Wykrywanie wirusa Tilapia Lake za pomocą konwencjonalnego RT-PCR i SYBR Green RT-qPCR

Witam wszystkich. Nazywam się Win Surachetpong. Jestem adiunktem na Wydziale Mikrobiologii i Immunologii Weterynaryjnej Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Kasetstart w Tajlandii.

Ja i mój zespół specjalizujemy się w pojawiających się chorobach wirusowych w tilapii. Obecnie pracujemy nad wirusem jeziora tilapia, który powoduje wysoką śmiertelność w tilapii. Ponieważ tilapia jest drugim najważniejszym gatunkiem ryb, który jest hodowany na całym świecie, stanowi źródło białka dla miliona ludzi i odgrywa ważną rolę w bezpieczeństwie żywnościowym.

Tak więc niedawny wybuch wirusa jeziora tilapia spowodował skutki społeczno-ekonomiczne, które skłoniły wielu naukowców do próby znalezienia rozwiązania tego problemu. Do tej pory potrzebna jest bardzo czuła, szybka i dokładna metoda wykrywania wirusa. W tym filmie pokażemy Ci krok po kroku, jak wykryć wirusa jeziora tilapia w tkance ryb, zaczynając od pobrania próbki, populacji próbki i analizy PCR w czasie rzeczywistym.

Najpierw rozpuść przedawkowanie oleju z tkanin w wodzie, aby poddać rybę eutanazji. Umieść martwą rybę na tacy, wysterylizuj sprzęt za pomocą 95% etanolu, a następnie spal palnikiem alkoholowym. Powoli rozetnij rybę od dolnej części brzucha w górę, aby zebrać wątrobę.

Zbierz część wątroby do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Pierwsza część ekstrakcji RNA powinna być wykonana w kapturze z przepływem laminarnym i nosić sprzęt ochronny. Dodaj jeden mililitr odczynnika do ekstrakcji RNA do probówki.

Sproszkować wątrobę za pomocą tłuczka tkankowego na jednorodną masę. Dodaj 200 mikrolitrów chloroformu do probówki. Następnie delikatnie wymieszaj, kilkakrotnie odwracając rurkę.

Odstawić na trzy minuty w temperaturze pokojowej. Wirować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy 12 000 RCF przez 15 minut. Ostrożnie zbierz probówki z wirówki.

Delikatnie przenieś 500 mikrolitrów bezbarwnej górnej górnej fazy wodnej do nowej probówki. Dodać jedną objętość izopropanolu do probówki. Podgrzewaj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez dwie godziny lub do nocy, aby wytrącić RNA.

Po inkubacji odwirować roztwór w tych samych warunkach wirówki. Zebrać probówki z wirówki, a następnie wyrzucić supernatant. Osad RNA można zobaczyć jako skierowany strzałką.

Dodaj jeden mililitr 75% etanolu do probówki, aby przepłukać osad RNA i kilkakrotnie odwróć. Wirować w temperaturze czterech stopni Celsjusza, w temperaturze 10 000 RCF przez 15 minut. Zebrać probówki z wirówki, a następnie wyrzucić supernatant.

Wyciągnij resztki etanolu za pomocą pipety automatycznej i wysusz na powietrzu w temperaturze pokojowej przez pięć do 10 minut. Dodaj od 30 do 60 mikrolitrów wody wolnej od RNaz, wstępnie podgrzanej do 55 do 60 stopni Celsjusza, aby rozpuścić osad RNA. Użyj jednego do dwóch mikrolitrów roztworu RNA, aby zmierzyć stężenie za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.

Wyniki pojawią się na ekranie. Rozcieńczyć stężenie do 200 nanogramów na mikrolitr za pomocą wody wolnej od RNazy. Przeprowadź syntezę cDNA przy użyciu substancji chemicznych i warunków wymienionych w następujący sposób.

Użyj termocyklera, aby przekształcić RNA w cDNA z sugerowanymi warunkami. Poniżej przedstawiono substancje chemiczne i warunki używane do określania obciążenia TiLV za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Dozować sześć mililitrów głównej mieszanki qPCR do każdej fiolki z białą probówką z paskami qPCR.

Następnie do studzienki ładowane są cztery mililitry próbki cDNA. Na tym etapie w każdym dołku należy wymienić nową końcówkę rury, aby uniknąć zanieczyszczenia z próbki na próbkę. Szczelnie uszczelnij pasek qPCR przezroczystą nasadką paska qPCR.

Delikatnie wymieszaj roztwór, przesuwając palcem po końcówce paska. Następnie odwiruj w dół za pomocą mikrowirówki, aby zebrać cały płyn na dnie naczyń. Użyj warunku dwuetapowego, jak pokazano na filmie, wybierz studzienkę w płytce 96-dołkowej, której zamierzasz użyć.

Wybierz cyber green jako florę do barwnika. Wybierz pozycję nieznany jako typ próbki i wstaw nazwę w polu nazwy próbki. Otwórz pokrywę maszyny do PCR w czasie rzeczywistym i umieść pasek qPCR w przypisanej studzience.

Następnie zamknij pokrywę. Uruchom maszynę z wybranym warunkiem. Maszyna uruchomi się i uruchomi, gdy pokrywa osiągnie żądaną temperaturę.

Po zakończeniu warunków qPCR pokazana jest krzywa amplifikacji. W tym miejscu strzałka szybkości wskazuje, gdzie poziom progowy odcina się między fazą wykładniczą a fazą liniową, co skutkuje wartością CT. Wartość CT jest następnie ekstrapolowana na liczbę kopii dziennika wirusa w celu obliczenia liczby pozostałości wirusa przy użyciu krzywej standardowej.

Szczyt topnienia jest również wyświetlany w celu określenia, czy wirus wykryty za pomocą qPCR to rzeczywiście TiLV, w którym szczyty topnienia zwykle mieszczą się w zakresie od 79,5 do 80,5 stopni Celsjusza. Mamy więc nadzieję, że metoda ta będzie ważnym narzędziem dla rolników i organizacji na całym świecie, którzy mogą wymagać wdrożenia kontroli i ograniczenia rozprzestrzeniania się zakażenia TiLV.