Wykrywanie wirusa Tilapia Lake za pomocą konwencjonalnego RT-PCR i SYBR Green RT-qPCR
10 listopada 2018
Ten protokół diagnozuje wirusa Tilapia Lake (TiLV) w tkankach tilapii za pomocą metodologii RT-PCR. Cała metoda jest opisana od rozwarstwienia tkanek do całkowitej ekstrakcji RNA, a następnie syntezy cDNA i wykrywania TiLV za pomocą konwencjonalnego PCR lub ilościowego PCR przy użyciu dsDNA wiążącego fluorescencyjny barwnik wiążący.
Witam wszystkich. Nazywam się Win Surachetpong. Jestem adiunktem na Wydziale Mikrobiologii i Immunologii Weterynaryjnej Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Kasetstart w Tajlandii.
Ja i mój zespół specjalizujemy się w pojawiających się chorobach wirusowych w tilapii. Obecnie pracujemy nad wirusem jeziora tilapia, który powoduje wysoką śmiertelność w tilapii. Ponieważ tilapia jest drugim najważniejszym gatunkiem ryb, który jest hodowany na całym świecie, stanowi źródło białka dla miliona ludzi i odgrywa ważną rolę w bezpieczeństwie żywnościowym.
Tak więc niedawny wybuch wirusa jeziora tilapia spowodował skutki społeczno-ekonomiczne, które skłoniły wielu naukowców do próby znalezienia rozwiązania tego problemu. Do tej pory potrzebna jest bardzo czuła, szybka i dokładna metoda wykrywania wirusa. W tym filmie pokażemy Ci krok po kroku, jak wykryć wirusa jeziora tilapia w tkance ryb, zaczynając od pobrania próbki, populacji próbki i analizy PCR w czasie rzeczywistym.
Najpierw rozpuść przedawkowanie oleju z tkanin w wodzie, aby poddać rybę eutanazji. Umieść martwą rybę na tacy, wysterylizuj sprzęt za pomocą 95% etanolu, a następnie spal palnikiem alkoholowym. Powoli rozetnij rybę od dolnej części brzucha w górę, aby zebrać wątrobę.
Zbierz część wątroby do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Pierwsza część ekstrakcji RNA powinna być wykonana w kapturze z przepływem laminarnym i nosić sprzęt ochronny. Dodaj jeden mililitr odczynnika do ekstrakcji RNA do probówki.
Sproszkować wątrobę za pomocą tłuczka tkankowego na jednorodną masę. Dodaj 200 mikrolitrów chloroformu do probówki. Następnie delikatnie wymieszaj, kilkakrotnie odwracając rurkę.
Odstawić na trzy minuty w temperaturze pokojowej. Wirować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy 12 000 RCF przez 15 minut. Ostrożnie zbierz probówki z wirówki.
Delikatnie przenieś 500 mikrolitrów bezbarwnej górnej górnej fazy wodnej do nowej probówki. Dodać jedną objętość izopropanolu do probówki. Podgrzewaj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez dwie godziny lub do nocy, aby wytrącić RNA.
Po inkubacji odwirować roztwór w tych samych warunkach wirówki. Zebrać probówki z wirówki, a następnie wyrzucić supernatant. Osad RNA można zobaczyć jako skierowany strzałką.
Dodaj jeden mililitr 75% etanolu do probówki, aby przepłukać osad RNA i kilkakrotnie odwróć. Wirować w temperaturze czterech stopni Celsjusza, w temperaturze 10 000 RCF przez 15 minut. Zebrać probówki z wirówki, a następnie wyrzucić supernatant.
Wyciągnij resztki etanolu za pomocą pipety automatycznej i wysusz na powietrzu w temperaturze pokojowej przez pięć do 10 minut. Dodaj od 30 do 60 mikrolitrów wody wolnej od RNaz, wstępnie podgrzanej do 55 do 60 stopni Celsjusza, aby rozpuścić osad RNA. Użyj jednego do dwóch mikrolitrów roztworu RNA, aby zmierzyć stężenie za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.
Wyniki pojawią się na ekranie. Rozcieńczyć stężenie do 200 nanogramów na mikrolitr za pomocą wody wolnej od RNazy. Przeprowadź syntezę cDNA przy użyciu substancji chemicznych i warunków wymienionych w następujący sposób.
Użyj termocyklera, aby przekształcić RNA w cDNA z sugerowanymi warunkami. Poniżej przedstawiono substancje chemiczne i warunki używane do określania obciążenia TiLV za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Dozować sześć mililitrów głównej mieszanki qPCR do każdej fiolki z białą probówką z paskami qPCR.
Następnie do studzienki ładowane są cztery mililitry próbki cDNA. Na tym etapie w każdym dołku należy wymienić nową końcówkę rury, aby uniknąć zanieczyszczenia z próbki na próbkę. Szczelnie uszczelnij pasek qPCR przezroczystą nasadką paska qPCR.
Delikatnie wymieszaj roztwór, przesuwając palcem po końcówce paska. Następnie odwiruj w dół za pomocą mikrowirówki, aby zebrać cały płyn na dnie naczyń. Użyj warunku dwuetapowego, jak pokazano na filmie, wybierz studzienkę w płytce 96-dołkowej, której zamierzasz użyć.
Wybierz cyber green jako florę do barwnika. Wybierz pozycję nieznany jako typ próbki i wstaw nazwę w polu nazwy próbki. Otwórz pokrywę maszyny do PCR w czasie rzeczywistym i umieść pasek qPCR w przypisanej studzience.
Następnie zamknij pokrywę. Uruchom maszynę z wybranym warunkiem. Maszyna uruchomi się i uruchomi, gdy pokrywa osiągnie żądaną temperaturę.
Po zakończeniu warunków qPCR pokazana jest krzywa amplifikacji. W tym miejscu strzałka szybkości wskazuje, gdzie poziom progowy odcina się między fazą wykładniczą a fazą liniową, co skutkuje wartością CT. Wartość CT jest następnie ekstrapolowana na liczbę kopii dziennika wirusa w celu obliczenia liczby pozostałości wirusa przy użyciu krzywej standardowej.
Szczyt topnienia jest również wyświetlany w celu określenia, czy wirus wykryty za pomocą qPCR to rzeczywiście TiLV, w którym szczyty topnienia zwykle mieszczą się w zakresie od 79,5 do 80,5 stopni Celsjusza. Mamy więc nadzieję, że metoda ta będzie ważnym narzędziem dla rolników i organizacji na całym świecie, którzy mogą wymagać wdrożenia kontroli i ograniczenia rozprzestrzeniania się zakażenia TiLV.
Przegląd
Niniejszy protokół szczegółowo opisuje diagnostykę wirusa jeziornej tilapii (TiLV) w tkankach tilapii z wykorzystaniem metodologii RT-PCR. Obejmuje on cały proces, od sekcji tkanek, przez ekstrakcję RNA, syntezę cDNA, aż po wykrywanie TiLV za pomocą konwencjonalnego lub ilościowego PCR.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia weterynaryjna
- Wirusologia
- Zarządzanie zdrowiem ryb
Wstęp
- Wirus jeziornej tilapii (Tilapia Lake Virus) powoduje znaczną śmiertelność tilapii, wpływając na bezpieczeństwo żywnościowe.
- Tilapia jest drugą najważniejszą gatunkowo rybą na świecie.
- Szybkie i dokładne metody detekcji są niezbędne do opanowania ognisk choroby.
- Celem niniejszego protokołu jest przedstawienie niezawodnej metody wykrywania TiLV.
Cel badania
- Opracowanie wysoce czułej metody wykrywania TiLV w tkankach ryb.
- Wsparcie hodowców i organizacji w kontrolowaniu rozprzestrzeniania się TiLV.
- Dostarczenie szczegółowej instrukcji krok po kroku dla badaczy i praktyków.
Zastosowane metody
- Pobieranie próbek i uśmiercanie ryb przy użyciu oleju goździkowego.
- Ekstrakcja RNA z tkanki wątroby w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
- Synteza cDNA, a następnie reakcja real-time PCR w celu wykrycia TiLV.
- Analiza krzywych amplifikacji i wartości CT w celu ilościowego oznaczenia ładunku TiLV.
Główne wyniki
- Skuteczna ekstrakcja i kwantyfikacja RNA z tkanek tilapii.
- Wykrywanie TiLV przy użyciu techniki real-time PCR w określonych warunkach.
- Ustanowienie krzywej standardowej do kwantyfikacji wirusa.
- Identyfikacja TiLV poprzez analizę peaków topnienia.
Wnioski
- Protokół zapewnia niezawodną metodę wykrywania TiLV.
- Może on wspomagać zarządzanie ogniskami choroby oraz zapewniać bezpieczeństwo żywnościowe.
- Przyszłe zastosowania mogą usprawnić kontrolę chorób wirusowych w akwakulturze.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Szybka i czuła detekcja wirusa jeziornej tilapii (TiLV) ma kluczowe znaczenie dla biosekurecji i zarządzania chorobami w akwakulturze, co bezpośrednio wpływa na bezpieczeństwo żywnościowe oraz globalne łańcuchy dostaw białka. Integracja konwencjonalnej metody RT-PCR oraz RT-qPCR z wykorzystaniem SYBR Green umożliwia zarówno jakościową, jak i ilościową detekcję wirusa, wspierając programy wczesnej interwencji i nadzoru. Ta diagnostyka molekularna dostarcza praktycznych danych niezbędnych do ograniczania ryzyka i przydzielania zasobów w warunkach badawczych oraz operacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępna faza odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjną detekcję RNA TiLV, wspierając nadzór nad patogenami oparty na hipotezach.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez odróżnianie próbek tkanek zainfekowanych od niezainfekowanych.
- Zwiększa pewność prognostyczną w monitorowaniu chorób i strategiach reagowania na ogniska epidemiczne.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane protokoły ekstrakcji RNA oraz konfiguracji testu qPCR, gwarantując powtarzalność.
- Dostarcza wyników ilościowych (wartości CT, liczba kopii wirusa) w celu rzetelnej standaryzacji testu.
- Umożliwia skalowalny screening dużych kohort próbek na potrzeby badań nadzorczych i naukowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wspiera rozwój biomarkerów translacyjnych poprzez ilościowe określanie ładunku wirusa w przypadkach podklinicznych.
- Zapewnia ciągłość od detekcji laboratoryjnej po nadzór terenowy i planowanie interwencji.
- Ogranicza ryzyko biologiczne w walidacji modeli przedklinicznych w badaniach nad chorobami organizmów wodnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten podwójny schemat PCR łączy wczesny etap odkrywania, opracowywanie testów oraz badania translacyjne w zakresie wodnych patogenów wirusowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie mechanizmów dynamiki zakażeń TiLV.
- Przesiewy: Zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty do analizy próbek wysokoprzepustowych.
- Analityka: Dostarcza wartości CT oraz kwantyfikację opartą na krzywej standardowej do badań porównawczych.
- Badania translacyjne: Umożliwia wykrywanie zakażeń o niskim poziomie, co wspiera strategie nadzoru i interwencji.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje zestandaryzowany, adaptowalny protokół do ciągłych programów nadzoru i badań.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność w wykrywaniu patogenów.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność procesów diagnostycznych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go w przypadku odpowiedzi na ogniska epidemiczne i rozmieszczania zasobów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację działań nadzorczych i interwencyjnych w oparciu o analizę ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu biologii molekularnej oraz konfiguracji testów qPCR.
- Wymaga dostępu do odczynników do ekstrakcji RNA, termocyklerów i aparatury do PCR w czasie rzeczywistym.
- Wymaga rygorystycznej standaryzacji między zespołami w celu zapewnienia porównywalności danych.
- Możliwość adaptacji do różnych typów tkanek i macierzy próbek poprzez optymalizację protokołu.
- Zależność od jakości próbek i integralności RNA w celu uzyskania wiarygodnych wyników.
