Zoptymalizowany test ELISpot interferonu gamma do pomiaru odpowiedzi limfocytów T w modelu świnki morskiej po szczepieniu
20 stycznia 2019
Rozwój testu interferon-gamma ELISpot dla PBMC świnek morskich pozwala na scharakteryzowanie odpowiedzi limfocytów T w tym bardzo istotnym modelu do badania chorób zakaźnych. Zastosowaliśmy test do pomiaru odpowiedzi limfocytów T związanych z śródskórnym dostarczaniem szczepionek DNA.
W przeszłości charakterystyka immunoterapeutyków w modelu świnki morskiej ograniczała się do pomiaru odporności humoralnej. Test ELISpot przezwycięża to ograniczenie i pomoże naukowcom wygenerować bardziej znaczące dane w tym modelu zwierzęcym. Główną zaletą tej techniki jest to, że komórki są pozyskiwane z krwi obwodowej.
Nie jest wymagana sekcja zwłok. Pozwala to na pomiar nie tylko wielkości, ale także kinetyki odpowiedzi limfocytów T u poszczególnych świnek morskich podczas naturalnej infekcji lub przez cały schemat szczepienia. Procedurę zademonstruje Holly Pugh.
Jest pracownikiem naukowym w Dziale Badań Przedklinicznych Inovio. Aby rozpocząć, dodaj 15 mikrolitrów 35% etanolu do każdej studzienki płytki testowej ELISpot. Po 60 sekundach dodaj 150 mikrolitrów PBS do każdej studzienki.
I odwróć płytkę, aby zatrzymać wstępną obróbkę etanolu. Należy również zachować szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z płytkami testowymi ELISpot, aby uniknąć zanieczyszczenia lub uszkodzenia membrany. Aby umyć płytkę, dodaj 250 mikrolitrów PBS do każdej studzienki.
Po powtórzeniu płukania jeszcze dwa razy, dodać 100 mikrolitrów wychwytywanego przeciwciała interferonu gamma przeciwko śwince morskiej VE4 do każdej studzienki. Następnie inkubuj płytkę przez co najmniej 12 godzin w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Po okresie inkubacji umyj płytki trzy razy.
Dodaj 200 mikrolitrów buforu blokującego do każdej studzienki. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Następnie umyj talerze jeszcze trzy razy.
Przygotować stożkowe probówki z 4,5 ml pożywki o gradiencie gęstości w temperaturze pokojowej. Następnie wymieszaj równą objętość zbalansowanego roztworu soli Hanksa z krwią. Rozcieńczoną krew nakładać stopniowo na podłoże o gradiencie gęstości, uważając, aby nie naruszyć interfejsu.
Następnie odwirować probówki o stężeniu 800 x g przez 30 minut bez hamulców w temperaturze pokojowej. Wyjmij probówkę z wirówki, uważając, aby nie naruszyć warstw. Po prawidłowej identyfikacji warstw należy zassać całą warstwę kożuchowca, aby zebrać PBMC.
Powoli nakładaj rozcieńczoną krew HBSS na podłoże o gradiencie gęstości. Unikaj jakichkolwiek zakłóceń rurki i wyłącz hamulce wirówki. Przenieść komórki do nowej probówki o pojemności 15 ml.
Następnie rozcieńczyć komórki w pożywce R10 do całkowitej objętości 15 ml. Po osadzeniu komórek należy odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 15 ml pożywki R10. Przepuść zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do nowej probówki.
Policz komórki i określ liczbę żywych komórek za pomocą testu wykluczenia błękitu trypanowego. Następnie rozcieńczyć komórki pożywką R10. Najpierw usuń bufor blokujący i umyj płytki.
Dla każdej próbki PBMC należy wskazać trzy egzemplarze kontroli dodatniej, kontroli ujemnej i każdego stymulanta specyficznego dla eksperymentu. Rozcieńczyć pulę peptydów białkowych w pożywce R10 do trzykrotności pożądanego stężenia końcowego. Następnie dodaj 50 mikrolitrów mieszaniny pożywki peptydowej R10 do studzienek testowych stymulantów na płytce.
Następnie dodaj 50 mikrolitrów preparatu peptydowego MT w pożywce R10 do studzienek kontroli ujemnej płytki. Dodać ConA w pożywce R10 do studzienek kontroli pozytywnej płytki, a następnie dodać 100 mikrolitrów zawiesiny PBMC do wszystkich studzienek. Umieść płytkę ELISpot na równej powierzchni w inkubatorze i unikaj naruszania płytki w okresie inkubacji.
Po ostrożnym wyjęciu płytki z inkubatora, należy odwrócić płytkę w celu usunięcia supernatantu. Następnie umyj talerz trzy razy. Dodać 100 mikrolitrów rozcieńczonego biotynylowanego przeciwciała anty-gwintylowego N-G3 przeciwko interferonowi gamma świnki morskiej do każdego dołka.
Następnie inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Odwróć płytkę, aby usunąć roztwór przeciwciał i powtórz mycie trzy razy. Po wyjęciu PBS z płytki, do każdej studzienki dodać 100 mikrolitrów streptawidyny sprzężonej z ALP, rozcieńczonej w buforze blokującym.
Następnie inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez godzinę. Odwrócić płytkę, aby wyrzucić roztwór streptawidyny ALP i dwukrotnie umyć płytkę. Odwróć talerz i osusz go czystym ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadmiar PBS.
Następnie umyj płytkę 250 mikrolitrami ultraczystej wody DI na studzienkę. Odwróć talerz i usuń nadmiar wody czystym ręcznikiem papierowym. Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu substratu BCIP/NBT do każdej studzienki.
Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 20 minut, chroniąc ją przed światłem. Opłucz płytkę czterokrotnie wodą DI. Następnie odwróć i postukaj w płytkę, aby usunąć nadmiar wody.
Na koniec usuń plastikowy drenaż z dolnej części płyty i pozwól membranie całkowicie wyschnąć. Po udanym odwirowaniu w gradiencie gęstości, jak wykazano wcześniej, czerwona lepka ciecz na dnie probówki powinna zawierać większość czerwonych krwinek. Warstwa kożuchy znajduje się pomiędzy warstwą plazmy a ośrodkiem gradientu gęstości.
Po wstępnej obróbce studzienek przed dodaniem przeciwciała wychwytującego, test wykazał lepszą definicję wraz ze zmniejszeniem liczby niespecyficznych plamek w studzienkach kontroli ujemnej. Plamki wskazują na limfocyty T wytwarzające interferon gamma w populacji PBMC. Próbując tej techniki, należy pamiętać o ostrożnym, ale szybkim przetwarzaniu krwi.
Poprawi to żywotność komórek, poprawi tworzenie plamek i zmniejszy tworzenie się niespecyficznych plam. Nie zapominaj, że praca z krwią i substratem BCIP/NBT może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiednich środków ochrony osobistej. Uważam, że ten protokół pozwala naukowcom badać choroby z ważnym komponentem komórek T, takie jak gruźlica, ebola i HSV.
Co ważne, pozwoli to na udoskonalenie opracowywania protokołów szczepień w modelu świnki morskiej i ograniczy stosowanie mniej istotnych modeli zwierzęcych.
Przegląd
Opracowanie testu ELISpot dla interferonu gamma z wykorzystaniem PBMC świnki morskiej umożliwia charakteryzację odpowiedzi limfocytów T w tym istotnym modelu chorób zakaźnych. Analiza ta pozwala badaczom na pomiar zarówno wielkości, jak i kinetyki odpowiedzi limfocytów T podczas naturalnych infekcji lub w ramach schematów szczepień.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Choroby zakaźne
- Opracowywanie szczepionek
Wstęp
- Poprzednie metody koncentrowały się na pomiarze odporności humoralnej u świnek morskich.
- Test ELISpot umożliwia ocenę odpowiedzi limfocytów T bez konieczności przeprowadzania nekropsji.
- Technika ta zwiększa ilość generowanych danych w modelu świnki morskiej.
- Jest ona kluczowa w badaniu chorób z istotnym udziałem limfocytów T.
Cel badania
- Opracowanie metody pomiaru odpowiedzi limfocytów T u świni morskich.
- Udoskonalenie protokołów szczepień w modelu świni morskiej.
- Ograniczenie zależności od mniej odpowiednich modeli zwierzęcych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie płytek do testu ELISpot za pomocą etanolu i PBS.
- Izolacja PBMC przy użyciu wirowania w gradiencie gęstości.
- Inkubacja z przeciwciałami wychwytującymi i odczynnikami detekcyjnymi.
- Staranne obchodzenie się z próbkami w celu uniknięcia kontaminacji i zapewnienia żywotności komórek.
Główne wyniki
- Test ten skutecznie mierzy odpowiedzi limfocytów T u świstaków.
- Poprawiona rozdzielczość i zredukowana liczba nieswoistych plam w wynikach.
- Umożliwia badanie dynamiki limfocytów T podczas infekcji i szczepień.
- Ułatwia badania nad chorobami takimi jak gruźlica, Ebola i HSV.
Wnioski
- Analiza ELISpot jest cennym narzędziem w badaniach immunologicznych u świni domesticated.
- Pozwala ona na lepsze zrozumienie odpowiedzi limfocytów T w chorobach zakaźnych.
- Metoda ta może przyczynić się do opracowania skuteczniejszych strategii tworzenia szczepionek.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Test ELISpot dla interferonu-gamma w przypadku PBMC świnki morskiej wypełnia krytyczną lukę w immunologii przedklinicznej, umożliwiając podłużne śledzenie odpowiedzi limfocytów T bez konieczności przeprowadzania nekropsji. Zdolność ta zwiększa pewność prognostyczną w odniesieniu do kandydatów na szczepionki wymierzone w patogeny wewnątrzkomórkowe i wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) we wczesnej fazie odkrywania. Wykorzystanie krwi obwodowej w tym teście ułatwia współpracę międzyfunkcyjną i zmniejsza zależność od mniej predykcyjnych modeli zwierzęcych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie specyficznych dla szczepionki odpowiedzi limfocytów T w celu walidacji immunologicznych mechanizmów działania.
- Wartość operacyjna: Dostarcza ilościowych pomiarów liczby plamek IFN-gamma jako funkcjonalnego odczytu zaangażowania celu i modulacji szlaku.
- Wartość prognostyczna: Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez korelację liczebności i kinetyki limfocytów T z odpornością ochronną w modelach istotnych dla danej choroby.
Przesiewy i opracowanie analizy
- Wartość naukowa: Pozwala na generowanie powtarzalnych, ilościowych danych z izolowanych PBMC w celu wsparcia standaryzacji testów dla różnych kandydatów na szczepionki.
- Wartość operacyjna: Eliminuje konieczność pobierania krwi końcowej, umożliwiając wielokrotne pobieranie próbek od poszczególnych zwierząt w celu profilowania kinetycznego.
- Gotowość testu: Zapewnia tworzenie wyraźnych plamek przy zredukowanym tle niespecyficznym, co poprawia stosunek sygnału do szumu podczas przesiewania związków lub antygenów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z fazą przedkliniczną poprzez pomiar dynamiki limfocytów T swoistych dla antygenu podczas stosowania schematów szczepień.
- Znaczenie chorobowe: Bezpośrednio stosowalne w przypadku patogenów o silnej zależności od limfocytów T, w tym gruźlicy, wirusa Ebola oraz HSV, jak zaznaczono w protokole.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację konstruktów szczepionkowych wywołujących silną odporność komórkową.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Test ten wpisuje się w kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając monitorowanie odpowiedzi immunologicznej po identyfikacji wiodącej cząsteczki i przed badaniami nad skutecznością w warunkach wyzwania.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących epitopów limfocytów T oraz polaryzacji cytokin w odpowiedzi na antygeny szczepionkowe.
- Przesiewanie: Dostarcza ustandaryzowane, ilościowe wyniki umożliwiające porównanie immunogenności różnych projektów antygenów lub platform dostarczania.
- Analityka: Zapewnia pomiary jednostek tworzących plamki (SFU) dla IFN-gamma, co pozwala na statystyczne porównanie odpowiedzi immunologicznych w różnych punktach czasowych i grupach terapeutycznych.
- Badania translacyjne: Łączy wczesne profilowanie odpornościowe z efektywnością przedkliniczną poprzez śledzenie specyficznych dla antygenu odpowiedzi limfocytów T in vivo.
- Zastosowania instytucjonalne: Tworzy wielokrotnego użytku platformę immunomonitoringu opartą na PBMC, którą można zastosować w programach szczepionkowych przeciwko chorobom zakaźnym oraz w onkologii.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność w zakresie walidacji celu poprzez dostarczenie funkcjonalnych danych dotyczących limfocytów T specyficznych dla antygenu z modelu istotnego fizjologicznie.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki standaryzacji wstępnego przygotowania płytek, izolacji PBMC oraz etapów detekcji, co minimalizuje zmienność.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez ograniczenie wykorzystania zwierząt i umożliwienie gromadzenia danych od tych samych osobników w wielu punktach czasowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów na szczepionki z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o profile immunogenności komórkowej.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza z zakresu immunologii, izolacji komórek oraz techniki aseptycznej w celu zachowania żywotności PBMC i spójności analizy.
- Konieczny jest dostęp do czytników płytek ELISpot, inkubatorów, wirówek oraz odczynników, w tym przeciwciał anty-IFN-gamma przeciwko świniom indyjskim oraz substratu BCIP/NBT.
- Niezbędna jest standaryzacja działań w obrębie zespołów w zakresie czasu przetwarzania krwi, przemywania komórek i warunków stymulacji, aby zapewnić porównywalność danych.
- Przy adaptacji analizy do innych modeli gryzoni lub naczelnych należy uwzględnić walidację odczynników specyficznych dla danego gatunku.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność bezzwłocznego przetwarzania krwi w celu zachowania funkcji komórek oraz wymogi dotyczące postępowania z materiałami biologicznymi potencjalnie niebezpiecznymi, takimi jak ludzka lub zwierzęca krew oraz substraty fosfatazy alkalicznej.
Częste pytania dotyczące Biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:58
Preparation of ELISpot-plates and Cell-stimulation
2:09
Blood Sample Processing
3:44
Plate Preparation and Cell-plating
4:47
Detection of Interferon-gamma Positive Spots
6:34
Results: ELISpot Assay Used to Characterize T-cell Responses in Guinea Pigs
7:15
Conclusion
