Name: Wykrywanie wirusa Tilapia Lake za pomocą konwencjonalnego RT-PCR i SYBR Green RT-qPCR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Poznaj metodę wykrywania wirusa Tilapia Lake w tkankach ryb za pomocą RT-PCR i RT-qPCR. Protokół obejmuje ekstrakcję RNA, syntezę cDNA oraz analizę krzywych amplifikacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Instytutowi Bakteriologii Weterynaryjnej, Wydziale Vetsuisse, Uniwersytetowi w Bernie za wsparcie. Praca ta została sfinansowana przez Komitet ds. Promocji Akademickiej Naukowców na Wczesnym Etapie Kariery i Równości Płci na Wydziale Vetsuisse Uniwersytetu w Bernie poprzez 120% modelowego finansowania przyznanego PN. WS i PR są wspierane przez Center for Advanced Studies for Agriculture and Food, Institute for Advanced Studies, Kasetsart University, Bangkok, Tajlandia w ramach Promocji Badań Szkolnictwa Wyższego i Narodowego Projektu Uniwersytetu Badawczego Tajlandii, Biuro Komisji Szkolnictwa Wyższego, Ministerstwo Edukacji, Tajlandia. Chcielibyśmy podziękować dr Kwanrawee Sirikanchana za jej narrację oraz Piyawatcharze Sikarin za montaż filmu.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

TiLV został po raz pierwszy zgłoszony w 2014 roku w Izraelu14 i od tego czasu został zidentyfikowany w wielu krajach, w tym w Egipcie, Kolumbii, Indiach, Malezji, Ugandzie, Tanzanii i Tajlandii 15,16,18,35,48. Światowa świadomość, szczególnie w krajach produkujących tilapię, zwróciła większą uwagę na wirusa i wdrożono różne ograniczenia i środki kontroli ze strony władz rządowych, próbując zapobiec rozprzestrzenianiu się TiLV. W tym miejscu wyjaśniono szczegółowy protokół wykrywania TiLV w tkance tilapii, obejmujący pobieranie próbek, izolację RNA, syntezę cDNA, testy PCR i qPCR. Istnieją różne aspekty tych metod, które wymagają szczegółowej dyskusji. TiLV zidentyfikowano dotychczas u ryb o różnych rozmiarach 9,12,14,15,49 i gatunkach tilapii, w tym tilapii hybrydowej hodowlanej (O. niloticus x O. aureus)11,14, tilapii nilowej (O. niloticus)9,10,14,15,16, 33,35,36,49,50 i tilapia czerwona (Oreochromis sp.)16,33,48,51, a także w dzikiej tilapii nilowej 9,12, tilapia51, T. zilli14,15, S. galilaeus, O. aureus i T. u dzikich karpi (Barbonymus schwanenfeldii) zidentyfikowano simonis intermedia 14, a całkiem niedawno TiLV u dzikich karpi (Barbonymus schwanenfeldii)52. Próbki tkanek z narządów wewnętrznych (skrzela, śledziona, wątroba, serce, głowa, nerka) lub śluzu37 mogą być pobierane zarówno ze zdrowej, jak i umierającej tilapii, niezależnie od wieku, wielkości lub gatunku, i przetwarzane w celu izolacji RNA. Przedstawiony tutaj protokół ekstrakcji całkowitego RNA wykorzystuje jednofazowy roztwór fenolu i tiocyjanianu guanidyny, który jest chaotropowym środkiem denaturującym. Tkanki są bezpośrednio homogenizowane w tym roztworze, a następnie dodawane jest chloroform i odwirowywane w celu uzyskania separacji faz, w której generowany jest przezroczysty RNA zawierający górną fazę wodną, interfazę i dolną fazę organiczną. RNA jest izolowane z fazy wodnej przez wytrącanie izopropanolu, a następnie płukanie odzyskanego RNA w celu pozbycia się zanieczyszczeń. Izolacja RNA za pomocą tej metodologii została zapoczątkowana przez Piotra Chomczyńskiego i Nicolettę Sacchi i została określona jako ekstrakcja tiocyjanianu guanidyny, fenolu i chloroformu53,54. Ten rodzaj odczynnika używanego do ekstrakcji RNA można kupić komercyjnie lub wyprodukować w laboratorium (więcej informacji znajduje się w Tabeli materiałów). Protokół ten trwa nieco dłużej niż metody oparte na kolumnach, takie jak oczyszczanie na bazie krzemionki, ale ogólnie rzecz biorąc, jest bardziej opłacalny i daje więcej RNA.
W tym protokole przedstawiono ilościowe określanie RNA przy użyciu wartości A260, przy czym wartości spektrofotometrii mogą wskazywać na jakość RNA (A260/A280 = 1,9 - 2,1). Chociaż metoda ta daje dobre wskazanie czystości próbki, nie może całkowicie informować o jakości wyekstrahowanego RNA. Aby prawidłowo określić, czy RNA jest nienaruszone, czy częściowo zdegradowane, próbki można rozdzielić za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, w której rozmazywanie prążków 18S i 28S rRNA barwionych EtBr wskazuje na degradację RNA. Dalsza weryfikacja jakości RNA może obejmować użycie instrumentu lab-on-a-chip. Ponadto ważne jest również trawienie oczyszczonego RNA za pomocą DNazy I w celu usunięcia zanieczyszczającego genomowego DNA gospodarza, które w zależności od dalszych zastosowań może prowadzić do fałszywych wyników. Jeśli gDNA gospodarza nadal w dużym stopniu zanieczyszcza próbkę RNA, można również przeprowadzić dodatkowe leczenie DNaząI pod koniec procedury ekstrakcji RNA (patrz tabela materiałów).
Komplementarna synteza DNA może znacznie wpłynąć na ogólne wyniki qPCR i jest aspektem metody, który może wprowadzać zmienność. Zalecany tutaj protokół cDNA składa się z pojedynczego zestawu komponentów przy użyciu oligo (dT), a zatem transkrybuje tylko mRNA zawierające ogony poliA. Pozwala użytkownikowi dokładnie kontrolować, które składniki mają być użyte w reakcji odwrotnej transkrypcji, a ten tryb syntezy cDNA okazał się skuteczny w wykrywaniu TiLV32. Alternatywą dla tego zestawu jest kupowana na rynku mieszanka wzorcowa zawierająca wszystkie składniki wymagane do reakcji odwrotnej transkrypcji i jest bardzo szybka i prosta bez zwykłego wieloetapowego, Protokół pipetowania i wielotemperaturowy. Jest to korzystne, ponieważ minimalizuje obsługę i zapewnia jednorodność we wszystkich próbkach. Takie mieszanki główne często zawierają zarówno oligo(dT), jak i losowe startery, dzięki czemu mają zastosowanie do różnych matryc RNA i generują reprezentatywne kopie cDNA sekwencji z całej długości RNA w populacji (mRNA gospodarza wirusa i tilapii), a teoretycznie każdy pożądany gatunek RNA można następnie zmierzyć za pomocą konwencjonalnego PCR lub qPCR z takiej próbki. Ta wszechstronność jest główną zaletą 2-etapowego podejścia RT-PCR; Zapewnia długoterminową pulę, którą można wykorzystać do wielu różnych eksperymentów. W uzyskanych wynikach przedstawiono jednoetapowe podejście RT-PCR, w którym zastosowano startery specyficzne dla sekwencji (Tabela 1), a RT i PCR przeprowadzono w jednej probówce (patrz lista materiałów). Ogólnie rzecz biorąc, startery specyficzne dla sekwencji pozwalają na wyższą wydajność RT specyficznego docelowego RNA niż przy użyciu losowego primingu, ale specyficzny docelowy RNA jest jedynym, który można określić ilościowo w takiej próbce cDNA, co może być jedynym celem niektórych laboratoriów (patrz Tabela materiałów dla sugestii produktów syntezy cDNA).
Podczas gdy konwencjonalny RT-PCR wydaje się być powszechnie stosowany do tej pory w diagnostyce TiLV 9,13,14,15,16,17,18,33,35,48,55. Wykazano, że RT-qPCR jest skuteczniejszym narzędziem do wykrywania i oznaczania ilościowego niewielkich ilości TiLV w tkankach ryb lub śluzie32,37. Ogólnie rzecz biorąc, qPCR jest szeroko stosowany w klinicznych laboratoriach diagnostycznych wirusologii ze względu na wysoką czułość, specyficzność, dobrą odtwarzalność, szeroki zakres dynamiki i szybkość21. Chociaż qPCR może być początkowo droższy do wdrożenia niż konwencjonalny RT-PCR, oferuje wiele ważnych zalet w porównaniu z konwencjonalnym PCR; ma szybszy czas realizacji od próbki do wyników i nie wymaga żadnych kroków po PCR. Ten ostatni punkt oznacza, że ryzyko zanieczyszczenia laboratorium jest minimalne i można go łatwiej dostosować do sytuacji o wysokiej przepustowości, takich jak w przypadku ognisk choroby. Ponadto jest z natury bardziej czuły niż konwencjonalny RT-PCR, co ma kluczowe znaczenie dla wykrywania niskiego miana wirusa w infekcjach subklinicznych21. Wymagałoby to zagnieżdżonego podejścia PCR wymagającego odwrotnej transkrypcji, dwóch dalszych reakcji PCR, a następnie analizy za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Te wiele kroków zajmuje dużo czasu i zwiększa ryzyko błędów lub zanieczyszczenia. Niemniej jednak, ze względu na wysoką czułość, RT-qPCR wymaga skrupulatnego projektowania eksperymentalnego i dokładnego zrozumienia technik kwantyfikacji w celu uzyskania precyzyjnych wyników56,57.
W protokole tym wykazano obecność fluoroforu wiążącego DNA, SYBR Green I. Jest to niespecyficzny barwnik wiążący DNA dsDNA, a zatem specyficzność testu leży całkowicie w zestawie starterów, które mogą generować wyniki fałszywie dodatnie58. W związku z tym, podczas gdy analiza krzywej topnienia dsDNA wykonywana na końcu każdego PCR jest szczególnie ważną częścią reakcji PCR, ponieważ potwierdza, że wytwarzany jest tylko jeden amplikon PCR o prawidłowymT m (należy to również osiągnąć za pomocą elektroforezy żelowej, gdy wdrażane są nowe testy). Tm fragmentu DNA zależy od wielu cech, takich jak jego długość, skład GC, sekwencja, komplementarność nici, stężenie, a także od składników buforowych i wzmacniaczy PCR. Analizy krzywej topnienia w reprezentatywnych wynikach pokazanych z dwóch laboratoriów nie wykazały obecności dimerów starterów ani innych niepożądanych produktów PCR, ale jeśli zaobserwuje się to w przypadku innych próbek i/lub konfiguracji eksperymentalnych, test powinien zostać ponownie zoptymalizowany. Bardziej zaawansowane technologie qPCR nie wymagają takiego kroku krzywej topnienia i rzeczywiście, od czasu napisania tego artykułu dotyczącego tej metody, TiLV RT-qPCR oparty na TaqMan został opracowany przy użyciu dwóch starterów i sondy, dzięki czemu jest wysoce specyficzny dla TiLV34.
Niewątpliwie startery zaprojektowane do testów RT-qPCR mają fundamentalne znaczenie dla powodzenia testu, a startery zostały zaprojektowane w oparciu o publicznie dostępne dane genomiczne TiLV w tamtym czasie32. Jednak wirusy RNA są dobrze znane z tego, że wykazują wysokie wskaźniki mutacji, a ewentualne szczepy unikną obecnych testów diagnostycznych, jak zaobserwowano w przypadku ISAV59. Takim typom wirusów zawsze będzie trudno wygenerować uniwersalny test pan-TiLV RT-qPCR, a takie testy będą stale ulepszane tylko wtedy, gdy dostępnych będzie więcej danych genomowych TiLV z odległych lokalizacji i okresów.
Wreszcie, konieczne jest przeprowadzenie podwójnych lub, jeśli to możliwe, potrójnych reakcji zarówno w testach wewnątrz, jak i między-qPCR. Jeśli wartości Ct są bardzo wysokie, zastosowanie kontrprób jest szczególnie ważne w celu upewnienia się, że reakcja PCR jest wiarygodna i odtwarzalna. Zasadniczo, jeśli dane z reakcji powtórzonych różnią się o więcej niż 0,5 cyklu, reakcje należy powtórzyć, a jeśli wartości Ct stale zmieniają się > 0,5 cykli w powtórzeniach, test powinien zostać ponownie zoptymalizowany. Zastosowanie zintegrowanego robota pipetującego qPCR ogromnie pomaga w rozwiązaniu tego problemu, ale jest to narzędzie luksusowe. Podobnie jak w przypadku każdego eksperymentu, włączenie odpowiednich i odpowiednich kontroli ma ogromne znaczenie dla opracowania solidnych testów molekularnych, zwłaszcza w laboratoriach diagnostycznych, w których takie testy muszą być akredytowane. Kontrole powinny obejmować dodatnie (dodatnia próbka TiLV, wzorzec plazmidu TiLV) i kontrole ujemne (NTC i -RT), a także wykrywanie endogennych genów porządkowych tilapii. Takie kontrole nie mogą być niedoceniane i powinny być uwzględniane w każdym badaniu, aby właściwie zrozumieć jakość każdego etapu testu i właściwie zinterpretować wyniki.

Globalna podaż ryb capita osiągnęła nowy rekord 20 kg w 2014 roku, co było spowodowane dynamicznym wzrostem w akwakulturze. Akwakultura pozostaje jednym z najszybciej rozwijających się sektorów produkcji żywności dla zwierząt na świecie i jest jedynym sektorem produkcji żywności dla zwierząt, który rozwija się szybciej niż populacja ludzka1. Tilapiine cichilds to druga najważniejsza ryba słodkowodna hodowana na świecie, o całkowitej globalnej produkcji 6,4 miliona ton (MT) i szacowanej wartości 9,8 miliarda dolarów amerykańskich w 2015 roku2. Dziesięciu największych producentów tilapii to Chiny (1,78 MT), Indonezja (1,12 MT) i Egipt (0,88 MT), a następnie Bangladesz, Wietnam, Filipiny, Brazylia, Tajlandia, Kolumbia i Uganda2. Oczekuje się, że do 2030 r. światowa produkcja tilapii wyniesie około 7,3 MT3. Tilapia stały się tak ważnym globalnym źródłem pożywienia nie tylko dlatego, że są niedrogim źródłem białka4, ale także dlatego, że są łatwe do rozmnażania w szerokim zakresie warunków wodnych i klimatycznych5,6. Jeszcze kilkadziesiąt lat temu uważano, że istnieje niewiele istotnych z handlowego punktu widzenia chorób zagrażających uprawie tilapii, ale to już nie jest prawda. Pojawiająca się choroba wirusowa zwana chorobą wirusa jeziora tilapii (TiLVD) jest pierwszą w historii krytyczną epidemią choroby stwierdzoną w tilapii, a cała branża jest zagrożona. Choroba ta ma poważne konsekwencje społeczno-ekonomiczne i stanowi bezpośrednie zagrożenie dla bezpieczeństwa żywnościowego milionów ludzi w Afryce7, Azji i Ameryce Południowej. Na początku 2018 roku Światowa Organizacja Zdrowia Zwierząt (OIE) poinformowała, że czynnik etiologiczny tej choroby, TiLV, został oficjalnie wykryty na trzech kontynentach obejmujących osiem krajów8, a od czasu aktualizacji tej karty informacji o patogenach pojawiło się więcej doniesień o TiLV w Tanzanii, Ugandzie9, Indonezji10, Tajwan11 i Peru12. TiLV jest nowym jednoniciowym wirusem RNA, opisanym jako wirus podobny do ortomykso, ponieważ zawiera różnorodne cechy przypominające inne ortomyoksowirusy, takie jak wirus grypy lub zakaźnej anemii łososia (ISAV)13. Po raz pierwszy został zidentyfikowany w następstwie ogromnych strat dzikich i hodowlanych tilapii w Jeziorze Galilejskim, Izrael14. Następnie podobne ogniska choroby określane jako śmiertelność letnia i zespół jednomiesięcznej śmiertelności związany z zakażeniem TiLV odnotowano odpowiednio w tilapii nilowej (Oreochromis niloticus) w Egipcie15 oraz tilapii nilowej i czerwonej hybrydowej (Oreochromis spp.) w Tajlandii16. Historycznie rzecz biorąc, wykrywanie wirusów zwierząt wodnych odbywa się poprzez wzrost i izolację wirusów w hodowli komórkowej. Różne linie komórkowe zostały przetestowane pod kątem rozmnażania i izolacji TiLV, w tym komórki E-11 pochodzące z ryby wężogłowej (Ophiocephalus striatus)17,18, OmB i TmB pochodzące z Oreochromis mossambicus18 oraz OnlB i OnlL pochodzące z tilapii nilowej (O. niloticus)19. O ile hodowla wirusa ma tę zaletę, że dostarcza materiału do dalszych eksperymentów, o tyle wadą jest to, że potrzebuje co najmniej 4-7 dni, aby zaobserwować powstawanie efektów cytopatycznych (CPE), a co najważniejsze, różne wirusy ryb, które są bardziej przystosowane do replikacji, mogą się rozmnażać i wytwarzać podobne CPE.
W ciągu ostatnich kilku dekad nastąpiło odejście od tradycyjnych, często czasochłonnych metod diagnostycznych, takich jak hodowla komórkowa, serologia i wykrywanie antygenów oraz zastępowanie ich szybszymi i bardziej czułymi testami wykrywania opartymi na kwasach nukleinowych20,21. Świadczy o tym fakt, że wiele testów qPCR zostało opracowanych jako ważne metody diagnostyczne dla wielu chorób wirusowych zwierząt wodnych, takich jak ISAV22,23, wirusowy wirus posocznicy krwotocznej (VHSV)24,25, betanodavirus26,27 alfawirus łososiowa28, irydowirus ryb29, Anguillid herpesvirus 1 (AngHV1)30, oraz wirus choroby limfocysty (LCDV)31. Pilnie potrzebne są solidne metody diagnozowania i nadzoru nad patogenami w celu ograniczenia rozprzestrzeniania się TiLV. Takie metody powinny umożliwiać wczesne wykrycie zakażenia przed wystąpieniem objawów klinicznych oraz wykrycie niskiego miana wirusa. Do tej pory do wykrywania TiLV w tkankach ryb opracowano różne protokoły PCR, w tym RT-PCRxref">14,32, zagnieżdżone RT-PCR18, częściowo zagnieżdżone RT-PCR i RT-qPCR32,34. Porównanie izolacji RT-qPCR i wirusa w podatnych liniach komórkowych do wykrywania TiLV wykazało, że RT-qPCR był 1000 razy bardziej czuły niż izolacja wirusa32. Chociaż każdy opublikowany protokół PCR zgłaszał różne czułości wykrywania TiLV, większość testów jest bardzo czuła, a granice wykrywalności kopii wirusa wynoszą 7,5 kopii33, 7 kopii18 lub 2 kopie32 na reakcję.
Celem tego artykułu o metodach jest szczegółowe wyjaśnienie, jak przeprowadzać testy wykrywania TiLV, zaczynając od pobrania tkanki tilapii, poprzez ekstrakcję całkowitego RNA, syntezę cDNA, a następnie testy PCR specyficzne dla TiLV. W szczególności opisano kompleksowe protokoły zarówno konwencjonalnego RT-PCR, jak i zielonego RT-qPCR opartego na SYBR, aby spodobać się szerokiemu gronu naukowców dążących do wykrycia TiLV. Ta pierwsza jest mniej czuła, ale jest zazwyczaj tańszą opcją wykrywania. Ten ostatni wymaga bardziej skomplikowanej infrastruktury, takiej jak ilościowa maszyna do PCR i droższe odczynniki, ale ma zalety tego, że jest ilościowy, szybki i bardzo czuły, co oznacza, że może być stosowany do wykrywania TiLV u subklinicznie zakażonych ryb. Protokoły RT-PCR i RT-qPCR przeprowadzono w dwóch różnych laboratoriach z różnymi izolatami geograficznymi TiLV, a zawarte wyniki podkreślają czułość i odtwarzalność opisanych tutaj testów.

<table><tbody><tr><td>Tissue collection</td><td></td><td></td><td>Step 1</td></tr><tr><td>Metanosulfonian trikainy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>Alternatywa dla olejku goździkowego. Krok 1.1</td></tr><tr><td>Roztwór do stabilizacji RNAlater</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; AM7020</td><td>Do przechowywania tkanek, jeśli nie można ich natychmiast przetworzyć Krok 1.3</td></tr><tr><td>< ekstrakcja >RNA</td><td></td><td></td> <td>Krok 2</td></tr><tr><td>TRIodczynnik</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td>Krok 2.1</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>15596026</td><td>Krok 2.1</td></tr><tr><td>GENEzol</td><td>Geneaid</td><td>GZR100</td><td>Krok 2.1</td></tr><tr><td>Trisure</td><td>Bioline</td><td>BIO-38032</td><td>Krok 2.1</td></tr><tr><td>Domowe rozwiązanie</td><td>&nbsp;-</td><td>&nbsp;-</td><td>94,53 g/L (800 mM) tiocyjanian guanidyny 30,45 g/L&nbsp; (400 mM) tiocyjanian amonu 8,20 g/L&nbsp; (100 mM) octan sodu 380 mL/L&nbsp; (38 % v/v) fenol 50 ml/l (5 % v/v) glicerol 1,0 g/l (0,1 % w/v) 8-chinolinol, pH 5,0 Przechowywać do 2 lat w temperaturze 4oC Krok 2.1</td></tr><tr><td>MagNA Lyser Green Beads</td><td>Roche</td><td>3358941001</td><td>Alternatywna metoda homogenizacji tkanek stosowana w połączeniu z maszynami do lizy tkanek opisanymi poniżej Krok 2.2</td></tr><tr><td>Lysing Matrix D, probówka 2 ml</td><td>MP BIOMEDICALS</td><td>116913050</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>Krok 2.3</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>RCI Labscan</td><td>AR1027E-G2.5L</td><td>Krok 2.3</td></tr><tr><td>1-bromo-3-chloropropan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9673</td><td>Mniej toksyczna alternatywa dla chloroformu Etap 2.3</td></tr><tr><td>Izopropanol (GC) > 99,8 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59300</td><td>Krok 2.6</td></tr><tr><td>Izopropanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur)</td><td>Merck KGaA (EMSURE)</td><td>1.09634.2500</td><td>Krok 2.6</td></tr><tr><td>Glikogen, klasa biologii molekularnej (np. Sigma, nr kat. G1767)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Thermo Scientific)</td><td>R0551</td><td>Przydatny krok, jeśli materiał wyjściowy tkanki jest mały, aby zmaksymalizować wytrącanie RNA opcjonalnie</td></tr><tr><td>Etanol (czystość (GC) &ge; 99,9</td>% <td>Sigma-Aldrich (EMD Millipore)</td><td>1.00983</td><td>Krok 2.9</td></tr><tr><td>Etanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur)</td><td>Merck (EMSURE)</td><td>1.00983.2500</td><td>Krok 2.9</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Promega</td><td>P1193</td><td>Krok 2.13</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Multicell</td><td>809-115-CL</td><td>Krok 2.13</td></tr><tr><td>Zestaw Ambion TURBO bez DNA&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>AM1907</td><td>Może być wykonywany na końcu protokołu ekstrakcji RNA opcjonalnie</td></tr><tr><td><silna>synteza cDNA</td><td></td><td></td><td>Krok 4</td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy cDNA</td><td>Vivantis</td><td>cDSK01</td><td>Krok 4.1 i 4.3</td></tr><tr><td>ReverTra Ace qPCR RT MasterMix z usuwaczem gDNA</td><td>Toyobo</td><td>A1172K</td><td>Alternatywna opcja&nbsp; zobacz dyskusję</td></tr><tr><td>ReverTra Ace qPCR RT Kit</td><td>Toyobo</td><td>FSQ-101</td><td>Alternatywna opcja&nbsp; zobacz dyskusję</td></tr><tr><td>AffinityScript Odwrotna transkryptaza wielokrotnej temperatury&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>600107</td><td>Alternatywna opcja&nbsp;</td></tr><tr><td>< silny> PCR< / silny></td><td></td><td></td><td>Krok 5</td></tr><tr><td>< silne>systemy polimerazy DNA: </td><td></td><td></td><td>Krok 5.2</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; - Platinum II Hot-Start Green PCR Master Mix (2X)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)&nbsp;</td><td>14001012a</td><td>Krok 5.2</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; - GoTaq Mastermix</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td>Krok 5.2</td></tr><tr><td>Oddzielne składniki mieszaniny PCR:</td><td></td><td></td><td>Krok 5.2</td></tr><tr><td>10mM dNTP Mix</td><td>Vivantis</td><td>NP2409</td><td>Krok 5.2</td></tr><tr><td>25mM MgCl2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0971</td><td>Krok 5.2</td></tr><tr><td>10X bufor Taq z KCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00348114</td><td>Krok 5.2</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Taq</td><td>Vivantis</td><td>PL1202</td><td>Krok 5.2</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; - Verso 1-etapowy RT-PCR ReddyMix z ThermoPrime Taq</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>AB1454</td><td>Jednoetapowy RT-PCR zilustrowany na rysunku 3B</td></tr><tr><td>Elektroforeza żelowa: </td><td></td><td></td><td>Do wizulacji produktów PCR z etapów 5.1-5.4</td></tr><tr><td>Roztwór bromku etydyny (10 mg / ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17898</td><td>Krok 5.5</td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> Tris/Acetic/EDTA (TAE): <td>Krok 5.5</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; -</td><td>Tris Vivantis</td><td>PR0612-1KG</td><td>Krok 5.5</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; - Kwas octowy (lodowaty) (ACS, ISO, Reag. Ph Eur)</td><td>Merck KGaA (EMSURE)</td><td>1.00063.2500</td><td>Krok 5.5</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; - Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0729</td><td>Krok 5.5</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Vivantis</td><td>PC0701-100G</td><td>Krok 5.5</td></tr><tr><td>Drabinki i markery DNA</td><td>Vivantis</td><td>NL1405</td><td>Krok 5.5</td></tr><tr><td>Barwnik ładujący żel DNA (6X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0611</td><td>Krok 5.5</td></tr><tr><td>qPCR</td><td></td><td></td><td>Krok 6</td></tr><tr><td>PowerUP SYBR Green Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)</td><td>A25779</td><td>Zilustrowany na rysunkach 4-6B Krok 6.2</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>BIO-RAD</td><td>1725120</td><td>zilustrowany na filmie i rysunkach 4-6A Krok 6.2</td></tr><tr><td>Sprzęt&nbsp; Tłuczek do mielenia tkanek </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dounce</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1110</td><td>Protokół 2</td></tr><tr><td>MagNA Lyser Instrument</td><td>Roche</td><td>3358976001</td><td>Alternatywna opcja homogenizacji tkanek dla protokołu 2, która jest stosowana w połączeniu z kulkami lizującymi opisanymi powyżej Krok 2.2</td></tr><tr><td>Homogenizator FastPrep-24 5G</td><td>MP BIOMEDICALS</td><td>116005500</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka z chłodzeniem</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf 5427R</td><td>Protokół 2 Krok&nbsp; 2.4, 2.7 & 2.10</td></tr><tr><td>Mikrowirówka z chłodzeniem</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf 5418R</td><td></td></tr><tr><td>Skrzynka grzewcza</td><td>Labnet</td><td>AccuBlock Cyfrowy protokół suchej kąpieli</td><td>2 Krok 2.13</td></tr><tr><td>Spektrofotometr mikroobjętościowy&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)</td><td>Protokół Nanodrop 2000</td><td>3 Krok 3.1 - 3.4</td></tr><tr><td>Maszyna do PCR</td><td>Protokół termocyklera BIO-RAD</td><td>T100</td><td>5 Krok 5.4</td></tr><tr><td>Zasilanie</td><td>Protokół BIO-RAD</td><td>PowerPac HC</td><td>5 Krok 5.5</td></tr><tr><td>Pozioma elektroforeza żelowa</td><td>Protokół #1704487edu komórek BIO-RAD</td><td>Mini ReadySub-Cell GT</td><td>5 Krok 5.5</td></tr><tr><td>Mini mikrowirówka</td><td>Corning</td><td>LSE 6766</td><td>Przydatna do szybkiego odkręcania probówek reakcyjnych PCR w protokołach 4, 5 i 6 Krok 6.5.1</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>LioFuge</td><td>LM-60</td><td>Krok 6.5.1</td></tr><tr><td>Maszyna i oprogramowanie qPCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7500 Szybki system PCR w czasie rzeczywistym z oprogramowaniem 7500 Protokół v2.0</td><td>6 Krok 6.6-6.8</td></tr><tr><td>Maszyna qPCR i oprogramowanie</td><td>BIO-RAD</td><td>CFX96 Dotykowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistym z oprogramowaniem</td><td></td> CFX Manager</tr><tr><td>General Materials&nbsp; Nożyczki </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mayo</td><td>Krok 1.1-1.2</td>Kleszcze Krok 1.1-1.2 Pipeta Rainin Pipet-Lite XLS Końcówki do pipet barierowych dla aerozoli Sigma-Aldrich Z333328, Z333336, Z333344 Probówki do mikrowirówek 1,5 ml bez nukleaz Eppendorf <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie wirusa tilapia lake za pomocą konwencjonalnego rt-pcr i sybr green rt-qpcr

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

Celem tej metody jest ułatwienie szybkiego, czułego i specyficznego wykrywania wirusa Tilapia Lake (TiLV) w tkankach tilapii. Protokół ten może być stosowany w ramach programów nadzoru, środków bezpieczeństwa biologicznego oraz w podstawowych laboratoriach badawczych TiLV. Złoty standard diagnostyki wirusów zazwyczaj obejmuje izolację wirusa, a następnie techniki uzupełniające, takie jak reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) w celu dalszej weryfikacji. Może to być kłopotliwe, czasochłonne i zazwyczaj wymaga próbek tkanek silnie zainfekowanych wirusem. Zastosowanie RT-ilościowego (q)PCR w wykrywaniu wirusów jest korzystne ze względu na jego ilościowy charakter, wysoką czułość, swoistość, skalowalność i szybki czas oczekiwania na wynik. W tym miejscu opisano całą metodę podejść do wykrywania TiLV opartych na PCR, od przekroju narządów tilapii, ekstrakcji całkowitego kwasu rybonukleinowego (RNA) przy użyciu roztworu tiocyjanianu guanidu, fenolu i chloroformu, kwantyfikacji RNA, a następnie dwuetapowego protokołu PCR obejmującego komplementarną syntezę kwasu dezoksyrybonukleinowego (cDNA) i wykrywanie TiLV za pomocą konwencjonalnego PCR lub identyfikacji ilościowej za pomocą qPCR przy użyciu barwnika SYBR green I. Konwencjonalny PCR wymaga kroków po PCR i po prostu informuje o obecności wirusa. To ostatnie podejście pozwoli na bezwzględne określenie ilościowe TiLV do zaledwie 2 kopii, a zatem jest wyjątkowo przydatne w diagnostyce TiLV w przypadkach subklinicznych. Szczegółowy opis dwóch podejść PCR, reprezentatywne wyniki z dwóch laboratoriów oraz dokładne omówienie krytycznych parametrów obu zostały dołączone, aby zapewnić, że badacze i diagności znajdą najbardziej odpowiednią i możliwą do zastosowania metodę wykrywania TiLV.

Ten protokół diagnozuje wirusa Tilapia Lake (TiLV) w tkankach tilapii za pomocą metodologii RT-PCR. Cała metoda jest opisana od rozwarstwienia tkanek do całkowitej ekstrakcji RNA, a następnie syntezy cDNA i wykrywania TiLV za pomocą konwencjonalnego PCR lub ilościowego PCR przy użyciu dsDNA wiążącego fluorescencyjny barwnik wiążący.

Wykrywanie wirusa Tilapia Lake za pomocą konwencjonalnego RT-PCR i SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Witam wszystkich. Nazywam się Win Surachetpong. Jestem adiunktem na Wydziale Mikrobiologii i Immunologii Weterynaryjnej Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Kasetstart w Tajlandii.Ja i mój zespół specjalizujemy się w pojawiających się chorobach wirusowych w tilapii. Obecnie pracujemy nad wirusem jeziora tilapia, który powoduje wysoką śmiertelność w tilapii. Ponieważ tilapia jest drugim najważniejszym gatunkiem ryb, który jest hodowany na całym świecie, stanowi źródło białka dla miliona ludzi i odgrywa ważną rolę w bezpieczeństwie żywnościowym.Tak więc niedawny wybuch wirusa jeziora tilapia spowodował skutki społeczno-ekonomiczne, które skłoniły wielu naukowców do próby znalezienia rozwiązania tego problemu. Do tej pory potrzebna jest bardzo czuła, szybka i dokładna metoda wykrywania wirusa. W tym filmie pokażemy Ci krok po kroku, jak wykryć wirusa jeziora tilapia w tkance ryb, zaczynając od pobrania próbki, populacji próbki i analizy PCR w czasie rzeczywistym.Najpierw rozpuść przedawkowanie oleju z tkanin w wodzie, aby poddać rybę eutanazji. Umieść martwą rybę na tacy, wysterylizuj sprzęt za pomocą 95% etanolu, a następnie spal palnikiem alkoholowym. Powoli rozetnij rybę od dolnej części brzucha w górę, aby zebrać wątrobę.Zbierz część wątroby do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Pierwsza część ekstrakcji RNA powinna być wykonana w kapturze z przepływem laminarnym i nosić sprzęt ochronny. Dodaj jeden mililitr odczynnika do ekstrakcji RNA do probówki.Sproszkować wątrobę za pomocą tłuczka tkankowego na jednorodną masę. Dodaj 200 mikrolitrów chloroformu do probówki. Następnie delikatnie wymieszaj, kilkakrotnie odwracając rurkę.Odstawić na trzy minuty w temperaturze pokojowej. Wirować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy 12 000 RCF przez 15 minut. Ostrożnie zbierz probówki z wirówki.Delikatnie przenieś 500 mikrolitrów bezbarwnej górnej górnej fazy wodnej do nowej probówki. Dodać jedną objętość izopropanolu do probówki. Podgrzewaj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez dwie godziny lub do nocy, aby wytrącić RNA.Po inkubacji odwirować roztwór w tych samych warunkach wirówki. Zebrać probówki z wirówki, a następnie wyrzucić supernatant. Osad RNA można zobaczyć jako skierowany strzałką.Dodaj jeden mililitr 75% etanolu do probówki, aby przepłukać osad RNA i kilkakrotnie odwróć. Wirować w temperaturze czterech stopni Celsjusza, w temperaturze 10 000 RCF przez 15 minut. Zebrać probówki z wirówki, a następnie wyrzucić supernatant.Wyciągnij resztki etanolu za pomocą pipety automatycznej i wysusz na powietrzu w temperaturze pokojowej przez pięć do 10 minut. Dodaj od 30 do 60 mikrolitrów wody wolnej od RNaz, wstępnie podgrzanej do 55 do 60 stopni Celsjusza, aby rozpuścić osad RNA. Użyj jednego do dwóch mikrolitrów roztworu RNA, aby zmierzyć stężenie za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.Wyniki pojawią się na ekranie. Rozcieńczyć stężenie do 200 nanogramów na mikrolitr za pomocą wody wolnej od RNazy. Przeprowadź syntezę cDNA przy użyciu substancji chemicznych i warunków wymienionych w następujący sposób.Użyj termocyklera, aby przekształcić RNA w cDNA z sugerowanymi warunkami. Poniżej przedstawiono substancje chemiczne i warunki używane do określania obciążenia TiLV za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Dozować sześć mililitrów głównej mieszanki qPCR do każdej fiolki z białą probówką z paskami qPCR.Następnie do studzienki ładowane są cztery mililitry próbki cDNA. Na tym etapie w każdym dołku należy wymienić nową końcówkę rury, aby uniknąć zanieczyszczenia z próbki na próbkę. Szczelnie uszczelnij pasek qPCR przezroczystą nasadką paska qPCR.Delikatnie wymieszaj roztwór, przesuwając palcem po końcówce paska. Następnie odwiruj w dół za pomocą mikrowirówki, aby zebrać cały płyn na dnie naczyń. Użyj warunku dwuetapowego, jak pokazano na filmie, wybierz studzienkę w płytce 96-dołkowej, której zamierzasz użyć.Wybierz cyber green jako florę do barwnika. Wybierz pozycję nieznany jako typ próbki i wstaw nazwę w polu nazwy próbki. Otwórz pokrywę maszyny do PCR w czasie rzeczywistym i umieść pasek qPCR w przypisanej studzience.Następnie zamknij pokrywę. Uruchom maszynę z wybranym warunkiem. Maszyna uruchomi się i uruchomi, gdy pokrywa osiągnie żądaną temperaturę.Po zakończeniu warunków qPCR pokazana jest krzywa amplifikacji. W tym miejscu strzałka szybkości wskazuje, gdzie poziom progowy odcina się między fazą wykładniczą a fazą liniową, co skutkuje wartością CT. Wartość CT jest następnie ekstrapolowana na liczbę kopii dziennika wirusa w celu obliczenia liczby pozostałości wirusa przy użyciu krzywej standardowej.Szczyt topnienia jest również wyświetlany w celu określenia, czy wirus wykryty za pomocą qPCR to rzeczywiście TiLV, w którym szczyty topnienia zwykle mieszczą się w zakresie od 79,5 do 80,5 stopni Celsjusza. Mamy więc nadzieję, że metoda ta będzie ważnym narzędziem dla rolników i organizacji na całym świecie, którzy mogą wymagać wdrożenia kontroli i ograniczenia rozprzestrzeniania się zakażenia TiLV.

detection-tilapia-lake-virus-using-conventional-rt-pcr-sybr-green-rt

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Ten film demonstruje ilościową metodę wykrywania infekcji wirusowej za pomocą PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym. Krok odwrotnej transkrypcji przekształca RNA w cDNA, które jest następnie amplifikowane w cyklach PCR. Obecność wirusowego RNA w próbce potwierdza się analizując krzywe amplifikacji i dysocjacji DNA uzyskane z PCR.

Ilościowy PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym do diagnozowania infekcji wirusowych

Tutaj prezentujemy procedurę ilościowego oznaczania enterowirusa i norowirusa w wodach środowiskowych i pitnych za pomocą odwrotnej transkrypcji ilościowej PCR. Średni odzysk wirusa z wód gruntowych przy użyciu tej znormalizowanej procedury z metody EPA 1615 wynosił 20% dla wirusa polio i 30% dla mysiego norowirusa.

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. Część III. Wykrywanie wirusów za pomocą RT-qPCR

Obecna diagnostyka multipleksowa do wykrywania wirusów Zika, chikungunya i denga wymaga skomplikowanego przygotowania próbek i kosztownego oprzyrządowania, a także jest trudna do użycia w środowiskach o niskich zasobach. Pokazujemy diagnostykę, która wykorzystuje amplifikację izotermiczną z sondami z przemieszczonymi niciami specyficznymi dla celu, aby wykryć i zróżnicować te wirusy z wysoką czułością i swoistością.

Multipleksowana platforma diagnostyczna oparta na amplifikacji izotermicznej do wykrywania wirusów Zika, Chikungunya i Denga 1

Ilościowa analiza łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym w połączeniu z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) jest szeroko stosowana do pomiaru poziomu infekcji wirusem RNA. W tym miejscu przedstawiamy bezpośredni test RT-qPCR, który nie wymaga etapu oczyszczania RNA, opracowany do oznaczania ilościowego kilku wirusów RNA, w tym wirusa dengi.

Pomiar RNA wirusa dengi w supernatancie hodowli zakażonych komórek za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym

Przedstawiamy kompletny protokół do pośmiertnej diagnozy wścieklizny zwierząt w warunkach polowych przy użyciu szybkiego immunochromatograficznego testu diagnostycznego (RIDT), od pobrania próbki z biopsji mózgu do ostatecznej interpretacji. Opisujemy również dalsze zastosowania urządzenia do analizy molekularnej i genotypowania wirusów.

Terenowy pośmiertny szybki immunochromatograficzny test diagnostyczny wścieklizny do zastosowań o ograniczonych zasobach z dalszymi zastosowaniami molekularnymi

Prezentujemy test RT-LAMP do wykrywania TiLV u ryb tilapia za pomocą prostych narzędzi w stosunkowo krótkim okresie czasu w porównaniu do konwencjonalnych technik RT-PCR. Protokół ten może pomóc w kontrolowaniu rozprzestrzeniania się epidemii TiLVD, zwłaszcza w krajach rozwijających się.

Test amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP) do specyficznego i szybkiego wykrywania wirusa Tilapia Lake

Tutaj udostępniamy kompletny protokół do standaryzacji i implementacji metody wykrywania wirusa SARS-CoV-2 w próbkach ludzkich za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP). Ta metoda, wykonana w ciągu 60 minut, może być dostosowana do każdego laboratorium lub punktu opieki nad pacjentem przy niskich kosztach i przy użyciu niedrogiego sprzętu.

Wykrywanie wirusa SARS-CoV-2 za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji

Prezentujemy dwa wewnętrzne, jednoetapowe zestawy RT-qPCR do powszechnych wirusów układu oddechowego. Pierwszy test dotyczy SARS-CoV-2 (N), grypy A (H1N1 i H3N2) oraz grypy B. Drugi dotyczy SARS-Cov-2 (N) i MERS (UpE i ORF1a). Testy te mogą być z powodzeniem wdrożone w każdym specjalistycznym laboratorium.

Opracowanie multipleksowych testów RT-qPCR w czasie rzeczywistym do wykrywania SARS-CoV-2, grypy A/B i MERS-CoV

Przedstawiono technikę laboratoryjnego szacowania efektywności transferu troficznego netto kongenerów polichlorowanego bifenylu (PCB) do ryb rybożernych z ich ofiary. Aby zmaksymalizować zastosowanie wyników laboratoryjnych w terenie, ryby rybożerne powinny być karmione rybami drapieżnymi, które są zwykle spożywane na polu.

Laboratoryjne oszacowanie efektywności transferu troficznego netto kongenerów PCB do pstrąga jeziorowego (Salvelinus namaycush) z jego ofiary

Eutrofizacja jezior jest problemem jakości wody na całym świecie, co sprawia, że potrzeba identyfikacji i kontroli źródeł składników odżywczych jest krytyczna. Laboratoryjne określenie szybkości uwalniania fosforu z rdzeni osadów jest cennym podejściem do określania roli wewnętrznego obciążenia fosforem i kierowania decyzjami zarządczymi.

Wyznaczony laboratoryjnie strumień fosforu z osadów jeziornych jako miara wewnętrznego obciążenia fosforem

Poznaj metodę wykrywania wirusa Tilapia Lake w tkankach ryb za pomocą RT-PCR i RT-qPCR. Protokół obejmuje ekstrakcję RNA, syntezę cDNA oraz analizę krzywych amplifikacji.

Wykrywanie wirusa Tilapia Lake za pomocą konwencjonalnego RT-PCR i SYBR Green RT-qPCR

Przeglądaj więcej filmów