały blok o wymiarach 1 x 1 centymetr zawierający tkankę zatopioną w żelatynie.Podnieś blok za pomocą małej szpatułki i ostrożnie przenieś do świeżego roztworu utrwalającego. Pozostawić na co najmniej 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po tym drugim utrwaleniu umyj blok żelatyny w pięciu mililitrach PB trzy razy.Po umyciu osusz blok za pomocą kawałka chusteczki papierowej. Następnie użyj niewielkiej ilości kleju cyjanoakrylowego, aby przykleić blok, zorientowany tkanką u góry, na ciężarówkę z wibratomem za pomocą super kleju. Pokrój plasterek o grubości 50 mikronów za pomocą wibratomu i ostrożnie umieść każdą część w szklanej fiolce zawierającej 10 procent sacharozy.Po podziale na sekcje ostrożnie pobrać fragment z fiolki i umieścić go płasko w pokrywie szalki Petriego. Następnie użyj świeżego ostrza skalpela, aby usunąć żelatynę z całego przekroju. Umieść skrawki w fiolce zawierającej 2 mililitry świeżej 10-procentowej sacharozy w PB i mieszaj przez 10 minut, aby rozpocząć proces krioprotekcji.Po krioochronie ułóż sekcje płasko na małym prostokącie folii aluminiowej za pomocą pędzla. Usuń nadmiar płynu z sekcji i ostrożnie złóż folię do paczki. Trzymaj folię aluminiową blisko powierzchni ciekłego azotu, nie dotykając powierzchni przez 30 sekund.A następnie pozwól sekcjom całkowicie się rozmrozić przez około 30 sekund. Powtórz rozmrażanie zamrażania jeszcze dwa razy. Usuń wszystkie skrawki z folii za pomocą pędzla i umieść je w szklanej fiolce zawierającej dwa mililitry PB, aby zmyć nadmiar sacharozy pod ciągłym mieszaniem.Po barwieniu immunologicznym do obrazowania fluorescencyjnego umieścić szkiełko w szklanej szalce Petriego zawierającej PBS i ostrożnie usunąć szkiełko nakrywkowe. Następnie zmyj skrawki szkiełka delikatnymi impulsami PBS z pipety Pasteura. Umieścić skrawki w czystej szklanej fiolce zawierającej PBS.Przeprowadź reakcję HRP Avidin, najpierw inkubując skrawki w kompleksie biotyny Avidin lub ABC przez co najmniej dwie godziny w celu amplifikacji produktu reakcji HRP. Następnie myj skrawki PBS 3 razy przez 10 minut, a następnie dwukrotnie buforem tris przez 10 minut. Po usunięciu ostatniego płukania buforem tris, szybko dodaj jedną kroplę ośmioprocentowego roztworu chlorku niklu do roztworu diaminobenzydyny lub roztworu DAB.Następnie odpipetuj roztwór do wtłaczania i wyjmowania, aby wymieszać i szybko dodaj jeden mililitr tego roztworu na sekcje. Inkubuj sekcje w tym roztworze przez 15 minut. Następnie dodaj 10 mikrolitrów 1% nadtlenku wodoru do roztworu DAB.Pozwól, aby reakcja postępowała w ciemności pod ciągłym mieszaniem przez około jedną do dwóch minut, aż komórki zostaną oznaczone. W dygestorium umieścić mały okrąg bibuły filtracyjnej na szalce Petriego i zwilżyć go PB. Podnieś skrawki pojedynczo ze szklanej fiolki za pomocą pędzla i ostrożnie ułóż je płasko na papierze. Przykryj skrawki kolejnym zwilżonym okręgiem bibuły filtracyjnej i usuń nadmiar buforu, delikatnie dotykając bibułą o powierzchnię.Nałóż osiem lub dziewięć kropli jednoprocentowego tetratlenku osmu w PB na górny papier. Przykryj naczynie i trzymaj w dygestoriach przez co najmniej 30 minut, ale nie dłużej niż 1 godzinę. Po spłukaniu, zamontowaniu i nakryciu odcinków, odwodnić przez serię 50-procentowych, 70-procentowych, 95-procentowych i 100-procentowych roztworów alkoholu.Po etapie odwadniania przenieś skrawki do szklanej fiolki zawierającej 100% etanolu na wytrząsarce na około pięć minut. Zastąp roztwór alkoholu tlenkiem propylenu i myj trzy razy przez pięć minut. Po ostatnim myciu trzymaj około dwóch mililitrów tlenku propylenu w fiolce i dodaj żywicę w stosunku 1:1.Upewnij się, że żywica jest rozpuszczona i utrzymuj sekcje w ciągłym mieszaniu przez 30 minut. Po 30 minutach za pomocą drewnianego patyczka umieść każdą sekcję w aluminiowej planszecie zawierającej żywicę epoksydową i inkubuj przez noc. Następnego dnia połóż planszetę na gorącym talerzu na około 10 minut.Następnie podnieś każdą sekcję drewnianym patyczkiem i umieść na czystej szkiełku. Po przeniesieniu wszystkich skrawków na szkiełko należy obejrzeć szkiełko pod mikroskopem preparacyjnym, aby sprawdzić orientację plastrów i nałożyć na nie szkiełko nakrywkowe. Utwardzać w piekarniku przez 48 godzin w temperaturze 56 stopni Celsjusza.Użyj obiektywu o małym powiększeniu, aby ustawić ostrość na sekcji głównej zawierającej korpus komórki. Następnie użyj obiektywu 100x, skup się na ciele komórki i kliknij na środku, aby zaznaczyć punkt odniesienia. Aby obrysować somę w 3D za pomocą obiektywu 100x, wybierz kontur z zakładki śledzenia i wybierz kontur ciała komórki.Użyj joysticka, aby przesunąć ostrość na samą górę korpusu komórki. Umieść punkty, klikając wokół obwodu części, która jest aktualnie aktywna. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Zamknij kontur, aby zakończyć ten pierwszy kontur.Powtarzaj ten proces w różnych pozycjach z, aż dojdziesz do dolnej części korpusu komórki. Aby prześledzić altanę dendrytyczną, wybierz dendryt lub dendryt wierzchołkowy w menu neuronów. Najpierw narysuj krótki początkowy segment dla każdego dendrytu za pomocą kółka przewijania myszy, aby dostosować średnicę kursora do średnicy dendrytu.Śledź wzdłuż każdego dendrytu. Po osiągnięciu węzła w drzewie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz z menu rozwijanego węzeł bifurkacyjny lub węzeł trifurkacyjny. Aby zidentyfikować pasujące punkty między dendrytami w sekcji, które pasują do ukończonej sekcji, kliknij kartę przenoszenia i wybierz punkty dopasowania.Wybierz liczbę punktów potrzebnych do dopasowania, a następnie naciśnij przycisk OK. Kliknij zakończenie ukończonej gałęzi, a następnie kliknij gałąź. Powtórz to dla każdego punktu meczowego. Po prześledzeniu wszystkich dendrytów każdej sekcji, prześledź akson przy użyciu tego samego procesu Pokazano tutaj rekonstrukcję komórki koszowej CA2 z ograniczoną trzpieniem dendrytycznym i aksonalnym za pomocą rurki ciągnącej.Dendryty są w kolorze czarnym, a akson w kolorze czerwonym. Jest to przykładowy obraz komórki koszyczkowej wypełnionej biocytyną zgodnie z opisanym tutaj protokołem Avidin HRP. Pokazano tutaj film przedstawiający rekonstrukcję neuronalną 3D komórki koszyczkowej CA2.Dendryty są w kolorze ciemnoróżowym, a akson w kolorze białym. Wreszcie, ten obraz pokazuje dendrogram komórki koszowej CA2. Osiągnięcie biegłości w tym protokole zajmie trochę czasu.Jednak to zoptymalizowane podejście może generować obrazy o wysokiej rozdzielczości złożonych struktur korowych i hipokampa in vitro.

biocytin-recovery-3d-reconstructions-filled-hippocampal-ca2

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film pokazuje proces wizualizacji interneuronu wypełnionego biocytyną w sekcji hipokampa szczura, podkreślając jego tożsamość neurochemiczną dzięki zastosowaniu specyficznych przeciwciał i mikroskopii fluorescencyjnej.

Barwienie immunologiczne interneuronów w odcinku hipokampa szczura

Ten film pokazuje procedurę barwienia utrwalonych wycinków mózgu szczura zawierających interneurony wypełnione biocytyną. Protokół obejmuje inkubację z kompleksem awidyny-biotyny (ABC), barwienie za pomocą HRP i substratu chromogennego, konserwację struktur tetratlenkiem osmu i zatopienie tkanki w żywicy w celu obrazowania.

Znakowanie interneuronów wypełnionych biocytyną w wycinkach hipokampa szczurów w celu wizualizacji

Aby zrozumieć strukturę sieci neuronowych, konieczna jest funkcjonalna i morfologiczna charakterystyka poszczególnych neuronów. Tutaj demonstrujemy znakowanie biocytyny przykłasomalnej, które umożliwia zapisy elektrofizjologiczne w konfiguracji zewnątrzkomórkowej, zachowując jednocześnie zdolność do wewnątrzkomórkowego znakowania neuronu w celu rekonstrukcji post hoc architektury dendrytycznej i aksonalnej.

Znakowanie biocytyny Juxtasomal w celu zbadania zależności struktura-funkcja poszczególnych neuronów korowych

Sieci korowe są kontrolowane przez mały, ale zróżnicowany zestaw hamujących interneuronów. Funkcjonalne badanie interneuronów wymaga zatem ukierunkowanego rejestrowania i rygorystycznej identyfikacji. Opisano tutaj podejście łączone obejmujące zapisy całych komórek z pojedynczych lub synaptycznie sprzężonych par neuronów z etykietowaniem wewnątrzkomórkowym, analizą morfologiczną post-hoc i immunocytochemiczną.

Nagrania całokomórkowych klamry krosowej z morfologicznie i neurochemicznie zidentyfikowanych interneuronów hipokampa

Kultury o niskiej gęstości pierwotnych neuronów hipokampa zazwyczaj wymagają warstwy zasilającej glej, aby dostarczyć czynników neurotroficznych i utrzymać długowieczność. Opisujemy tutaj uproszczoną metodę hodowli neuronów o ultra niskiej gęstości na szklanych szkiełkach nakrywkowych w obecności warstwy zasilającej neurony o dużej gęstości, co ułatwia badanie specyficznych mechanizmów neuronalno-autonomicznych.

Uproszczona metoda długoterminowej hodowli pierwotnych neuronów hipokampa o bardzo niskiej gęstości

Ten protokół przedstawia metodę morfologicznego odzyskiwania neuronów załatanych podczas zapisów elektrofizjologicznych za pomocą wypełnienia biocytyną i późniejszego immunohistochemicznego przetwarzania końcowego. Pokazujemy, że grube skrawki wypełnione biocytyną, które zostały wybarwione i przykryte, mogą być ponownie wybarwione drugim pierwotnym przeciwciałem kilka dni lub miesięcy później.

Barwienie immunologiczne skrawków wypełnionych i przetworzonych biocytyną pod kątem markerów neurochemicznych

Prezentujemy metodę łączącą zapisy z całokomórkowego patch-clampu i obrazowania dwufotonowego w celu zarejestrowania stanów przejściowych Ca2+ w dendrytach neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu.

Dwufotonowe obrazowanie wapnia w dendrytach neuronalnych w wycinkach mózgu

Tutaj prezentujemy protokoły przygotowania ostrych wycinków mózgu zawierających jądro kolankowate boczne oraz badania elektrofizjologicznego funkcji synaps retinogenikulacyjnych i kortykogenicznych. Protokół ten zapewnia skuteczny sposób badania synaps z wysokim i niskim prawdopodobieństwem uwalniania w tych samych ostrych wycinkach mózgu.

Badania elektrofizjologiczne funkcji synaps retinogenikulacyjnych i kortykogenicznych

Przedstawiamy protokół przygotowania ostrych plastrów z grzbietowo-pośredniego hipokampa myszy. Porównujemy ten preparat poprzeczny z cięciem koronalnym pod względem jakości zapisów i zachowania cech morfologicznych zarejestrowanych neuronów.

Przygotowanie ostrych wycinków z grzbietowego hipokampa do zapisu całych komórek i rekonstrukcji neuronów w zakręcie zębatym dorosłych myszy

Tutaj prezentujemy protokół opisujący transdukcję wirusa w dyskretnych obszarach mózgu za pomocą konstruktów optogenetycznych, które umożliwiają specyficzną dla synaps charakterystykę elektrofizjologiczną w ostrych wycinkach mózgu gryzoni.

Ex vivo Badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej

Połączenie transdukcji wektora wirusowego i oczyszczania mózgu za pomocą metody CLARITY pozwala na badanie dużej liczby neuronów i astrocytów jednocześnie.

Badanie interakcji przestrzennych między astrocytami a neuronami w oczyszczonych mózgach

Poznaj metodę rekonstrukcji 3D interneuronów CA2 w hipokampie po zapisach elektrofizjologicznych. Technika immunofluorescencji zachowuje ultrastrukturę neuronów, umożliwiając szczegółową analizę morfologii dendrytów i aksonów.

Odzyskiwanie biocytyny i rekonstrukcje 3D wypełnionych interneuronów CA2 w hipokampie

Przeglądaj więcej filmów